JP6550471B2 - Evaporation reduction method and reagent used therefor - Google Patents
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- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Description
関連出願の相互参照
本出願は２０１５年４月１５日に出願され本明細書に参照として援用される係属中の米国特許出願１４／７０１，０４３号に基づき優先権を主張する非仮出願である。
This application is a non-provisional application claiming priority based on pending US Patent Application No. 14 / 701,043 filed on April 15, 2015 and incorporated herein by reference. .
本発明は分析用試薬に関する。 The present invention relates to analytical reagents.
インサイチュハイブリダイゼーションに基づく免疫組織化学的分析及び分析技術は、癌性腫瘍に見られるような異常細胞の診断やその他の疾病の診断等の医療診断において広く使用されている。多くの分析は、スライド上の試薬中の試料などの試料に対する熱の付加を伴う。昇温時の分析工程は分析試薬の実質的な蒸発を引き起こすおそれがある。少量が使用される場合、試料の変性、ハイブリダイゼーション、洗浄及び老化工程、並びに得られる分析結果が蒸発によって損なわれるおそれがある。 Immunohistochemical analysis and analysis techniques based on in situ hybridization are widely used in medical diagnosis such as diagnosis of abnormal cells as found in cancerous tumors and diagnosis of other diseases. Many analyzes involve the addition of heat to a sample, such as the sample in a reagent on a slide. The analysis step at elevated temperatures can cause substantial evaporation of the analytical reagents. If small amounts are used, the denaturation, hybridization, washing and aging steps of the sample, and the resulting analytical results may be lost by evaporation.
組織又は細胞試料の処理において試薬の蒸発を低減する。 Reduce evaporation of reagents in the treatment of tissue or cell samples.
組織又は細胞試料の処理において試薬の蒸発を低減するように作用可能な、水溶液中の蒸発低減剤を含む試薬及び試薬の使用方法が開示される。 Disclosed are reagents and methods of using reagents including evaporation reducing agents in an aqueous solution, which are operable to reduce evaporation of the reagents in the treatment of tissue or cell samples.
上記したような試薬が用途を見出す代表的な処理としては、昇温工程（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション手順における昇温工程）を伴う、脱ろう、細胞調整／抗原賦活化／細胞老化、過酸化物／ホスファターゼ阻害、プローブ変性、プローブハイブリダイゼーション、洗浄、リンカーハイブリダイゼーション、抗体インキュベーション、プローブ検出、色原体沈殿、及び対比染色が挙げられるが、これらに限定されない。溶液は典型的には、核酸（一本鎖若しくは二本鎖プローブ）ハイブリダイゼーション分析の変性、洗浄、若しくはハイブリダイゼーション工程において、又は免疫組織化学若しくは免疫細胞化学染色における抗体を使用するインキュベーション、抗原賦活化、若しくは洗浄工程において、使用され得る。好適な試薬は、ハイブリダイゼーション溶液試薬における溶液拡散に役立つ洗浄剤／界面活性剤等の他の成分を含んでもよい。一実施形態では、組織又は細胞処理のために作用可能な試薬における蒸発低減剤の好適な量は、ハイブリダイゼーション溶液を２５℃〜５０℃の高温に１０分〜２４時間暴露する（例えば、ハイブリダイゼーション又はインキュベーションプロセス）又は６０℃〜１００℃の高温に２〜９０分間暴露する（例えば、変性又は抗原賦活化プロセス）といった工業的に許容可能な試薬処理条件下で、蒸発に起因する試薬の損失を２０％以下に制限する量である。一実施形態では、蒸発低減剤の好適な量は、試薬組成物（例えば溶液）の１１体積％〜６０体積％の範囲である。 Representative treatments for which the reagent as described above finds use include dewaxing, cell conditioning / antigen activation / cell senescence, peroxide, which involve a temperature rising step (for example, a temperature rising step in an in situ hybridization procedure). / Phosphatase inhibition, probe denaturation, probe hybridization, washing, linker hybridization, antibody incubation, probe detection, chromogen precipitation, and counterstaining, but is not limited thereto. The solution is typically incubated in the denaturation, wash, or hybridization step of nucleic acid (single-stranded or double-stranded probe) hybridization assays, or using antibodies in immunohistochemistry or immunocytochemical staining, antigen retrieval Can be used in chemical or washing steps. Suitable reagents may also include other components such as detergents / surfactants that aid in solution diffusion in hybridization solution reagents. In one embodiment, a suitable amount of evaporation reducing agent in the reagent operable for tissue or cell processing exposes the hybridization solution to an elevated temperature of 25 ° C. to 50 ° C. for 10 minutes to 24 hours (eg, hybridization) Or industrially acceptable reagent processing conditions such as exposure to elevated temperatures of 60 ° C. to 100 ° C. for 2 to 90 minutes (eg denaturation or antigen retrieval process), loss of reagents due to evaporation It is an amount limited to 20% or less. In one embodiment, a suitable amount of evaporation reducing agent is in the range of 11% to 60% by volume of the reagent composition (e.g. solution).
一実施形態では、試薬（組成物）は、効果的な蒸発低減量の、一般式Ｉ：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
の式を含む蒸発低減剤を含み、
式中、Ｒは、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子で置換されていてよい（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、又は芳香族を画定する１つ以上の炭化水素の水素原子を−ＯＨ、−ＳＨ、又は−ＮＨ２で置換）か、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子で中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ）してよい（例えば、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−、−Ｃ−ＳＨ−Ｃ−、−Ｃ−ＮＨ−Ｃ−）、炭素数１以上（例えば、一実施形態では炭素数１〜６、別の実施形態では炭素数１〜４）のアルキル、アルケニル、アルキニル、又は芳香族部分である（Ｒが炭素数１の部分である場合にはＲはアルキルであることが理解される）。アルキル部分はＸ１及びＸ２への接続のための連結部の開点を含有するアルカンである。アルケニル部分はＸ１及びＸ２への接続のための連結部の開点を含有するアルケンである。アルキニル部分はＸ１及びＸ２への接続のための連結部の開点を含有するアルキンである。代表的なアルキルとしては、さらに置換されていてもされていなくてもよい直鎖又は分枝鎖アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル）が挙げられる。代表的なアルケニルとして直鎖又は分枝鎖アルケニル（例えば、エテニル、プロペニル、イソプロペニル）が挙げられる。代表的なアルキニルとしては、さらに置換されていてもされていなくてもよい直鎖又は分枝鎖アルキニル（例えば、エチニル、プロピニル、イソプロピニル）が挙げられる。芳香族部分は環を形成する結合の相互作用によって安定化されている原子の不飽和環である。芳香族部分の例はベンジルである。中断された芳香族部分の例はピリジン（窒素原子により中断；フラン（酸素原子により中断）；及びチオフェン（硫黄原子により中断）である。
In one embodiment, the reagent (composition) comprises an effective evaporation reducing amount of the general formula I:
X 1 -R-X 2
Containing evaporation reducing agents, including
In the formula, R may be substituted with an oxygen atom, a sulfur atom, and / or a nitrogen atom (eg, alkyl, alkenyl, alkynyl or one or more hydrocarbon hydrogen atoms defining an aromatic group -OH) (Substituted with —SH or —NH 2 ) or interrupted with an oxygen atom, a sulfur atom, and / or a nitrogen atom (eg, —C—O—C—, —C—SH—C— —C—NH—C—), alkyl, alkenyl, alkynyl or aromatic moiety having 1 or more carbon atoms (eg, 1 to 6 carbon atoms in one embodiment, 1 to 4 carbon atoms in another embodiment) It is understood that R is alkyl if R is a moiety of 1 carbon. The alkyl moiety is an alkane containing the open point of the connection for connection to X 1 and X 2 . The alkenyl moiety is an alkene containing the open point of the connection for connection to X 1 and X 2 . An alkynyl moiety is an alkyne containing the open point of the connection for connection to X 1 and X 2 . Representative alkyls include linear or branched alkyls (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl) which may be further substituted or unsubstituted. Representative alkenyls include linear or branched alkenyl (eg, ethenyl, propenyl, isopropenyl). Representative alkynyls include linear or branched alkynyl which may be further substituted or unsubstituted (eg ethynyl, propynyl, isopropynyl). The aromatic moiety is an unsaturated ring of the atom being stabilized by the interaction of the bonds forming the ring. An example of an aromatic moiety is benzyl. Examples of interrupted aromatic moieties are pyridine (disrupted by a nitrogen atom; furan (disrupted by an oxygen atom); and thiophene (disrupted by a sulfur atom).
一般式Ｉ中のＸ１及びＸ２は、一方又は両方が水素結合を受けやすい及び／又は電気陰性の原子を含有する部分となるように独立に選択される。Ｘ１及びＸ２のための代表的な部分は、ヒドロキシル部分（−ＯＨ）；カルボニル部分（−ＣＯ）；アミン部分（−ＮＨ２）；アルデヒド部分（−ＣＨＯ）；ハロゲン部分（−Ｙ、ＹはＣｌ−、Ｆ−、Ｂｒ−、又はＩ−）；エーテル部分（−ＯＲ１、Ｒ１は水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる及び／又は電気陰性の原子を含有する部分で置換されていてもよいアルキル（例えば、炭素数１〜６のアルキル）である）；カルボキシル部分（−ＣＯＯＲ２、Ｒ２は水素原子、又は水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる及び／又は電気陰性の原子を含有する部分で置換されていてもよいアルキル（例えば、炭素数１〜６のアルキル）である）；及びアミド部分（−ＣＯＮＲ３Ｒ４、Ｒ３及びＲ４は水素原子又は水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる及び／又は電気陰性の原子を含有する部分で置換されていてもよいアルキル（例えば、炭素数１〜６のアルキル）から独立に選択される）等であるがこれらに限定されない、水素結合できる官能基を含むことになる。Ｘ１及びＸ２のためのエーテル、カルボキシル、及びアミド部分に関連する注記したアルキル（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４）のための水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる置換部分の代表例としては、ヒドロキシル、カルボニル、アミン、アルデヒド、ハロゲン、エーテル、カルボキシル、及びアミド部分が挙げられる。 X 1 and X 2 in the general formula I are independently selected so that one or both of them is a moiety containing a hydrogen bondable and / or electronegative atom. Representative moieties for X 1 and X 2 are hydroxyl moiety (-OH); carbonyl moiety (-CO); amine moiety (-NH 2 ); aldehyde moiety (-CHO); halogen moiety (-Y, Y) Is a Cl − , F − , Br − , or I − ); ether moiety (—OR 1 , R 1 is substituted with a moiety susceptible to or capable of hydrogen bonding and / or containing an electronegative atom) Alkyl moiety (eg, alkyl having 1 to 6 carbon atoms); carboxyl moiety (-COOR 2 , R 2 is a hydrogen atom, or a hydrogen bond susceptible or hydrogen bondable and / or contains an electronegative atom) optionally substituted at a portion alkyl (e.g., alkyl having 1 to 6 carbon atoms) a is); and amide moiety (-CONR 3 R 4, R 3 and R 4 are hydrogen atom or An alkyl (for example, independently selected from an alkyl having 1 to 6 carbon atoms) which may be substituted by a moiety containing an atomic bond which is susceptible to hydrogen bonding or capable of hydrogen bonding and / or an electronegative atom; It will include functional groups that can be hydrogen bonded, not limited to these. Hydrogen bonds susceptible or capable of hydrogen bonding for the noted alkyl (R 1 , R 2 , R 3 and R 4 ) related to ether, carboxyl and amide moieties for X 1 and X 2 Representative examples include hydroxyl, carbonyl, amine, aldehyde, halogen, ether, carboxyl and amide moieties.
一般式Ｉを有する好適な蒸発低減剤の例としては、エチレングリコール、グリシン、セリン、イソエチオニン酸、エタノールアミン、ポリエチレングリコール、及び１，３−プロパンジオールが挙げられる。一実施形態では、Ｒは置換も中断もされていない。Ｒが置換も中断もされていない蒸発低減剤の代表例は、ＲがエチルでありＸ１及びＸ２の各々がヒドロキシル部分である、エチレングリコール（ＨＯ（ＣＨ２）２ＯＨ）である。Ｘ２が水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる部分でさらに置換された一級アミドである蒸発低減剤の例は、Ｒが−（ＣＨ２）３−；Ｘ１が−ＮＨ２、及びＸ２が−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨである、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨである。一実施形態では、好適な試薬は、一般式Ｉの式を有する１種以上の蒸発低減剤を含む（例えば、試薬は一般式Ｉの式を有する２つ又は３つの蒸発低減剤の組み合せを含む）。 Examples of suitable evaporation reducing agents having the general formula I include ethylene glycol, glycine, serine, isoethionic acid, ethanolamine, polyethylene glycol and 1,3-propanediol. In one embodiment, R is not substituted or interrupted. A representative example of an evaporation reducing agent in which R is not substituted or interrupted is ethylene glycol (HO (CH 2 ) 2 OH) in which R is ethyl and each of X 1 and X 2 is a hydroxyl moiety. Examples of evaporation reducing agents in which X 2 is a primary amide further substituted with a hydrogen bond or a moiety capable of undergoing a hydrogen bond include: R is-(CH 2 ) 3- ; X 1 is -NH 2 , and X 2 is it is -NH (CH 2) 2 COOH, H 2 N- (CH 2) a 3 -NH (CH 2) 2 COOH . In one embodiment, a suitable reagent comprises one or more evaporation reducing agents having the formula of general formula I (for example, the reagent comprises a combination of two or three evaporation reducing agents having the formula of general formula I ).
蒸発低減剤は分子の遊離形態（分子）であってもその許容可能な塩（化合物）若しくはイオン性の液体であってもよい。塩の例は、塩酸塩のような分子のハロゲン化水素酸塩である。 The evaporation reducing agent may be the free form (molecule) of the molecule or an acceptable salt (compound) or ionic liquid thereof. An example of a salt is a hydrohalide of a molecule such as a hydrochloride.
一実施形態では、溶質としての蒸発低減剤は、１種以上の他の試薬と混合されると溶液の蒸気圧を低下させる。かかる溶質は、水との完全な又は部分的な溶解性又は混和性を示す場合があり、その溶質が混合される又は他の態様で導入される水溶液の分圧を低下させることができる、分子、イオン性塩、イオン性液体、非イオン性剤であり得る。加えて、蒸発低減剤は水との共沸性混合物を形成してもしなくてもよい。蒸発低減剤が水との共沸性混合物を形成する場合には、一実施形態では溶質は、水と負の共沸混合物を形成する。 In one embodiment, the evaporation reducing agent as a solute reduces the vapor pressure of the solution when mixed with one or more other reagents. Such solutes may exhibit complete or partial solubility or miscibility with water and may reduce the partial pressure of the aqueous solution into which the solute is mixed or otherwise introduced. , Ionic salts, ionic liquids, non-ionic agents. In addition, the evaporation reducer may or may not form an azeotropic mixture with water. If the evaporation reducer forms an azeotropic mixture with water, in one embodiment, the solute forms a negative azeotropic mixture with water.
一般的に言うと、この文脈において溶媒及び溶質が混合される場合、結果として生ずる溶媒の化学ポテンシャルは低下し、その結果溶媒分子の分圧が下がって、溶媒単独溶液に対して気体相への移行しやすさが低下する。典型的に、溶質が非揮発性の蒸発低減剤である水溶液中における水の分圧は低下することになり、このことが混合物の沸点の上昇並びに表面における蒸発の低下につながる場合がある。 Generally speaking, when the solvent and the solute are mixed in this context, the chemical potential of the resulting solvent is reduced, so that the partial pressure of the solvent molecules is reduced, to the gas phase relative to the solvent alone solution. Ease of migration is reduced. Typically, the partial pressure of water in an aqueous solution in which the solute is a non-volatile evaporation reducing agent will decrease, which may lead to an increase in the boiling point of the mixture as well as to a decrease in evaporation at the surface.
水素結合は、分子中で、水素原子が酸素、窒素、又はフッ素原子等の電気陰性の原子に結合され分子が電気陽性原子に近接したときに起こり得る。この性質の静電引力は５〜３０ｋＪ／ｍｏｌ程度の強さを有し、ファンデルワールス引力よりも強いが、共有結合やイオン結合よりは弱い。 Hydrogen bonding can occur when, in a molecule, a hydrogen atom is attached to an electronegative atom such as an oxygen, nitrogen, or fluorine atom and the molecule is in proximity to an electropositive atom. The electrostatic attraction of this nature has a strength of about 5 to 30 kJ / mol and is stronger than the van der Waals attraction but weaker than the covalent bond or the ionic bond.
一実施形態では、蒸発低減剤は溶質として水と混合されて、水の分圧が低下される溶液を生成することによって水の蒸気圧を低下させて、分圧が下がらなかった場合よりも効率的に分析（例えば、免疫組織化学的分析）を行うことができる。一実施形態では、溶質は、当業者に既知の分析を妨害し得る残存する残留物が全くないか最小限となるように選択される。 In one embodiment, the evaporation reducing agent is mixed with water as a solute to lower the water vapor pressure by producing a solution in which the water partial pressure is reduced, more efficiently than if the partial pressure was not reduced. Analysis (eg, immunohistochemical analysis) can be performed. In one embodiment, the solute is selected such that there is no or minimal residual residue that can interfere with assays known to those skilled in the art.
一実施形態では、細胞又は組織試料を処理する際に使用するために作用可能な試薬は、ベース試薬と蒸発低減剤とを組み合わせることにより調製される。好適な組成物中にさらなる成分を組み合わせてもよい。試薬を水性の緩衝溶液に加えて、高温時の蒸発を低減することもできる。一実施形態では、蒸発に起因する組み合わせのあらゆる損失を２０％以下に、別の実施形態では１０％以下に、制限するような量で蒸発低減剤を組み合わせる。典型的には、蒸発低減剤又は低減剤の組み合わせが１１体積％〜６０体積％の量で組成物中に存在するか、又は低減剤の１％〜６０％の量が非グリコール含有化合物又は低減剤の組み合わせである。ベース試薬、蒸発低減剤、及び何れかの他の成分を組み合わせた後、組成物を混合してもよい。 In one embodiment, an agent operable for use in processing a cell or tissue sample is prepared by combining a base reagent and an evaporation reducing agent. Additional ingredients may be combined in suitable compositions. Reagents can also be added to aqueous buffer solutions to reduce evaporation at elevated temperatures. In one embodiment, the evaporative reducing agent is combined in an amount to limit any loss of the combination due to evaporation to 20% or less, and in another embodiment 10% or less. Typically, a combination of evaporation reducer or reducer is present in the composition in an amount of 11% by volume to 60% by volume, or an amount of 1% to 60% of the reducer is non-glycol containing compound or reduced A combination of agents. The composition may be mixed after combining the base reagent, the evaporation reducing agent, and any other ingredients.
一実施形態では、高温での分析に使用するための、パラフィンを含まない、または脱パラフィン化した組織又は細胞試料の処理において作用可能な方法が開示される。一実施形態では、方法はいずれかの水系の処理試薬の蒸発を低減するために作用可能である。この方法は、組織又は細胞試料を一般式Ｉ：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
の式を有する蒸発低減剤を（例えば、溶質として）含む試薬と接触させることを含む。
このような接触は、試薬をスライド上の試料に塗布することを含む。試料を試薬と接触させた後、試料を当該技術分野で既知の技術によって処理してよい。
In one embodiment, a method is disclosed that can act in the processing of paraffin-free or deparaffinized tissue or cell samples for use in analysis at high temperatures. In one embodiment, the method is operable to reduce evaporation of any aqueous processing reagents. The method comprises treating a tissue or cell sample with the general formula I:
X 1 -R-X 2
Contacting the agent with an evaporation reducing agent having the formula (for example, as a solute).
Such contacting involves applying a reagent to the sample on the slide. After contacting the sample with the reagent, the sample may be processed by techniques known in the art.
一実施形態では、高温における分析に使用するための、パラフィンを含まない又は脱パラフィン化された組織又は細胞試料の処理において作用可能な方法が開示される。一実施形態では、方法は、溶質を溶媒に加えることによって何れかの水性の処理試薬の蒸発を低減するために作用可能である。結果として得られる溶媒の化学ポテンシャルは低下し、その結果溶媒分子の分圧が低下して、溶媒分子の気相への移行のしやすさが低下する。溶質が非揮発性物質である水溶液における水の分圧が低下した結果、沸点が上昇し得るとともに表面における蒸発が低下し得る。 In one embodiment, a method is disclosed that can act in the processing of paraffin-free or deparaffinized tissue or cell samples for use in analysis at high temperatures. In one embodiment, the method is operable to reduce evaporation of any aqueous processing reagent by adding a solute to the solvent. The chemical potential of the resulting solvent is reduced, which reduces the partial pressure of the solvent molecules and reduces the ease of transfer of the solvent molecules into the gas phase. As a result of the reduced partial pressure of water in the aqueous solution in which the solute is a non-volatile substance, the boiling point can rise and the evaporation at the surface can be reduced.
実施例１：異なるハイブリダイゼーション温度でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の蒸発に起因する体積損失
４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を６つの試料スライドの各々に塗布し、これらのスライドを個々に異なる温度で３０分間加熱した。ハイブリダイゼーション工程の間、ハイブリダイゼーション溶液を有するスライド上で蒸発が起こったことが観察された。
Example 1: Volume Loss Due to Evaporation During Oligonucleotide Hybridization at Different Hybridization Temperatures 400 μl of hybridization solution (reagent) is applied to each of six sample slides, and these slides at individually different temperatures Heated for 30 minutes. It was observed that evaporation occurred on the slide with the hybridization solution during the hybridization step.
実施例２：異なる試薬によるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の蒸発の低減
異なる蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を各試料スライドに塗布し、４３℃で３０分間加熱した。１つの試料スライドは蒸発低減剤を有さないハイブリダイゼーション溶液を含んでいた。４３℃のハイブリダイゼーション工程中、蒸発低減剤を有さないハイブリダイゼーション溶液を含有する試料スライドで実質的により大きなハイブリダイゼーション溶液の蒸発が起こったが、蒸発低減剤の添加により低減されたことが観察された。
Example 2 Reduction of Evaporation During Oligonucleotide Hybridization with Different Reagents 400 μl of hybridization solution (reagent) with different evaporation reducing agents was applied to each sample slide and heated at 43 ° C. for 30 minutes. One sample slide contained the hybridization solution without the evaporation reducing agent. Observe that during the 43 ° C hybridization step, substantially greater hybridization solution evaporation occurred on the sample slide containing the hybridization solution without the evaporation reducing agent, but was reduced by the addition of the evaporation reducing agent It was done.
実施例３：異なる濃度のエチレングリコールを用いたハイブリダイゼーション中の蒸発の低減
異なる濃度のエチレングリコールの蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を、各試料スライドに塗布し、４３℃で３０分間加熱した。比較のために、エチレングリコールを有さない４００μｌのハイブリダイゼーション溶液もまた試料スライドに塗布し４３℃で３０分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液へのエチレングリコールの添加により蒸発が低減されたことが観察された。エチレングリコールを含有するハイブリダイゼーション溶液についての分析性能は、エチレングリコールを有さないハイブリダイゼーション溶液と類似していることがわかった。
Example 3: Reduction of evaporation during hybridization with different concentrations of ethylene glycol 400 μl of hybridization solution (reagent) with different concentrations of ethylene glycol evaporation reducer is applied to each sample slide at 43 ° C. Heated for 30 minutes. For comparison, 400 μl of hybridization solution without ethylene glycol was also applied to the sample slide and heated at 43 ° C. for 30 minutes. It was observed that the evaporation was reduced by the addition of ethylene glycol to the hybridization solution. The analytical performance for a hybridization solution containing ethylene glycol was found to be similar to a hybridization solution without ethylene glycol.
実施例４：ハイブリダイゼーション中の蒸発体積損失の減少の再現性
特定の濃度のエチレングリコールの蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を、各試料スライドに塗布し、４３℃で３０分間加熱した。比較のために、４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を各試料スライドに塗布し４３℃で３０分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液へのエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。
Example 4 Reproducibility of Reduction of Evaporation Volume Loss During Hybridization 400 μl of hybridization solution with a specific concentration of ethylene glycol evaporation reducer was applied to each sample slide and heated at 43 ° C. for 30 minutes. For comparison, 400 μl of hybridization solution was applied to each sample slide and heated at 43 ° C. for 30 minutes. It was observed that the evaporation was reduced by the addition of ethylene glycol to the hybridization solution.
実施例５：変性中の蒸発の低減
２０％エチレングリコールの蒸発低減剤を有する約４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を、各試料スライドに塗布し、９２〜９８℃で２分間加熱した。比較のためにエチレングリコールを有さない約４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を各試料スライドに塗布し９２〜９８℃で２分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液に対するエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。
Example 5 Reduction of Evaporation During Denaturation Approximately 400 μl of hybridization solution with 20% ethylene glycol evaporation reducer was applied to each sample slide and heated at 92-98 ° C. for 2 minutes. For comparison, about 400 μl of hybridization solution without ethylene glycol was applied to each sample slide and heated at 92-98 ° C. for 2 minutes. It was observed that evaporation was reduced by the addition of ethylene glycol to the hybridization solution.
実施例６：抗体インキュベーション工程中の蒸発の低減
２０％エチレングリコールの蒸発低減剤を有する約４００μｌの一次抗体希釈液（試薬）を各試料スライドに塗布し、特定の温度で３０分間インキュベートした。比較のために、エチレングリコールを有さない約４００μｌの一次抗体希釈液を各試料スライドに塗布し、特定の温度で３０分間インキュベートした。抗体希釈液へのエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。
Example 6 Reduction of Evaporation During Antibody Incubation Step Approximately 400 μl of primary antibody dilution (reagent) with 20% ethylene glycol evaporation reducer was applied to each sample slide and incubated for 30 minutes at a specified temperature. For comparison, approximately 400 μl of primary antibody dilution without ethylene glycol was applied to each sample slide and incubated for 30 minutes at a specific temperature. It was observed that the addition of ethylene glycol to the antibody dilution reduced evaporation.
実施例７：異なる試薬によるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の蒸発の低減
異なる蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を各試料スライドに塗布し４３℃で３０分間加熱した。蒸発低減剤を含有しないハイブリダイゼーション溶液もまた、試料スライドに塗布した。４３℃ハイブリダイゼーション工程中に、ハイブリダイゼーション溶液を有するスライドにおいて蒸発が起こったが、特定の試薬の添加により低減されたことが観察された。
Example 7 Reduction of Evaporation During Oligonucleotide Hybridization with Different Reagents 400 μl of hybridization solution with different evaporation reducing agents were applied to each sample slide and heated at 43 ° C. for 30 minutes. A hybridization solution containing no evaporation reducing agent was also applied to the sample slide. During the 43 ° C hybridization step, it was observed that evaporation occurred on the slide with the hybridization solution, but was reduced by the addition of certain reagents.
実施例８：異なる温度でのハイブリダイゼーション中のエチレングリコールを用いた蒸発の低減
エチレングリコールを有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を各試料スライドに塗布し、３５、３７、又は４０℃で１２０分間加熱した。比較のために、エチレングリコールを有さない４００μｌのハイブリダイゼーション溶液もまた試料スライドに塗布し、４０℃で１２０分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液へのエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。異なるハイブリダイゼーション温度でのエチレングリコールを含有するハイブリダイゼーション溶液についての分析性能は、エチレングリコールを有さないハイブリダイゼーション溶液と類似していることがわかった。
Example 8: Reduction of evaporation with ethylene glycol during hybridization at different temperatures 400 μl of hybridization solution (reagent) with ethylene glycol is applied to each sample slide, for 120 minutes at 35, 37 or 40 ° C. Heated. For comparison, 400 μl of hybridization solution without ethylene glycol was also applied to the sample slide and heated at 40 ° C. for 120 minutes. It was observed that the evaporation was reduced by the addition of ethylene glycol to the hybridization solution. The analytical performance for the hybridization solution containing ethylene glycol at different hybridization temperatures was found to be similar to the hybridization solution without ethylene glycol.
上記の記述では、説明の目的で、実施形態の完全な理解を提供するために多くの特定の詳細事項を記載したが、当業者には、これらの特定の詳細事項の幾つかを有することなく１以上の他の実施形態が実行され得ることが理解されよう。記載された特定の実施形態は発明を限定するためではなく例示するために提示されている。本発明の範囲は上記に提供された特定の実施例によって決まるものではなく、下記の特許請求の範囲によってのみ決まるものである。他の例では、記述の理解の妨げとなるのを避けるために、周知の構造、装置、及び操作は、ブロック図の形態で即ち詳細を述べずに示した。適切と考える場合には、同様の特徴を有していてもよい対応する又は類似の要素を示すために、参照番号又は参照番号の末端部分を図面間で反復させた。 In the above description, for the purposes of explanation, numerous specific details are set forth to provide a thorough understanding of the embodiments, but one of ordinary skill in the art would not have to have some of these specific details. It will be appreciated that one or more other embodiments may be implemented. The particular embodiments described are presented to illustrate but not to limit the invention. The scope of the present invention is not to be determined by the specific embodiments provided above, but only by the following claims. In other instances, well-known structures, devices, and operations are shown in block diagram form, ie, without further details, in order to avoid obscuring the description. Where considered appropriate, reference numbers or terminal portions of reference numbers have been repeated among the figures to indicate corresponding or similar elements that may have similar features.
本明細書を通した「一実施形態」「実施形態」「１以上の実施形態」又は「異なる実施形態」への参照は、例えば、本発明の実行においてある特定の特徴が含まれてもよいことを意味するということも理解すべきである。同様に、記述において、開示を簡素化し及び種々の発明の態様の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図、又はそれらの記述中で種々の特徴がグループ化される場合があるということも理解すべきである。しかしながら、こうした開示の方法が、本発明が各請求項に明確に記載した以上の特徴を必要とするとの意図を反映するものと解釈すべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲に反映されるように、発明の態様が、開示された単一の実施形態のすべての特徴よりも少ない特徴にある場合もある。したがって、この「発明を実施するための形態」に続く特許請求の範囲はここに「発明を実施するための形態」に明確に組み入れられ、各請求項がそれ自身を本発明の個別の実施形態として主張する。 References to "one embodiment" "embodiment" "one or more embodiments" or "different embodiments" throughout this specification may include, for example, certain features in the practice of the present invention It should also be understood that it means. Similarly, in the description, various features may be grouped together in a single embodiment, diagram, or description thereof to simplify the disclosure and to facilitate the understanding of various inventive aspects. Also should be understood. However, such disclosed methods should not be interpreted as reflecting the intention that the present invention requires the features described in the respective claims. Rather, as the following claims reflect, inventive aspects may lie in less than all features of a single disclosed embodiment. Thus, the claims following this Detailed Description are hereby expressly incorporated into the Detailed Description, with each claim standing on its own as a separate embodiment of the present invention. To insist.
Claims (10)
前記少なくとも１種の蒸発低減剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、グリシン、セリン、イソエチオニン酸、エタノールアミン、１．３−プロパンジオール、又はH 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 2 COOHを含み、前記少なくとも１種の蒸発低減剤は、非グリコール含有試薬又は２種以上の蒸発低減剤の組み合わせである場合は前記組成物に対して１〜６０体積％の量で存在し、又は前記少なくとも１種の蒸発低減剤がグリコール含有試薬である場合は前記組成物に対して１１〜６０体積％の量で存在する工程と、
前記組織又は細胞試料を処理する工程とを含む蒸発低減方法。 A method of evaporation reduction, wherein a tissue or cell sample is brought into contact with a composition comprising a hybridization solution or a primary antibody dilution solution comprising a detergent and at least one evaporation reducing agent to aid in solution diffusion,
The at least one evaporation reducing agent may be ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, glycine, serine, isoethionine acid, ethanolamine, 1.3-propanediol, or H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 2 ) 2 COOH, wherein the at least one evaporation reducing agent is present in an amount of 1 to 60% by volume based on the composition when it is a non- glycol containing reagent or a combination of two or more evaporation reducing agents a step to, or if the at least one evaporation reducing agent is glycol-containing reagent is present in an amount of 11 to 60 vol% relative to the composition,
Evaporation reduction method comprising the step of treating said tissue or cell sample.
前記少なくとも１種の蒸発低減剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、グリシン、セリン、イソエチオニン酸、エタノールアミン、１．３−プロパンジオール、又はH 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 2 COOHを含み、前記少なくとも１種の蒸発低減剤は、非グリコール含有試薬又は２種以上の蒸発低減剤の組み合わせである場合は前記組成物に対して１〜６０体積％の量で存在し、又は前記少なくとも１種の蒸発低減剤がグリコール含有試薬である場合は前記組成物に対して１１〜６０体積％の量で存在することを特徴とする試薬。 A reagent operable for use in processing a tissue or cell sample, the reagent comprising a hybridization solution or primary antibody dilution solution comprising a detergent to aid in solution diffusion and at least one evaporation reducing agent Containing things,
The at least one evaporation reducing agent may be ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, glycine, serine, isoethionine acid, ethanolamine, 1.3-propanediol, or H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 2 ) 2 COOH, wherein the at least one evaporation reducing agent is present in an amount of 1 to 60% by volume based on the composition when it is a non-glycol containing reagent or a combination of two or more evaporation reducing agents Or wherein the at least one evaporation reducing agent is a glycol-containing reagent, said reagent being present in an amount of 11 to 60% by volume with respect to the composition .
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