JP6544827B2 - 腸疾患の予防剤および／または治療剤 - Google Patents
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Description
本発明は、腸疾患、具体的には炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤に関する。より詳細には、インドールピルビン酸(IPA)またはその誘導体を有効成分として含む、炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
大腸及び小腸の粘膜に慢性の炎症または潰瘍を引き起こす疾患を炎症性腸疾患（IBD）と総称する。炎症性腸疾患は、寛解と再燃を繰り返すことが多い慢性的な疾患であり、大きく分けて潰瘍性大腸炎およびクローン病に分類される。潰瘍性大腸炎は肛門直腸から連続性に口方向に向かって進む、粘膜表層の連続性の炎症性疾患であり、クローン病は、口から肛門までどの臓器にも起こりうる、全層性の炎症性疾患である。国内における潰瘍性大腸炎の患者は、1970年代までほとんど報告がなかったが、ここ20年で5倍以上に急増し、2008年には特定疾患医療受給者証交付人数が10万人を突破し、現在でも年間約8000人の割合で患者数が増加している。また、国内におけるクローン病の患者は、1976年に125人だったのが、2013年には特定疾患医療受給者証交付人数が約4万人となり、ここ数年は年間1000人以上の割合で患者数が増加している。
炎症性腸疾患は、腸管特有の免疫装置に異常が生じ、様々な外来異物に対する免疫反応が異常に亢進した結果、発症するとされているものの、その発症原因は特定されておらず、根治療法も未だ確立されていない。
炎症性腸疾患は、腸管特有の免疫装置に異常が生じ、様々な外来異物に対する免疫反応が異常に亢進した結果、発症するとされているものの、その発症原因は特定されておらず、根治療法も未だ確立されていない。
現在、炎症性腸疾患の治療として、活動期での寛解導入療法と、寛解導入後の長期の寛解維持療法が実施されている。寛解導入療法とは、腸の炎症を抑えて、下痢や粘血便などの症状を緩和するための治療であり、寛解維持療法とは、炎症を抑えた状態である寛解期を長く維持するための治療である。例えば、治療剤として、5-アミノサリチル酸（5-ASA）製剤、コルチコステロイド（プレドニゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン）、免疫抑制剤（6-メルカプトプリン、アザチオプリン）が用いられている。また、抗TNF-α抗体製剤（インフリキシマブ、アダリムマブ）およびIFN-γ中和抗体といった生物学的製剤も炎症性腸疾患の治療に用いられている。IFN-γ中和抗体であるフォントリズマブは、臨床試験によりその有効性が確認されている（非特許文献１）。
しかしながら、これらの薬剤には、重篤な副作用の発現や投薬中止による炎症の再燃といった問題がある。そのような既存薬剤における問題を受けて、新たな治療法として、抗炎症性のサイトカインであるIL-10を産生するTr1細胞を移入する方法が開発されたが、治療に際して細胞を培養する技術が必要であることから実用化には至っていない。
しかしながら、これらの薬剤には、重篤な副作用の発現や投薬中止による炎症の再燃といった問題がある。そのような既存薬剤における問題を受けて、新たな治療法として、抗炎症性のサイトカインであるIL-10を産生するTr1細胞を移入する方法が開発されたが、治療に際して細胞を培養する技術が必要であることから実用化には至っていない。
そこで、細胞を培養するステップを必要とせずに、Tr1細胞を誘導することができれば、より簡易な予防・治療法につながると考えられている。例えば、Bifidobacterium breveの投与により、マウスの大腸粘膜においてTr1細胞が誘導され、マウスの大腸炎を予防する方法が報告されている(非特許文献２)。かかる方法は、Tr1細胞を大腸粘膜に誘導するという、体質自体を改善する方法であるため、投薬を中止しても炎症再燃の危険性が低下することも期待されている。しかしながら、副作用を発現することなく、大腸粘膜においてTr1細胞を誘導する効果を有する低分子化合物の薬剤は見出されていない。
上述のように、炎症性腸疾患においては抗IFN-γ抗体や抗TNF-α抗体が治療に利用されており、IFN-γやTNF-αを産生するTh1細胞が炎症誘導において重要な役割を果たしていることが示唆されている。このため、腸管においてTh1細胞への過剰な分化を抑制することは炎症性腸疾患の有効な予防・治療方法になると考えられる。Th1細胞への過剰な分化を抑制する方法は体質を改善する方法であるため、炎症再燃の危険性を低下させることも期待される。
インドールピルビン酸は、マウス皮膚に塗布することにより、紫外線照射による経皮水分蒸散量の上昇や炎症を抑えられることが報告されている（非特許文献３）が、インドールピルビン酸またはその誘導体の使用によって、紫外線照射による皮膚炎症と発生機構が異なる、腸疾患の炎症が抑制されることは報告されていない。
また、インドールピルビン酸が大腸粘膜においてTr1細胞を誘導することやTh1細胞の分化を抑制することも報告されていない。
また、インドールピルビン酸が大腸粘膜においてTr1細胞を誘導することやTh1細胞の分化を抑制することも報告されていない。
Hommes et al., Gut, 55(8), 2006, 1131-1137
Jeon et al., PLOS PATHOGENS 8(5), 2012, e1002714
Aoki et al., PLOS ONE 9(5), 2014, e96804
本発明は、腸疾患、具体的には炎症性腸疾患を予防・治療することができるインドールピルビン酸またはその誘導体を含み、副作用が少なく、かつ、経口投与剤として利用に適した、予防剤および／または治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、インドールピルビン酸またはその誘導体として、式（Ｉ）で表される化合物およびその医薬的に許容される塩（以下、「式（Ｉ）の化合物」と称することもある）が、大腸粘膜において炎症性のIFN-γ産生性T細胞（Th1細胞）の増加を抑制し、抗炎症性のIL-10産生性T細胞（Tr1細胞）の割合を増加させることを見出し、さらに、Tr1細胞の分化誘導を促進する作用およびTh1細胞の分化誘導を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様の発明を提供するものである。
［１］ 式（Ｉ）：
［式中：Ｒ１は、各々独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキル−アミノ、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールは、置換可能な位置で、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキル−アミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−４アシル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、腸疾患の予防剤および／または治療剤。
［１］ 式（Ｉ）：
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、腸疾患の予防剤および／または治療剤。
［２］ Ｒ１が、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、［１］記載の予防剤および／または治療剤。
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、［１］記載の予防剤および／または治療剤。
［３］ Ｒ１〜Ｒ４が、各々独立して、水素またはＣ１−４アルキルである、［１］または［２］記載の予防剤および／または治療剤。
［４］ Ｒ１〜Ｒ４が全て、水素である、［１］〜［３］のいずれかに記載の予防剤および／または治療剤。
［５］ 前記腸疾患が、炎症性腸疾患である、［１］〜［４］のいずれかに記載の予防剤および／または治療剤。
［６］ 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、［５］記載の予防剤および／または治療剤。
［７］ 経口投与剤である、［１］〜［６］のいずれかに記載の予防剤および／または治療剤。
［８］ 式（Ｉ）：
［式中：Ｒ１は、各々独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキル−アミノ、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールは、置換可能な位置で、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキル−アミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−４アシル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、Ｔｒ１細胞分化誘導促進剤。
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、Ｔｒ１細胞分化誘導促進剤。
［９］ Ｒ１が、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、［８］記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、［８］記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
［１０］ Ｒ１〜Ｒ４が、各々独立して、水素またはＣ１−４アルキルである、［８］または［９］記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
［１１］ Ｒ１〜Ｒ４が全て、水素である、［８］〜［１０］のいずれかに記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
［１２］ 経口投与剤である、［８］〜［１１］のいずれかに記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
［１３］ 式（Ｉ）：
［式中：Ｒ１は、各々独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキル−アミノ、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールは、置換可能な位置で、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキル−アミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−４アシル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、Th1細胞分化誘導抑制剤。
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、Th1細胞分化誘導抑制剤。
［１４］ Ｒ１が、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、［１３］記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、［１３］記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
［１５］ Ｒ１〜Ｒ４が、各々独立して、水素またはＣ１−４アルキルである、［１３］または［１４］記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
［１６］ Ｒ１〜Ｒ４が全て、水素である、［１３］〜［１５］のいずれかに記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
［１７］ 経口投与剤である、［１３］〜［１６］のいずれかに記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
また、本発明は、
［１８］ 治療が必要な患者に、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする、炎症性腸疾患の治療方法；
［１９］ 炎症性腸疾患の治療に使用する、式（Ｉ）の化合物；
［２０］ 炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤を製造するための、式（Ｉ）の化合物の使用；
［２１］ 治療が必要な患者に、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする、Tr1細胞分化誘導を促進する方法；および
［２２］ 治療が必要な患者に、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする、Th1細胞分化誘導を抑制する方法；
を提供するものである。
［１８］ 治療が必要な患者に、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする、炎症性腸疾患の治療方法；
［１９］ 炎症性腸疾患の治療に使用する、式（Ｉ）の化合物；
［２０］ 炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤を製造するための、式（Ｉ）の化合物の使用；
［２１］ 治療が必要な患者に、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする、Tr1細胞分化誘導を促進する方法；および
［２２］ 治療が必要な患者に、治療上の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを特徴とする、Th1細胞分化誘導を抑制する方法；
を提供するものである。
また、上記［１］〜［３］に含まれる化合物またはその医薬的に許容される塩で、公知の化合物（例えば、インドールピルビン酸）を除く化合物自身も本発明の態様に含まれる。
本発明の予防剤および／または治療剤は、大腸粘膜において炎症性のIFN-γ産生性T細胞（Th1細胞）の増加を抑制すること、および抗炎症性のIL-10産生性T細胞（Tr1細胞）の割合を増加させることができる。その結果、本発明の予防剤および／または治療剤は、大腸や小腸などの腸の炎症を予防および／または軽減することができる。したがって、本発明の予防剤および／または治療剤は、腸疾患の炎症を抑制する医薬品として利用することができ、特に経口投与剤の形態に適している。
本明細書における用語について以下に説明する。
「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。中でも好ましくは、フッ素原子、塩素原子または臭素原子である。
「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。中でも好ましくは、フッ素原子、塩素原子または臭素原子である。
「アルキル」とは、所定数の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基を意味する。これらは、置換可能な位置で、所望により本発明に含まれる１以上の置換基で置換されていてもよい。好ましいアルキルはＣ１−６アルキル、Ｃ１−４アルキルが挙げられる。例えば、「Ｃ１−６アルキル」は、炭素数１から６のアルキル基を示す。アルキルの例として、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
「アルケニル」とは、１以上の炭素−炭素二重結合を含有する、所定数の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の不飽和炭化水素基を意味する。これらは、置換可能な位置で、所望により本発明に含まれる１以上の置換基で置換されていてもよい。好ましいアルケニルは、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−４アルケニルが挙げられる。例えば、「Ｃ２−６アルケニル」は、炭素数２から６のアルケニルを示す。アルケニルの例として、限定されるものではないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
「アルコキシ」とは、所定数の炭素原子を有する上記に定義のアルキル基が酸素原子を介して結合している基を意味する。これらは、アルキル部分が所望により本発明に含まれる１以上の置換基で置換されていてもよい。好ましいアルコキシは、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−４アルコキシが挙げられる。例えば、「Ｃ１−６アルコキシ」は、炭素数が１から６のアルコキシ（−Ｏ−Ｃ１−６アルキル）を示す。アルコキシの例として、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
「ハロアルキル」とは、１個以上の水素原子がハロゲン原子によって置き換えられている、所定数の炭素原子を有する上記に定義のアルキル基を意味する。例えば、「Ｃ１−６ハロアルキル」は、炭素数が１から６のハロアルキルを示す。置き換えられている水素原子の数は、１個から、最大で親アルキル基に他に存在しうる水素原子の総数の範囲まで及びうる。ハロゲン原子を複数有する場合は、同一または異なるハロゲン原子で置換されていてもよい。ハロアルキルの例として、限定されるものではないが、クロロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチルなどが挙げられる。
「ヒドロキシアルキル」とは、１個以上のヒドロキシ基によって置き換えられている、所定数の炭素原子を有する上記に定義のアルキル基を意味する。これらは、アルキル部分が所望により本発明に含まれる１以上の置換基で置換されていてもよい。好ましいヒドロキシアルキルは、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキルが挙げられる。例えば、「Ｃ１−６ヒドロキシアルキル」は、炭素数１から６のヒドロキシアルキルを示す。ヒドロキシアルキルの例として、限定されるものではないが、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチルなどが挙げられる。
「モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ」とは、１個または２個の水素原子が１〜６個の炭素原子を有する上記に定義のアルキル基によって置き換えられている、アミノ基を意味する。アルキル基によって２個置換される場合は、同一または異なるアルキル基で置換されていてもよい。モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキルアミノの例として、限定されるものではないが、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。
「アシル」とは、水素原子、上記に定義のアルキル基が結合している、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ））を意味する。好ましいアシルは、Ｃ１−４アシルが挙げられる。例えば、「Ｃ１−４アシル」とは、炭素数１から３のアルキル基が結合しているカルボニル基を示す。アシルの例として、限定されるものではないが、ホルミル、アセチル、プロパノイル、プチリル、イソブチリルなどが挙げられる。
「アリール」とは、芳香族環に結合する１個の水素原子が除外された、６個以上の炭素原子を有する単環または二環の芳香族炭化水素基を意味する。これらは、置換可能な位置で、所望により本発明に含まれる１以上の置換基で置換されていてもよい。アリールの例として、限定されるものではないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、アントラセニルなどが挙げられる。
「ヘテロアリール」とは、環炭素の少なくとも１個が窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、単環または二環の芳香族複素環基を意味する。これらは、置換可能な位置で、所望により本発明に含まれる１以上の置換基で置換されていてもよい。好ましいヘテロアリールは、３〜１０員のヘテロアリール、３〜６員のヘテロアリール、５〜６員のヘテロアリールが挙げられる。例えば、「５〜６員のヘテロアリール」は、窒素原子、硫黄原子または酸素原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、５〜６員の単環式複素環基を示す。ヘテロアリールの例として、限定されるものではないが、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアジン、インドール、プリン、キノリン、イソキノリンなどが挙げられる。
「置換されていてもよい」とは、基の置換可能な位置が置換されていない場合（無置換）と置換されている場合を含む。「無置換」とは、基の置換可能な位置が全て水素原子であることを意味する。置換されている場合は、可能であれば２つ以上の基で置換されていてもよく、その置換基は同一であっても異なっていてもよい。
「医薬的に許容される塩」とは、本発明の式（Ｉ）の化合物と医薬的に許容される酸または塩基により形成される塩を意味する。本発明の式（Ｉ）の化合物がアミノ基などの塩基性官能基を有する場合、各種の酸と塩を形成することができる。酸付加塩の例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩などの有機酸塩、およびグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などの酸性アミノ酸塩が挙げられる。
本発明の式（Ｉ）の化合物が酸性官能基を有する場合、各種の塩基と塩を形成することができる。塩基付加塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、低級アルキルアミン塩、低級アルコールアミン塩などの有機アミン塩、リジン、アルギニン、オルニチンなどとの塩基性アミノ酸塩およびアンモニウム塩が挙げられる。
本発明の式（Ｉ）の化合物が酸性官能基を有する場合、各種の塩基と塩を形成することができる。塩基付加塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、低級アルキルアミン塩、低級アルコールアミン塩などの有機アミン塩、リジン、アルギニン、オルニチンなどとの塩基性アミノ酸塩およびアンモニウム塩が挙げられる。
「治療」とは、哺乳動物、特にヒトにおける炎症性腸疾患の治癒および／または改善を意味する。例えば、（ａ）炎症性腸疾患を予防すること；および（ｂ）炎症性腸疾患を緩和および／または軽減することなども含まれる。
「患者」とは、ヒトおよび動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどを意味する。その中でも、ヒトが好ましい。
「治療上の有効量」とは、未治療対象と比べて、疾患、障害および／または副作用の改善、治癒、予防および／または軽減をもたらす量、あるいは疾患および／または障害の進行速度の遅延をもたらす量を意味する。該用語は、その範囲内に、正常な生理的機能を促進するのに有効な量も含む。
かかる有効量として、本発明の式（Ｉ）の化合物単独の量、本発明の式（Ｉ）の化合物の組み合わせの量および／または他の炎症性腸疾患の治療剤と組み合わせた本発明の式（Ｉ）の化合物の量が挙げられる。
かかる有効量として、本発明の式（Ｉ）の化合物単独の量、本発明の式（Ｉ）の化合物の組み合わせの量および／または他の炎症性腸疾患の治療剤と組み合わせた本発明の式（Ｉ）の化合物の量が挙げられる。
本発明のTr1細胞分化誘導促進剤とは、大腸粘膜において抗炎症性のIL-10産生性T細胞（Tr1細胞）の分化誘導を促進して、IL-10の産生量を増加させ、大腸の慢性的な炎症の発生を抑制するものである。
本発明のTh1細胞分化誘導抑制剤とは、大腸粘膜において炎症性のIFN-γ産生性T細胞（Th1細胞）の分化誘導を抑制して、大腸炎症に関わるIFN-γの産生量を抑制させ、大腸の慢性的な炎症の発生を抑制するものである。
Ｒ１の好ましい態様は、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよい。より好ましくは、水素またはＣ１−４アルキルであり、最も好ましくは、水素である。
Ｒ２の好ましい態様は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルである。より好ましくは、水素またはＣ１−４アルキルであり、最も好ましくは、水素である。
Ｒ３およびＲ４の好ましい態様は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである。より好ましくは、水素またはＣ１−４アルキルであり、最も好ましくは、水素である。
本発明の予防剤および／または治療剤、Tr1細胞分化誘導促進剤またはTh1細胞分化誘導抑制剤の有効成分として好ましい式（Ｉ）の化合物は、インドールピルビン酸である。
本発明の予防剤および／または治療剤、Tr1細胞分化誘導促進剤またはTh1細胞分化誘導抑制剤の有効成分である式（Ｉ）の化合物は、当該分野において公知の合成方法を用いて合成することができる。また、インドールピルビン酸については、トリプトファンから脱アミノ反応により生合成することもできる。
本発明の予防剤および／または治療剤は、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含むものであればよく、腸の炎症を予防または抑制する作用を阻害しない限り、他の成分をさらに含むものであってもよい。したがって、本発明の予防剤および／または治療剤中の式（Ｉ）の化合物の割合は特に限定されるものではない。例えば、本発明の予防剤および／または治療剤は、式（Ｉ）の化合物を０．１重量％以上、または０．５重量％以上、または１．０重量％以上含むものであってもよい。あるいは、本発明の予防剤および／または治療剤は、式（Ｉ）の化合物のみからなるものであってもよい。
本発明のTr1細胞分化誘導促進剤は、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含むものであればよく、Tr1細胞の割合を増加させる作用を阻害しない限り、他の成分をさらに含むものであってもよい。したがって、本発明のTr1細胞分化誘導促進剤中の式（Ｉ）の化合物の割合は特に限定されるものではない。例えば、本発明のTr1細胞分化誘導促進剤は、式（Ｉ）の化合物を０．１重量％以上、または０．５重量％以上、または１．０重量％以上含むものであってもよい。あるいは、本発明のTr1細胞分化誘導促進剤は、式（Ｉ）の化合物のみからなるものであってもよい。
本発明のTh1細胞分化誘導抑制剤は、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含むものであればよく、Th1細胞の増加を抑制する作用を阻害しない限り、他の成分をさらに含むものであってもよい。したがって、本発明のTh1細胞分化誘導抑制剤中の式（Ｉ）の化合物の割合は特に限定されるものではない。例えば、本発明のTh1細胞分化誘導抑制剤は、式（Ｉ）の化合物を０．１重量％以上、または０．５重量％以上、または１．０重量％以上含むものであってもよく、０．１〜７０重量％が好ましい。あるいは、本発明のＴｈ１細胞分化誘導抑制剤は、式（Ｉ）の化合物のみからなるものであってもよい。
本発明の剤形は、対象の身体状況、健康状態などに応じて適宜選択することができ、調製することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤などの経口投与剤、または注射剤、透析用剤、吸入剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏剤、点耳剤、点鼻剤、外用剤、スプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの非経口投与剤の剤形に、常法により調製されうる。
本発明の好ましい剤形は、錠剤などの経口投与剤である。
本発明の好ましい剤形は、錠剤などの経口投与剤である。
本発明の予防剤および／または治療剤、Tr1細胞分化誘導促進剤またはTh1細胞分化誘導抑制剤は、必要に応じ、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトールおよび微結晶セルロース）、崩壊剤（例えば、カルメロース、カルメロースナトリウムおよび低置換度ヒドロキシプロピルセルロース）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドンおよび結晶セルロース）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク）、溶剤（例えば、水、エタノールおよびプロピレングリコール）、緩衝剤（例えば、リン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム）、懸濁化剤（例えば、アラビアゴム、トラガントおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）、乳化剤（例えば、グリセリン脂肪酸エステルおよびソルビタン脂肪酸エステル）など１種以上の医薬的に許容される担体を含むものであってもよい。
本発明の式（Ｉ）の化合物の投与量は、投与方法、対象の年齢、疾患の程度、症状、剤形等により適宜選択されるが、例えば、一日あたり、０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇ、０．１ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、５ｍｇ〜１０ｍｇ、１０ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、５００ｍｇ〜１ｇ、１ｇ〜１．５ｇ、１．５ｇ〜２ｇ、２ｇ〜５ｇ、５ｇ〜１０ｇの用量で、経口投与されうる。１日あたりの式（Ｉ）の化合物の量を、１回〜数回に分けて投与してもよい。
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
実施例１：デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導性腸管炎症モデルにおける芳香族ピルビン酸の抗炎症作用の検討
大腸炎症の動物モデルとして、炎症性腸疾患のモデルとして広く一般に利用されているデキストラン硫酸ナトリウム誘導性腸管炎症モデルを用いて、芳香族ピルビン酸（フェニルピルビン酸、ヒドロキシフェニルピルビン酸およびインドールピルビン酸）の抗炎症作用を確認した。
大腸炎症の動物モデルとして、炎症性腸疾患のモデルとして広く一般に利用されているデキストラン硫酸ナトリウム誘導性腸管炎症モデルを用いて、芳香族ピルビン酸（フェニルピルビン酸、ヒドロキシフェニルピルビン酸およびインドールピルビン酸）の抗炎症作用を確認した。
実験手順
フェニルピルビン酸（和光純薬）、ヒドロキシフェニルピルビン酸（Sigma-Aldrich）、インドールピルビン酸（Sigma-Aldrich）を0.1％含有するMF飼料を調製し、それぞれ26日間、C57BL/6NCrlCrljマウス（日本チャールスリバー）に投与した。最初の５日間は3% DSS（36,000〜50,000 Da）（MP Biomedicals）水を、残りの21日間は水を飲ませた。0、5、12、19、26日目の下痢スコアを測定した。下痢スコアは正常便を0点、軟便を1点、下痢便を2点、水様便を3点として評価した。
フェニルピルビン酸（和光純薬）、ヒドロキシフェニルピルビン酸（Sigma-Aldrich）、インドールピルビン酸（Sigma-Aldrich）を0.1％含有するMF飼料を調製し、それぞれ26日間、C57BL/6NCrlCrljマウス（日本チャールスリバー）に投与した。最初の５日間は3% DSS（36,000〜50,000 Da）（MP Biomedicals）水を、残りの21日間は水を飲ませた。0、5、12、19、26日目の下痢スコアを測定した。下痢スコアは正常便を0点、軟便を1点、下痢便を2点、水様便を3点として評価した。
実験開始から26日目に解剖を実施し、大腸重量・長さを測定するとともに大腸を10% ホルマリンで固定し、パラフィン切片を作成した。切片はヘマトキシリン・エオシン（HE）染色後、顕微鏡で観察し、大腸の炎症の度合いを組織学的スコアにより評価した。組織学的スコアは、炎症なしを0点、低レベルの炎症を1点、中程度レベルの炎症を2点、腸管４壁の肥厚を伴う高レベルの炎症を3点、全層性の炎症性細胞の浸潤、ゴブレット細胞の消失、腸管壁の肥厚が認められる炎症を4点として評価した。
結果
インドールピルビン酸の投与により、下痢の慢性化、解剖時の大腸重量/長の増加を抑制する傾向が認められた（図１および図２）。また、DSS水給水終了の3週間後の大腸組織の炎症スコアは、インドールピルビン酸の投与により有意に低い値をとった（図３）。したがって、インドールピルビン酸は、大腸炎症を抑制する作用を有するものと認められる。
インドールピルビン酸の投与により、下痢の慢性化、解剖時の大腸重量/長の増加を抑制する傾向が認められた（図１および図２）。また、DSS水給水終了の3週間後の大腸組織の炎症スコアは、インドールピルビン酸の投与により有意に低い値をとった（図３）。したがって、インドールピルビン酸は、大腸炎症を抑制する作用を有するものと認められる。
実施例２：免疫不全マウスnaive T細胞移入モデルにおける芳香族ピルビン酸の抗炎症作用の検討
DSS大腸炎症の進展にはTh1細胞をはじめとするT細胞サブセットが深く関わっていることが明らかであり、インドールピルビン酸の炎症抑制メカニズムにはT細胞が関与している可能性がある。そこで、その効果の確認とメカニズムの解明を目的に、SCIDマウスnaive T細胞移入モデルを用いて試験を実施した。
SCIDマウスにnaive T細胞を移入することにより、慢性的な大腸炎が誘導されることが報告されている。このマウスモデルでは、Th1細胞由来のサイトカインであるIFN-γやTNF-αが炎症に関係していることが、中和抗体の投与やノックアウトマウスを用いた試験から明らかになっている。逆に、この大腸炎を抑制するT細胞としてはIL-10を産生するT細胞（Tr1細胞）が知られている。さらに、近年、炎症性腸疾患患者の大腸粘膜においてTh17細胞が増加していることが報告されるなど、Th17細胞の役割が注目されている。Th17細胞はIL-17を産生するエフェクターT細胞であり、自己免疫性の関節炎や脳脊髄炎の発症に関係することが知られている。Th17細胞の炎症性腸疾患に対する役割には炎症の誘導と抑制の両面に関係していることが報告されており、例えば、SCIDマウスnaive T細胞移入モデルにおいても、Th17細胞の生存に関わるIL-23Rを欠損するnaive T細胞の移入では炎症を誘導できないことが報告される一方で、IL-17Aを欠損するnaive T細胞の移入ではより重篤な大腸炎を誘導することが報告されている。
DSS大腸炎症の進展にはTh1細胞をはじめとするT細胞サブセットが深く関わっていることが明らかであり、インドールピルビン酸の炎症抑制メカニズムにはT細胞が関与している可能性がある。そこで、その効果の確認とメカニズムの解明を目的に、SCIDマウスnaive T細胞移入モデルを用いて試験を実施した。
SCIDマウスにnaive T細胞を移入することにより、慢性的な大腸炎が誘導されることが報告されている。このマウスモデルでは、Th1細胞由来のサイトカインであるIFN-γやTNF-αが炎症に関係していることが、中和抗体の投与やノックアウトマウスを用いた試験から明らかになっている。逆に、この大腸炎を抑制するT細胞としてはIL-10を産生するT細胞（Tr1細胞）が知られている。さらに、近年、炎症性腸疾患患者の大腸粘膜においてTh17細胞が増加していることが報告されるなど、Th17細胞の役割が注目されている。Th17細胞はIL-17を産生するエフェクターT細胞であり、自己免疫性の関節炎や脳脊髄炎の発症に関係することが知られている。Th17細胞の炎症性腸疾患に対する役割には炎症の誘導と抑制の両面に関係していることが報告されており、例えば、SCIDマウスnaive T細胞移入モデルにおいても、Th17細胞の生存に関わるIL-23Rを欠損するnaive T細胞の移入では炎症を誘導できないことが報告される一方で、IL-17Aを欠損するnaive T細胞の移入ではより重篤な大腸炎を誘導することが報告されている。
実験手順
6週齢のBALB/cマウス（日本チャールズリバー）から脾臓を摘出し、CD4+CD62L+ T cell アイソレーションキットII（Miltenyi Biotec）を用いてnaive T細胞を精製した。6週齢のSCIDマウス（日本クレア）に精製したnaive T細胞を1ｘ106細胞で腹腔に移入した。対照のSCIDマウスにはnaive T細胞の代わりにリン酸緩衝液（PBS）を腹腔に注入した。これらのマウスに、MF飼料または芳香族ピルビン酸（フェニルピルビン酸、ヒドロキシフェニルピルビン酸およびインドールピルビン酸）を0.1%含有するMF飼料を5週間投与した。毎週、体重を測定し、5週目に下痢スコアを測定後、解剖を行い、大腸を摘出した。大腸重量・長さを測定後、大腸の一部を切片用に10%ホルマリンで固定するとともに、RNA用にRNAlater（Ambion）内で保存した。パラフィン切片を作成後、HE染色を行い、組織学的スコアを評価した。RNAはRNeasy mini kit（Qiagen）により抽出し、0.5 μgをRevertra ace（東洋紡）を用いてcDNA化した。炎症および抗炎症にかかわるmRNA（IFN-γ、TNF-α、IL-12p35、IL-12p40、IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、Foxp3、Cox-2、IL-10）の発現を、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（東洋紡）を用いてSYBR Green法によるリアルタイムPCRにより解析した。リアルタイムPCRはT100 サーマルサイクラー（Bio-Rad）により行い、PCR反応条件は95℃で60秒の初期変性の後、変性（95℃、15秒）、アニーリングおよび伸長反応（60℃、30秒、40サイクル）で実施した。
それぞれのmRNA発現の解析に用いたプライマーは以下の通りである。GAPDHフォワードプライマー:TCATCAACGGGAAGCCCATCAC（配列番号：１）、GAPDHリバースプライマー:AGACTCCACGACATACTCAGCAC（配列番号：２）、IFN-γフォワードプライマー:GGATGCATTCATGAGTATTGC（配列番号：３）、IFN-γリバースプライマー:CCTTTTCCGCTTCCTGAGG（配列番号：４）、TNF-αフォワードプライマー:CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA（配列番号：５）、TNF-αリバースプライマー:TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC（配列番号：６）、IL-12p35フォワードプライマー:CCCTTGCCCTCCTAAACCAC（配列番号：７）、IL-12p35リバースプライマー:TAGTAGCCAGGCAACTCTCG（配列番号：８）、IL-12p40フォワードプライマー:GGAAGCACGGCAGCAGAATAAAT（配列番号：９）、IL-12p40リバースプライマー:AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG（配列番号：１０）、IL-17Aフォワードプライマー:TCCAGAAGGCCCTCAGACTA（配列番号：１１）、IL-17Aリバースプライマー:AGCATCTTCTCGACCCTGAA（配列番号：１２）、IL-17Fフォワードプライマー:CAAAACCAGGGCATTTCTGT（配列番号：１３）、IL-17Fリバースプライマー:ATGGTGCTGTCTTCCTGACC（配列番号：１４）、IL-1βフォワードプライマー:CCTTCCAGGATGAGGACATGA（配列番号：１５）、IL-1βリバースプライマー:TGAGTCACAGAGGATGGGCTC（配列番号：１６）、IL-6フォワードプライマー:GAGGATACCACTCCCAACAGACC（配列番号：１７）、IL-6リバースプライマー:AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA（配列番号：１８）、Foxp3フォワードプライマー:TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC（配列番号：１９）、Foxp3リバースプライマー:CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG（配列番号：２０）、Cox-2フォワードプライマー:CAGACAACATAAACTGCGCCTT（配列番号：２１）、Cox-2リバースプライマー:GATACACCTCTCCACCAATGACC（配列番号：２２）、IL-10フォワードプライマー:ATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG（配列番号：２３）、IL-10リバースプライマー:CCCAAGTAACCCTTAAAGTCCTGC（配列番号：２４）。
6週齢のBALB/cマウス（日本チャールズリバー）から脾臓を摘出し、CD4+CD62L+ T cell アイソレーションキットII（Miltenyi Biotec）を用いてnaive T細胞を精製した。6週齢のSCIDマウス（日本クレア）に精製したnaive T細胞を1ｘ106細胞で腹腔に移入した。対照のSCIDマウスにはnaive T細胞の代わりにリン酸緩衝液（PBS）を腹腔に注入した。これらのマウスに、MF飼料または芳香族ピルビン酸（フェニルピルビン酸、ヒドロキシフェニルピルビン酸およびインドールピルビン酸）を0.1%含有するMF飼料を5週間投与した。毎週、体重を測定し、5週目に下痢スコアを測定後、解剖を行い、大腸を摘出した。大腸重量・長さを測定後、大腸の一部を切片用に10%ホルマリンで固定するとともに、RNA用にRNAlater（Ambion）内で保存した。パラフィン切片を作成後、HE染色を行い、組織学的スコアを評価した。RNAはRNeasy mini kit（Qiagen）により抽出し、0.5 μgをRevertra ace（東洋紡）を用いてcDNA化した。炎症および抗炎症にかかわるmRNA（IFN-γ、TNF-α、IL-12p35、IL-12p40、IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、Foxp3、Cox-2、IL-10）の発現を、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（東洋紡）を用いてSYBR Green法によるリアルタイムPCRにより解析した。リアルタイムPCRはT100 サーマルサイクラー（Bio-Rad）により行い、PCR反応条件は95℃で60秒の初期変性の後、変性（95℃、15秒）、アニーリングおよび伸長反応（60℃、30秒、40サイクル）で実施した。
それぞれのmRNA発現の解析に用いたプライマーは以下の通りである。GAPDHフォワードプライマー:TCATCAACGGGAAGCCCATCAC（配列番号：１）、GAPDHリバースプライマー:AGACTCCACGACATACTCAGCAC（配列番号：２）、IFN-γフォワードプライマー:GGATGCATTCATGAGTATTGC（配列番号：３）、IFN-γリバースプライマー:CCTTTTCCGCTTCCTGAGG（配列番号：４）、TNF-αフォワードプライマー:CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA（配列番号：５）、TNF-αリバースプライマー:TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC（配列番号：６）、IL-12p35フォワードプライマー:CCCTTGCCCTCCTAAACCAC（配列番号：７）、IL-12p35リバースプライマー:TAGTAGCCAGGCAACTCTCG（配列番号：８）、IL-12p40フォワードプライマー:GGAAGCACGGCAGCAGAATAAAT（配列番号：９）、IL-12p40リバースプライマー:AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG（配列番号：１０）、IL-17Aフォワードプライマー:TCCAGAAGGCCCTCAGACTA（配列番号：１１）、IL-17Aリバースプライマー:AGCATCTTCTCGACCCTGAA（配列番号：１２）、IL-17Fフォワードプライマー:CAAAACCAGGGCATTTCTGT（配列番号：１３）、IL-17Fリバースプライマー:ATGGTGCTGTCTTCCTGACC（配列番号：１４）、IL-1βフォワードプライマー:CCTTCCAGGATGAGGACATGA（配列番号：１５）、IL-1βリバースプライマー:TGAGTCACAGAGGATGGGCTC（配列番号：１６）、IL-6フォワードプライマー:GAGGATACCACTCCCAACAGACC（配列番号：１７）、IL-6リバースプライマー:AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA（配列番号：１８）、Foxp3フォワードプライマー:TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC（配列番号：１９）、Foxp3リバースプライマー:CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG（配列番号：２０）、Cox-2フォワードプライマー:CAGACAACATAAACTGCGCCTT（配列番号：２１）、Cox-2リバースプライマー:GATACACCTCTCCACCAATGACC（配列番号：２２）、IL-10フォワードプライマー:ATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG（配列番号：２３）、IL-10リバースプライマー:CCCAAGTAACCCTTAAAGTCCTGC（配列番号：２４）。
さらに、一部のマウスでは大腸を摘出後、大腸粘膜固有層リンパ（LPL）の解析を行った。以下に使用した溶液の組成を示す。5% FCS-HBSS(-)：5 mM EDTA、0.04% NaHCO3、5% FCS HBSS(-)。5% FCS-HBSS(+)：0.04% NaHCO3、5% FCS HBSS(+)。10% FCS-RPMI培地：100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、10 mM HEPES、50 μM 2-メルカプトエタノール、10% FCS RPMI培地（Sigma-Aldrich）。100% percoll-HBSS(+)：percoll 900 mlに10×HBSS(+)を100 ml混合。30% percoll-HBSS(+)：100% percoll-HBSS(+)を3、5% FCS-HBSS(+)を7の割合で混合。70% percoll-HBSS(+)：100% percoll-HBSS(+)を7、5% FCS-HBSS(+)を3の割合で混合。FCMバッファー：0.05% NaN3、1% FCS PBS。
マウスより大腸を摘出後、腸管を切り開き、3〜4 cmにカットし、37℃に保温した30 mlの5% FCS-HBSS(-)を入れた50 ml チューブに小腸を入れ、37℃の恒温槽にて150 rpm、20分間振盪した。チューブを20回激しく振り、ガーゼで濾過した。この処理を計3回繰り返し、大腸から腸管上皮細胞を除去した。大腸を2 mm程度に細かく断片化し、100 μg/ml DNase I（Roche）、100 U/ml コラゲナーゼタイプI（Invitrogen）、10% FCS-RPMI培地10 mlに入れ、37℃、60分間スターラーで撹拌し、細胞を組織から分離した。ガーゼで濾過処理した後、遠心操作により細胞を回収した。30% percoll-HBSS(+)を10 ml加え懸濁し、1800 rpm、20分遠心した。上清を1 ml残して吸引し、100% percoll-HBSS(+)を4.1 ml、RPMI培地を2 ml加え、5% FCS-HBSS(+)で10 mlにメスアップした（44% percoll-HBSS(+)）。70% percoll-HBSS(+)を2 ml下へ重層し、1800 rpm、20分遠心後、界層のリンパ細胞をスポイトで回収し、大腸LPLとした。調製した大腸LPLはCD4T細胞におけるIFN-γ、IL-10、IL-17A産生細胞の割合を細胞内サイトカイン染色法により解析した。大腸LPLを10% FCS-RPMI培地に2ｘ106細胞/mlに調製し、24ウェルプレートに500 μlで播種後、cell stimulation cocktail（ebioscience）を1 μl添加し、12時間、37℃、CO2インキュベーター内で培養した。細胞をPBSで洗浄後、Fixable Viability Dye（ebioscience）で死細胞を15分間、氷上で染色した。細胞はFCMバッファーで洗浄後、10 μg/ml 抗CD16/32（BD pharMingen）で10分間処理し、抗マウスCD4 APC-eFour（登録商標） 780で20分間、氷上で染色した。FCMバッファーで洗浄後、IC Fixation Buffer（ebioscience）で、20分間室温で固定し、Permeabilization Buffer（ebioscience）で2回洗浄した。その後、抗マウスIFN-γ Alexa Fluor（登録商標）488、抗マウスIL-10 PE、抗マウスIL-17 APC（いずれもebioscience）を含むPermeabilization Bufferに細胞を懸濁し、20分間室温で細胞内のサイトカインを染色した。Permeabilization BufferとFCMバッファーで1回ずつ細胞を洗浄し、Gallios（Beckman coulter）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
マウスより大腸を摘出後、腸管を切り開き、3〜4 cmにカットし、37℃に保温した30 mlの5% FCS-HBSS(-)を入れた50 ml チューブに小腸を入れ、37℃の恒温槽にて150 rpm、20分間振盪した。チューブを20回激しく振り、ガーゼで濾過した。この処理を計3回繰り返し、大腸から腸管上皮細胞を除去した。大腸を2 mm程度に細かく断片化し、100 μg/ml DNase I（Roche）、100 U/ml コラゲナーゼタイプI（Invitrogen）、10% FCS-RPMI培地10 mlに入れ、37℃、60分間スターラーで撹拌し、細胞を組織から分離した。ガーゼで濾過処理した後、遠心操作により細胞を回収した。30% percoll-HBSS(+)を10 ml加え懸濁し、1800 rpm、20分遠心した。上清を1 ml残して吸引し、100% percoll-HBSS(+)を4.1 ml、RPMI培地を2 ml加え、5% FCS-HBSS(+)で10 mlにメスアップした（44% percoll-HBSS(+)）。70% percoll-HBSS(+)を2 ml下へ重層し、1800 rpm、20分遠心後、界層のリンパ細胞をスポイトで回収し、大腸LPLとした。調製した大腸LPLはCD4T細胞におけるIFN-γ、IL-10、IL-17A産生細胞の割合を細胞内サイトカイン染色法により解析した。大腸LPLを10% FCS-RPMI培地に2ｘ106細胞/mlに調製し、24ウェルプレートに500 μlで播種後、cell stimulation cocktail（ebioscience）を1 μl添加し、12時間、37℃、CO2インキュベーター内で培養した。細胞をPBSで洗浄後、Fixable Viability Dye（ebioscience）で死細胞を15分間、氷上で染色した。細胞はFCMバッファーで洗浄後、10 μg/ml 抗CD16/32（BD pharMingen）で10分間処理し、抗マウスCD4 APC-eFour（登録商標） 780で20分間、氷上で染色した。FCMバッファーで洗浄後、IC Fixation Buffer（ebioscience）で、20分間室温で固定し、Permeabilization Buffer（ebioscience）で2回洗浄した。その後、抗マウスIFN-γ Alexa Fluor（登録商標）488、抗マウスIL-10 PE、抗マウスIL-17 APC（いずれもebioscience）を含むPermeabilization Bufferに細胞を懸濁し、20分間室温で細胞内のサイトカインを染色した。Permeabilization BufferとFCMバッファーで1回ずつ細胞を洗浄し、Gallios（Beckman coulter）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
結果
インドールピルビン酸は、大腸の慢性炎症に伴う下痢症状を抑制し、体重の増加に寄与した（図４）。また、慢性炎症に伴う大腸重量/長の増大を抑制し（図５）、大腸組織学的スコアを抑制した（図６）。一方、フェニルピルビン酸やヒドロキシフェニルピルビン酸ではそのような効果は認められなかった。
大腸のmRNA発現においては、大腸の炎症に関わるサイトカインであり、Th1細胞系サイトカインであるIFN-γおよびTNF-α、Th17細胞系サイトカインであるIL-17AおよびIL-17F、さらに炎症性のサイトカインであるIL-12p40やIL-1βの発現はインドールピルビン酸により有意に抑制され、逆に抗炎症性サイトカインであるIL-10の発現は有意に増強された（図７）。また、インドールピルビン酸により大腸LPLの細胞数が抑えられるとともに、CD4T細胞に占めるIFN-γ+ IL-10- CD4T細胞の割合が抑えられる一方で、IFN-γ-IL-10+ CD4T細胞の割合とIL-17A+ CD4T細胞の割合が増加した（図８）。CD4T細胞における割合ではなく大腸あたりの細胞数として評価した場合は、インドールピルビン酸の投与によりIFN-γ+ IL-10- CD4T細胞が顕著に抑えられ、IL-17A+ CD4T細胞も減少していた（図８）。
したがって、インドールピルビン酸は、大腸LPLにおいて、炎症の誘導に関わるTh1細胞の増加を抑え、抗炎症性のTr1細胞の割合を増加させるものと認められる。
インドールピルビン酸は、大腸の慢性炎症に伴う下痢症状を抑制し、体重の増加に寄与した（図４）。また、慢性炎症に伴う大腸重量/長の増大を抑制し（図５）、大腸組織学的スコアを抑制した（図６）。一方、フェニルピルビン酸やヒドロキシフェニルピルビン酸ではそのような効果は認められなかった。
大腸のmRNA発現においては、大腸の炎症に関わるサイトカインであり、Th1細胞系サイトカインであるIFN-γおよびTNF-α、Th17細胞系サイトカインであるIL-17AおよびIL-17F、さらに炎症性のサイトカインであるIL-12p40やIL-1βの発現はインドールピルビン酸により有意に抑制され、逆に抗炎症性サイトカインであるIL-10の発現は有意に増強された（図７）。また、インドールピルビン酸により大腸LPLの細胞数が抑えられるとともに、CD4T細胞に占めるIFN-γ+ IL-10- CD4T細胞の割合が抑えられる一方で、IFN-γ-IL-10+ CD4T細胞の割合とIL-17A+ CD4T細胞の割合が増加した（図８）。CD4T細胞における割合ではなく大腸あたりの細胞数として評価した場合は、インドールピルビン酸の投与によりIFN-γ+ IL-10- CD4T細胞が顕著に抑えられ、IL-17A+ CD4T細胞も減少していた（図８）。
したがって、インドールピルビン酸は、大腸LPLにおいて、炎症の誘導に関わるTh1細胞の増加を抑え、抗炎症性のTr1細胞の割合を増加させるものと認められる。
実施例３：Tr1細胞分化に与えるインドールピルビン酸の効果の検討
実施例２より、インドールピルビン酸の投与により大腸LPLでIL-10+CD4T細胞の割合が増加することが明らかになったため、その機構を検討することを目的に、Tr1細胞分化に与えるインドールピルビン酸の効果を検討した。Tr1細胞はTGF-βとIL-27によりnaive T細胞より分化が誘導されることが報告されており、この分化誘導系に対するインドールピルビン酸の添加効果を解析した。
実施例２より、インドールピルビン酸の投与により大腸LPLでIL-10+CD4T細胞の割合が増加することが明らかになったため、その機構を検討することを目的に、Tr1細胞分化に与えるインドールピルビン酸の効果を検討した。Tr1細胞はTGF-βとIL-27によりnaive T細胞より分化が誘導されることが報告されており、この分化誘導系に対するインドールピルビン酸の添加効果を解析した。
実験手順
BALB/cマウス脾臓よりCD4+CD62L+ T cell アイソレーションキットIIを用いてnaive T細胞を精製した。5 μg/mlの抗マウスCD3e（ebioscience）で24ウェルプレートを37℃、2時間処理し、ウェルをコーティングした。調製したnaive T細胞（1×106 cells）を10% FCS-RPMI培地 500 μlに懸濁して、ウェルに加え、抗マウスCD28抗体（ebioscience）（終濃度2 μg/ml）で刺激した。Tr1分化誘導条件ではヒト組換えTGF-β（R&D）（終濃度2 ng/ml）、マウス組換えIL-27（R&D）（終濃度50 ng/ml）をウェルに加えた。また、インドールピルビン酸の添加では、これらに加えインドールピルビン酸を終濃度で50 μMとなるようにウェルに加えた。37℃、96時間、CO2インキュベーターで培養後、培養上清および細胞を回収した。培養上清中のIL-10濃度は、ELISAにより測定した。また、細胞は一部をトリパンブルーで染色し、生細胞数をカウントするとともに、細胞内IL-10の染色法によりIL-10産生細胞の割合を測定した。実施例２と同様に、細胞内サイトカイン染色法を行い、細胞内のサイトカインを測定する抗体は抗マウスIL-10 PEのみを用いた。
BALB/cマウス脾臓よりCD4+CD62L+ T cell アイソレーションキットIIを用いてnaive T細胞を精製した。5 μg/mlの抗マウスCD3e（ebioscience）で24ウェルプレートを37℃、2時間処理し、ウェルをコーティングした。調製したnaive T細胞（1×106 cells）を10% FCS-RPMI培地 500 μlに懸濁して、ウェルに加え、抗マウスCD28抗体（ebioscience）（終濃度2 μg/ml）で刺激した。Tr1分化誘導条件ではヒト組換えTGF-β（R&D）（終濃度2 ng/ml）、マウス組換えIL-27（R&D）（終濃度50 ng/ml）をウェルに加えた。また、インドールピルビン酸の添加では、これらに加えインドールピルビン酸を終濃度で50 μMとなるようにウェルに加えた。37℃、96時間、CO2インキュベーターで培養後、培養上清および細胞を回収した。培養上清中のIL-10濃度は、ELISAにより測定した。また、細胞は一部をトリパンブルーで染色し、生細胞数をカウントするとともに、細胞内IL-10の染色法によりIL-10産生細胞の割合を測定した。実施例２と同様に、細胞内サイトカイン染色法を行い、細胞内のサイトカインを測定する抗体は抗マウスIL-10 PEのみを用いた。
結果
Tr1細胞の分化誘導条件にインドールピルビン酸を添加することで、誘導後の生細胞数およびIL-10産生細胞の割合が増加し、培養上清中に産生されるIL-10が増加することが明らかになった（図９）。なお、TGF-β、IL-27の非存在下での、インドールピルビン酸の単独添加ではT細胞のIL-10産生を増強できなかった。したがって、インドールピルビン酸はTr1細胞への分化を促進する効果があるものと認められる。
Tr1細胞の分化誘導条件にインドールピルビン酸を添加することで、誘導後の生細胞数およびIL-10産生細胞の割合が増加し、培養上清中に産生されるIL-10が増加することが明らかになった（図９）。なお、TGF-β、IL-27の非存在下での、インドールピルビン酸の単独添加ではT細胞のIL-10産生を増強できなかった。したがって、インドールピルビン酸はTr1細胞への分化を促進する効果があるものと認められる。
実施例４：Th1細胞分化に与えるインドールピルビン酸の効果の検討
腸管膜リンパ(MLN)樹状細胞のT細胞分化誘導能に対するインドールピルビン酸の効果を検討した。樹状細胞は強い抗原提示能を有する細胞でT細胞の分化を誘導し、また、MLN樹状細胞は腸管指向性のT細胞を分化誘導することが知られている。
腸管膜リンパ(MLN)樹状細胞のT細胞分化誘導能に対するインドールピルビン酸の効果を検討した。樹状細胞は強い抗原提示能を有する細胞でT細胞の分化を誘導し、また、MLN樹状細胞は腸管指向性のT細胞を分化誘導することが知られている。
実験手順
６週齢のBALB/cマウスにMF食または0.1%IPA含有MF食を摂取させた。２週間投与後、マウスを解剖しMLNを摘出し、CD11c+アイソレーションキットII（Miltenyi biotec）を用いて樹状細胞を精製した。さらに、別のBALB/cマウス脾臓よりCD4+CD62L+ T cell アイソレーションキットIIを用いてnaive T細胞を精製した。調製した樹状細胞（1ｘ105細胞)とnaive T細胞（1ｘ105細胞）を10% FCS-RPMI培地 200 μlに懸濁して、96穴丸底プレートのウェルに加え、抗マウスCD3抗体（終濃度1 μg/ml）で刺激した。37℃、72時間、CO2インキュベーターで培養後、培養上清を回収した。培養上清中のIFN-γ、IL-17、IL-10濃度をELISAにより測定した。
６週齢のBALB/cマウスにMF食または0.1%IPA含有MF食を摂取させた。２週間投与後、マウスを解剖しMLNを摘出し、CD11c+アイソレーションキットII（Miltenyi biotec）を用いて樹状細胞を精製した。さらに、別のBALB/cマウス脾臓よりCD4+CD62L+ T cell アイソレーションキットIIを用いてnaive T細胞を精製した。調製した樹状細胞（1ｘ105細胞)とnaive T細胞（1ｘ105細胞）を10% FCS-RPMI培地 200 μlに懸濁して、96穴丸底プレートのウェルに加え、抗マウスCD3抗体（終濃度1 μg/ml）で刺激した。37℃、72時間、CO2インキュベーターで培養後、培養上清を回収した。培養上清中のIFN-γ、IL-17、IL-10濃度をELISAにより測定した。
結果
MLN樹状細胞によるT細胞の分化誘導によりサイトカインの産生が誘導された。インドールピルビン酸を投与したマウス由来のMLN樹状細胞を用いた場合には、IFN-γの産生量が有意に抑制された（図１０）。
したがって、インドールピルビン酸は、MLNでのTh1細胞分化を抑制する効果があるものと認められる。
MLN樹状細胞によるT細胞の分化誘導によりサイトカインの産生が誘導された。インドールピルビン酸を投与したマウス由来のMLN樹状細胞を用いた場合には、IFN-γの産生量が有意に抑制された（図１０）。
したがって、インドールピルビン酸は、MLNでのTh1細胞分化を抑制する効果があるものと認められる。
本発明の予防剤および／または治療剤は、大腸粘膜において炎症性のIFN-γ産生性T細胞（Th1細胞）の増加を抑制すること、および抗炎症性のIL-10産生性T細胞（Tr1細胞）の割合を増加させることができる。その結果、本発明の予防剤および／または治療剤は、大腸や小腸などの腸の炎症を予防および／または軽減することができる。したがって、本発明の予防剤および／または治療剤は、腸疾患の炎症を抑制する医薬品として利用することができ、特に経口投与剤の形態に適している。
Claims (16)
- 式（Ｉ）：
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、炎症性腸疾患（腸炎ビブリオによる腸疾患を除く）の予防剤および／または治療剤。 - Ｒ１が、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、請求項１記載の予防剤および／または治療剤。 - Ｒ１〜Ｒ４が、各々独立して、水素またはＣ１−４アルキルである、請求項１または２記載の予防剤および／または治療剤。
- Ｒ１〜Ｒ４が全て、水素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予防剤および／または治療剤。
- 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の予防剤および／または治療剤。
- 経口投与剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の予防剤および／または治療剤。
- 式（Ｉ）：
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、Tr1細胞分化誘導促進剤。 - Ｒ１が、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、請求項７記載のTr1細胞分化誘導促進剤。 - Ｒ１〜Ｒ４が、各々独立して、水素またはＣ１−４アルキルである、請求項７または８記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
- Ｒ１〜Ｒ４が全て、水素である、請求項７〜９のいずれか一項に記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
- 経口投与剤である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のTr1細胞分化誘導促進剤。
- 式（Ｉ）：
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；および
ｎは、１〜５である］
で表される化合物またはその医薬的に許容される塩を有効成分として含む、Th1細胞分化誘導抑制剤。 - Ｒ１が、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシは、置換可能な位置で、ハロゲンおよびヒドロキシからなる群から選択される１つまたは同一もしくは異なる２つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ１−６ヒドロキシアルキルであり；
Ｒ３が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルであり；および
Ｒ４が、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルである、請求項１２記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。 - Ｒ１〜Ｒ４が、各々独立して、水素またはＣ１−４アルキルである、請求項１２または１３記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
- Ｒ１〜Ｒ４が全て、水素である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
- 経口投与剤である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のTh1細胞分化誘導抑制剤。
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| IT1224546B (it) * | 1988-09-29 | 1990-10-04 | Polifarma Spa | Utilizzatore farmaceutica di acido 3 -indolpiruvico come agente inibitore di patologie degenerative |
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