JP6516255B2 - アレルギー型薬物性肝障害の評価方法 - Google Patents
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Description
(1)検査対象薬物を含有する培地中で、被検者由来の免疫細胞を、細胞は透過しないが薬物及びその代謝物は透過する膜を隔てた状態で、薬物代謝酵素を発現した肝細胞と共培養する工程、および
前記工程後の免疫細胞を解析する工程、を含む、アレルギー型薬物性肝障害の評価方法。(2)共培養工程が、液体培地を入れて底面に肝細胞を接着培養した第1の培養容器内に、底面に透過性膜を有する第2の培養容器を、肝細胞に接触せず、かつ液体培地が内部に収容される状態で設置し、当該第2の培養容器内で免疫細胞を入れて培養する工程である、(1)に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
(3)膜の孔サイズが直径0.20μm〜1.0μmである、(1)または(2)に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
(4)薬物代謝酵素がシトクロムP450である、(1)〜(3)のいずれかに記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
(5)免疫細胞がヒト末梢血単核細胞である、(1)〜(4)のいずれかに記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
(6)免疫細胞の解析が、免疫細胞の表面マーカーに対する抗体を使用したフローサイトメトリーで行われる、(1)〜(5)のいずれかに記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
これらの薬物代謝酵素は公知の配列を有するものを使用することができるが、例えば、以下のGenBank Accession番号で登録された塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有する酵素が挙げられる。ただし、配列は人種や個体差にもよって異なるのでこれらの配列には限定されず、これらのバリアント(例えば、アミノ酸配列の同一性90%以上の
配列を有するタンパク質)も当然使用可能である。
・CYP1A1:2.6 kbp, NM_000499
・CYP1A2:3.1 kbp, NM_000761
・CYP2C9:1.9 kbp, NM_000771
・CYP2C19:1.5 kbp, NM_000769
・CYP2D6:1.7 kbp, NM_000106
・CYP2E1:1.7 kbp, NM_000773
・CYP3A4:2.8 kbp, NM_017460
発現ベクターは宿主細胞で機能し得るプロモーターを含むことが好ましく、プロモーターとして具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルス由来プロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにtRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が挙げられる。発現ベクターは、さらに、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、SV40複製オリジン、転写終結シグナル、選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子等)等をさらに含有することもできる。なお、薬物代謝酵素遺伝子導入細胞は一過性に薬物代謝酵素遺伝子を発現するものでもよいし、恒常的に薬物代謝酵素遺伝子を発現するものでもよい。
Ham's F12、DMEM、MEM又はこれらの混合培地等の基本培地を使用し、血清やアミノ酸やビタミン等、必要な栄養素を添加した培地を使用することができる。培養条件としては、例えば、pHは約6〜約8であり、培養温度は約30〜約40℃であり、O2濃度は約5〜20%であり、CO2濃度は約5%である。
なお、このような共培養の態様は、例えば、コーニング社のトランスウェルを使用して実施することができる。
の細胞表面マーカーとしては、CD3, CD4, CD8a, CD25, CD127, CD279, PD-1などが挙げられる。本発明者らの検討により、アレルギー型薬物性肝障害患者群では、それ以外の急性肝炎群と比較してTregの数が有意に低下することが確認できているので、共培養後にTregマーカーの解析を行うことにより、薬物がアレルギー型薬物性肝障害を起こし得るかを評価することができる。
・培養培地A
D-MEM (High Glucose) (Wako:043-30085) 500ml
MEM-NEAA (Gibco: 11140-050) 5ml
ウシ胎児血清 (Japan Bioserum:S1560) 50ml
・D-PBS(-) (Wako:045-29795)
・CYP3A4の活性は、P450-Glo-CYP3A4 Assay System(Promega)とLuciferin-IPA(Promega: V9002)およびLuciferin Detection Reagent(LDR:Promega)を用いて測定した。
Macrophage-SFM(1×) (gibco:12065-074)
Hepato ZYME-SFM(1×)(gibco:17705-021)
〈DAY1〉HepG2細胞の播種
HepG2細胞を培養培地Aに溶解し、24well plate(Falcon:353504)に1.0×105cells/1000μl/wellで播種し、37℃、5%CO2条件で培養する。
24well plateの各wellから培養培地Aを吸引し、1ウェルあたり、Ad-CYP3A4 1.0×105 PFU/μlを40μlとDMEM960μlを添加する(20MOI)。同様にnegative controlとして、1ウェルあたり、Ad-LacZ 1.0×105 PFU/μlを40μl/wellとDMEM960μlを添加する(20MOI)。
24well plateの各wellをPBS 300μlで洗浄した後、Luciferin-IPA含有培地を300μl/well添加し、5%CO2 incubatorで60分培養する。培養後、Luciferin-IPA含有培地40μlとLDR40μl をwhite plateに入れ、遮光の上、室温で20分間反応させ、その後Luminoscan Asent(Thermo Scientific)で測定しCYP3A4の活性を測定する。結果を図2に示す。
24well plateからウイルス含有培養上清を吸引後、PBS 300μl/wellで洗浄し、その後評価薬物を混ぜた上記無血清培地 1000μlを24well plateに入れる。Cell culture insertを各wellに載せ、その中に患者末梢血単核球(PBMC)を1.0×106 cells/1000μl/wellを入れ、5% CO2 incubatorで48時間共培養する。
上層(Cell culture insert内)よりPBMCを含む培養液を回収し、それを3000rpm,5minでspin downし、上清を廃棄する。その後、PBMCを含むペレットをPBS100μl/系統で溶解し、100μlずつ分け、各種細胞表面マーカーに対する抗体と、FACSCantoII(BD Biosciences)を用いて免疫細胞頻度を測定する。
(1)FITC anti-human:CD3(5μl/tube) (BioLegend, #317306)
(2)PE anti-human:CD4(5μl/tube) (BioLegend, #317410)
(3)APC anti-human:CD8a(2μl/tube)(BioLegend, #301014)
(4)PE/Cy7 anti-human:CD8a(2μl/tube) (BioLegend, #300914)
(5)PerCP/Cy5.5 anti-human:CD279(2μl/tube)(BioLegend, #329914)
(6)APC/Cy7 anti-human:CD25(2μl/tube) (BioLegend, #302614)
(7)Pacific Blue anti-human:CD56(2μl/tube)(BioLegend, #318326)
(8)Unstain
(9)Isotype (下記それぞれ5μl/tube)
Percp/Cy5.5 Mouse IgG1 k (BioLegend, #400149)
PE/Cy7 Mouse IgG2a k (BioLegend, #400231)
APC Mouse IgG1 k (BioLegend, #400120)
APC/Cy7 Mouse IgG2a k (BioLegend, #400229)
PE Mouse IgG2b k (BioLegend, #400313)
(10)死細胞染色:Amician(1μl/tube) (BioLegend , Zonbie AquaTM #423102)
(1)CD1c:APC/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #331520)
(2)CD303:PerCP/Cy5.5 anti-human 5μl/test (BioLegend, #354210)
(3)CD304:PE/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #354508)
(4)CD274:PE anti-human 5μl/test (BioLegend, #329706)
(5)CD14:FITC anti-human 5μl/test (BioLegend, #325604)
(6)CD19:FITC anti-human 5μl/test (BioLegend, #302206)
(7)CD86:Pacific Blue anti-human 5μl/test (BioLegend, #305423)
(8)CD141:APC anti-human 5μl/test (BioLegend, #344106)
(1)CD8a:PE/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #300914)
(2)CD25:APC/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #302614)
(3)CD127:Pacific Blue anti-human 5μl/test (BioLegend, #351306)
(4)CD279:PerCP/Cy5.5 anti-human 5μl/test (BioLegend, #329914)
(5)CD3:FITC anti-human 5μl/test (BioLegend, #317306)
(6)CD4:PE anti-human 5μl/test (BioLegend, #317410)
(1)CD56:Pacific Blue anti-human 2μl/test (BioLegend, #318326)
(2)CD16:PE/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #302016)
(3)CD3:FITC anti-human 5μl/test (BioLegend, #317306)
(4)CD314:APC anti-human 5μl/test (BioLegend, #320808)
(1)CD274:PE anti-human 5μl/test (BioLegend, #329706)
(2)CD33 :APC anti-human 5μl/test (BioLegend, #303408)
(3)CD116:PerCP/Cy5.5 anti-human 5μl/test (BioLegend, #301328)
(4)CD14 :APC/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #325620)
(5)CD16 :Pacific Blue anti-human 5μl/test (BioLegend, #302032)(6)HLA-DR:PE/Cy7 anti-human 5μl/test (BioLegend, #307616)
PBS1mlを入れ、3000rpm 5minで遠心し、上清を廃棄し、PBS(+1〜2%PFA)300μlを入れて溶解し、FACS tubeへ入れ、FACS canto IIで測定する。
Claims (6)
- 検査対象薬物を含有する培地中で、被検者由来の免疫細胞を、細胞は透過しないが薬物及びその代謝物は透過する膜を隔てた状態で、薬物代謝酵素を発現した肝細胞と共培養する工程、および
前記工程後の免疫細胞を解析する工程、を含む、アレルギー型薬物性肝障害の評価方法。 - 共培養工程が、液体培地を入れて底面に肝細胞を接着培養した第1の培養容器内に、底面に透過性膜を有する第2の培養容器を、肝細胞に接触せず、かつ液体培地が内部に収容される状態で設置し、当該第2の培養容器内で免疫細胞を入れて培養する工程である、請求項1に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
- 膜の孔サイズが直径0.20μm〜1.0μmである、請求項1または2に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
- 薬物代謝酵素がシトクロムP450である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
- 免疫細胞がヒト末梢血単核細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
- 免疫細胞の解析が、免疫細胞の表面マーカーに対する抗体を使用したフローサイトメトリーで行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のアレルギー型薬物性肝障害の評価方法。
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