JP6531164B2 - 神経障害およびｃｎｓ障害の処置におけるデンドリマー組成物および使用 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，６７５号および２０１４年８月１３日に出願された同第６２／０３６，８３９号（これらは、参考として援用される）への優先権を主張する。

脳および中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達は、とりわけＣＮＳ内の特定の細胞への標的化送達が望ましい場合、困難である。薬物および送達ビヒクルは、血液脳関門（ＢＢＢ）を克服し、脳組織内に移動し、標的細胞に局在化しなければならない。神経疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、脳腫瘍、および大部分の神経遺伝障害を有する患者は、重度の消耗性症状を患い、治癒的処置をもたらす治療選択肢が欠如している。脳への全身送達に対する主要な障壁である血液脳関門（ＢＢＢ）を操作または迂回するために、様々な戦略が開発されている［Ｊａｉｎ、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｌｏｎｄ）、２０１２年、７巻（８号）：１２２５〜３３頁；Ｗｏｈｌｆａｒｔら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１２年、１６１巻（２号）：２６４〜２７３頁］。これらの手法には、ＣＮＳへの局所投与［Ｐａｔｅｌら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１２年、６４巻（７号）：７０１〜７０５頁］および集束超音波によるＢＢＢの可逆的破壊［Ｍａｒｑｕｅｔら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．、２０１１年；６巻（７号）：ｅ２２５９８頁；Ｄｏｗｎｓら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．、２０１５年５月６日；１０巻（５号）：ｅ０１２５９１１頁］または化学試薬［Ｋｒｏｌｌら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、１９９８年、４２巻（５号）：１０８３〜１０９９頁；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ、１０９９〜１００頁。］が含まれる。しかしながら、一たびＢＢＢを越えると、脳細胞間に存在する異方性で静電的に荷電した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が、別の決定的な障壁として広く認識されている［Ｔｈｏｒｎｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２００６年４月４日；１０３巻（１４号）：５５６７〜７２頁；Ｎａｎｃｅら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Ｓｙｋｏｖａら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜１３４０頁；Ｚａｍｅｃｎｉｋ， Ｊ．、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、２００５年、１１０巻（５号）：４３５〜４４２頁］。この「脳組織障壁」は、投与方法にかかわらず、脳内の高分子およびナノ粒子の広範な分布を妨げ、それによって神経疾患の散在する標的領域全体にわたるそれらの網羅を限定する［Ｖｏｇｅｓ， Ｊ．ら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、２００３年、５４巻（４号）：４７９〜４８７頁；Ｎａｎｃｅ， Ｅ．Ａ．ら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Ｓｙｋｏｖａら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜３４０頁；ＭａｃＫａｙら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２００５年、１０３５巻（２号）：１３９〜１５３頁］。ＥＣＭは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、リンクタンパク質およびテネイシンに富み、カチオン性ポリマー担体の貫通に対して負に荷電した接着性障壁を与えうる［Ｓｙｋｏｖａら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜１３４０頁；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００８年、１３０巻（４号）：６３５〜６５３頁］。さらに、ＥＣＭの孔径は、ＣＮＳ内のナノ粒子の移動に立体障壁を設け、非接着性の１１４ｎｍの粒子は、脳組織内に貫通することができるが、２００ｎｍの粒子はできない［Ｎａｎｃｅ， Ｅ．Ａ．ら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Ｋｅｎｎｙ， Ｇ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３年、３４巻（３６号）：９１９０〜９２００頁。親水性の中性に荷電したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で極めて良好に被覆された１００ｎｍ未満のナノ粒子は、脳ＥＣＭ中に急速に拡散して、治療薬の広範な分布を可能にすることが示されている［Ｎａｎｃｅら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ．、２０１４年１０月２８日；８巻（１０号）：１０６５５〜６４頁、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ５０４２１０ｇ、Ｅｐｕｂ ２０１４年１０月８日；Ｎａｎｃｅ， Ｅ．Ａ．ら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁］。

ＣＮＳ疾患の自然歴を変更または逆転させうる特定の遺伝子標的に関する知識の蓄積により、遺伝子療法は、魅力的な治療戦略となっている［Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ， Ａ．Ｍ．ら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁；Ｌｅｎｔｚら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ、２０１２年、４８巻（２号）：１７９〜１８８頁。］。複数の前臨床および臨床研究は、先進的なウイルスまたは非ウイルス遺伝子ベクターを使用して、ＣＮＳへの核酸の送達を改善することを目的としており、脳組織全体にわたる導入遺伝子発現のレベルおよび分布を向上させることに特に焦点を合わせている［Ｏ’Ｍａｈｏｎｙら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁。；Ｐｅｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ、２０１２年、３１巻（４号）：６９７〜７１０頁］。

ウイルス遺伝子ベクターは、比較的効率的であるが、低いパッケージング容量、スケールアップの技術的困難、高い生産コスト［Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２００３年、４巻（５号）：３４６〜３５８頁。］および突然変異誘発のリスク［ＯｌｓｅｎおよびＳｔｅｉｎ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２００４年、３５０巻（２１号）：２１６７〜２１７９頁。］を含む、１つまたは複数の欠点によって限定されている。さらに、ＣＮＳの免疫特権性にもかかわらず、反復投与または事前曝露に続発して、中和免疫応答が起こりうる［Ｌｅｎｔｚら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ、２０１２年、４８巻（２号）：１７９〜１８８頁；Ｘｉａｏ， Ｘ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、１９９６年、７０巻（１１号）：８０９８〜８１０８頁；Ｃｈｉｒｍｕｌｅ， Ｎ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２０００年、７４巻（５号）：２４２０〜２４２５頁；Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００７年、７巻（５号）：３４７〜６０頁；Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ｐ．Ｒ．ら、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００７年、４巻（４号）：７１５〜７２４頁；Ｖｏｇｅｓ， Ｊ．ら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、２００３年、５４巻（４号）：４７９〜４８７頁。］。

非ウイルス遺伝子ベクターは、これらの限定の多くが存在しない、遺伝子送達のための魅力的な代替戦略を提供しうる［Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ， Ａ．Ｍ．ら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁］。カチオン性ポリマーベースの遺伝子ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ凝縮および効率的な遺伝子移入のための調整可能なプラットフォームを提供する。それらの正電荷密度は、負に荷電した核酸の安定なコンパクションを可能にし［Ｓｕｎ， Ｘ．およびＮ． Ｚｈａｎｇ、Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２０１０年、１０巻（２号）：１０８〜１２５頁；Ｄｕｎｌａｐ， Ｄ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１９９７年、２５巻（１５号）：３０９５〜３１０１頁］、それらを酵素分解から保護する［Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ， Ｊ．Ｆ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０００年、１１巻（１０号）：１３８５〜１３９５頁。］。また、プロトン化可能なアミンの数は、「プロトンスポンジ効果（ｐｒｏｔｏｎ ｓｐｏｎｇｅ ｅｆｆｅｃｔ）」によってエンドソーム逸脱を促進する緩衝能の増加を提供して、効率的なトランスフェクションにつながる［Ａｋｉｎｃ， Ａ．ら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、２００５年、７巻（５号）：６５７〜６６３頁］。多種多様なカチオン性ポリマーがこの目的のために開発され、多様な物理化学的プロファイルおよびｉｎ ｖｉｖｏ挙動を有する遺伝子ベクターが提供されている［Ｍｉｎｔｚｅｒ， Ｍ．Ａ．およびＥ．Ｅ． Ｓｉｍａｎｅｋ．、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ、２００９年、１０９巻（２号）：２５９〜３０２頁；Ｐａｔｈａｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ、２００９年、４巻（１１号）：１５５９〜７２頁。］。しかしながら、非ウイルス遺伝子ベクターはなお、脳内の標的細胞に到達する前にいくつかの障壁に直面する［Ｏ’Ｍａｈｏｎｙら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁］。

対流強化送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）は、頭蓋内投与中に圧力勾配を提供することによって、治療薬の分布をさらに向上させるために適用されうる［Ａｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９年、３０巻（１２号）：２３０２〜２３１８頁。］。しかしながら、ＣＥＤは、接着性相互作用および／または立体妨害に起因して粒子が脳実質内で捕捉されたままである場合、顕著な利益を提供しない可能性が高い。脳実質内の制約のない拡散を可能にする粒子の物理化学的特性は、ＣＥＤに従って粒子貫通の向上を達成するために依然として肝要である［Ａｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９年、３０巻（１２号）：２３０２〜１８頁；Ｋｅｎｎｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３年、３４巻（３６号）：９１９０〜９２００頁］。ＣＥＤに従っても、正に荷電した粒子と負に荷電したＥＣＭとの間の相互作用により、カチオン性ナノ粒子が注射点および血管周囲腔に閉じ込められ、脳実質へのそれらの貫通が限定される［ＭａｃＫａｙら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２００５年、１０３５巻（２号）：１３９〜１５３頁；Ｋｅｎｎｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３年、３４巻（３６号）：９１９０〜９２００頁；Ｗｒｉｔｅｒら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１２年、１６２巻（２号）：３４０〜８頁。］。

血液脳関門を克服し、脳実質内に拡散することに加えて、重大な課題は、脳内の疾患プロセスに関与する特定の細胞、例えば免疫プロセスに関与するミクログリアおよび星状膠細胞を標的化することである。これは、広汎性神経炎症が重大な因子であり、かつＣＮＳ内のいくつかの領域が関与しうるいくつかの神経炎症性障害、神経発達障害および神経変性障害において、とりわけ肝要となる［Ｋａｎｎａｎ Ｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１２年、１８：４（１３０：１３０ｆｓ８）］。

要約すれば、脳への薬物および遺伝子の送達は、ＢＢＢ、脳微小環境、および神経炎症の広汎性に起因して、困難である。したがって、結果として、多くの神経障害、とりわけ神経発達障害は、治療選択肢が限定され、技術開発が限定されている。

レット症候群（ＲＴＴ）は、消耗性神経発達障害の一例である。ＲＴＴは、初めは正常に見える小児において、発達を遅らせ、続いて機能を突然退行させることによって女児に影響を及ぼす。これらの小児は、手の意図的動作の喪失、手揉み（ｈａｎｄ ｗｒｉｎｇｉｎｇ）の増加、呼吸困難、脳の成長の減少、歩行／這行不能、発語不能、知的能力障害および痙攣発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）を有する。ＲＴＴを有する患者は、自閉症において見られるいくつかの特色を示し、自閉症の重症型とみなされる場合がある。脳の炎症は、ＲＴＴおよび自閉症を有する小児における病因および症状の悪化において重大な役割を果たす。これらの障害に利用可能な治癒法は存在しない。

ＲＴＴにおいて、血液脳関門もしくは脳微小環境が処置に対する最大の障壁であるか、または大部分の神経疾患の場合のように、両方の組合せであるかは公知でない。現在の療法には、抗痙攣剤による薬物療法および運動能力障害に対する作業療法が含まれる。炎症を減弱させる標的化療法は、レットおよび自閉症スペクトラム障害の両方において影響をもたらしうる。神経炎症に関与する細胞を抑制する全身投与療法が脳に到達できれば、有効性の改善、副作用およびコストの低減において大きな意義を有しうる。

Ｊａｉｎ、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｌｏｎｄ）、２０１２年、７巻（８号）：１２２５〜３３頁 Ｗｏｈｌｆａｒｔら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１２年、１６１巻（２号）：２６４〜２７３頁

したがって、本発明の一目的は、改善された送達、例えば傷害細胞の特異的標的化、ならびに脳およびＣＮＳ内のこれらの細胞における複数の経路の同時標的化を提供することである。

本発明のさらなる目的は、脳および中枢神経系の神経障害、神経発達障害、および神経変性障害、とりわけ自閉症およびＲＴＴを処置する手段を提供することである。

治療薬剤、予防薬剤および／または診断薬剤を送達するデンドリマーを含む医薬組成物は、全身投与されて、脳および中枢神経系内の標的細胞に到達しうる。好ましい実施形態では、デンドリマー組成物は、脳およびＣＮＳの神経障害、神経発達障害、および神経変性障害、例えば自閉症スペクトラム障害およびＲＴＴを処置するために使用される。ＲＴＴマウスモデルを使用して実証されるように、抗炎症薬剤のデンドリマーへのコンジュゲーションは、無処置または遊離薬物処置と比較して、移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）、歩行、足揉み（ｐａｗ ｗｒｉｎｇｉｎｇ）、足の握りしめ（ｐａｗ ｃｌｅｎｃｈｉｎｇ）、振戦および呼吸パターンの有意な改善をもたらす。デンドリマーコンジュゲートは、薬物単独よりも有意に良好に、無処置動物と比較して、死亡率および運動／行動機能を改善する。本明細書に記載された表面属性を有するデンドリマーは、多くの現在の「脳組織障壁」に関連した課題を克服する。

好ましい実施形態では、デンドリマーは、少なくとも１つの治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤に共有結合的に連結している、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーを含む、デンドリマーナノ粒子の形態である。ＲＴＴまたは自閉症スペクトラム障害を処置するための特に好ましい実施形態では、デンドリマーナノ粒子は、被験体のレット症候群または自閉症スペクトラム障害の１つまたは複数の症状を処置するのに有効な量の、生物学的に活性な薬剤に共有結合的に連結している、１つまたは複数の、エチレンジアミンコアのＰＡＭＡＭヒドロキシル末端世代４〜１０の（≧Ｇ４−ＯＨ）デンドリマーを含む。興奮毒性障害もまた、同じ組成物を使用して処置されうる。

結果は、世代４のデンドリマーと比較して、世代６のデンドリマーで、損傷または疾患脳による取込みの有意な向上が観察されることを実証する。実施例に記載するように、世代６のデンドリマーは、脳傷害の大型動物モデルにおいて非常に望ましい脳脊髄液（ＣＳＦ）対血清レベルを有することが示され、これらの組成物が、ＣＮＳ薬物を傷害脳に選択的に送達するのに優れていることが示される。臨床的に関連する大型動物モデル（多くの態様でヒトに類似する）における肯定的結果は、知見の重要性を強調する。これは、診断および処置のための手段を提供する。デンドリマーの別の利益は、同じデンドリマーを使用して、２つまたはそれ超の異なる薬剤を送達できることである。これは、２つの異なる治療薬剤であってもよく、治療薬剤と、１つまたは複数の診断薬剤または予防薬剤との組合せであってもよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
脳の神経障害、神経変性障害、または神経発達障害を処置するための方法であって、前記障害を処置または診断するための治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤にコンジュゲートしているかまたはこれらと複合体形成しているデンドリマーを含む薬学的に許容される組成物を、被験体に全身投与することを含む、方法。
（項目２）
前記デンドリマーが、少なくとも１つの治療薬剤に共有結合的に連結している、世代４〜１０のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマーである、項目１に記載の方法。
（項目４）
治療薬剤にコンジュゲートしているかまたは治療薬剤と複合体形成している前記デンドリマーが、前記被験体のレット症候群および／または自閉症スペクトラム障害の１つまたは複数の症状を軽減するのに有効な量の単位投薬量にある、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
治療薬剤にコンジュゲートしている前記デンドリマーが、興奮毒性障害の１つまたは複数の症状を軽減するのに有効な量の単位投薬量にある、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記治療薬剤が、抗炎症薬剤または免疫抑制薬剤である、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記治療薬剤が、ステロイド系抗炎症薬剤、非ステロイド系抗炎症薬剤、および金化合物抗炎症薬剤からなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記治療薬剤が、抗興奮毒性薬剤である、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記治療薬剤が、バルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート、Ｄ−アミノホスホノヘプタノエート、グルタミン酸形成／放出の阻害剤、バクロフェン、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、１−メチルトリプトファン、バルプロ酸、２−（３− グルタミン酸−カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＧＣＰ−ＩＩ）、例えばメルカプトプロピル）ペンタン二酸（２−ＭＰＰＡ）、２−（ホスホノメチル）ペンタン二酸（２−ＰＭＰＡ）、およびグルタミナーゼ阻害剤、例えばＮ−（５−｛２−［２−（５−アミノ−［１，３，４］−チアジアゾール−２−イル）−エチルスルファニル］−エチル｝−［１，３，４］チアジアゾール−２−イル）−２−フェニルアセトアミド、（ビス−２−［（１，２，４−チアジアゾール−２−イル）−５−フェニルアセトアミド］エチルスルフィド）、ラニビズマブ、ミノサイクリン、ならびにラパマイシンからなる群より選択される抗興奮毒性薬剤である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記デンドリマーが、第１の治療薬剤と、治療薬剤、予防薬剤、および診断薬剤からなる群より選択される第２の薬剤とにコンジュゲートしている、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記デンドリマーが、２つの治療薬剤にコンジュゲートしている、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記デンドリマーが、抗炎症薬剤および抗興奮毒性薬剤にコンジュゲートしている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
デンドリマー複合体が、ミクログリアおよび星状膠細胞に局在化し、これらを標的化するための治療的に活性な薬剤を含む、項目１から１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
デンドリマー−治療薬剤が、ＲＴＴを有する個体に投与される、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
デンドリマーコンジュゲートまたは複合体が、懸濁物、乳濁液、または溶液中で製剤化される、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
デンドリマー組成物が、自閉症スペクトラム障害を有する個体に投与される、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
デンドリマー組成物が、ＲＴＴを有する個体に投与される、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
デンドリマー組成物が、興奮毒性障害を有する個体に投与される、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記組成物が、１日おき、３日毎、４日毎、毎週、隔週、毎月、および隔月からなる群より選択される期間で、前記被験体に投与される、項目１から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
デンドリマー−診断薬剤コンジュゲートを投与することと、次いで、脳内の前記コンジュゲートの場所を検出することとを含む、脳傷害の存在、場所または程度を評価するための、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
脳脊髄液および血清中のレベルを決定することと、比を評価することとを含む、項目１から２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
項目１から１３のいずれかに記載の方法における使用のための、デンドリマー組成物。
（項目２３）
器官組織と比較して、脳脊髄液または脳中で高い濃度を有する、項目２１に記載のデンドリマー組成物。

図１Ａは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおけるＮＡＣおよびＤ−ＮＡＣ療法後のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。ＭｅＣＰ２欠損仔マウスにおける週２回のＮＡＣまたはＤ−ＮＡＣ療法後に、生存を評価した。Ｄ−ＮＡＣは、非処置動物（ＰＢＳ）と比較して、生存を改善しない。Ｄ−ＮＡＣは、ＮＡＣの安全性を改善する。Ｄ−ＮＡＣおよびＰＢＳで処置したＭｅＣＰ２欠損仔マウスは、ＮＡＣで処置した仔マウスと比較して、有意に良好な５０％生存を有しており（ｐ＝０．０１４）、遊離製剤として与えられた場合のＮＡＣの潜在的毒性が示される。図１Ｂは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおけるＤ−ＮＡＣ療法後の神経行動学的転帰の線グラフである。ＭｅＣＰ２欠損マウスを、３週齢（ＰＮＤ２１）で始めて、食塩水（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇのＮＡＣ、または１０ｍｇ／ｋｇ（ＮＡＣベース）のＤ−ＮＡＣで処置した。仔マウスを週２回処置した。行動試験を、ベースラインを決定するためにＰＮＤ１０およびＰＮＤ１で実施し、ＰＮＤ２１で始める各処置日の処置前に実施した。同腹のＷＴ仔マウスを、体重および行動の両方の対照として使用した。Ｄ−ＮＡＣ療法は、ＮＡＣおよびＰＢＳ処置と比較して、行動的転帰を有意に改善した。Ｄ−ＮＡＣは、非処置仔マウスと比較して、ＭｅＣＰ２欠損マウスの全体的な外観を改善した。非処置仔マウスは、痩せ衰え、複数の握りしめた足、猫背姿勢、および眼状態不良を有していた。 図２Ａ〜２Ｆは、ＷＴ（白抜きバー）およびＭｅＣＰ２欠損（斜線バー）マウスにおける炎症促進性および抗炎症性ｍＲＮＡ発現レベルの発現のグラフである。図２Ａ、ＴＮＦ−α；図２Ｂ、ＩＬ−６；図２Ｃ、ＩＬ−Ｉβ；図２Ｄ、ＴＧＦ−β；図２Ｅ、ＩＬ−１０；および図２Ｆ、ＩＬ−４。 図２Ａ〜２Ｆは、ＷＴ（白抜きバー）およびＭｅＣＰ２欠損（斜線バー）マウスにおける炎症促進性および抗炎症性ｍＲＮＡ発現レベルの発現のグラフである。図２Ａ、ＴＮＦ−α；図２Ｂ、ＩＬ−６；図２Ｃ、ＩＬ−Ｉβ；図２Ｄ、ＴＧＦ−β；図２Ｅ、ＩＬ−１０；および図２Ｆ、ＩＬ−４。 図２Ａ〜２Ｆは、ＷＴ（白抜きバー）およびＭｅＣＰ２欠損（斜線バー）マウスにおける炎症促進性および抗炎症性ｍＲＮＡ発現レベルの発現のグラフである。図２Ａ、ＴＮＦ−α；図２Ｂ、ＩＬ−６；図２Ｃ、ＩＬ−Ｉβ；図２Ｄ、ＴＧＦ−β；図２Ｅ、ＩＬ−１０；および図２Ｆ、ＩＬ−４。 図３Ａ〜３Ｃは、ＷＴならびに症状前（ｐｒｅ−ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）および症候性のＭｅＣＰ２欠損マウスの脳における炎症プロファイルのグラフである。炎症促進性および抗炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルを、ＷＴ（白抜き）およびＭｅＣＰ２欠損（斜線）仔マウスの脳において、１、２、３、５、および７週齢で測定した。２ΔΔＣＴ中央値が提示され、エラーバーは上下四分位範囲によって表される。（図３Ａ）経時的な炎症プロファイルの変化を、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βを含む複合炎症促進スコアの、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、およびＩＬ−４を含む複合抗炎症スコアに対する比として提示する。複合スコアは、各週齢で、所与の遺伝子型におけるその週齢の全ての仔マウスについて、全ての炎症促進２ΔΔＣＴ値または全ての抗炎症２ΔΔＣＴ値の中央値を取ることによって生成した。（図３Ｂ）ＭｅＣＰ２欠損マウスにおける炎症促進プロファイルは、２週および７週で、炎症促進マーカーの増加傾向を示す。しかしながら、抗炎症性ｍＲＮＡ発現（図３Ｃ）は、２週、５週、および７週齢で、同齢および同腹のＷＴマウスと比較して、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおいて有意な減少を示す。これは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおける神経炎症プロセスが、炎症促進性発現の増加傾向ではなく、抗炎症性発現の有意な減少によって引き起こされることを示唆する。 図３Ａ〜３Ｃは、ＷＴならびに症状前および症候性のＭｅＣＰ２欠損マウスの脳における炎症プロファイルのグラフである。炎症促進性および抗炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルを、ＷＴ（白抜き）およびＭｅＣＰ２欠損（斜線）仔マウスの脳において、１、２、３、５、および７週齢で測定した。２ΔΔＣＴ中央値が提示され、エラーバーは上下四分位範囲によって表される。（図３Ａ）経時的な炎症プロファイルの変化を、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βを含む複合炎症促進スコアの、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、およびＩＬ−４を含む複合抗炎症スコアに対する比として提示する。複合スコアは、各週齢で、所与の遺伝子型におけるその週齢の全ての仔マウスについて、全ての炎症促進２ΔΔＣＴ値または全ての抗炎症２ΔΔＣＴ値の中央値を取ることによって生成した。（図３Ｂ）ＭｅＣＰ２欠損マウスにおける炎症促進プロファイルは、２週および７週で、炎症促進マーカーの増加傾向を示す。しかしながら、抗炎症性ｍＲＮＡ発現（図３Ｃ）は、２週、５週、および７週齢で、同齢および同腹のＷＴマウスと比較して、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおいて有意な減少を示す。これは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおける神経炎症プロセスが、炎症促進性発現の増加傾向ではなく、抗炎症性発現の有意な減少によって引き起こされることを示唆する。 図４は、複合行動スコアに基づく脳傷害の重症度の関数としての、脳内のＤ−Ｃｙ５量（μｇ／ｇ）のグラフである。この取込みと傷害の重症度との相関関係の実証は、傷害の程度を診断するための手段を提供する。 図５は、時間単位の経時的な脳脊髄液中のＤ−Ｃｙ５濃度／血清中のＤ−Ｃｙ５濃度のグラフである。 図６は、海馬、皮質および小脳内のデンドリマー蓄積（μｇ／ｇ）のグラフである。 図７は、様々な器官および脳内のデンドリマー蓄積（μｇ／ｇ）のグラフである。

Ｉ．定義
用語「治療薬剤」は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を防止または処置するために投与することのできる薬剤を指す。例としては、以下に限定されないが、核酸、核酸類似体、小分子、ペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、タンパク質、ペプチド、炭水化物、もしくは糖、脂質、もしくは界面活性剤、またはそれらの組合せが挙げられる。

用語「処置すること」は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状を防止または軽減することを指す。疾患または状態を処置することは、このような薬剤が痛みの原因を処置しなくても鎮痛薬剤の投与によって被験体の痛みを処置することなど、根底にある病態生理が影響を受けないとしても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善することを含む。

「薬学的に許容される」という語句は、健全な医療上の判断の範囲内で、合理的な利益／リスクの比に見合う過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、人間および動物の組織に接触させる際の使用に適した、組成物、ポリマー、および他の材料ならびに／または剤形を指す。「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または一器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の一部までの任意の対象組成物の運搬もしくは輸送に関与する被包材料を指す。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性があり、かつ患者に害にならないという意味で、「許容される」でなければならない。

「治療有効量」という語句は、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスクの比で、いくらかの所望の効果をもたらす治療薬剤の量を指す。有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の標的化構築物、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの要因に応じて、様々であることがある。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定してもよい。

ＩＩ．製剤
Ａ．デンドリマー
本明細書に使用されるときの用語「デンドリマー」としては、以下に限定されないが、内部コアと、この起点コアに規則的に付着している繰り返し単位の内部層（または「世代」）と、最も外側の世代に付着している末端基の外部表面とを有する、分子構造物が挙げられる。デンドリマーの例としては、以下に限定されないが、ＰＡＭＡＭ、ポリエステル、ポリリジン、およびＰＰＩが挙げられる。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カルボキシル、アミン、およびヒドロキシル末端を有することができ、任意の世代のデンドリマーとすることができるが、そのようなものとしては、以下に限定されないが、世代１のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代２のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代３のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代４のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代５のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代７のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代８のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代９のＰＡＭＡＭデンドリマー、または世代１０のＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。ともに使用するのに適したデンドリマーとしては、以下に限定されないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、および／または芳香族ポリエーテルのデンドリマーが挙げられる。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様のまたは異なる化学的性質を有していてもよい（例えば、第１のデンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを含んでもよく、一方で、第２のデンドリマーは、ＰＯＰＡＭデンドリマーを含んでもよい）。一部の実施形態では、第１または第２のデンドリマーは、追加の薬剤をさらに含んでいてもよい。多重腕のＰＥＧポリマーとしては、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を保有する少なくとも２つの分枝を有するポリエチレングリコールが挙げられる。しかし、本明細書に開示される実施形態は、このクラスに限定されず、他の末端基、例えばスクシンイミジルまたはマレイミド末端などを保有するＰＥＧポリマーを、使用することができる。分子量１０ｋＤａから８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。

デンドリマー複合体は、多種のデンドリマーを含む。例えば、本デンドリマー複合体は、第３のデンドリマーを含むことができる。ここで、第３のデンドリマーは、少なくとも１つの他のデンドリマーと複合体形成している。さらに、第３の薬剤は、第３のデンドリマーと複合体形成することができる。別の実施形態では、第１および第２のデンドリマーは、それぞれ第３のデンドリマーと複合体形成し、ここで、第１および第２のデンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーであり、第３のデンドリマーは、ＰＯＰＡＭデンドリマーである。本発明の趣旨を逸脱することなく、追加のデンドリマーを組み入れることができる。多種のデンドリマーを利用する際には、多種の薬剤も組み入れることができる。これは、互いに複合体形成するデンドリマーの数によって限定されない。

本明細書に使用されるとき、用語「ＰＡＭＡＭデンドリマー」は、ポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味し、それは、アミドアミン基本要素を含む異なるコアを含有することがある。それらを作製するための方法は、当業者によって公知であり、概して、中心の起点コアの周りにある樹状のβ−アラニン単位の同心の殻（世代）を生成する、２ステップの反復する反応シークエンスを含む。このＰＡＭＡＭコア殻構造物は、追加される殻（世代）の関数として、線状に直径を成長させる。その間に、表面基が、樹状−分枝形成の数学に従って、各世代で指数関数的に増幅する。それらは、５種の異なるコアタイプと１０個の表面官能基を有する世代Ｇ０〜１０で利用可能である。デンドリマー分枝型ポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリグリセロール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリリジン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチドのデンドリマーからなっていてもよい。

一部の実施形態に従って、使用されるＰＡＭＡＭデンドリマーは、世代４のデンドリマーまたはそれを超えるものとすることができ、それらは、その表面官能基に付着したヒドロキシル基を有する。多重腕のＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を保有する２つまたはそれを超える分枝を有する、ポリエチレングリコールを含む。しかし、実施形態は、このクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端など、他の末端基を保有するＰＥＧポリマーを使用することができる。分子量１０ｋＤａから８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。

一部の実施形態では、本デンドリマーは、ナノ粒子の形態であり、国際特許公報ＷＯ２００９／０４６４４６に詳細に記載されている。

ＰＡＭＡＭ−ＮＡＣの調製
下記は、リンカーとしてＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用して、Ｎ−アセチルシステインをアミン末端第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＰＡＭＡＭ−ＮＨ_２）にコンジュゲートするための合成スキームである。

Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の合成は、２ステップの手順、スキーム１によって実施される。最初に、３−メルカプトプロピオン酸を２，２’−ジピリジルジスルフィドとチオール−ジスルフィド交換によって反応させて、２−カルボキシエチル２−ピリジルジスルフィドを得る。アミン末端デンドリマーのＳＰＤＰへの連結を促進するために、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４−ジメチルアミノピリジンを使用することによるＮ−ヒドロキシスクシンイミドでのエステル化によって、スクシンイミド基を２−カルボキシエチル２−ピリジルジスルフィドと反応させて、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを得る。

スルフヒドリル反応性基を導入するために、ＰＡＭＡＭ−ＮＨ_２デンドリマーをヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰと反応させる、スキーム２。ＳＰＤＰのＮ−スクシンイミジル活性化エステルは、末端第一級アミンとカップリングして、アミド連結２−ピリジルジチオプロパノイル（ＰＤＰ）基を生じる、スキーム２。ＳＰＤＰとの反応後に、ＰＡＭＡＭ−ＮＨ−ＰＤＰをＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析して、ＳＰＤＰがデンドリマーと反応した程度を決定することができる。

別の実施形態では、Ｄ−ＮＡＣを合成するために、下記のスキーム４に記載された合成ルートをピリジルジチオ（ＰＤＰ）官能化デンドリマー３まで使用することができる。次いで、化合物３をＤＭＳＯ中でＮＡＣと室温で終夜反応させて、Ｄ−ＮＡＣ ５を得る。

デンドリマー−ＰＥＧ−バルプロ酸コンジュゲート（Ｄ−ＶＰＡ）の調製
初めに、バルプロ酸をチオール反応性基で官能化する。スキーム３に示すように、（ＣＨ_２）_２Ｏ−の３つの繰り返し単位を有する短鎖ＰＥＧ−ＳＨをバルプロ酸と、カップリング試薬としてＤＣＣを使用して反応させる。得られた粗製のＰＥＧ−ＶＰＡをカラムクロマトグラフィーによって精製し、プロトンＮＭＲによって特徴付けた。ＮＭＲスペクトルにおいて、ＰＥＧのＯＨ基に近接するＣＨ_２プロトンのピークの３．６５ｐｐｍから４．２５ｐｐｍへのダウンシフトが存在し、それにより、ＰＥＧ−ＶＰＡの形成が確認された。チオール基はまた、酸性官能基と反応しやすい場合があるが、ＮＭＲスペクトルは、ＰＥＧのチオール基に隣接するＣＨ_２プロトンに属するピークのいかなる下方シフトも示さなかった。これは、チオール基がチオール反応性官能化デンドリマーと自由に反応できることを示唆する。

ＰＥＧ−ＶＰＡをＰＡＭＡＭ−ＯＨにコンジュゲートするために、デンドリマーとバルプロ酸との間にジスルフィド結合を導入する、スキーム４。最初に、デンドリマーをフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護したγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）と反応させることによって、デンドリマーを二官能性デンドリマー１に変換する。ＰＥＧ−ＶＰＡの二官能性デンドリマーへのコンジュゲーションは、２ステップのプロセスを伴い、第１のステップは、アミン官能化二官能性デンドリマー１とＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応であり、第２のステップは、チオール官能化バルプロ酸をコンジュゲートすることを伴う。ＳＰＤＰを中間体２とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で反応させて、ピリジルジチオ（ＰＤＰ）官能化デンドリマー３を得る。

これはｉｎ ｓｉｔｕ反応プロセスであるが、構造を^１Ｈ ＮＭＲによって確立した。スペクトルにおいて、ピリジル基の芳香族プロトンの６．７から７．６ｐｐｍの間の新規ピークにより、生成物の形成が確認された。ピリジル基の数およびＧＡＢＡリンカーの数は同じであることが検証され、これは、アミン基の大部分がＳＰＤＰと反応したことを示す。これは、薬物のデンドリマーへのコンジュゲーションのための重大なステップであることから、アミン基当たりのＳＰＤＰのモル当量の使用および反応の所要時間を確証した。最後に、ＰＥＧ−ＶＰＡをＰＤＰ官能化デンドリマーとｉｎ ｓｉｔｕで反応させて、デンドリマー−ＰＥＧ−バルプロ酸（Ｄ−ＶＰＡ）を得る。最終コンジュゲートの形成およびＶＰＡのローディングを^１Ｈ ＮＭＲによって確認し、コンジュゲートの純度を逆相ＨＰＬＣによって評価した。ＮＭＲスペクトルにおいて、ＶＰＡの脂肪族プロトンの０．８５から１．６７ｐｐｍの間の多重線（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）、ＰＥＧのＣＨ_２プロトンの３．５３から３．６６ｐｐｍの間の多重線、およびピリジルの芳香族プロトンの非存在により、コンジュゲート形成が確認された。ＶＰＡのローディングは、プロトン積分法を使用して推定して約２１分子であり、これは、１〜２個のアミン基が未反応で残存することを示唆する。ＨＰＬＣチャートにおいて、Ｄ−ＶＰＡの溶出時間（１７．２分）は、Ｇ４−ＯＨの溶出時間（９．５分）と異なっており、このことは、コンジュゲートが純粋であり、測定可能な微量のＶＰＡ（２３．４分）およびＰＥＧ−ＶＰＡ（３９．２分）を含まないことが確認される。デンドリマーに対するＶＰＡローディングの百分率は、約１２ｗ／ｗ％であり、３つの異なるバッチにおけるグラム分量を作製するための方法を確証する。

Ｂ．カップリング剤およびスペーサー
デンドリマー複合体は、デンドリマーまたは多重腕のＰＥＧにコンジュゲートまたは付着している治療的に活性な薬剤または化合物（以降「薬剤」とする）から形成され得る。付加は、薬剤とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して起こりうる。本デンドリマー複合体は、体内に見出される還元条件下で、ｉｎ ｖｉｖｏでチオール交換反応によって、薬剤を速やかに放出することが可能である。

本明細書に使用されるときの用語「スペーサー」は、治療的に活性な薬剤をデンドリマーに連結するために使用される組成物を含むことが意図される。スペーサーは、一緒に連結されてポリマーと治療薬剤またはイメージング剤とを架橋する、単一の化学実体かまたは２つもしくはそれを超える化学実体のどちらかとすることができる。スペーサーとしては、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカーボネート末端を有する、任意の小さな化学実体、ペプチド、またはポリマーを挙げることができる。

スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカーボネート基で終結する化合物のクラスの中から選択することができる。スペーサーは、チオピリジン末端化合物、例えばジチオジピリジン、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエートＬＣ−ＳＰＤＰ、またはスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを含むことができる。また、スペーサーとしては、ペプチドを挙げることができ、ここで、ペプチドは、線状または環状であり、本質的にはスルフヒドリル基、例えばグルタチオン、ホモシステイン、システイン、およびその誘導体、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）、シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）を有する。スペーサーは、メルカプト酸誘導体、例えば３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン−２−オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸など、および他のメルカプト誘導体、例えば２メルカプトエタノール、および２メルカプトエチルアミンとすることができる。スペーサーは、チオサリチル酸およびその誘導体、（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−２−ピリジチオ）トルエン、（３−［２−ピリジチオ（ｐｙｒｉｄｉｔｈｉｏ）］プロピオニルヒドラジドとすることができる。スペーサーは、マレイミド末端を有することができ、ここで、スペーサーは、ポリマーまたは小さな化学実体、例えばビス−マレイミドジエチレングリコールおよびビス−マレイミドトリエチレングリコール、ビス−マレイミドエタン、ビスマレイミドヘキサンを含む。スペーサーは、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホンなどのビニルスルホンを含むことができる。スペーサーは、チオグルコースなどのチオグリコシドを含むことができる。スペーサーは、還元タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン、ジスルフィド結合を形成することが可能な任意のチオール末端化合物とすることができる。スペーサーとしては、マレイミド、スクシンイミジルおよびチオール末端を有するポリエチレングリコールを挙げることができる。

Ｃ．治療薬剤、予防薬剤および診断薬剤
本明細書で使用される「デンドリマー複合体」という用語は、デンドリマーと、治療的に活性な薬剤、予防的に活性な薬剤および／または診断的に活性な薬剤との組合せを指す。デンドリマーはまた、標的化薬剤を含んでもよいが、実施例によって実証されるように、これらは、傷害脳への送達に必要ではない。これらのデンドリマー複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する還元条件下で薬物を細胞内に優先的に放出できる、ＰＡＭＡＭデンドリマーまたは多重腕ＰＥＧに付着またはコンジュゲートしている薬剤を含む。デンドリマー複合体は、ｉ．ｖ．注射によって投与された場合、疾患状態でのみ血液脳関門（ＢＢＢ）を優先的に横断することができ、正常状態では横断しない。デンドリマー複合体はまた、神経炎症、脳性麻痺、ＡＬＳならびに炎症および組織への損傷を特徴とする他のＣＮＳ疾患における治療薬の標的化送達に有用である。

薬剤は、共有結合的に付着しているか、または分子内に分散もしくは被包されているかのいずれかでありうる。デンドリマーは、好ましくは、カルボキシル、ヒドロキシル、またはアミン末端を有する世代１０までのＰＡＭＡＭデンドリマーである。ＰＥＧポリマーは、２つまたはそれ超のアームを有し、かつ１０ｋＤａから８０ｋＤａの分子量を有する星型ポリマーである。ＰＥＧポリマーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、またはマレイミド末端を有する。デンドリマーは、ジスルフィド、エステルまたはアミド結合で終端するスペーサーを介して薬剤に連結している。

代表的な治療薬剤（プロドラッグを含む）、予防薬剤または診断薬剤は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、小分子、またはそれらの組合せでありうる。例示的な治療薬剤には、抗炎症薬物、抗増殖剤、化学治療薬剤、血管拡張剤、および抗感染薬剤が含まれる。抗生物質には、β−ラクタム、例えばペニシリンおよびアンピシリン、セファロスポリン、例えばセフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セファドロキシル（ｃｅｐｈｙｄｒｏｘｉｌ）、セフポドキシム（ｃｅｐｆｏｄｏｘｉｍｅ）およびプロキセチル、テトラサイクリン抗生物質、例えばドキシサイクリンおよびミノサイクリン、マイクロライド（ｍｉｃｒｏｌｉｄｅ）抗生物質、例えばアジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびクラリスロマイシン、フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、エンロフロキサシン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシンおよびノルフロキサシン、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナム、ならびに抗炎症活性を保有することが公知である抗生物質、例えばエリスロマイシン、アジスロマイシン、またはクラリスロマイシンが含まれる。好ましい抗炎症剤は、抗酸化薬物、例えばＮ−アセチルシステインである。好ましいＮＳＡＩＤには、メフェナム酸、アスピリン、ジフルニサル、サルサレート、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デキスケトプロフェン（ｄｅａｃｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ（ｅｌｅｃｏｘｉｂ）、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ（ｆｉｒｏｃｏｘｉｂ）、スルホンアニリド、ニメスリド、ニフルム酸、およびリコフェロン（ｌｉｃｏｆｅｌｏｎｅ）が含まれる。

代表的な小分子には、ステロイド、例えばメチルプレドニゾン、デキサメタゾン、非ステロイド系抗炎症薬剤、例えばＣＯＸ−２阻害剤、コルチコステロイド抗炎症薬剤、金化合物抗炎症薬剤、免疫抑制薬剤、抗炎症薬剤および抗血管新生薬剤、抗興奮毒性薬剤、例えばバルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート、Ｄ−アミノホスホノヘプタノエート、グルタミン酸形成／放出の阻害剤、バクロフェン、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、サリチル酸系抗炎症薬剤、ラニビズマブ、抗ＶＥＧＦ薬剤、例えばアフリベルセプト、ならびにラパマイシンが含まれる。他の抗炎症薬物には、非ステロイド系薬物、例えばインドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウムおよびイブプロフェンが含まれる。コルチコステロイドは、フルオシノロンアセトニドおよびメチルプレドニゾロンでありうる。ペプチド薬物は、ストレプチドキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｉｄｏｋｉｎａｓｅ）でありうる。

一部の実施形態では、分子は、抗体、例えばダクリズマブ、ベバシズマブ（ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、バシリキシマブ、ラニビズマブ、およびペガプタニブナトリウムまたはＳＮ５０等のペプチド、ならびにＮＦのアンタゴニストを含みうる。

代表的なオリゴヌクレオチドには、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡが含まれる。治療薬剤は、アミンまたはヒドロキシル末端を有するＰＡＭＡＭデンドリマーでありうる。

例示的な診断薬剤としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、ならびに放射性核種、ｘ線イメージング剤、および造影剤が挙げられる。これらはまた、上述のものを用いて標識されているリガンドまたは抗体であってもよいし、または当業者に公知の方法によって検出可能な標識化リガンドもしくは抗体に結合してもよい。

例示的な診断薬剤としては、色素、蛍光色素、近赤外色素、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＰＥＴイメージング剤、および放射性同位体が挙げられる。代表的な色素としては、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、ツイカルボシアニン（ｔｈｕｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）およびメロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素−ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ６４７、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ６８０、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ７５０、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳが挙げられる。

代表的なＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージング剤としては、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ジアミンジチオール、活性化メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ｇｙｌｃｉｎｅ）（ＭＡＧ３）、およびヒドラジノニコチンアミド（ｈｙｄｒａｚｉｄｏｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）（ＨＹＮＩＣ）などのキレート剤が挙げられる。

代表的な同位体としては、Ｔｃ−９４ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｄ^３＋、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｃｏ−５５、Ｃｏ−５７、Ｆ−１８、Ｓｃ−４７、Ａｃ−２２５、Ｂｉ−２１３、Ｂｉ−２１２、Ｐｂ−２１２、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、およびＤｙ−ｉ６６が挙げられる。

標的化部分としては、葉酸、線状または環状のどちらかのＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、ＬＨＲＨ、およびＢＨ３が挙げられる。

ＲＴＴおよび自閉症スペクトラム障害を処置するための一実施形態では、デンドリマーナノ粒子は、被験体のレット症候群および自閉症スペクトラム障害を処置するのに有効な量の、少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤に共有結合的に連結している、ＰＡＭＡＭヒドロキシル末端デンドリマーから形成される。

生物活性化合物または治療的に活性な薬剤に連結しているデンドリマー複合体は、標的化、病的部位での局在化、薬物の放出、およびイメージングの目的を含む、いくつかの機能を果たすために使用することができる。デンドリマー複合体は、デンドリマーと薬剤またはイメージング剤との間のジスルフィド結合がスペーサーまたはリンカー分子を介して形成されるように、標的化部分を用いてまたは用いずにタグ付けされうる。

Ｄ．デバイスおよび製剤
本デンドリマーは、硬膜下、静脈内、羊膜内（ｉｎｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ）、腹腔内、または皮下の経路によって、非経口的に投与することができる。

本明細書で使用される担体または希釈剤は、固形製剤のための固形担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体担体もしくは希釈剤、またはそれらの混合物であってもよい。

液体製剤のために、薬学的に許容される担体は、例えば、水性または非水性の溶液、懸濁物、乳濁液、または油であってもよい。非経口的なビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射のための）としては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、ならびに不揮発性油が挙げられる。非水性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、水、アルコール性／水性溶液、シクロデキストリン、乳濁液または懸濁物が挙げられ、食塩水および緩衝化媒体を含む。本デンドリマーはまた、乳濁液で、例えば油中水で投与することができる。油の例は、石油、動物、植物、または合成由来のもの、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ペトロラタム、および鉱物である。非経口的な製剤での使用に適した脂肪酸としては、例えばオレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適した脂肪酸エステルの例である。

非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、ならびに目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁剤を含むことのできる水性および非水性の滅菌懸濁物、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、ならびに保存剤を含み得る。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲル・デキストロースをベースにするものなどを挙げることができる。概して、水、食塩水、水性デキストロース、および関連の糖溶液、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、好適な液体担体であり、特に注射可能な溶液に好適である。

注射可能な組成物に用いるための注射可能な医薬担体は、当業者に周知である［例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、 ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編、２３８〜２５０頁（１９８２年）、ならびにＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ、Ｔｒｉｓｓｅｌ、第１５版、６２２〜６３０頁（２００９年）を参照］。

対流強化送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（「ＣＥＤ」）のための製剤は、小分子量の塩（ｓａｌｅｓ）および糖、例えばマンニトールなどの溶液を含む。

ＩＩＩ．処置方法
Ａ．脳およびＣＮＳへの送達
治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤に連結している、デンドリマー、好ましくは少なくとも第４世代のデンドリマー、より好ましくは少なくとも世代６のデンドリマーを含む、デンドリマー複合体組成物は、脳性麻痺を含む、いくつかの神経変性疾患の病因において重大な役割を果たすミクログリアおよび星状膠細胞を選択的に標的化することができる。これらの細胞を標的化することによって、デンドリマーは、神経炎症を処置するために特異的に薬剤を送達する。

Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）は、広範に調査され、研究されている。母子感染症に関連する神経炎症についても調査されている。しかしながら、ＮＡＣは、高い血漿タンパク質結合に起因して、バイオアベイラビリティが低い。デンドリマー複合体組成物は、ＮＡＣの活性に影響を及ぼすことなく、血漿タンパク質結合を克服する。

単回ｉ．ｖ．投与で、Ｇ４ ＰＡＭＡＭ−ＮＡＣは、遊離薬物ＮＡＣよりも、ｉｎ ｖｉｖｏで１０から１００倍効果的でありうる。遊離薬物ＮＡＣは、非常に高い血漿タンパク質結合を示し、バイオアベイラビリティの低減をもたらす。本デンドリマー複合体の主要な利点の１つは、望ましくない薬物血漿タンパク質間相互作用を制限することによってバイオアベイラビリティを向上させ、薬物の細胞内への速やかな放出を選択的にもたらして、所望の治療作用を示すことである。

Ｇ４ ＰＡＭＡＭ−ＮＡＣ中の薬物ＮＡＣの高いペイロードは、非常に少ない分量（約５０ｍｇ／ｋｇ）の担体、ＰＡＭＡＭデンドリマー、およびより少ない分量の薬物（約１０ｍｇ／ｋｇ）を必要とし、それによって投与される量を低減する。対照的に、遊離ＮＡＣは、典型的には、動物モデルにおいて１００〜３００ｍｇ／ｋｇの１日用量で使用される。薬剤の分量の減少により、薬剤に関連する副作用が限定される。薬剤のバイオアベイラビリティは依然として高いことから、より少ない分量の薬剤の投与にもかかわらず、薬剤の効能（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）は低下しない。デンドリマー−薬物コンジュゲートを含むデンドリマー複合体は、組織および器官へのその生体内分布を制限し、薬物を標的部位で優先的に送達し、それによって望ましくない副作用を低減する。

デンドリマー複合体は、ＢＢＢを越えて有効に輸送し、したがって、神経障害、神経発達障害、および神経変性障害ならびに脳傷害における標的化された薬物送達に有用である。Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲートは、神経炎症性障害における活性化ミクログリア細胞および星状膠細胞を特異的に標的化する。

発達中のウサギ脳（脳性麻痺の動物モデル）において、白質傷害およびミエリン形成減少を誘導するためのリポ多糖（ＬＰＳ）による２日間の動物処置の後に、Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣデンドリマーコンジュゲートの治療効力を評価した。Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣデンドリマー複合体から選択的に送達されたＮＡＣは、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６ ｍＲＮＡ）、炎症性シグナル伝達因子、例えばＮＦ．カッパ．Ｂおよびニトロチロシンを強力に抑制し、ＧＳＨレベルを向上させた。Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣは、遊離ＮＡＣと比較して、１０から１００倍効果的であることが見出された。これは、Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣがＢＢＢを通過したという結論を裏付ける。デンドリマー複合体から活性化ミクログリア細胞へのＮＡＣの標的化送達は、脳性麻痺の新生仔ウサギモデルにおいて、運動欠陥およびＬＰＳ誘導性脳傷害からの回復の減弱を改善した。

Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣデンドリマー複合体の投与により、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６ ｍＲＮＡ）の有意な低減が観察された。ＮＡＣおよびＧ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣで処置した仔ウサギは、食塩水で処置した仔ウサギと比較して、胎仔炎症応答の減少および運動欠陥の改善を示した。Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲートからのＮＡＣの持続的送達に起因して、Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲートで処置した仔ウサギは、ＮＡＣ単独を受けた仔ウサギと比較して、行動変化が少なく、脳内のミクログリア活性化が低かった。結果は、Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲートが、活性化マクロファージおよびミクログリア細胞によって優先的に取り込まれることから、ＮＡＣ単独よりも大きな効果を有し、炎症作用ならびに酸化およびニトロソ化（ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ）作用を低減することを示した。

Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣデンドリマー複合体による処置は、白質傷害およびミクログリア活性化を低減した。遊離ＮＡＣについて観察された応答と同様の応答を誘発するために、Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣとして投与された場合、ＮＡＣの用量の有意な低減が観察された。１００ｍｇ／ｋｇの濃度の遊離ＮＡＣおよび１０ｍｇ／ｋｇの濃度のＧ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣはいずれも、１０ｍｇで同一の応答が誘発され、デンドリマーへのコンジュゲートにより、用量の低減が達成されることが実証される。Ｇ４−ＰＡＭＡＭ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣは、遊離ＮＡＣよりも低い濃度において、ＬＰＳ誘導性脳傷害に対する有意な保護効果、ＴＮＦ−αの抑制およびＩＬ−６活性の下方調節を示す。デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲートのこの活性は、シグナル伝達因子ＮＦ−．カッパ．Ｂおよびニトロチロシンを遮断または改変し、それによって細胞活性化をモジュレートすることによって初期炎症応答に干渉するその能力を原因としうる。

海馬におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の下方調節は、脳内のミクログリア細胞による特異的な細胞取込みによる、デンドリマー複合体の優先的な生体内分布を原因とすると思われる。デンドリマー−ＮＡＣ複合体は、母体感染症に関連する臨床症状を発症し、乳児においてＰＶＬおよびＣＰを発症するリスクが増加した妊婦の処置に使用することができる。結果は、デンドリマー−ＮＡＣによるミクログリア細胞、星状膠細胞の阻害が、新生ウサギ脳における白質傷害を減少させたことを示す。さらに、デンドリマーは、コンジュゲートしている薬物の持続的放出を示し、長期にわたり薬物の有効性を向上させる。より低い用量において、デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲートは、ＮＡＣ単独よりも有効であった。デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲートは、有意な用量低減、バイオアベイラビリティの向上、および投薬の低減を含む、より多くの利点を提供するようである。

６および８アームＰＥＧ−ＮＡＣコンジュゲートは、細胞内ＧＳＨ濃度（２および１０ｍＭ）で、７４％のＮＡＣを２時間以内に放出した。０．００８〜０．８ｍＭの間の濃度範囲において、コンジュゲートは、ミクログリア細胞に対して非毒性であった。等モル濃度のＮＡＣ（０．５ｍＭ）において、６アームＰＥＧ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣおよび８アームＰＥＧ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣは、遊離ＮＡＣよりも効率的にＧＳＨ枯渇を阻害した。６および８アームＰＥＧ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲートはいずれも、それぞれ０．５ｍＭおよび５Ｍｍの濃度において、等モル濃度の遊離ＮＡＣと比較して、ＲＯＳ産生の有意な阻害を示した。これらの研究は、コンジュゲートが、遊離ＮＡＣと比較して、ＮＯ産生の阻害に優れていることを実証する。最高濃度（５ｍＭ）において、遊離薬物は、Ｈ_２Ｏ_２レベルおよび亜硝酸塩レベルを３０〜４０％低減したのに対し、コンジュゲートは、Ｈ_２Ｏ_２および亜硝酸塩レベルを７０％超低減した。これは、コンジュゲートが、薬物を細胞内に運搬し、薬物を遊離形態で放出することができ、遊離薬物よりも有意に効果的であることを示す。５ｍＭの濃度において、６アームＰＥＧ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲート（１）は、等濃度のＮＡＣと比較して、ＴＮＦ−α産生の有意な阻害（７０％）を示した（Ｐｂ０．０５）。８アームＰＥＧ−Ｓ−−Ｓ−ＮＡＣコンジュゲート（３）は、５ｍＭにおいて、等濃度のＮＡＣと比較して、ＴＮＦ−α産生の有意な阻害（７０％）を示した（Ｐｂ０．０５およびＰｂ０．０１）。ＰＥＧはヒトへの使用が承認されていることから、ペグ化ＮＡＣは、製薬業界への有用性を有するデンドリマー複合体であり、この方策は、ＮＡＣの限定に対処し、より大きな効力をもたらす。

実施例において実証されるように、世代６のデンドリマーは、とりわけ損傷を受けた脳組織へのさらに大きな送達を提供する。世代４のデンドリマーで決定された用量を、送達の増加を相殺するために相応に調整する。当業者は、過度の実験なしに相対的投薬を決定することができる。

典型的には、担当医は、種々の要因、例えば年齢、体重、全身の健康状態、食事、性別、投与される化合物、投与経路、および処置されている状態の重症度などを考慮して、各個体被験体を処置するのに用いる組成物の投薬量を決定することになる。組成物の用量は、処置される被験体の体重１ｋｇ当たり約０．０００１から約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、および約０．５ｍｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重でありうる。

概して、投与のタイミングおよび頻度は、所与の処置または診断スケジュールの有効性と、所与の送達系の副作用とのバランスを取るように調整されることになる。例示的な投薬頻度としては、持続注入、単回および多回の投与、例えば毎時、毎日、毎週、毎月、または毎年の投薬などが挙げられる。

本発明の方法において使用される投薬レジメンは、被験体のレット症候群および／または関連した自閉症スペクトラム障害を処置するのに十分な任意の長さの時間でありうることが、当業者には理解されよう。本明細書で使用される「長期の」という用語は、投薬レジメンの時間の長さが、数時間、数日、数週、数か月、または場合により数年でありうることを意味する。

デンドリマー複合体は、上記で論じた状態または疾患を処置できることが公知である１つまたは複数の追加の治療的に活性な薬剤と組み合わせて投与することができる。

Ｂ．処置される障害または疾患
脳の炎症は、ＲＴＴおよび自閉症スペクトラム障害を有する小児における病因および症状の悪化において重大な役割を果たす。本明細書で使用される場合、「脳の炎症性疾患」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ Ｖにおいて分類されるように、脳のミクログリアまたは星状膠細胞の活性化に関連する脳の疾患、例えばＲＴＴおよび自閉症スペクトラム障害を意味する。

レット症候群
レット症候群（ＲＴＴ）は、消耗性神経発達障害の一例であり、自閉症スペクトラム障害と共通する多くの態様を有する。ＲＴＴは、初めは正常に見える小児において、発達を遅らせ、続いて機能を突然退行させることによって女児に影響を及ぼす。脳の炎症は、ＲＴＴおよび自閉症を有する小児における病因および症状の悪化において重大な役割を果たす。これらの障害に利用可能な治癒法は存在しない。

レット症候群を有する小児は、多くの場合、初期段階において自閉症様行動を示す。レット症候群の最も初期の症状は、生後６から１８か月頃に現れ、自閉症によく似ている：小児は、社会参加（ｓｏｃｉａｌ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）から撤退し、コミュニケーション能力を喪失し、手揉み等の反復動作を生じる。レット症候群を有する患者のＣＳＦではグルタミン酸の増加が見られ、自閉症を有する患者の剖検標本ではミクログリア活性化の増加が見られる。

レットの動物モデルは、レットに関連する最も一般的な遺伝子異常、すなわちＭｅＣＰ２欠失を有する。マウスは、レットおよび自閉症を有する患者において見られる特徴的な足揉みおよび足組み（ｐａｗ ｃｌａｓｐｉｎｇ）動作を示す。このモデルにおいて、動物は、３週齢での症状の発症から約７週齢までの死亡へと急速に進行する。

１週齢または３週齢のいずれかから始める週１回のデンドリマー−抗炎症薬剤（Ｄ−ＮＡＣ １０ｍｇ／ｋｇ）による処置は、処置されていない動物と比較して、症状の改善、症状発症の遅延および／または症状の無進行をもたらすが、これは、生存率の有意な増加に関連しない。デンドリマー−ＮＡＣ処置は、処置された動物における体重増量の増加をもたらした。処置された動物におけるミクログリアの形態および表現型もまた改善される。

ヒトにおいて、症状の改善は、大きな進歩となる。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、抗炎症薬剤（Ｄ−ＮＡＣ）ならびに抗興奮毒性およびＤ−抗グルタミン酸薬剤を送達するために使用される。好ましい候補は、ＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、１−ＭＴ、ＪＨＵ−２９、抗グルタミナーゼ阻害剤ならびにＧＣＰＩＩ阻害剤、例えば２−ＭＰＰＡおよび２−ＰＭＰＡである。

自閉症スペクトラム障害
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、以下を特徴とする：
複数の状況にわたる社会的コミュニケーションおよび社会的相互作用の持続的欠陥；
制限された、反復的パターンの行動、関心、または活動；
症状が、発達初期において存在しなければならない（典型的には、生後最初の２年内に認識される）；および
症状が、社会的、職業的、または他の重要領域の現在の機能における臨床的に有意な機能障害を引き起こす。

「スペクトラム」という用語は、ＡＳＤを有する小児が有しうる幅広い症状、技能、および機能障害または能力障害のレベルを指す。一部の小児は、その症状によって軽度の機能障害を受け、他の小児は、重度の能力障害を受ける。最新版のＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ （ＤＳＭ−５）には、アスペルガー症候群は含まれなくなったが、アスペルガー症候群の特徴は、ＡＳＤの広義のカテゴリー内に含まれる。

一部の場合、ＡＳＤを有する乳児は、その発達の非常に初期において、異なって見える場合がある。一部の乳児は、１歳の誕生日前にさえ、ある特定の対象物に過度に集中し、ほとんど目を合わせず、典型的な双方向的遊び（ｂａｃｋ−ａｎｄ−ｆｏｒｔｈ ｐｌａｙ）および親との喃語に参加することができない。他の小児は、生後２年目またはさらに３年目まで正常に発達するが、その後他者への関心を喪失し始め、寡黙になり、引きこもり、または社会的シグナル（ｓｏｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ）に無関心になる場合がある。正常な発達の喪失または逆転は、退行と呼ばれ、ＡＳＤを有する小児の一部において起こる。

自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の診断は、多くの場合、２段階のプロセスである。第１の段階は、小児科医または幼児期医療提供者による小児健診中の一般的な発達スクリーニングを伴う。何らかの発達の問題を示す小児は、追加評価に回される。第２の段階は、医師チームおよび幅広い専門分野を有する他の医療専門家による徹底的な評価を伴う。この段階において、小児は、ＡＳＤまたは別の発達障害を有すると診断されうる。

現時点で、ＡＳＤの態様を処置するためにＦＤＡによって承認されている薬物療法は、抗精神病剤リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）およびアリピプラゾール（ａｒｉｐｒｉｐａｚｏｌｅ）（Ａｂｉｌｉｆｙ）のみである。これらの薬物療法は、小児年齢における易刺激性−攻撃性、自傷行為、またはかんしゃくを意味する−を低減するのに役立ちうる。
ＡＳＤを有する小児のために適応外処方されうる一部の薬物療法には、以下が含まれる：

抗精神病剤による薬物療法は、重度の精神病、例えば統合失調症を処置するために、より一般的に使用される。これらの薬は、ＡＳＤを有する小児を含む、小児における攻撃性および他の深刻な行動の問題を低減するのに役立ちうる。これらはまた、反復行動、多動、および注意の問題を低減するのに役立ちうる。

抗うつ剤による薬物療法、例えばフルオキセチンまたはセルトラリンは、うつ病および不安を処置するために通常処方されるが、反復行動を低減するために処方される場合もある。一部の抗うつ剤はまた、ＡＳＤを有する小児における攻撃性および不安を制御するのに役立ちうる。

刺激剤による薬物療法、例えばメチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ）は、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を有する人を処置するのに安全かつ有効である。メチルフェニデートはまた、ＡＳＤを有する小児における多動を有効に処置することが示されている。しかし、ＡＳＤを有する小児で処置に応答する者はそれほど多くなく、応答する者は、ＡＤＨＤを有しＡＳＤを有さない小児よりも多くの副作用を示している。

本明細書に記載されたデンドリマーコンジュゲートは、死後脳標本における活性化ミクログリアおよび星状膠細胞の存在の増加ならびにサイトカインのＣＳＦレベルの増加によって見られるように、自閉症を有する患者が神経炎症の証拠を有することを示す近年の研究を特に考慮して、そのような個体の処置および診断に効力を有するはずである。Ｖａｒｇａｓら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．、２００５年１月；５７巻（１号）：６７〜８１頁。訂正：Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．、２００５年２月；５７巻（２号）：３０４頁。

興奮毒性障害
興奮毒性は、神経細胞が過剰に刺激されたことに起因して損傷を受けるプロセスである。脳卒中、外傷性脳傷害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、および脊髄傷害を含むいくつかの状態は、興奮毒性に関係する。神経細胞への損傷は、対応する神経症状をもたらし、症状は、損傷を受けた細胞および損傷の程度に応じて変動しうる。神経細胞は、一度損傷を受けると、修復することができず、患者は恒久的な機能障害を経験しうる。

興奮毒性が起こるプロセスは、グルタミン酸の上昇から始まる。グルタミン酸は、神経細胞間の電気シグナル伝達を促進する働きをする興奮性神経伝達物質である。しかしながら、グルタミン酸レベルが上がりすぎると、ニューロンを開放位置で本質的に動かなくし、カルシウムを細胞内に自由に流入させる。カルシウムは、細胞の構造およびＤＮＡに損傷を与え、細胞が死滅し、グルタミン酸を放出し、それが近接細胞に溢れ出るようなカスケード反応を生み出して、損傷を広がらせる。

ＡＭＰＡおよびＮＤＭＡ受容体を含む、神経細胞上のいくつかの受容体は、グルタミン酸に感作される。ニューロン間のこの相互作用は、興奮性または阻害性のいずれかでありうる。主要な興奮性アミノ酸神経伝達物質は、グルタミン酸およびアスパラギン酸であり、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）、グリシン（アミノ酢酸）、およびタウリンは、阻害性である。

脳卒中、外傷、てんかん、さらには神経変性状態、例えばハンチントン病、エイズ認知複合症、および筋萎縮性側索硬化症を含む、難解な多様性のある神経障害であるが、この疾患スペクトラムは、ニューロンの傷害および死滅の同じ機序を共有するとは通常考えられない。外傷は、細胞外グルタミン酸レベルを大幅に上昇させる鈍的機序である。正常な細胞外グルタミン酸濃度は、約０．６μｍｏｌ／Ｌである。実質的なニューロンの興奮毒性傷害は、２から５μｍｏｌ／Ｌのグルタミン酸濃度で起こる。

ニューロンへの外傷性傷害は、約１０μｍｏｌ／Ｌの正常な細胞内グルタミン酸濃度の細胞外空間への露出により、悲惨な結果を生じさせうる。したがって、単一のニューロンへの機械的傷害により、近接するニューロン全てが危険にさらされる。このタイプのグルタミン酸放出から、周囲のニューロンへの顕著な二次的傷害が起こる。１つの近年の治療戦略は、頭部または脊柱への傷害を有する人を、グルタミン酸受容体遮断剤で直ちに処置して、直接の物理的に破壊されたニューロンを越えたニューロンの死滅の広がりを最小限に抑えることである。

過剰なグルタミン酸蓄積のいくつかの機序は、虚血におそらく関わる。ニューロン小胞内の貯蔵部位からのグルタミン酸の異常放出は、少なくとも１つの因子である。この放出されたグルタミン酸が追加のグルタミン酸放出を刺激することから、フィードバックループが生成される。虚血はまた、グルタミン酸輸送体による再取込みを害するエネルギー不全を引き起こす。これらの輸送体は、共輸送体として挙動し、これは、グルタミン酸をその濃度勾配に逆らって細胞内に移動させる細胞膜を横切るナトリウム勾配に依拠する。しかしながら、ナトリウム勾配は、エネルギー依存性ポンプによって維持され、これは、虚血において不全を起こす。そのような不全は、シナプス間隙（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｐａｃｅ）からのグルタミン酸輸送に影響を及ぼすだけでなく、輸送体を逆走させ、細胞外グルタミン酸の吸収源ではなく供給源となる。虚血は、ニューロンから酸素およびグルコースを欠乏させて、エネルギー不全をもたらすが、エネルギー不全それ自体は、ニューロンに対して特に毒性でない。神経毒性は、結果として生じるグルタミン酸受容体依存性機序のカスケードの活性化により起こる。これらの受容体が適切なアンタゴニストによって遮断されると、ニューロンは、酸素および代謝基質が欠乏する期間を生き抜くことができる。これは、急性虚血事象を処置するためのグルタミン酸受容体遮断剤が近年開発され、検査されている論理的根拠である。梗塞を起こしたゾーンを救済することはできないが、危険にさらされた隣接ペナンブラへの周囲損傷を防止することが望まれている。

これらの受容体遮断剤はまた、脳の急性虚血領域への灌流を再確立する介入的かつ薬理学的に関連した試みの開発途上分野において肝要でありうる。受容体または細胞内レベルのいずれかにおける興奮毒性カスケードの同時停止を伴わない組織再灌流および虚血領域への酸素濃度の増加は、スーパーオキシドアニオンの形態の追加のフリーラジカルを提供することによって、およびミトコンドリアカルシウム貯蔵の放出を刺激することにより細胞内サイトゾルカルシウムレベルを増加させることによって、ニューロンの損傷を減少させるのではなく増加させうる。

ニューロンの傷害に至るグルタミン酸興奮毒性カスケードを中断し、影響を与え、または一時的に停止させる試みで、いくつかの薬物が開発され、使用されている。１つの戦略は、グルタミン酸放出を減少させる「上流の」試みである。このカテゴリーの薬物には、ナトリウムチャネル遮断剤であるリルゾール、ラモトリギン、およびリファリジン（ｌｉｆａｒｉｚｉｎｅ）が含まれる。一般的に使用されるニモジピンは、電位依存性チャネル（Ｌ型）遮断剤である。共役したグルタミン酸受容体それ自体の様々な部位に影響を及ぼす試みもまたなされている。これらの薬物の一部には、フェルバメート、イフェンプロジル、マグネシウム、メマンチン、およびニトログリセリンが含まれる。これらの「下流の」薬物は、フリーラジカル形成、酸化窒素形成、タンパク質分解、エンドヌクレアーゼ活性、およびＩＣＥ様プロテアーゼ形成（プログラム細胞死、またはアポトーシスにつながるプロセスにおける重要要素）等の細胞内事象に影響を与えることを試みたものである。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されよう。

（実施例１）
ＲＴＴを有するマウスへのデンドリマー−薬物コンジュゲートの全身投与。
材料および方法

デンドリマー−Ｃｙ５およびデンドリマー−薬物コンジュゲートを作製するためのプロトコールを含む、下記の実験において使用した詳細な材料および方法は、Ｋａｎｎａｎ Ｓら著、Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．、４巻：１３０ｒａ４６頁（２０１２年）および米国特許第８，８８９，１０１号に記載されている。

ＲＴＴマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能なＡｄｒｉａｎ Ｂｉｒｄモデルであった。

デンドリマー注射および動物の屠殺。ＲＴＴマウスにデンドリマーを静脈内注射した。静脈内注射については、１００μＬの滅菌ＰＢＳに溶解した６００μｇのＤ−Ｃｙ５を、３０ｇ針によって、大腿部に小切開を加えた後、大腿静脈に注射した。遊離Ｃｙ５およびＰＢＳを注射した動物が、この研究のための陽性または陰性対照として機能した。デンドリマー注射後の適切な時点（２４時間、７２時間および２１日、および６週後まで）において、動物をケタミン／キシラジンを使用して麻酔し、致死用量のペントバルビタールナトリウムを使用して安楽死させた。脳を直ちに取り出し、免疫組織化学分析のために処理した。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析。デンドリマー−Ｃｙ５コンジュゲート（Ｄ−Ｃｙ５）の純度を、Ｗａｔｅｒｓインライン脱気装置、バイナリーポンプ、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、マルチ蛍光λ検出器およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアとインターフェースで接続したオートサンプラー（４℃で維持した）を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ機器（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を使用して分析した。ＨＰＬＣクロマトグラムを、デンドリマーの２１０ｎｍおよびＣｙ５の６５０ｎｍでの吸光度についてＷａｔｅｒｓ ２９９８ ＰＤＡ検出器を使用して、ならびに６４５ｎｍで励起し、６６２ｎｍで発光する蛍光についてＷａｔｅｒｓ ２４７５蛍光検出器を使用して、同時にモニタリングした。水／アセトニトリル（０．１ｗ／ｗ％ＴＦＡ）を新たに調製し、濾過し、脱気し、移動相として使用した。ＴＳＫ−Ｇｅｌガードカラムに接続されたＴＳＫ−Ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ Ｔｓ（２５０×４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ、粒径５μｍ）を使用した。勾配流を使用し、初期条件は９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）であり、次いで、３０分でアセトニトリル濃度を徐々に増加させて１０：９０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）とし、６０分で元の初期条件９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に戻し、流量は１ｍｌ／分であった。

動物および炎症の評価
体重および行動もまた評価した。炎症マーカーの評価のための標準的なマウスプライマーを使用して、サイトカインを測定した（Ｋａｎｎａｎ Ｓら、Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．、４巻：１３０ｒａ４６頁（２０１２年））。

免疫組織化学および共焦点顕微鏡法。脳スライスをＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定した。脳を、１：２の比の２０％スクロースおよび最適切断温度化合物（ＯＣＴ）（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）中で、イソペンタン中ドライアイスを丁重に使用して凍結した。クライオブロックを切片化するまで−８０℃で保存する。クライオスタットを使用して、凍結ブロックから８μｍの切片を切断した。切片を、ミクログリア細胞マーカーであるウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター１分子（Ｉｂａ−１）（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国）中でインキュベートし、ヤギ抗ウサギ−Ｃｙ３二次抗体を加えた。切片をＺｅｉｓｓ ５１０共焦点顕微鏡で分析した。ＩＶ注射した動物における全ての組織を分析するための、励起および発光波長ならびにレーザー設定は同一であった。切片のＺスタックを取得し、分割（ｃｏｌｌａｐｓｅ）して、切片全体の深さにわたる画像を得た。

デンドリマーコンジュゲートのコンジュゲーション。デンドリマーのＣｙ５へのコンジュゲーションは、以前に報告された方法を使用して行った（Ｋａｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ（２０１２年４月）。薬物実験については、デンドリマーをＮ−アセチル−システインにコンジュゲートし、異なる時点において２〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与した。

マウスにＤ−薬物またはＰＢＳを３〜４日毎に注射した。統計分析。２群間の有意性を決定するためにスチューデントのｔ検定を使用して、データの再現性を分析した。０．０５に等しいまたはそれ未満のｐ値を有意とみなした。

結果
デンドリマーコンジュゲートは、脳内で、炎症を媒介する活性化ミクログリア中に蓄積しうる。症候性のＲＴＴマウスにおいて、Ｃｙ５標識デンドリマーを３週齢で全身投与し、脳を採取し、灌流し、固定して、ミクログリアへのデンドリマー局在化を調べた。

デンドリマーは、事前研究により傷害または損傷が示された脳の領域内のミクログリアに局在化した。健康な対照マウスは、脳内の蓄積を示さない。

デンドリマー−薬物コンジュゲート（Ｄ−薬物）は、ＲＴＴを代表する症状を提示するマウスにおいて全身投与された場合、同様の疾患重症度を有する非処置マウスと比較して、８週齢までの全体的な仔マウスの健康、外観、および疾患の顕著な行動的特徴の有意な改善を示す。３週齢で全身投与したＣｙ５にコンジュゲートしているデンドリマーは、ＲＴＴマウスの外側皮質のミクログリア中に蓄積する。

デンドリマー−薬物（Ｄ−薬物）コンジュゲートは、症候性のＲＴＴマウスにおいて３週齢で始めて３〜４日毎に全身投与された場合、８週齢での全体的な健康および外観の有意な改善を提供した。ＰＢＳで処置したマウスは、重度の足の握りしめ、猫背姿勢、および失明を示した。

処置されたマウスは、遊離薬物と比較して、生存率の改善を示した（図１Ａ）。図１Ａは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおけるＮＡＣおよびＤ−ＮＡＣ療法後のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。ＭｅＣＰ２欠損仔マウスにおける週２回のＮＡＣまたはＤ−ＮＡＣ療法後に、生存率を評価した。Ｄ−ＮＡＣは、非処置動物と比較して、生存率を改善しない。Ｄ−ＮＡＣは、ＮＡＣの安全性を改善する。Ｄ−ＮＡＣおよびＰＢＳで処置したＭｅＣＰ２欠損仔マウスは、ＮＡＣで処置した仔マウスと比較して、有意に良好な５０％生存を有しており（ｐ＝０．０１４）、遊離製剤として与えられた場合のＮＡＣの潜在的毒性が示される。実際に、コンジュゲートしていない遊離薬物（ＮＡＣ）は、デンドリマー−薬物コンジュゲート（ＤＮＡＣ）上の薬物と同等の用量において、非処置レットマウスよりも低い生存率につながった。デンドリマー−薬物コンジュゲートによる処置は、ＰＢＳで処置したレットマウスと比較して、有意に改善された行動を維持した（図１Ｂ）。図１Ｂは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおけるＤ−ＮＡＣ療法後の神経行動学的転帰のグラフである。ＭｅＣＰ２欠損マウスを、３週齢（ＰＮＤ２１）で始めて、食塩水（ＰＢＳ、黒破線）、１０ｍｇ／ｋｇのＮＡＣ（赤線）、または１０ｍｇ／ｋｇ（ＮＡＣベース）のＤ−ＮＡＣ（青線）で処置した。仔マウスを週２回処置した。行動試験を、ベースラインを決定するためにＰＮＤ１０およびＰＮＤ１７で実施し、ＰＮＤ２１で始める各処置日の処置前に実施した。同腹のＷＴ仔マウス（黒実線）を、体重および行動の両方の対照として使用した。Ｄ−ＮＡＣ療法は、ＮＡＣおよびＰＢＳ処置と比較して、行動的転帰を有意に改善した。Ｄ−ＮＡＣは、非処置仔マウスと比較して、ＭｅＣＰ２欠損マウスの全体的な外観を改善した。非処置仔マウスは、ひどく痩せ衰え、複数の握りしめた足、猫背姿勢、および眼状態不良を有していた。

動物を３〜４日毎に処置前に録画し、移動性、歩行、振戦、足の握りしめ、足の握りしめ時間、足揉み、および呼吸を０〜３の尺度で全てスコア付けし、「０」は最低スコアを示し、「３」は最高または正常である。複合スコアを生成し（０〜２１の範囲、正常な健康マウスは２０〜２１のスコアを有する）、群間で比較し、低いスコアは行動の悪化を示す。同様の生存（６６日齢、または６週の処置）を示した研究における全てのマウスで、スコアを平均した。

ＷＴおよびＭｅＣＰ２欠損マウスにおける脳内取込みおよび細胞局在化を決定し、比較した。症状前の期間（１週齢）において、デンドリマー（Ｄ−Ｃｙ５、赤）の局在化は、主として、脳室上部（ｓｕｐｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）領域内で、ミクログリア（Ｉｂａ）におけるものであり、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）にはない。症候性の期間に入った７週齢までに、Ｄ−Ｃｙ５は、皮質のミクログリアおよび脳室上部領域の星状膠細胞に局在化する。Ｄ−Ｃｙ５は、両方の週齢のＷＴマウスにおいて、血管に局在化したままであった。

ミクログリア形態をＷＴおよびＭｅＣＰ２欠損マウスにおいて評価した。ＭｅＣＰ２欠損マウス（ＫＯ）において、ミクログリア（Ｉｂａ）は、１週齢では脳室周辺の領域内でアメーバ状である。ＫＯマウスにおけるミクログリアは、２週および５週齢では少数の細い突起を有し、７週齢ではより多くの突起を有するが、７週でのＷＴミクログリアと比較してあまり接続されていない。

ＷＴならびに症状前および症候性のＭｅＣＰ２欠損マウスの脳における炎症プロファイルを測定した（図２Ａ〜２Ｆ）。炎症促進性および抗炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルを、ＷＴおよびＭｅＣＰ２欠損仔マウスの脳において、１、２、３、５、および７週齢で測定した。

２ΔΔＣＴ中央値が提示され、エラーバーは上下四分位範囲によって表される。（図３Ａ）経時的な炎症プロファイルの変化を、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βを含む複合炎症促進スコアの、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、およびＩＬ−４を含む複合抗炎症スコアに対する比として提示する。複合スコアは、各週齢で、所与の遺伝子型におけるその週齢の全ての仔マウスについて、全ての炎症促進２ΔΔＣＴ値または全ての抗炎症２ΔΔＣＴ値の中央値を取ることによって生成した。（図３Ｂ）ＭｅＣＰ２欠損マウスにおける炎症促進プロファイルは、２週および７週で、炎症促進マーカーの増加傾向を示す。しかしながら、抗炎症性ｍＲＮＡ発現（図３Ｃ）は、２週、５週、および７週齢で、同齢および同腹のＷＴマウスと比較して、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおいて有意な減少を示す。これは、ＭｅＣＰ２欠損マウスにおける神経炎症プロセスが、炎症促進性発現の増加ではなく、抗炎症性発現の減少によって引き起こされることを示唆する。

図４は、複合行動スコアに基づく脳傷害の重症度の関数としての、脳内のＤ−Ｃｙ５量（μｇ／ｇ）のグラフである。この取込みと傷害の重症度との相関関係の実証は、傷害の程度を診断するための手段を提供する。

（実施例２）
イヌ類モデルにおける脳傷害の処置
材料および方法
低体温循環停止のイヌ類動物モデルにおけるデンドリマーの脳内取込みおよび脳傷害に対する標的化療法は、Ｍａｎｏｊら著、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１４年、８巻（３号）、２１３４〜２１４７頁に記載されている。

エチレンジアミン（ＥＤＡ）コアを有する世代６の第一級ヒドロキシル官能化ＰＡＭＡＭデンドリマーを、これらの研究において使用した。

コンジュゲートの調製
コンジュゲートは、上記のように調製した。

イヌ類ＨＣＡモデルおよび実験計画
全ての実験は、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで開発されたＨＣＡのイヌ類モデルを使用した。（Ｒｅｄｍｏｎｄら、Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ．、１９９５年、５９巻、５７９〜５８４頁；Ｒｅｄｍｏｎｄら、Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ．、１９９４年、１０７巻、７７６〜７８６頁）この大型動物モデルは、低体温循環停止に関連する神経傷害に対処するための容易に転換可能な治療モデルを開発するために、ヒトとイヌ類との間のある特定の固有の生理学的類似性を活用している。これは大型動物モデルであることから、ヒトの手術室において経験されるものに極めて忠実に外科手術を再現することができ、最悪のヒト症例において見られるものと同様の神経傷害の程度を再現することができる。

馴化させたイヌ糸状虫陰性の６〜１２月齢のオスのクラスＡイヌ（およそ３０ｋｇ）を、全ての実験に使用した（Ｍａｒｓｈａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹ）。実験は、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＭｅｄｉｃｉｎｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（１９９６年、米国国立衛生研究所）に準拠した。

イヌにメトヘキシタールナトリウム（１２ｍｇ／ｋｇ ＩＶ、分割用量）を投与し、気管内挿管し、イソフルラン吸入麻酔（０．５〜２．０％）、１００％酸素、およびＩＶフェンタニル（１５０〜２００μｇ／用量）、およびミダゾラム（２．５ｍｇ／用量）で維持した。実験を通じて、鼓膜、食道、および直腸プローブにより体温をモニタリングした。血圧のモニタリングおよび動脈血ガスのサンプリングのために、ＣＰＢの開始前に左大腿動脈カニューレを留置した。ＥＫＧを継続的にモニタリングした。右大腿動脈にカニューレ挿入し、カニューレを下行胸大動脈に進めた。静脈カニューレを右大腿および右外頸静脈から右心房に進めた。非開胸ＣＰＢを開始し、動物を冷却した。６０〜１００ｍＬ／ｋｇ／分のポンプ流量により、６０〜８０ｍｍＨｇの平均動脈圧を維持した。鼓膜温が１８℃に到達したら、ポンプを止め、血液を重力でレザバに排出した。標準的な血液希釈および動脈血ガスのアルファスタット調節を用いて、イヌに２時間のＨＣＡを施した。ＨＣＡの後に、ＣＰＢを再開し、動物を２時間にわたり３７℃の中核温に再加温した。洞調律が自発的に戻らない場合、心臓を３２℃で除細動した。連続血液ガスレベルを取得して適正なｐＨを確実に、電解質濃度を検証し、動脈カニューレを利用して継続的な血行動態測定値を記録した。３７℃において、各イヌをＣＰＢから離脱させ、カニューレを取り外した。バイタルサイン、動脈血ガス、および尿排出量を頻繁にモニタリングして、イヌが挿管中に麻酔から回復した。一部の動物は、バイパスからの離脱を成功させるために、この段階において血行動態補助およびアシドーシスの是正を必要とした。血行動態的および臨床的に安定したら、イヌを抜管し、回復および生存のためにケージに移し、神経学的評価を２４時間間隔で所望の終了点（バイパス後２４または７２時間）まで行った。

デンドリマー投与（生体内分布研究用）
デンドリマー−フルオロフォアコンジュゲートを、低体温循環停止の２４時間後に１回ボーラスとして注射した。３匹のイヌを、Ｄ−ＦＩＴＣ（１４０ｍｇ／動物、およそ５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入およびＤ−Ｃｙ５（５ｍｇ／動物、０．１７ｍｇ／ｋｇ）の槽内（ＩＣＭ、「脳内」）注射で同時に処置し、コンジュゲート投与の４８時間後に安楽死させた。続いて、組織内取込みおよび生体内分布を屠殺時に測定した（投与の４８時間後）。ＦＩＴＣおよびＣｙ５をそれらの別個の特徴的波長で分析したことから、それらの生体内分布を同時に評価することができる。

デンドリマー投与（効力研究用）
遊離薬物（ＶＰＡおよびＮＡＣ）またはデンドリマー−薬物コンジュゲートを、ＨＣＡの前および後に静脈内投与した。遊離薬物投与の用量は、遊離ＶＰＡで神経保護が達成された本発明者らの以前の研究に基づいており、遊離Ｎ−アセチルシステインについては文献に基づいていた。以前の研究により、ＮＡＣによる前処置は、心停止のモデルにおいて保護的であることが報告されている。デンドリマー−薬物コンジュゲートの用量は、遊離薬物用量の１／１０（ＶＰＡ）または１／３０（ＮＡＣ）に設定し、ウサギＣＰモデルにおけるそのような用量比での顕著な神経保護に関する事前の知見に基づいていた。遊離薬物については、動物を１００ｍｇ／ｋｇのＶＰＡおよび３００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣで処置し、そのうち、用量の半分を心停止前に静脈内投与し、残りを心停止後に投与した。デンドリマー−薬物コンジュゲートについては、イヌを１０ｍｇ／ｋｇのＮＡＣを含有するＤ−ＮＡＣおよび／または１０ｍｇ／ｋｇのＶＰＡを含むＤ−ＶＰＡで静脈内処置した。Ｄ−ＶＰＡは、２５％をボーラスとしてＨＣＡ前に、続いて７５％を２時間にわたる注入としてＨＣＡが完了した後に静脈内投与した。Ｄ−ＮＡＣは、５０％をボーラスとしてＨＣＡ前に、５０％を２時間にわたる注入としてＨＣＡが完了した後に静脈内投与した。これらのレジメンは、遊離薬物に使用されたものと同様である。

安楽死
動物を放血によって安楽死させた。鎮静および挿管の後、動物に胸骨正中切開を施し、２２Ｆｒｅｎｃｈカニューレを使用して上行大動脈にカニューレ挿入した。下行大動脈をクランプして、脳を１２Ｌの氷冷食塩水（４℃）で６０ｍｍＨｇで灌流することを確実にした後に、ＣＰＢを開始した。右心耳を横切開し、静脈還流を流出させた。灌流の直後に脳を採取し、半球を分離し、一方の半球は１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し（免疫組織化学的評価およびイメージング用）、他方の半球は１ｃｍの冠状スライスに切断し、速やかに凍結した（生体内分布定量化用）。

蛍光顕微鏡法
海馬および小脳のクライオスタット切片を、退色防止媒体（ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）でマウントした。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｍ２を使用して、各脳領域の全てのサンプルについて等しい露光時間で、蛍光画像を得た。画像のコントラストおよび輝度を最適化するために、表示設定を各画像セット内で等しく調整した。

神経学的評価
神経学的臨床評価を、全ての動物において、屠殺まで２４時間毎に実施した。この研究において使用したイヌ特異的行動尺度は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで確証された。神経学的機能の以下の５つの要素を評価した：意識レベル、呼吸パターン、脳神経機能、運動および感覚機能、ならびに行動。２人の調査者が、独立して、各要素に０（正常）から１００（重度の傷害）の間のスコアを割り当て、これらを平均し合計して、０（正常）から５００（脳死）の範囲を取りうる総スコアを得た。

結果
低体温循環心停止誘導性脳傷害のイヌ類モデルにおいて実証されるように、傷害を受けたＢＢＢを横切って薬物を送達するために、Ｇ６ ＰＡＭＡＭデンドリマーは、Ｇ４デンドリマーよりも優れている。Ｇ６デンドリマーは、持続的期間にわたり高い脳脊髄液（ＣＳＦ）対血清比を維持した。そのような高いＣＳＦ／血清比を維持することは、多くのＣＮＳ薬物にとっての重大な難点である。図５を参照されたい。傷害脳において見られる高いＣＳＦレベルは、重大な新規特色である。デンドリマーの蓄積は、傷害の程度に依存し（図４参照）、Ｇ６デンドリマーが活性化ミクログリアおよび傷害ニューロンによって内在化されることを示す研究に基づいている（ＡＣＳ Ｎａｎｏ． ２０１４年３月２５日；８巻（３号）：２１３４〜４７頁）。

図５に示すように、Ｇ６デンドリマーは、脳脊髄液（ＣＳＦ）中への高い分配を有し、ＣＳＦ／血清比は、イヌ５９２および５９３について２４時間まで１０％超であり、７２時間で約４〜５％である。注入時間中およびその直後に、比は、傷害の程度に応じて４０％まで上がりうる。

図６に示すように、Ｇ６デンドリマーの脳内蓄積は領域依存性であり、海馬内の蓄積が最も高く、続いて小脳および皮質であり、傷害のパターンと一致する。

デンドリマー投与後４８時間において、Ｇ６デンドリマーは、脳内の全領域にわたって、Ｇ４デンドリマー（検出限界未満）よりも有意に高い脳内蓄積を示した。図６を参照されたい。傷害領域におけるＧ６デンドリマーのレベルは、投与後４８時間でさえ、６時間の初期時点でのＧ４デンドリマーのレベルよりも何倍も高い。

海馬において、Ｇ６デンドリマーは、ＣＡ１およびＣＡ３領域よりも歯状回で高い蓄積を示した。海馬において、Ｇ６デンドリマーは、異なるタイプの細胞局在化を示し、主に活性化ミクログリアおよび傷害ニューロンによって取り込まれる。

図７によって示されるように、Ｇ６デンドリマーは、第２のボーラス用量後４８時間において、腎皮質および肝臓内に主に蓄積し、このことにより、腎および肝クリアランスはいずれも、循環からのデンドリマー除去に重要であることが示唆される。

Ｇ４デンドリマーと比較して、Ｇ６デンドリマーは、低い腎臓レベルを示し、高い血清レベルと一致する。

結果は、Ｇ４およびＧ６デンドリマーのいずれも、５００倍高い用量において毒性でなく、腎臓を介して無傷で除去されないことを実証する。

本明細書に記載の方法および材料の改変および変形は、当業者に明らかになるものであり、特許請求の範囲によって包含されることを意図するものである。

Claims (21)

1. 脳の神経障害、神経変性障害、または神経発達障害を処置、予防または診断するための組成物であって、前記組成物は、１つまたは複数の治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤にコンジュゲートしているかまたはこれらと複合体形成している、世代６（Ｇ６）、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９および／またはＧ１０のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを、Ｇ４ ＰＡＭＡＭデンドリマーを使用して同じ薬剤を投与した場合の脳脊髄液（ＣＳＦ）中濃度の血清中濃度の比よりも、高いＣＳＦ対血清比をもたらすのに有効な量で含み、前記組成物が、前記被験体に全身投与されることを特徴とする、組成物。
2. 前記デンドリマーが、ヒドロキシル末端デンドリマーである、請求項１に記載の組成物。
3. レット症候群を有する被験体を処置および／または診断するための組成物であって、前記組成物は、治療薬剤、予防薬剤または診断薬剤にコンジュゲートしているかまたはこれらと複合体形成しているポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーを、レット症候群を処置および／または診断するのに有効な量で含む、組成物。
4. 前記デンドリマーが、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９および／またはＧ１０ ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
6. 治療薬剤にコンジュゲートしているかまたは治療薬剤と複合体形成している前記デンドリマーが、前記被験体のレット症候群の１つまたは複数の症状を軽減するのに有効な量の単位投薬量にある、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
7. 前記治療薬剤が、抗炎症薬剤または免疫抑制薬剤である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
8. 前記治療薬剤が、ステロイド系抗炎症薬剤、非ステロイド系抗炎症薬剤、および金化合物抗炎症薬剤からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
9. 前記治療薬剤が、抗興奮毒性薬剤である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
10. 前記治療薬剤が、バルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート、Ｄ−アミノホスホノヘプタノエート、グルタミン酸形成／放出の阻害剤、バクロフェン、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、１−メチルトリプトファン、バルプロ酸、グルタミン酸−カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＧＣＰ−ＩＩ）、例えば２−（３−メルカプトプロピル）ペンタン二酸（２−ＭＰＰＡ）、２−（ホスホノメチル）ペンタン二酸（２−ＰＭＰＡ）、およびグルタミナーゼ阻害剤、例えばＮ−（５−｛２−［２−（５−アミノ−［１，３，４］−チアジアゾール−２−イル）−エチルスルファニル］−エチル｝−［１，３，４］チアジアゾール−２−イル）−２−フェニルアセトアミド、（ビス−２−［（１，２，４−チアジアゾール−２−イル）−５−フェニルアセトアミド］エチルスルフィド）、ラニビズマブ、ミノサイクリン、ならびにラパマイシンからなる群より選択される抗興奮毒性薬剤である、請求項９に記載の組成物。
11. 前記デンドリマーが、第１の治療薬剤と、治療薬剤、予防薬剤、および診断薬剤からなる群より選択される第２の薬剤とにコンジュゲートしている、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
12. 前記デンドリマーが、２つの治療薬剤にコンジュゲートしている、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
13. 前記デンドリマーが、抗炎症薬剤および抗興奮毒性薬剤にコンジュゲートしている、請求項１２に記載の組成物。
14. デンドリマー複合体が、ミクログリアおよび星状膠細胞に局在化し、これらを標的化するための治療的に活性な薬剤を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物。
15. デンドリマーコンジュゲートまたは複合体が、懸濁物、乳濁液、または溶液中で製剤化される、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。
16. 前記脳の神経障害、神経変性障害、または神経発達障害が、自閉症スペクトラム障害である、請求項１に記載の組成物。
17. 組成物が、ＲＴＴを有する個体に投与されることを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
18. 前記組成物が、１日おき、３日毎、４日毎、毎週、隔週、毎月、および隔月からなる群より選択される期間で、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれかに記載の組成物。
19. デンドリマー−診断薬剤コンジュゲートを含む前記組成物が投与され、次いで、脳内の前記コンジュゲートの場所が検出されることを特徴とする、脳傷害の存在、場所または程度を評価するための、請求項１から１８のいずれかに記載の組成物。
20. 前記組成物が、投与後２４時間以内に、１：１０よりも高い脳脊髄液（ＣＳＦ）中濃度の血清中濃度に対する比（ＣＳＦ対血清比）をもたらすのに有効な量で投与されることを特徴とする、請求項１から１９のいずれかに記載の組成物。
21. 前記組成物が静脈内投与されることを特徴とする請求項１から２０のいずれかに記載の組成物。