JP6521669B2

JP6521669B2 - 標的ｄｎａに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法

Info

Publication number: JP6521669B2
Application number: JP2015033825A
Authority: JP
Inventors: 真咲岩上; 精一土岐
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2015-02-24
Publication date: 2019-05-29
Anticipated expiration: 2035-02-24
Also published as: JP2015177788A; US10301636B2; WO2015129686A1; US20160362699A1

Description

本発明は、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、並びに該植物体の子孫、クローン及び繁殖材料に関する。また、本発明は、前記植物細胞の製造方法、その製造方法に用いるためのＤＮＡ構築物、並びにそのＤＮＡ構築物を含むキットに関する。

ジーンターゲッティング（ＧＴ）は、ＤＮＡの塩基配列の相同性を利用した組換えによりゲノム上の標的ＤＮＡを任意に改変する技術であり、植物の分野においても、基礎研究と育種素材の開発とにおいて非常に有望な技術である。

しかしながら、高等植物における相同組換えの頻度は低く、ＧＴを介して標的ＤＮＡを改変すべく、標的ＤＮＡに相同な配列上に任意の変異を持つベクター（ＧＴベクター）を細胞外から導入した際には、その殆どはゲノム中にランダムに挿入されてしまう。そこで、ＧＴに成功した細胞を効率よく選抜するためにポジティブ・ネガティブ選抜法が開発されている。この方法は、ＧＴベクターがゲノムにランダムに組み込まれた細胞をネガティブ選抜マーカー遺伝子の発現で排除し、ＧＴによって標的ＤＮＡに変異が導入された細胞をポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現によって単離する選抜法である（非特許文献１）。

しかしながら、この方法を用いた場合、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現カセットが標的ＤＮＡに残ってしまうため、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入したい場合はこのカセットを除去する必要がある。この点に関し、これまでに、部位特異的組換え酵素を用いてＧＴ後にポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去する系が報告されている。しかしながら、この系を用いるとマーカー除去後に部位特異的組換え酵素の認識配列が残ってしまう。短い塩基配列の挿入も周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼすことも報告されているため、自然突然変異と同等な変異の導入系を構築するに際し、ＧＴ後に足跡が残らないマーカー除去を行える技術の開発が待ち望まれていた。

マーカー遺伝子を除去する技術に関し、本発明者らは以下の知見を明らかにしている。すなわち先ず、マーカー遺伝子と、その両端に配置したヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子を有するＴ−ＤＮＡを、植物細胞に導入する。そして、レポーター遺伝子がゲノムＤＮＡにランダムに挿入された植物細胞においてＩ−ＳｃｅＩを発現させることにより、レポーター遺伝子からマーカー遺伝子を除去できることを示している。この手法において、前述の部位特異的組換え酵素を利用した場合と同様に、単に２カ所のＩ−ＳｃｅＩ認識部位を利用して選抜マーカー遺伝子を切り出しただけでは切断末端の再結合が生じ、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位がゲノムＤＮＡ内に残ってしまう。そのため、本発明者らは、さらに前記Ｔ−ＤＮＡにおいて、該認識部位の外側６００ｂｐの配列を一致（重複）させる工夫を行った。これにより、マーカー遺伝子の切り出し後に、切断末端の当該重複ＤＮＡ配列間にて相同組換えが生じ、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位も除去することができた（非特許文献２）。

しかしながら、非特許文献２に記載の方法においては、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させる前に前記重複ＤＮＡ配列間にて相同組換えが生じてしまい、かなりのマーカー遺伝子がゲノムＤＮＡから除去されてしまうため、マーカー遺伝子の発現を指標として、レポーター遺伝子がゲノムＤＮＡにランダムに挿入された植物細胞を選択することが困難であるという問題があった。

したがって、このような重複ＤＮＡ配列間の相同組換えによるマーカー遺伝子除去技術を、ＧＴに応用するためには、標的ＤＮＡに変異が導入された細胞をマーカー遺伝子の発現を指標として安定的に選択するためのさらなる技術の開発が必要であった。

ＴｅｒａｄａＲ.ら、ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年、２７巻、２９〜３７ページＹｏｎｇ−ＩｋＫｗｏｎら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．、２０１２年、５３巻、１２号、２１４２〜２１５２ページ

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能とし、さらに選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することを可能とすることを目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、植物細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみを標的ＤＮＡに導入することを可能とするため、図１に示す系を構想した。

すなわち先ず、図１の第１工程に示すように、標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入することによって、相同組換えを生じさせる。

なお、このＤＮＡ構築物においては、
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている。

そのため、植物細胞のゲノムＤＮＡ上の標的ＤＮＡと、第１及び第２の相同ＤＮＡとの相同組換えが生じることにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的ＤＮＡに導入されることになる。

そして、前記マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異等が標的ＤＮＡに導入された植物細胞を選抜する。

さらに、図１の第２工程に示すように、このようにして選抜された細胞に、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、該ヌクレアーゼにより第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を切断し、前記マーカー遺伝子を前記標的ＤＮＡから除去する。さらに切断された第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複ＤＮＡ配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去する。

したがって、この構想によれば、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する変異植物体を作製することが可能となる。

そこで、図１に示す系を実際に構築し、その有効性を検証した。その結果、植物細胞において、相同組換えによりゲノムＤＮＡ内に挿入されたマーカー遺伝子をヌクレアーゼにより除去することができ、さらにヌクレアーゼ認識部位に隣接する３０ヌクレオチドの配列を一致（重複）させることにより、該認識部位も痕跡残すことなく除去できることが初めて明らかになった。しかも、前記短鎖重複ＤＮＡ配列の長さを３０ヌクレオチドに抑えることにより、非特許文献２において示されていたような、ヌクレアーゼを発現させる前に、短鎖重複ＤＮＡ配列間における相同組換えは生じにくく、変異等が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことができた。

なお、図１３に示す系を用い、短鎖重複ＤＮＡ配列のヌクレオチド数と、ヌクレアーゼ非発現下における該短鎖重複ＤＮＡ配列間の相同組換えの頻度との関連を評価した結果、短鎖重複ＤＮＡ配列の長さを１０００ヌクレオチドとした際には、ヌクレアーゼを発現させる前であっても解析に用いた細胞塊（カルス）の約３０パーセントにおいて相同組換えが生じた細胞が存在した。一方、前記短鎖重複ＤＮＡ配列の長さを３０ヌクレオチドとした際には、ヌクレアーゼ非発現下における相同組換えの発生は完全に抑えられていた。

したがって、本発明は、標的ＤＮＡのみならず、該ＤＮＡ以外の領域においても、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみが標的ＤＮＡに導入された植物細胞の製造方法、該方法により製造された植物細胞、並びに該製造方法に用いるためのキット等に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法
（ｉ）標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている
（ｉｉ）第１及び第２の相同ＤＮＡと前記標的ＤＮＡとの相同組換えにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的ＤＮＡに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を当該標的ＤＮＡから除去する工程。
（２）前記ヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩである、（１）に記載の方法。
（３）（１）又は（２）に記載の方法により製造された、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞。
（４）標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物が導入されることにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第１及び第２の相同ＤＮＡとの相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
（５）前記ヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩである、（４）に記載の植物細胞。
（６）（３）〜（５）のうちのいずれか一に記載の細胞を含む植物体。
（７）（６）に記載の植物体の子孫又はクローンである植物体。
（８）（６）又は（７）に記載の植物体の繁殖材料。
（９）標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが、相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
（１０）（１）又は（２）に記載の方法に用いるための、下記（ａ）及び（ｂ）を含むキット
（ａ）（９）に記載のＤＮＡ構築物
（ｂ）第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを、植物細胞内に発現させるためのＤＮＡ構築物。

本発明によれば、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能となる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することも可能となる。

本発明の、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法を示す概略図である。図中、ＧＴベクター上の「Ｐｏｓｉ」と記載された矢印は、マーカー遺伝子（ポジティブ選抜マーカー遺伝子）を示し、ＧＴベクター上の対になっており、「Ｎｅｇａ」と付されている矢印はネガティブ選抜マーカー遺伝子を示す。星印は、標的ＤＮＡに導入される所望の変異部位を示す。ヌクレアーゼと付された矢印は、該ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを示し、「認識部位」は、該ヌクレアーゼが特異的に認識し切断する部位を示す。また、Ｐｏｓｉと記載された矢印に認識部位を介して付加されている白抜きの四角は、短鎖重複ＤＮＡ配列を示す。さらに、ヌクレアーゼと付された矢印の両側と、ＧＴベクター上の対になっている矢印の両側とに付されている黒い棒は、ＧＴベクター及びヌクレアーゼをコードするＤＮＡを植物細胞にアグロバクテリウムを介して導入する際に利用される、右側境界配列（ＲＢ）及び左側境界配列（ＬＢ）を示す。なお、図中の表記については、図２、３、５及び９においても同様である。本発明の植物細胞の製造方法において、標的ＤＮＡをイネＰＤＳ遺伝子座とし、ヌクレアーゼをＩ−ＳｃｅＩとした際の態様を示す概要図である。すなわち、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位（Ｉ−ＳｃｅＩフォワード、１８ヌクレオチド）を介して、ＰＤＳ遺伝子の７３１１〜７３４０位のヌクレオチドからなる領域に相同な、短鎖重複ＤＮＡ配列（ＰＤＳ７３１１−７３４０、３０ヌクレオチド）が付加されており、該マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位（Ｉ−ＳｃｅＩリバース、１８ヌクレオチド）を介して、ＰＤＳ遺伝子の７３１１〜７３４０位のヌクレオチドからなる領域に相同な、短鎖重複ＤＮＡ配列（ＰＤＳ７３１１−７３４０、３０ヌクレオチド）が付加されており、また第１のヌクレアーゼ認識部位と第２のヌクレアーゼ認識部位とは逆向きに配置されていることを示す概略図である。図中、矢頭は、Ｉ−ＳｃｅＩの切断部位を示し、その具体的な切断様式を図中の下部に示す。本発明の植物細胞の製造方法の工程（ｉｉ）において選択された植物細胞（ＧＴ候補カルス）を対象とし、標的ＤＮＡ（ＰＤＳ遺伝子座）にマーカー遺伝子が挿入されているかどうかを調べるために行われた、ＰＣＲ分析の概略図である。図３に示すＰＣＲ分析の結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。本発明の植物細胞の製造方法の工程（ｉｉ）において選択され、図３に示すＰＣＲによりマーカー遺伝子の挿入が確認された植物細胞（ＧＴ候補カルス）を対象とし、該挿入が相同組換えによるものなのか、ランダム挿入によるものなのかを調べるために行われた、サザンブロット分析の概略図である。図５に示すサザンブロット分析の結果を示す、メンブレンの写真である。なお、図中、ＷＴ（野生型イネ）以外はＧＴ候補カルスの分析結果を示す。また、このサザンブロット分析において、相同組換えが生じた場合には９９８５ｂｐのバンドのみが検出される。９９８５ｂｐ以外のバンドは、ネガティブ選抜マーカー遺伝子が削れたＧＴベクターのランダムな挿入であると考えられる。Ｉ−ＳｃｅＩを植物細胞においてβ−エストラジオールに応じて誘導的に発現させるために、該細胞内に導入されたＩ−ＳｃｅＩ発現コンストラクト（＃１０４５）の構成を示す、概略図である。＃１０４５の作製工程を示す概略図である。相同組換えにより標的ＤＮＡにおけるマーカー遺伝子の挿入が確認された植物細胞（ＧＴカルス）においてＩ−ＳｃｅＩを発現させることにより、ポジティブ選抜マーカーが除去されかどうかを調べるために行われた、サザンブロット分析の概略図である。図９に示すサザンブロット分析の結果を示す、メンブレンの写真である。図中、「ＷＴ」は野生型イネについての分析結果を示し、「Ｒ３０４Ｓ−４」、「Ｒ３０４Ｓ−１１」及び「Ｒ３０４Ｓ−１４」は、＃１０４５により形質転換する前のＧＴカルスについて分析した結果を示す。その他は、＃１０４５による形質転換体をβ−エストラジオール処理して得られた再分化個体について分析した結果を示す。また、アステリスクのついた個体はマーカー遺伝子が除去されていた個体であり、無印の個体はマーカー遺伝子が残存していた個体である。なお、図中の表記は図１２においても同様である。ＧＴカルスにおいてＩ−ＳｃｅＩを発現させることにより、マーカー遺伝子が除去されかどうかを調べるために行われた、＃１０４５を対象とするプローブを用いたサザンブロット分析の概略図である。図１１に示すサザンブロット分析の結果を示す、メンブレンの写真である。なお、図中、同一のバンドパターンを示す再分化植物体は同一細胞由来と考えられる。短鎖重複ＤＮＡ配列のヌクレオチド数と、ヌクレアーゼ非発現下における該短鎖重複ＤＮＡ配列間の相同組換えの頻度との関連を評価するためのレポーター系を示す概略図である。図１３に示すレポーター系を用いて得られた解析結果を示すグラフである。図中、横軸は、図１３に示すレポーター系における短鎖重複ＤＮＡ配列のヌクレオチド数を示し、縦軸は、図１３に示すレポーター系を導入したカルスにおいて、該レポーターの発現が検出されたカルスの割合を示す。

本発明の植物細胞の製造方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法である
（ｉ）標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている
（ｉｉ）第１及び第２の相同ＤＮＡと前記標的ＤＮＡとの相同組換えにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的ＤＮＡに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を当該標的ＤＮＡから除去する工程。

かかる方法によれば、後述の実施例において示す通り、植物細胞のゲノムＤＮＡ上の標的ＤＮＡ及び前記ＤＮＡ構築物との間で相同組換えが生じることにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれたマーカー遺伝子と所望の変異とが当該標的ＤＮＡに導入されることになる。そして、該マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異等が標的ＤＮＡに導入された植物細胞を選抜することができ、さらに、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させることにより、該ヌクレアーゼにより第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位が切断され、前記マーカー遺伝子を前記標的ＤＮＡから除去することが可能となる。次いで、切断された第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複ＤＮＡ配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去することができる。したがって、本発明によれば、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能となる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することも可能となる（図１参照）。

本発明の製造方法の工程（ｉ）において、標的ＤＮＡに変異を導入するために植物細胞に導入される「ＤＮＡ構築物」は、標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、前記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物である。

本発明において「標的ＤＮＡ」とは、変異導入の対象となるゲノム上のＤＮＡを意味する。標的ＤＮＡは、植物細胞のゲノムＤＮＡから任意に選択することができ、またタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、機能性ＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡであってもよい。さらに、標的ＤＮＡには、タンパク質やノンコーディングＲＮＡをコードしていない領域（ＵＴＲ等）のみならず、タンパク質をコードする転写産物やノンコーディングＲＮＡの発現を調節する領域も含まれる。また、標的ＤＮＡは、通常内因性のものであるが、植物細胞のゲノムＤＮＡに外来的に挿入されているＤＮＡであってもよい。

標的ＤＮＡに導入される「変異」としては、特に制限はなく、ナンセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異又はスプライス部位変異等のヌル変異であってもよく、サイレント変異であってもよい。また、標的ＤＮＡにおける変異としては、例えば、該ＤＮＡにおける、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、付加及び／又は挿入が挙げられる。さらに、標的ＤＮＡにおける変異の個数としても、特に制限はなく、１個でもよく、また複数個でもよい。

「標的ＤＮＡと相同なＤＮＡ」とは、前述のゲノム上の標的ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを意味し、本発明のＤＮＡ構築物においては、後述のマーカー遺伝子の５’側に後述の第１のヌクレアーゼ認識部位を介して付加されている第１の相同ＤＮＡと、後述のマーカー遺伝子の３’側に後述の第２のヌクレアーゼ認識部位を介して付加されている第２の相同ＤＮＡとがある。

第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡのヌクレオチド数としては、該相同ＤＮＡと標的ＤＮＡとの間で相同組換えが生じ得る数であればよく、各々通常、５００〜７０００ヌクレオチド（好ましくは１０００〜５０００ヌクレオチド、より好ましくは２０００〜４０００ヌクレオチド、さらに好ましくは約３０００ヌクレオチド（例えば、２５００〜３０００））である。

また、本発明において、第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とは、相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（本発明においては「短鎖重複ＤＮＡ配列」とも称する）である必要があり、好ましくは、相同な３０〜３００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列であり、より好ましくは、相同な３０〜１００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列である。前記短鎖重複ＤＮＡ配列のヌクレオチド数が前記下限未満では、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼにより当該ヌクレアーゼ認識部位が切断された後に、短鎖重複ＤＮＡ配列間における相同組換えが生じにくく、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位が標的ＤＮＡ内に残存し易い傾向にある。他方、前記上限を超えると、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼにより当該ヌクレアーゼ認識部位が切断される前に、短鎖重複ＤＮＡ配列間で相同組換えが生じてしまい、当該ヌクレアーゼ認識部位及びこれら認識部位に挟まれているマーカー遺伝子が標的ＤＮＡから除去され易くなる。そのため、工程（ｉｉ）において、マーカー遺伝子の発現を指標として、所望の変異等が標的ＤＮＡに導入されている植物細胞を選択しにくい傾向にある。

また、第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記変異は、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に導入されている必要がある。標的ＤＮＡに導入された前記変異を、短鎖重複ＤＮＡ配列間の相同組換えにより除去されることなく、標的ＤＮＡに残すためである。

第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡと後述のマーカー遺伝子との間に付加される、第１及び第２のヌクレオチド認識配列は、後述のヌクレアーゼにより特異的に認識されて切断される配列であればよい。また、第１及び第２のヌクレオチド認識配列は同一のヌクレアーゼに特異的に認識される配列であってもよく、異なるヌクレアーゼに各々特異的に認識される配列であってもよいが、後述の工程（ｉｉ）において発現させるヌクレアーゼを１種類とすることにより、形質転換等の作業の手間を抑えるという観点から、同一のヌクレアーゼに特異的に認識される配列であることが好ましい。さらに、第１及び第２のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される配列であり、該配列が非対称配列である場合には、第１のそれの向きは第２のそれと逆向きになっていることが好ましい。第１のヌクレオチド認識配列と第２のそれとが同じ向きとなっている場合には、ヌクレアーゼによって切断された際に、該切断によって生じた末端配列どうしの再結合が生じ易くなり、短鎖重複ＤＮＡ配列間における相同組換えが生じにくくなるからである。

第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を介して挟まれている「マーカー遺伝子」は、その発現が標的ＤＮＡが導入された少数の形質転換細胞を大多数の非形質転換細胞の中から効率良く選択するための指標となるものであればよく、例えば、導入された細胞の増殖に必須なタンパク質又は該増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子（いわゆる、薬剤耐性遺伝子等のポジティブ選抜マーカー遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子等のレポーター遺伝子が挙げられるが、マーカー遺伝子の発現を検出するために煩雑な操作（例えば、ＦＡＣＳによるスクリーニング）を必要としないという観点から、薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８等）耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｈｐｔ）、カナマイシン耐性遺伝子、ＡＬＳ（ＡＨＡＳ）遺伝子やＰＰＯ遺伝子等の除草剤耐性遺伝子が挙げられる。

また、本発明のＤＮＡ構築物においては、前記マーカー遺伝子に、導入された植物細胞において該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための制御領域が作動可能に連結されている。

該タンパク質を恒常的に発現させる場合には、制御領域として、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｇ１０−９０プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来のポリユビキチン１プロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、イネ由来の伸長因子１αプロモーター等のプロモーターと、該プロモーター等により誘導された遺伝子の転写を終結するためのターミネーター配列（エンドウマメ由来のルビスコＥ９遺伝子ターミネーター（ＴｐｅａｒｂｓＥ９）、エンドウマメ由来のルビスコ３Ａ遺伝子ターミネーター（Ｔｐｅａ３Ａ）、イネ由来の熱ショックタンパク質１７．３ターミネーター、イネ由来の熱ショックタンパク質１６．９ａターミネーター、イネ由来のアクチンターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター等）が挙げられる。さらに、遺伝子の発現効率を高めるために、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー、転写エンハンサーＥ１２、オメガ配列等のエンハンサー等のエンハンサーも、前記制御領域には含まれていてもよい。

また、タンパク質を誘導的に発現させる場合には、例えば、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、イネｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター、イネｈｓｐ８０遺伝子及びｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター、シロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子プロモーター、パセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、エストラジオール（β−エストラジオール）、テトラサイクリン、デキサメタゾン等の薬剤に応答して発現を誘導するプロモーター等の、刺激に応答して発現を誘導するプロモーターが好適に用いられる。

また、前記マーカー遺伝子の他、本発明のＤＮＡ構築物においては、第１及び第２のヌクレオチド認識配列の間に配置されている限り、他のＤＮＡが挿入されていてもよい。かかる他のＤＮＡとしては特に制限はないが、例えば、前記マーカー遺伝子等が挿入された標的ＤＮＡがコードするタンパク質等を不活性化するという観点から、ターミネーターが挙げられる。また、前記ＤＮＡ構築物を導入した後に、標的ＤＮＡからマーカー遺伝子等を除去させるためにヌクレアーゼを発現させるためのＤＮＡ構築物を再度導入する工程を省略できるという観点から、当該ヌクレアーゼを誘導的に発現させることが可能なＤＮＡ構築物（発現カセット）が挙げられる。

本発明の「ＤＮＡ構築物」において、第１の相同ＤＮＡの５’末端及び第２の相同ＤＮＡの３’末端に、導入された細胞の増殖を阻害するタンパク質又は該増殖を抑制するタンパク質をコードする遺伝子（いわゆる、ネガティブ選抜マーカー遺伝子）が付加されていてもよい（図１の「ＧＴベクター」参照）。

「ネガティブ選抜マーカー遺伝子」としては、例えば、ジフテリアトキシンαサブユニット（ＤＴ−Ａ）遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子、エクソトキシンＡ遺伝子、リシントキシンＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子、ＲＮａｓｅＴ１遺伝子、バルナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらの中では、イネカルス等に関して、ネガティブ選抜効率と、細胞間移行能がないために周囲の細胞に悪影響を及ぼさないという観点から、ＤＴ−Ａ遺伝子が好ましい。また、ネガティブ選抜マーカー遺伝子には、前述のマーカー遺伝子同様、本発明のＤＮＡ構築物においては、導入された植物細胞において該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための制御領域が作動可能に連結されている。

そして、このようなネガティブ選抜マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を植物細胞に導入した際に、ＤＮＡ構築物の一部（標的ＤＮＡと相同なＤＮＡ）が相同組換えにより標的ＤＮＡに組み込まれれば、ネガティブ選抜マーカー遺伝子は該相同ＤＮＡの外側にあるため、該細胞のゲノムＤＮＡに挿入されることはない。そのため、植物細胞は該遺伝子の影響を受けることなく増殖することができる。一方、ＤＮＡ構築物が植物細胞のゲノムＤＮＡにランダムに挿入された際には、ネガティブ選抜マーカー遺伝子も挿入されうるため、ランダム挿入が生じた植物細胞の増殖は抑制又は阻害されうる。したがって、ネガティブ選抜マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を植物細胞に導入することにより、ランダム挿入は生じず、相同組換えにより、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞を効率よく選択することができる。

以上、本発明の「ＤＮＡ構築物」について説明したが、本発明の製造方法の工程（ｉ）において、かかるＤＮＡ構築物を植物細胞に導入する方法としては特に制限はなく、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。

次に、本発明の製造方法の工程（ｉｉ）においては、第１及び第２の相同ＤＮＡと前記標的ＤＮＡとの相同組換えにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的ＤＮＡに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する。

かかる「選択」は、当業者であれば用いるマーカー遺伝子の種類に合わせて適宜公知の手法により選択して行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、工程（ｉ）において本発明のＤＮＡ構築物を導入した植物細胞を、対応する薬剤存在下にて培養することにより、標的ＤＮＡに変異等が導入された植物細胞を選択することができる。ＧＦＰ遺伝子等のレポーター遺伝子を用いた場合には、工程（ｉ）において本発明のＤＮＡ構築物を導入した植物細胞をＦＡＣＳ等にかけることにより、標的ＤＮＡに変異等が導入された植物細胞を選択することができる。

また、該工程においては、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する他、前記変異及び前記マーカー遺伝子等が相同組換えによって標的ＤＮＡに導入されたことを、ＰＣＲ法、シークエンシング法、サザンブロット法、ＣＡＰＳ（切断増幅多型配列）法等により確認してもよい。

次に、工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を当該標的ＤＮＡから除去する。

本発明における「ヌクレアーゼ」は、特定の配列を認識し、該配列内部を切断できる酵素であればよく、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼ、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等の人工ヌクレアーゼが挙げられるが、切断活性が高く、またイネ等のゲノムＤＮＡにおいて認識配列が存在せず、標的ＤＮＡ以外の領域に変異を導入しにくいという観点から、Ｉ−ＳｃｅＩが好ましい。

なお、Ｉ−ＣｒｅＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼについては、ＢｅｌｆｏｒｔＭ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１９９７年、２５巻、１７号、３３７９〜３３８８ページの記載を参照して、特にＩ−ＳｃｅＩについては、ＰｕｃｈｔａＨ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９９３年、２１巻、２２号、５０３４〜５０４０ページ、Ｓａｌｏｍｏｎ＆Ｐｕｃｈｔａ、ＥＭＢＯＪ．、１９９８年、１７巻、２０号、６０８６〜６０９５ページ等の記載も参照して、ＺＦＮについては、特許第４３５０９０７号公報、特許第４５５５２９２号公報等の記載を参照して、ＴＡＬＥＮについては、特表２０１２−５１４９７６号公報、特表２０１３−５１３３８９号公報等の記載を参照して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９については、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｅ、２０１２年、３３７巻、８１６〜８２１ページ、Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｅ、２０１３年、３３９巻、８２３〜８２６ページ等の記載を参照して、当業者であれば適宜これらのヌクレアーゼをコードするＤＮＡを調製することができる。さらに、これら文献の記載に基づき、前記第１及び第２のヌクレアーゼ認識配列も調製することもできる。

また、本発明において「ヌクレアーゼ」には、機能性タンパク質が付加していてもよい。機能性タンパク質は、ヌクレアーゼのＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側に、直接的に又は間接的に付加させることができる。機能性タンパク質としては特に制限はなく、ヌクレアーゼに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、該ヌクレアーゼの検出等をし易くするという観点から、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。また、ヌクレアーゼを安定的に核内において機能させるという観点から、核内移行シグナルが付加されていてもよい。

また、工程（ｉｉｉ）における、ヌクレアーゼの発現は、刺激に応じて誘導される発現であってもよく、恒常的な発現であってもよいが、刺激に応じて誘導される発現の方が好ましい。本発明のＤＮＡ構築物を導入する植物細胞として、事前に調製して樹立した、刺激に応じて誘導的にヌクレアーゼを発現できる植物細胞を用いれば、その後の形質転換にかかる手間を省き、時間も短縮することができるからである。さらに、かかる手間及び時間を抑えることにより、カルスを経ることに伴う自然変異の生じ易さや、培養期間の長さに伴う再分化効率の低下等も抑えることができることから、ヌクレアーゼの発現は、刺激に応じて誘導される方が好ましい。

また、工程（ｉｉｉ）において、ヌクレアーゼを誘導的に発現させる方法としては、例えば、該ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子を誘導的に発現させるための制御領域を備えたＤＮＡ構築物を、導入した植物細胞を発現誘導の条件である刺激の存在下培養する方法が挙げられる。

ヌクレアーゼを誘導的に発現させるための当該ＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する時期としては、工程（ｉ）において、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含む前述のＤＮＡ構築物の導入と同時であってもよく、それよりも前であってもよい。さらには、工程（ｉｉ）において、前記マーカー遺伝子の発現を指標とする選択の前であってもよく、その選択の後であってもよいが、前述の観点から、工程（ｉ）の前に導入し、刺激に応じて誘導的にヌクレアーゼを発現できる植物細胞として樹立しておくことが好ましい。

また、ヌクレアーゼを「誘導的に発現させるための制御領域」としては、上述の「本発明のＤＮＡ構築物」の説明の際に列挙した「誘導的に発現させる場合の制御領域」を用いることができるが、薬剤処理の有無により発現の有無を厳密に制御できる観点から、β−エストラジオールに応答して発現を誘導するプロモーターが好ましい。

かかるプロモーターとしては、後述の実施例において示すような、大腸菌のＳＯＳレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）のリプレッサーであるＬｅｘＡの部分配列、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）由来のＶＰ１６の転写活性ドメイン及びエストロゲン受容体の制御領域（ＥＲ）が融合した合成転写活性化因子ＸＶＥと、β−エストラジオールとが結合することによって活性化されるＬｅｘＡ応答配列を備えたプロモーター（例えば、ＰＬｅｘ−４６）が挙げられる（図７参照）。

一方、ヌクレアーゼを恒常的に発現させる方法としては、特に制限はないが、例えば、該ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子を恒常的に発現させるための制御領域を備えたＤＮＡ構築物を、工程（ｉｉ）にて選択された細胞に導入する方法が挙げられる。さらに、導入された該ＤＮＡ構築物は、恒常かつ安定的にヌクレアーゼを発現させるという観点から、植物細胞のゲノムＤＮＡに挿入されていることが好ましい。

ヌクレアーゼを「恒常的に発現させるための制御領域」としては、上述の「本発明のＤＮＡ構築物」の説明の際に列挙した「恒常的に発現させる場合の制御領域」を用いることができる。

さらに、ヌクレアーゼを恒常的又は誘導的に発現させるためのＤＮＡ構築物には、該ＤＮＡ構築物が導入された植物細胞を効率よく選択できるという観点から、前述のレポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子が含まれていてもよい。

また、ヌクレアーゼを恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物を植物細胞に導入する方法としては特に制限はなく、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。

そして、このようにして、工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、前述のヌクレアーゼを発現させることにより、該ヌクレアーゼにより第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位が切断され、前記マーカー遺伝子を前記標的ＤＮＡから除去することが可能となる。さらに切断された第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複ＤＮＡ配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去することができ、ひいては、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能となる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することも可能となる（図１参照）。

また、本発明の製造方法においては、前記短鎖重複ＤＮＡ配列間における相同組換え効率を向上させるという観点から、ＲｅｃＱｌ４及び／又はＥｘｏ１を前記ヌクレアーゼと共に発現させてもよい。ＲｅｃＱｌ４及びＥｘｏ１については非特許文献２の記載を参照のこと。

＜植物細胞＞
前述の通り、本発明の製造方法によれば、標的ＤＮＡに所望の変異のみが導入されている植物細胞を得ることができる。したがって、本発明は、前記製造方法により製造された、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞を提供するものである。

また、後述の実施例において示す通り、相同組換えにより第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と所望の変異とが標的ＤＮＡ内に挿入された植物細胞は、本発明において初めて作製されたものであり、前述の通り、標的ＤＮＡに所望の変異のみが導入された植物細胞を作製する上で有用である。

したがって、本発明は、標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、上記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物が導入されることにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第１及び第２の相同ＤＮＡとの相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞をも提供するものである。

本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等の単子葉植物や、タバコ、ジャガイモ、ナス、ナタネ等の双子葉植物が挙げられる。また、「植物細胞」には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。

＜植物体等＞
本発明の植物細胞は、再生させることにより植物体を得ることができる。特に、本発明の製造方法により製造された植物細胞は、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有しているため、このような植物細胞から再生させた植物体は、当該変異に伴い、表現型が変化しうる。したがって、本発明の方法を利用すれば、植物の育種を効率的に行うことが可能であり、また標的ＤＮＡの機能を効率よく分析することが可能となる。

植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、アラビドプシスであればＡｋａｍａら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：７−１１，１９９２）に記載の方法が挙げられ、イネであればＤａｔｔａ（ＩｎＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＴｏＰｌａｎｔｓ（ＰｏｔｒｙｋｕｓＩａｎｄＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇＥｄｓ．）ｐｐ６６−７４，１９９５）に記載された方法、Ｔｏｋｉら（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３−１５０７，１９９２）に記載された方法、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２，１９９１）に記載された方法及びＨｉｅｉら（ＰｌａｎｔＪ．６：２７１−２８２，１９９４）に記載された方法が挙げられ、オオムギであれば、Ｔｉｎｇａｙら（ＰｌａｎｔＪ．１１：１３６９−１３７６，１９９７）に記載された方法、Ｍｕｒｒａｙら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔ２２：３９７−４０２，２００４）に記載された方法、及びＴｒａｖａｌｌａら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔ２３：７８０−７８９，２００５）に記載された方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：５８１，１９８９）に記載された方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：６０３，１９９０）に記載された方法が挙げられ、トマトであればＭａｔｓｕｋｕｒａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４：１８３７−１８４５，１９９３）に記載された方法が挙げられ、ダイズであれば、特許公報（米国特許第５，４１６，０１１号）に記載された方法が挙げられ、ジャガイモであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，７８：５９４，１９８９）に記載された方法が挙げられ、タバコであればＮａｇａｔａとＴａｋｅｂｅ（Ｐｌａｎｔａ，９９：１２，１９７１）に記載された方法が挙げられる。ここに挙げた以外の植物についても、例えば、田部井豊編「形質転換プロトコール植物編」（（株）化学同人発行）に記載された方法を用いることによって、当業者であれば植物体への再生が可能である。

一旦、このようにして標的ＤＮＡに変異が導入された細胞を含む植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって、本発明には、本発明の植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。

また、本発明の製造方法において製造された植物細胞の標的ＤＮＡにおいては、所望の変異のみが導入されているが、通常、該細胞においては外来的に導入されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡが残存することとなる。しかしながら、本発明の製造方法において製造された植物細胞を含む植物体と、野生型のそれとを交配させ、戻し交配を行うことにより、ヌクレアーゼをコードするＤＮＡをも除去することができる。

また、本発明は、本発明の植物細胞、植物体、繁殖材料から製造される加工物をも提供する。本発明における加工物としては特に制限はなく、従来より植物から作られている加工物全般のことであり、例えば、植物体からの抽出液、植物体の乾燥粉末、加工食品が挙げられる。より具体的には、イネであれば米飯及び煎餅等、小麦であればパン及び麺類等、トウモロコシであればコーン油、コーンスターチ及びコーンチップス等、ダイズであれば大豆油、豆腐及び納豆等、ジャガイモであればポテトチップス及びデンプン等、トマトであればケッチャップ等、キャノーラであればキャノーラ油等が挙げられる。

＜キット等＞
前述の通り、本発明のＤＮＡ構築物は、本発明の製造方法において有用であり、その有効性も本発明において初めて示されたものである。したがって、本発明は、標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、上記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物をも提供するものである。

また、前述の通り、ヌクレアーゼを植物細胞内で恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物も本発明の製造方法において有用である。したがって、本発明は、本発明の製造方法に用いるための、下記（Ａ）及び（Ｂ）を含むキットをも提供するものである。
（Ａ）標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、上記（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＤＮＡ構築物
（Ｂ）第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを植物細胞内に発現させるためのＤＮＡ構築物。

これらＤＮＡ構築物については各々、上述の本発明の製造方法における工程（ｉ）及び（ｉｉｉ）についての記載の通りであるが、これらの形態は１本鎖ＤＮＡであってもよく、２本鎖ＤＮＡであってもよい。また、直鎖状ＤＮＡであってもよく、環状ＤＮＡであってもよく、前述の植物細胞への導入方法に適した形態に調製し得る。

例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に導入する場合には、前記ＤＮＡ構築物の形態として、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系又はｐＳＭＡ系のベクター等が挙げられ、また、より好適な形態として、バイナリーベクター系のベクター（ｐＺＨＧ、ｐＫＯＤ４、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＧ２１１３等）が挙げられる。

また、電気穿孔法等の他の方法により植物細胞に導入する場合には、前記ＤＮＡ構築物の形態として、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等のｐＵＣ系ベクターが挙げられる。さらに、ＣａＭＶ、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターの形態も、前記ＤＮＡ構築物はとり得る。

また、このようなＤＮＡ構築物は、後述の実施例において示す通り、ＰＣＲ法、制限酵素処理、クローニング法等の公知の遺伝子組換え技術を利用して当業者であれば適宜調製することができる、また、市販の自動化ＤＮＡ配列合成装置等を用いて化学的に合成することもできる。

さらに、（Ａ）に記載のＤＮＡ構築物の作製において、当業者であれば部位特異的変異誘発法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．８２，４８８−４９２に記載の方法）等により、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡに、所望の変異を導入することができる。

また、ヌクレアーゼを植物細胞内に高発現させるという観点から、（Ｂ）に記載のＤＮＡ構築物には、該ＤＮＡ構築物を導入する植物のコドン使用頻度に最適化したヌクレアーゼをコードするＤＮＡが挿入されていてもよい。

以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

本発明者らは、ジーンターゲティング（ＧＴ、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法）において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能とし、その後、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することを可能とするため、図１に示す系を構想した。

すなわち先ず、図１の第１工程に示すように、標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子（ポジティブ選抜マーカー遺伝子）とを含むＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入することによって、相同組換えを生じさせる。

なお、このＤＮＡ構築物においては、
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが、相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている。

また、この際、前記相同ＤＮＡの外側にネガティブ選抜マーカー遺伝子を配することにより、前記ＤＮＡ構築物が、標的ＤＮＡ以外の領域にランダムに挿入された細胞は排除されることとなる。

そこで、以下に示す方法にて、図１に示す系を構築し、その有効性を検証した。なお、本実施例においては、標的ＤＮＡ及び該ＤＮＡに導入する変異として、イネフィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＰＤＳ））遺伝子及びＲ３０４Ｓ変異（ＣＧＡ−＞ＡＧＴ）を選択した。また、ヌクレアーゼとしてＩ−ＳｃｅIを選択し、ポジティブ選抜マーカー遺伝子及びネガティブ選抜マーカー遺伝子として、ＮＰＴＩＩ遺伝子及びＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンαサブユニット）遺伝子を各々選択した。

（実施例１）
＜ジーンターゲッティング（ＧＴ）ベクターの構築＞
ＰＤＳ遺伝子座を標的としたＧＴベクター（ポジティブ・ネガティブ選抜ベクター）を以下のようにして構築した。

該構築において、先ず、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の上流ＰＤＳゲノム配列をクローニングした。すなわち、イネ（品種：日本晴）からゲノムＤＮＡを「ＥｎｄｏＭ.ら、ＰｌａｎｔＪ．、２００７年、５２巻、１５７〜１６６ページ」に記載の方法で調製した。当該ゲノムＤＮＡを鋳型に、２回のＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にクローニングした。クイックチェンジＩＩＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により、ＰＣＲ産物中のＰａｃＩ認識部位をＨｐａＩ認識部位に置換した後、ＡｓｃＩ認識部位及びＰａｃＩ認識部位を利用してＰＣＲ産物を切り出し、同じくＡｓｃＩ及びＰａｃＩにて処理したｐＥ（Ｌ１−Ｌ４）にクローニングした。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
＜１ｓｔＰＣＲ＞
ＡｓｃＰＤＳ４．７ｋＦ５’−ｔｔｃｔｇｇｃｇｃｇｃｃＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号：１）
Ｉ−ＳｃｅＩＰＤＳ７．３ｋＲ５’−ＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡ−３’（配列番号：２）
＜２ｎｄＰＣＲ＞
ＡｓｃＰＤＳ４．７ｋＦ５’−ｔｔｃｔｇｇｃｇｃｇｃｃＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号：３）
ＰａｃＩ−ＳｃｅＩＰＤＳ７．３ｋＲ５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣＴ−３’（配列番号：４）。

次に、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の下流ＰＤＳゲノム配列をクローニングした。すなわち、上述のイネ（品種：日本晴）ゲノムＤＮＡを鋳型に、２回のＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にクローニングした。クイックチェンジＩＩＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により、ＰＣＲ産物中にＲ３０４Ｓ変異（ＣＧＡ−＞ＡＧＴ）を導入した後、ＡｓｃＩ認識部位及びＰａｃＩ認識部位を利用してＰＣＲ産物を切り出し、同じくＡｓｃＩ及びＰａｃＩにて処理したｐＥ（Ｌ３−Ｌ２）にクローニングした。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
＜１ｓｔＰＣＲ＞
Ｉ−ＳｃｅＩＰＤＳ７．３ｋＦ５’−ＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＣＴ−３’（配列番号：５）
ＰａｃＰＤＳ１０ｋＲ５’−ＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡａｇｔｇａｇｔｇｃａａａｇｇｇａｇａＴＡＡＧＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号：６）
＜２ｎｄＰＣＲ＞
ＡｓｃＩ−ＳｃｅＩＰＤＳ７．３ｋＦ５’−ＡＡＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴ−３’（配列番号：７）
ＰａｃＰＤＳ１０ｋＲ５’−ＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡａｇｔｇａｇｔｇｃａａａｇｇｇａｇａＴＡＡＧＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号：６）。

そして、ＬＲクロナーゼＩＩプラス（登録商標、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ｐＫＤＯ４、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ４）ＰＤＳ５’、ｐＥ（Ｒ４−Ｒ３）ＴａｃＰ３５ＳｎｐｔＩＩＴｈｓｐ１７．３、ｐＥ（Ｌ３−Ｌ２）ＰＤＳ３’を連結することにより、ＧＴベクターを構築した。

このようにして構築したＧＴベクターにおいて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）の両端にはＩ−ＳｃｅＩの認識配列１８ｂｐが存在する。そのため、図１に示す通り、該ＧＴベクターを用いた形質転換により、該遺伝子がＰＤＳ遺伝子座（標的ＤＮＡ）に導入されている植物細胞において、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させた場合には、Ｉ−ＳｃｅＩ配列が切断され、ポジティブ選抜マーカー遺伝子が該標的ＤＮＡから除去されることとなる。しかし、単に２カ所のＩ−ＳｃｅＩ認識部位を利用してポジティブ選抜マーカー遺伝子を切り出しただけでは切断末端の再結合が生じ、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位が残ってしまう。そこで、図２に示す通り、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位に隣接する領域において、イネゲノム配列を３０ｂｐ重複させておき、マーカー遺伝子除去後に切断末端の短鎖重複ＤＮＡ配列（ＰＤＳ７３１１−７３４０）間で相同組換えを生じさせることで、一切痕跡を残さずにポジティブ選抜マーカーを除去できる仕掛けが、ＧＴベクターには施してある。さらに、当該ＧＴベクターにおいて、図２に示す通り、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の５’末端側に隣接して配置するＩ−ＳｃｅＩ認識部位と、３’末端側に隣接して配置するＩ−ＳｃｅＩ認識部位とは逆向きにしてある。これらＩ−ＳｃｅＩ認識部位が同じ向きとなっている場合には、Ｉ−ＳｃｅＩによって切断された際に、該切断によって生じた末端配列どうしの再結合が生じ易くなり、前述の短鎖重複ＤＮＡ配列間における相同組換えが生じにくくなるからである。

なお、図２に記載の、短鎖重複ＤＮＡ配列「ＰＤＳ７３１１−７３４０」、並びにＩ−ＳｃｅＩ認識部位「Ｉ−ＳｃｅＩフォワード」及び「Ｉ−ＳｃｅＩリバース」の配列を、各々配列番号：８〜１０に示す。

（実施例２）
次に、前記ＧＴベクターを用い、以下に示す方法にて、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する植物体の作製を試みた。

すなわち先ず、前記ＧＴベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムＥＨＡ１０５株に導入した。そして、イネへの形質転換を、「ＴｏｋｉＳ．、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、１９９７年、１５巻、１６〜２１ページ」及び「ＴｏｋｉＳ.ら、ＰｌａｎｔＪ．、２００６年、４７巻、９６９〜９７６ページ」に記載された方法（アグロバクテリウム法）により行った。より具体的には、イネ種子（品種：日本晴）を滅菌し、カルス化培地に置床した後、３週間培養し、生じたカルスに前述のＧＴベクターを有するアグロバクテリウムを感染させた。イネカルスとアグロバクテリウムとの共存培養を行った後、アグロバクテリウムを除菌した。次いで、イネカルスを選抜培地（Ｇ４１８３５ｍｇ／Ｌ入Ｎ６Ｄ固形培地）に置床し、ＧＴ候補カルス（Ｇ４１８耐性カルス）の選抜を行った。得られた結果を後述の表１に示す。

なお、この選抜培地での培養において、ＧＴベクターが形質転換されていない細胞はＧ４１８感受性を示し、増殖しない。ＧＴベクターが形質転換されたが、イネゲノム中にランダムに挿入された細胞はネガティブ選抜マーカーであるジフテリアトキシンαサブユニット（ＤＴ−Ａ）により増殖することができない。したがって、選抜培地上ではＧＴに成功したカルスが増殖することとなる。

次に、Ｇ４１８を含む培地上で増殖してきたカルスからゲノムＤＮＡを調製し、これらカルスにおいて標的ＤＮＡ（ＰＤＳ遺伝子座）にポジティブ選抜マーカー遺伝子が挿入されているか、ＰＣＲによる確認を行った。ＧＴに成功するとＰＤＳの第６イントロン内にポジティブ選抜マーカー遺伝子が挿入される。そこで、ポジティブ選抜マーカー遺伝子上に位置するフォワードプライマー（Ｔｈｓｐ１７．３Ｆ）とＧＴベクター上には含まれないＰＤＳ下流遺伝子の下流に位置するリバースプライマー（ＰＤＳ−１０．１５ｋＲ）とを用いたＰＣＲを行った。また、ポジティブ選抜マーカー遺伝子上に位置するリバースプライマー（ＴａｃｔＰ３５Ｓ５５４Ｒ）とＧＴベクター上には含まれないＰＤＳ上流に位置するフォワードプライマー（ＰＤＳ−４．２ｋＲ）とを用いたＰＣＲを行った（図３参照）。得られた結果を後述の表１に示す。また、結果のいくつかの例を図４に示す。なお、これらのプライマーの組み合わせでは、ランダムに挿入されたＧＴベクターは増幅されず、ＧＴにより内在ＰＤＳ遺伝子座にポジティブ選抜マーカー遺伝子が挿入された場合のみＰＣＲ産物が増幅されることとなる。また、使用したプライマーの配列は以下の通りである。
Ｔｈｓｐ１７．３Ｆ５’−ＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＴＣＡＡＴＣＣＣＴＴ−３’（配列番号：１１）
ＰＤＳ−１０．１５ｋＲ５’−ＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴ−３’（配列番号：１２）
ＰＤＳ−４．２ｋＦ５’−ＴＧＡＴＧＧＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号：１３）
ＴａｃｔＰ３５Ｓ５５４Ｒ５’−ＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＴＡＴＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号：１４）。

さらに、サザンブロット法により、ＧＴを確認した（図５参照）。すなわち、前述のＰＣＲによって同定したＧＴ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをＳａｃＩにて処理し、ポジティブ選抜マーカー遺伝子であるＮＰＴＩＩ遺伝子上に位置するプローブを用いた検出を行った。得られた結果を表１及び図６に示す。なお、サザンブロットは「ＥｎｄｏＭ.ら、ＰｌａｎｔＪ．、２００７年、５２巻、１５７〜１６６ページ」に記載の方法にて行った。また、検出に用いたプローブ（ＤＩＧプローブ）作製に用いたプライマー及びそれらの配列は以下の通りである。
ｎｐｔＩＩ＋２３Ｆｗ５’−ＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣ−３’（配列番号：１５）
ｎｐｔＩＩ＋５２７Ｒｖ５’−ＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＧＡ−３’（配列番号：１６）。

表１に示す通り、上述の形質転換実験を２回行い、計１４４０個のカルスをＧＴベクターの形質転換に用い、５５個のＧ４１８耐性カルスを得た。そして、これら５５個のＧ４１８耐性カルスからＤＮＡを調製し、前述のＰＤＳ遺伝子座においてＧＴが生じた場合のみ増幅するＰＣＲを行った結果、１１カルスにおいて増幅が見られた。

さらに、この１１カルスについて、サザンブロット解析によるＧＴの確認を行い、ポジティブ選抜マーカー遺伝子上に位置するプローブにより検出を行った結果、表１及び図６に示す通り、８カルス（ＧＴカルス）において、ＧＴが生じた際に出現する約１０ｋｂのバンドが検出された。したがって、ＧＴ効率は、供試カルスに対して０．６％（８／１４４０）、ポジティブ・ネガティブ選抜で得られたカルスに対しては１４．５％（８／５５）であった。

次に、標的ＤＮＡにおけるＧＴが確認された前述のカルスにおいて、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させ、該標的ＤＮＡからポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去した。

該除去に際して先ず、Ｉ−ＳｃｅＩをカルス内にて刺激（β−エストラジオール）に応じて誘導的に発現させるために、Ｉ−ＳｃｅＩ発現コンストラクト（＃１０４５、図７参照）を図８に示す工程にて作製した。すなわち、ｐＥＲ８（ＺｕｏＪ.ら、ＰｌａｎｔＪ．、２０００年、２４巻、２６５〜２７３ページ参照）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中のＧＦＰをコードするＤＮＡをＩ−ＳｃｅＩをコードするＤＮＡに置換することにより、β−エストラジオール依存的にＩ−ＳｃｅＩを発現させるためのベクター（＃１０４５）を構築すべく、先ずｐＥＲ８中のＰＬｅｘ−４６とＴｐｅａ３Ａとの間を、ｐＵＣ１９ＡＭ（ｐＵＣ１９のＭＣＳの両端にＡｓｃＩ認識部位及びＰａｃＩ認識部位を付加したベクター）中のＳｐｈＩ認識部位及びＫｐｎＩ認識部位間に置換したベクター（＃１０４１）を作製した。次に、ＰＬｅｘ−４６とＴｐｅａ３Ａとの間にある、ＸｈｏＩ認識部位及びＳｐｅＩ認識部位にＮＬＳ−ＦＬＡＧ−Ｉ−ＳｃｅＩをクローニングし、＃１０４２を作製した。また、バイナリーベクターであるｐＺＨ２Ｂ（ＫｕｒｏｄａＭ.ら、ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ、２０１０年、７４巻、１１号、２３４８〜２３５１ページ参照）のＳａｌＩ認識部位及びＫｐｎＩ認識部位に、ｐＥＲ８中のＰＧ１０−９０とＴｐｅａｒｂｓＥ９との間をクローニングし、＃１０６を作製した。そして、＃１０６のＡｓｃＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位との間に、＃１０４２のＡｓｃＩ認識部位とのＭｌｕＩ認識部位との間をクローニングし、＃１０４５を作製した。なお、使用したＩ−ＳｃｅＩ遺伝子（ＰｕｃｈｔａＨ.ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９９３年、２１巻、２２号、５０３４〜５０４０ページ参照）は、Ｐｕｃｈｔａらから分譲を受けた遺伝子である。

次に、ＧＴ当代のカルスにおいてポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去するため、前述の通りＧＴが確認された８個のＧＴカルスに対して、＃１０４５を有するアグロバクテリウムを感染させ、その後、ハイグロマイシンを含むＮ６Ｄ固形培地上で２週間培養し、＃１０４５形質転換細胞の選抜を行った。なお、形質転換は、前述のＧＴベクターを用いた形質転換同様に行った。

次に、＃１０４５を形質転換したＧＴカルスを、β−エストラジオール５ｕＭを含むＮ６Ｄ固形培地に移植し、Ｉ−ＳｃｅＩの発現誘導を行った。当該培地上でカルスを２週間培養し、増殖及びＩ−ＳｃｅＩの発現誘導を行った後、β−エストラジオールを含まない再分化培地に移植し、カルスから植物体の再生を行い、９５個体の再分化個体を得た。

次に、得られた再分化個体において、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させたことにより、標的ＤＮＡからポジティブ選抜マーカー遺伝子が除去されたかどうかを分析するため、これら再分化個体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子を含む断片を増幅するＰＣＲを行った。
ＰＤＳ−６．２ｋＦ５’−ＡＧＧＴＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＧＧＡＡＧＴ−３’（配列番号：１７）
ＰＤＳ−８．３３ｋＲ５’−ＴＣＣＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡ−３’（配列番号：１８）。

なお、このＰＣＲにおいて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子が残っているＰＤＳ遺伝子座では約６ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、野生型ＰＤＳ遺伝子座及び、ＧＴ後にポジティブ選抜マーカー遺伝子が除去されたＰＤＳ遺伝子座では約２ｋｂのＰＣＲ産物が生じることとなる。

さらに、前記ＰＣＲにてポジティブ選抜マーカー遺伝子が除去されたと考えられたカルスについて、前記ＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスにより、それらの配列を同定した。なお、ＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスした場合、相同組換えによって痕跡無くマーカー遺伝子が除去されている個体では、点変異（Ｒ３０４Ｓ変異（ＣＧＡ−＞ＡＧＴ））が導入された箇所のみダブルピークとなる。短鎖重複ＤＮＡ配列が重複して残存している場合や、塩基の挿入、欠失があった場合には、野生型遺伝子座由来のＰＣＲ産物と混在するため、波形が二重になる。そのため、波形が二重になったＰＣＲ産物に関しては、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にクローニングし、そのシークエンスを解析した。得られた結果を表２に示す。シークエンス解析には、ポジティブ選抜マーカーの上流に位置するプライマー（ＰＤＳ−７．２ｋＦ）を用いた。該プライマーの配列は以下の通りである。
ＰＤＳ−７．２ｋＦ５’−ＴＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＴ（配列番号：１９）。

そして、ダイレクトシークエンス及び、クローニングしたＰＣＲ産物をシークエンス解析した結果、表２に示す通り、Ｒ３０４Ｓ変異を含むが、相同組換えによってポジティブ選抜マーカーがきれいに除去されており、塩基の挿入や欠失、短鎖重複ＤＮＡ配列が部分的にも重複して残存することなくきれいに繋がっている配列が検出された植物体９個体を同定した（表２中「痕跡なし」参照）。またこの他に、短鎖重複ＤＮＡ配列の一部が重複して残存している個体が３個体、短鎖重複ＤＮＡ配列とは異なる配列が挿入されている個体が１個体あった（表２中「重複配列残存」及び「挿入、欠失あり」参照）
さらに、痕跡無くポジティブ選抜マーカーが除去されていることが明らかとなった植物体のＤＮＡを用いて、図９に示すサザンブロット解析を行った。ＧＴ後に痕跡無くマーカーが除去された場合、ＰＤＳ遺伝子座に残るのは点変異のみである。すなわち、当該植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳａｃＩにて処理した。次いで、それら処理産物を電気泳動にて分画し、ＰＤＳ遺伝子をプローブとしたサザンブロット解析を行い、野生型のそれと同一のバンドパターンになることを確認した。得られた結果を図１０に示す。なお、検出に用いたＤＩＧプローブの作製に用いたプライマーは以下の通りである。
ＰＤＳ−８．７ｋＦ５’−ＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＴＡＡＣＴＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴ−３’（配列番号：２０）
ＰＤＳ−９．３３ｋＲ５’−ＴＴＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号：２１）。

図１０に示す通り、サザンブロット解析の結果、ＰＣＲ産物のシークエンス解析によって、痕跡無くマーカーが除去されていることが確認された個体では野生型と同じバンドパターンを示し、マーカーが抜けていなかった個体では＃１０４５を形質転換する前のＧＴカルスと同じバンドパターンを示した。

また、図１０に示したメンブレンをストリピングし、＃１０４５上に位置するＨＰＴ遺伝子をプローブにサザンブロットを行った（図１１参照）。その結果、図１２に示す通り、Ｉ−ＳｃｅＩのゲノム内への挿入が確認された。

したがって、前記９５個体のＧＴカルスから、９個体のポジティブ選抜マーカーが除去された形質転換イネ個体（９．５％）を得ることができた。

（参考例１）
非特許文献２においては、マーカー遺伝子と、その両端に配置したヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子を有するＴ−ＤＮＡを、植物細胞に導入し、レポーター遺伝子がゲノムＤＮＡにランダムに挿入された植物細胞においてＩ−ＳｃｅＩを発現させることにより、レポーター遺伝子からマーカー遺伝子を除去できることが示されている。さらに前記Ｔ−ＤＮＡにおいて、該認識部位の外側６００ｂｐの配列を一致（重複）させることにより、マーカー遺伝子の切り出し後に、切断末端の当該重複ＤＮＡ配列間にて相同組換えが生じ、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位も除去することができることが示されている。

しかしながら、非特許文献２に記載の方法においては、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させる前に前記重複ＤＮＡ配列間にて相同組換えが生じてしまい、かなりのマーカー遺伝子がゲノムＤＮＡから除去されてしまうため、マーカー遺伝子の発現を指標として、レポーター遺伝子がゲノムＤＮＡにランダムに挿入された植物細胞を選択することが困難となる。

一方、本発明によれば、上述の通り、短鎖重複ＤＮＡ配列を少なくとも３０ヌクレオチドとすることにより、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことができる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することもできる。

そこで、短鎖重複ＤＮＡ配列のヌクレオチド数と、ヌクレアーゼ非発現下における該短鎖重複ＤＮＡ配列間の相同組換えの頻度との関連を、図１３に示すレポーター系を構築して評価した。

すなわち先ず、図１３に示す、マーカー遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）と、その両端に配置したＩ−ＳｃｅＩの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を有するＴ−ＤＮＡを構築した。

なお、当該Ｔ−ＤＮＡにおいて、該認識部位の外側１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド又は３０ヌクレオチドの配列は一致（重複）させてある。そのため、このＴ−ＤＮＡが導入されたイネカルスにおいて、これら重複配列間で相同組換えが生じた場合には、マーカー遺伝子及び認識部位がレポーター遺伝子より除去される。そして、該遺伝子が再構築され、コードするルシフェラーゼタンパク質の発現が可能となるため、その基質であるルシフェリンの分解の際に生じる化学発光を通して、前記相同組換えの有無を解析することができる。

前記重複配列の長さが異なる３種類のＴ−ＤＮＡを各々、上述の実施例同様の方法にてイネカルスに導入し、その２カ月後にこれらカルスにおけるルシフェラーゼによる化学発光を検出した。得られた結果を図１４に示す。

図１４に示す通り、重複配列を１０００ヌクレオチドとした系においては、Ｉ−ＳｃｅＩを発現させなくとも、２４カルス中、一部であってもルシフェラーゼによる発光が検出されたカルスは８個あり、約３０％ものカルスにおいて、該重複配列間で相同組換えが生じていることが認められた。一方、重複配列を５００ヌクレオチドとすることにより、その頻度を約１５％まで低減させることができ、さらに３０ヌクレオチドとすることで、Ｉ−ＳｃｅＩ非発現下における相同組換えの発生を完全に抑えられることが明らかになった。

導入する変異そのものが選抜形質を付与しない遺伝子をターゲットとするＧＴでは、外来の選抜マーカーを利用する必要がある。また、内在遺伝子に必要最低限の改変を加えたい場合、ひいては、自然突然変異と同等の変異の導入を目的とする場合、ＧＴ後に選抜マーカーを痕跡なく除去する技術は非常に重要である。

上述の通り、本発明によれば、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的ＤＮＡに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能とし、その後、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することが可能となる。

したがって、本発明の標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法等は、遺伝子の機能解析等の基礎研究において有用である。また、必要最低限の遺伝子改変により作出された有用作物は、従来の遺伝子組換え作物以上に社会的に受容され易いと考えられることから、本発明は育種素材の開発において非常に有用である。

配列番号：１〜７及び１１〜２１
＜２２３＞人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：８
＜２２３＞ＰＤＳ７３１１−７３４０
配列番号：９
＜２２３＞Ｉ−ＳｃｅＩフォワード
配列番号：１０
＜２２３＞Ｉ−ＳｃｅＩリバース

Claims

下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法
（ｉ）標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｅ）の特徴を有するＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが、相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている
（ｅ）第１及び第２のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される非対称配列であり、前記ＤＮＡ構築物において、第１のヌクレオチド認識配列の向きと第２のヌクレオチド認識配列の向きとが逆になっている
（ｉｉ）第１及び第２の相同ＤＮＡと前記標的ＤＮＡとの相同組換えにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的ＤＮＡに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を当該標的ＤＮＡから除去する工程。
前記ヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩである、請求項１に記載の方法。
標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｅ）の特徴を有するＤＮＡ構築物が導入されることにより、第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第１及び第２の相同ＤＮＡとの相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが、相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている
（ｅ）第１及び第２のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される非対称配列であり、前記ＤＮＡ構築物において、第１のヌクレオチド認識配列の向きと第２のヌクレオチド認識配列の向きとが逆になっている。
前記ヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩである、請求項３に記載の植物細胞。
標的ＤＮＡと相同な第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡと、マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物であって、下記（ａ）〜（ｅ）の特徴を有するＤＮＡ構築物
（ａ）前記マーカー遺伝子の５’側に第１のヌクレアーゼ認識部位を介して第１の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｂ）前記マーカー遺伝子の３’側に第２のヌクレアーゼ認識部位を介して第２の相同ＤＮＡが付加されており、
（ｃ）第１の相同ＤＮＡの３’末端領域と第２の相同ＤＮＡの５’末端領域とが、相同な３０〜５００ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列（短鎖重複ＤＮＡ配列）であり、
（ｄ）第１の相同ＤＮＡ及び第２の相同ＤＮＡの少なくとも１のＤＮＡにおいて、前記短鎖重複ＤＮＡ配列以外の領域に所望の変異が導入されている
（ｅ）第１及び第２のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される非対称配列であり、前記ＤＮＡ構築物において、第１のヌクレオチド認識配列の向きと第２のヌクレオチド認識配列の向きとが逆になっている。
請求項１又は２に記載の方法に用いるための、下記（ａ）及び（ｂ）を含むキット
（ａ）請求項５に記載のＤＮＡ構築物
（ｂ）第１及び第２のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを、植物細胞内に発現させるためのＤＮＡ構築物。