JP6506258B2 - クロルヘキシジン塩を含む抗菌性マイクロ粒子及びナノ粒子、その製造方法、並びに使用 - Google Patents

クロルヘキシジン塩を含む抗菌性マイクロ粒子及びナノ粒子、その製造方法、並びに使用 Download PDF

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Description

本発明は、抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子(MNP)の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、クロルヘキシジン塩を含む抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子、並びにその製造及び使用方法;クロルヘキシジンの送達を制御するために斯かる抗微生物性MNPを含む医療用物品及び複合材料に関する。
クロルヘキシジン(CHX)は、様々な医療応用での使用が見出されたよく知られた抗微生物薬である。それらには、皮膚洗浄用製剤、手指消毒剤、及び口内洗浄剤が挙げられる。グラム陽性菌及び陰性菌の両方、並びに多くの種の酵母に対する有効性のため、CHXは有用な抗微生物薬である。他の抗微生物薬を越える更なる利点は、CHXに関連する望ましい抗生物質耐性特性である。高い環境濃度に晒されると、個々の微生物集団はCHXに対して感受性がなくなることもあるが、試験はこの耐性が一時的なものであり、CHX刺激が取り除かれると低下することを示した。CHXの系統名は、N’,N’’’’’−ヘキサン−1,6−ジイルビス[N−(4−クロロフェニル)(イミドジカルボンイミド酸ジアミド)]であり、以下の化学式を有する。
最も一般的なCHX抗微生物薬は、易溶性塩であるCHX二グルコン酸塩の水溶液である。わずかに溶けにくい塩であるCHX二酢酸塩(CHA)も、時にはそれらの材料にある程度の抗微生物特性を与えるために材料に加えられる乾燥結晶粉末として使用された。
これらのCHX化合物に関する問題は、抗微生物組成物で使用されると、標的領域へのCHX水溶液の送達が非常に短時間しか提供できないことにある。例えば、口腔衛生用途では、CHX二グルコン酸塩は口内洗浄剤の状態で口腔に提供され得るが、数分以内に、この水溶液中のCHXレベルが著減する。標的領域への十分なレベルの抗微生物薬の送達を維持するには処置の繰り返しが必要である。
更なる制限は、溶液状態の可溶性CHX塩で表面処理するとき、処理された基材から放出され得るCHXの量(例えば、単位表面積あたりの量)が、該CHX溶液の濃度に制限され、且つ、関連するため、これらの溶液の抗微生物効果もまた制限され、容易に管理できないので、十分でなくなる可能性がある。
EP2462960A2は、抗微生物剤を含むカテーテルなどの医療用留置デバイスを開示する。そのデバイスは、シリコーン−ウレタン共重合体及びCHXなどの生物活性物質又はCHAなどのその好適な薬理学的塩である原料物質を含んでいる。CHXは具体的な共重合体組成に依存した速度で原料物質から放出される。CHXのゆっくりとした放出は14日間にわたって観察される。しかしながら、CHXを保持するのに塩基重合体が必要であるので、その用途はポリマーカテーテル上のコーティングに限定される。加えて、さらに広い範囲にCHXの持続放出を提供することが望まれる。
US2007/0212419A1は、歯根膜感染の処置における使用のための、マトリックスゲル、ナノ粒子(NP)及びCHXを含んでいるナノ複合体の生体適合性ヒドロゲル(NCHG)を開示する。NPは、共重合した2−ヒドロキシエチルメタクリラート(HEMA)とポリエチレングリコールジメタクリラート(PEGDMA)から作られた重合体である。架橋化マトリックスを作製するのに同じモノマーが使用される。CHX二グルコン酸塩は活性物質として使用される。NPはCHXを吸収し、そして、200時間を超える持続放出が観察される。一方、用途はマトリックスゲルの存在によって制限されるので、いくつかの用途では、CHXの放出プロフィールがまだ不十分である。既存の医療用物品又は組成物に抗微生物特性を付与するのにNCHGは使用できない。
本発明は、CHX塩を含む抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子(MNP)を提供することによって先に考察された問題に対処する。
本明細書中に構想した特定のCHX塩のいくつかは、いくつかの態様では、ただ数日又は数週間よりむしろ数カ月の長期間にわたるCHXの素晴らしい放出プロフィールを示す難溶性MNPをもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載したCHX MNPは、80日間より長い間、徐々にCHXを放出する。本明細書中に構想された他のCHX塩は、より短いCHX放出の期間を有するが、数時間又は数日にわたり、非常に高い用量の可溶性CHXを放出する。いくつかの態様において、これらのCHX塩のMNPで処理されたサンプルからのCHXの放出は、CHX溶液だけで処理されたサンプルより速く、且つ、より大量であった。これらのより速い放出態様は、汚染除去の用途において、或いは特に難治性の若しくは急性の感染又は大流行を処置するのに有効であり得る。さらに、MNPは、追加の抗微生物特性を付与するための医療用物品に若しくはその中に埋め込まれるコーティングか、或いは抗微生物性MNPの外側に可溶性CHXのゆるやかな浸出を用いて長期間にわたり標的領域に抗微生物性CHXの一定用量を送達するため、又はCHX溶液で処理されたサンプルから可能であるよりはるかに高い用量のCHXをより一層迅速に送達するために使用される複合材料の成分としてなどの幅広い用途での使用が見出される可能性がある。さらに、本発明のMNPはまた、遅延放出プロフィール、又はCHXの放出が環境条件の変化によって引き起こされるプロフィールを呈してもよい。
特定の態様において、本発明は、CHX塩を含む抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を提供する。特に、本発明は、CHX塩を含む抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を提供し、該塩のアニオンは、リン、炭素、窒素、及び硫黄のオキソアニオン並びに部分的に水素化されたオキソアニオンから選択される。好ましくは、アニオンはリン、炭素、窒素、及び硫黄のオキソアニオンから選択され、そしてより好ましくは、アニオンはホスファート、カルボナート、ニトラート又はスルファートから選択される少なくとも1つである。より好ましくは、アニオンは、ピロホスファートに始まるポリホスファートの同族列、及びトリメタホスファートに始まる環状メタホスファートの同族列、並びに窒素及び硫黄のオキソアニオン及び部分的に水素化されたオキソアニオンから選ばれたホスファートから選択される。より好ましくは、アニオンは、ピロホスファートに始まるポリホスファートの同族列及びトリメタホスファートに始まる環状メタホスファートの同族列から選ばれたホスファートから選択される。最も好ましくは、アニオンは、トリメタホスファート、特にヘキサメタホスファートに始まる環状メタホスファートの同族列から選択される。
好ましい態様において、MNPはナノサイズである、すなわち、構造物は1nm〜1μmの範囲内に少なくとも1つの寸法を有する。
本発明はまた、本明細書中に記載した抗微生物性MNPのコロイド懸濁液も提供する。
これらの構想はまた、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを含む医療用物品及び本明細書中に記載した抗微生物性MNPを含む複合材料を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを製造及び使用する方法を企図する。
「抗微生物性(antimicrobial)」とは、微生物を殺滅するか、又はそれらの生長を少なくとも阻害するように作用する物質を意味する。「微生物(microbe)」という用語は、例えば、細菌、古細菌、及び/又は真菌などの微生物を表すのに使用される。そのため、本明細書中の抗微生物性化合物及び組成物は、微小生物を殺滅し得るか、又はそれらの成長を少なくとも阻害し得る。
「ホスファート(phosphate)」という用語は、本明細書中で使用される場合、あらゆるリン及び酸素ベースのアニオンも指す。ホスファートは、通常、四面体的に配置されたオルトリン残基を作り出す。ホスファートは、直鎖、分岐又は環状であってもよい。代表的なホスファートとしては、オルトホスファート及びピロホスファートに始まる直鎖ホスファート及びポリホスファートの同族列、並びにトリメタホスファートに始まる環状メタホスファートの同族列のホスファートが挙げられる。有機ホスファートもまた、この定義の中に含まれている。代表的な有機ホスファートとしては、C1-6アルキルホスファートなどのアルキルホスファートが挙げられる。
「マイクロ粒子又はナノ粒子(micro or nanoparticle)」では、約1nm〜100μmのサイズを有する粒子を意味する。
今の説明の中で、「マイクロ粒子又はナノ粒子」はまた、チューブ(単一及び複数の壁を有するものの両方)や、スクロールや、ロッドや、円錐や、「ハリネズミ(hedgehog)」形態や、結晶(伸長結晶など)及び非結晶などの他の好適なマイクロ構造及びナノ構造を包含することを意図する。斯かる構造は、約1nm〜100μm、好ましくは1nm〜10μm、好ましくは1nm〜1μm未満(すなわち、「ナノ構造(nanostructure)」又は「ナノスケール(nanoscale)」の寸法)、より好ましくは5nm〜500nm、より好ましくは20〜200nm、そして、より一層好ましくは20〜140nmのうちの少なくとも1つの空間的規模を呈する。構造物の三次元構造のすべてがこの粒径範囲内に収まる。
注意事項−スケールバーサイズ及び画像の倍率は、各SEMに関して角括弧の中に示した。
図1は、以下の組成物への浸漬後のホウケイ酸ガラス製カバーガラスのSEM顕微鏡写真を示す。(a)水又はCHX水溶液(25μMと5mM)[220μm、540×];(b)5/5CHX−オルトホスファート[10μm、6200×];(c)5/5CHX−ピロホスファート[20μm、5350×];(d)5/5CHX−トリホスファート[20μm、5150×]。 図2は、以下の組成物への浸漬後にホウケイ酸ガラス製カバーガラスのSEM顕微鏡写真を示す。(e)5/5CHX−HMP[10μm、6500×];(f)5/5CHX−ニトラート[10μm、6400×];(g)5/5CHX−カルボナート[10μm、7800×]。 図3は、オルトホスファート、ピロホスファート、及びトリホスファート標本のCHX溶出プロフィールを示す。 図4は、それぞれ25μMと5mMのCHX溶液に晒された対照標本と共に、ニトラート及びカルボナート標本のCHX溶出プロフィールを示す。 図5は、アルギン酸塩創傷包帯に関する以下のSEM顕微鏡写真を示す。(a)対照標本、MNPなし[60μm、2000×];(b)CHX−HMP−0.5MNP[10μm、10400×];(c)CHX−HMP−5MNP[10μm、10000×]。 図6は、ホウケイ酸ガラス製カバーガラスに関する以下のSEM顕微鏡写真を示す。(a)対照標本、MNPなし[60μm、1980×];(b)CHX−HMP−0.5MNP[10μm、9900×];(c)CHX−HMP−5MNP[10μm、10000×]。 図7は、その一部がMNPを組み込んでいる、エチレン酢酸ビニル(EVA)重合体に関する以下のSEM顕微鏡写真を示す。(a)対照標本、MNPなし[10μm、9900×];(b)CHX−HMP−0.5MNP[10μm、9800×];(c)CHX−HMP−5MNP[10μm、10200×]。 図8は、その一部がMNPで処理されたチタニウム表面に関する以下のSEM顕微鏡写真を示す。(a)対照標本、MNPなし[50μm、2080×];(b)CHX−HMP−0.5MNP[10μm、10000×];(c)CHX−HMP−5MNP[10μm、10000×]。 図9は、その一部がMNPで処理された以下のチタニウム表面に関するAFM画像を示す(水平目盛1μm、垂直目盛55nm)。(a)研磨したTi表面;(b)CHX−HMP−0.5MNP;(c)CHX−HMP−5MNP。 図10は、その一部がMNPで処理された以下のガラス表面のAFM画像を示す(水平目盛1μm、垂直目盛60nm)。(a)清浄した未処理ガラス;(b)CHX−HMP−0.5MNP;(c)CHX−HMP−5MNP。 図11は、その一部がMNPで処理された以下の雲母(「ウルトラフラット」)表面のAFM画像を示す(水平目盛1μm、垂直目盛20nm)。(a)清浄した未処理ガラス;(b)CHX−HMP−0.5MNP。 図12は、対照(25μMのCHX)溶液、CHX−HMP−0.5、及びCHX−HMP−5で処理されたアルギン酸塩包帯からのCHX溶出プロフィールを示す。 図13は、対照(25μMのCHX)溶液、CHX−HMP−0.5、及びCHX−HMP−5で処理されたガラスからのCHX溶出プロフィールを示す。 図14は、対照(25μMのCHX)溶液、CHX−HMP−0.5、及びCHX−HMP−5で処理されたEVA重合体からのCHX溶出プロフィールを示す。 図15は、対照(25μMのCHX)溶液、CHX−HMP−0.5、及びCHX−HMP−5で処理されたチタニウムからのCHX溶出プロフィールを示す。 図16は、異なったレベルのCHX−HMP MNPで処置されたグラスアイオノマーセメント(GIC)標本からの累積CHX放出プロフィールを示す。 図17は、異なったレベルのCHX−HMP MNPで処置されたGIC標本からの累積フッ素放出を示す。 図18は、GIC標本の破壊表面を示す以下のSEM顕微鏡写真を示す。(a)未処理GIC[20μm、5000×];(b)1wt%MNP[20μm、5050×];(c)2wt%MNP[20μm、5000×];(d)5wt%MNP[20μm、5000×];(e)10wt%MNP[20μm、5000×];(f)20wt%MNP[20μm、5050×]。 図19は、MRSAに対するCHX及びCHX−HMP−5に関する620nmにおける吸光度(OD)の測定値を示す。これらから最小発育阻止濃度が計算できる。暗灰色の棒グラフ:25μmのCHX;薄灰色の棒グラフ:CHX−HMP−5。 図20は、P.エルギノーサに対するCHX及びCHX−HMP−5に関する620nmの吸光度(OD)の測定値を示す。これらから最小発育阻止濃度が計算できる。暗灰色の棒グラフ:25μmのCHX;薄灰色の棒グラフ:CHX−HMP−5。 図21は、MRSAに対するCHX又はCHX−HMP−5処置後の595nmにおける吸光度(OD)の測定値を示す。これらからバイオフィルム阻害が評価できる。暗灰色の棒グラフ:25μmのCHX;薄灰色の棒グラフ:CHX−HMP−5。 図22は、P.エルギノーサに対するCHX又はCHX−HMP−5処置後の595nmにおける吸光度(OD)の測定値を示す。これらからバイオフィルム阻害が評価できる。暗灰色の棒グラフ:25μmのCHX;薄灰色の棒グラフ:CHX−HMP−5。 図23は、(上側)CHX−HMP−0.5及び(下側)CHX−HMP−5 NPのTEM顕微鏡写真を示す。個々のNPの例を矢印で示す。スケールバー=500nm。 図24は、(上側)CHX−HMP−5及び(下側)CHX−HMP−0.5のサイズ分布を示すDLSデータを示す。3つのデータセットは、測定が各濃度にて三連で実施されたことを示す。 図25は、(上側)CHX−HMP−5及び(下側)CHX−HMP−0.5 NPの荷電分布を示すζ電位データを示す。3つのデータセットは、測定が各濃度にて三連で実施されたことを示す。 図26は、特定の量のCHX−HMP−5 NPを含むCMCフィルム(1m2あたり55gのCMC)からのCHX溶出プロフィールを示す。四角形は700kDaのCMC Mwと6wt%NPを示し;三角形は250kDaのCMC Mwと6wt%NPを示し;×印は700kDaのCMC Mwと3つのwt%MNPを示し;菱形は250kDaのCMC Mwと3wt%NPを示し;円は250kDaのCMC Mwと0wt%NPを示す。 図27は、特定の量のCHX−HMP−5MNPを含むアルギン酸塩フィルムからのCHX溶出プロフィールを示す。四角形は6wt%のMNPを示し;菱形は3wt%のMNPを示す。 図28は、(菱形)1回のディップコートにてCHX−HMP−5 NPでコートされたポリウレタン及び(ダッシュ記号)25μMのCHX水溶液で処理されたポリウレタンに関するCHX溶出プロフィールを示す。 図29は、(左側)5回反復[50μm、2000×]及び(右側)10回の反復[50μm、2020×]のディップコーティング方法を使用してCHX−HMP−5 NPでコートされたポリウレタンを示すSEM画像を示す。右側の領域はNPの堆積を示す。 図30は、(左から右に向かって)MNPなし(未処理);CHX−HMP−5MNP;CHX−HMP−50MNPで処理されたポリウレタン基材上で培養した4種類の微生物:(上から下に向かって)MRSA;E.コリ(E. coli);P.エルギノーサ(P. aeruginosa);及びK.ニューモニエ(K. pneumonia)、に関する生死染色画像を示す。 図31は、(上側)本体(B)シリコーンと(下側)密封材(S)シリコーンに関して、1分間(菱形)、30分間(四角形)、2時間(三角形)又は6時間(円)のディップコーティング時間を用いてCHX−HMP−5 NPで、及び対照CHX溶液(ダッシュ記号)でコートしたシリコーンからのCHX放出を示す。あらゆる飽和が説明できるように、媒質は8週間で新しくされた。 図32は、(上側)本体(B)シリコーンと(下側)密封材(S)シリコーンに関して、1分間(菱形)、30分間(四角形)、2時間(三角形)又は6時間(円)のディップコーティング時間を用いてCHX−TP−5 NPで、及び対照CHX溶液(ダッシュ記号)でコートしたシリコーンからのCHX放出を示す。あらゆる飽和が説明できるように、媒質は8週間で新しくされた。 (上側)本体(B)シリコーンと(下側)密封材(S)シリコーンに関して、1分間(菱形)、30分間(四角形)、2時間(三角形)又は6時間(円)のディップコーティング時間を用いてCHX−TMP−5 NPで、及び対照CHX溶液(ダッシュ記号)でコートしたシリコーンからのCHX放出する図33を示す。あらゆる飽和が説明できるように、媒質は8週間で新しくされた。 図34は、CHX−HMP−5 NPのコーティング(左側、薄灰色の棒グラフ)がある、及びCHX−HMP NPのコーティング(右側、暗灰色の棒グラフ)がないチタニウム表面におけるS.ゴルドニイ(S. gordonii)の増殖を示す。 図35は、CHX水溶液又は脱イオン水中の等価濃度のCHX−HMP MNP懸濁液で処理されたヒドロキシアパタイトディスクからのCHX放出を示す。CHX水溶液のデータは破線として示され、それに対して、NP懸濁液のデータは実線として示されている。5mMの濃度は黒で示され;2.2mMの濃度は中間の灰色で示され;1mMの濃度は薄灰色で示されている。下から上に向かって:CHX水溶液1mM;CHX水溶液2.2mM;NP懸濁液1mM;CHX水溶液5mM;NP懸濁液2.2mM;NP懸濁液5mM。 図36は、質量で25%のCHX−HMP−5 NPを含む(左側)Diamond Mattエマルジョン塗布剤[240μm、490×]及び(右側)Diamond Mattエマルジョン塗布剤[220μm、530×]の表面のSEM画像を示す。 図37は、24時間のインキュベーション後の、Diamond Matt塗布剤(陰性対照、左側の棒グラフ)、Sterishield塗布剤(陽性対照、中央の棒グラフ)、及び「Nanopaint」(CHX−HMP MNPを含む塗布剤、右側の棒グラフ)上の(左側)MRSA及び(右側)E.コリの増殖を示す。y軸の単位は、コロニー形成単位(cfu)である。
詳細な説明
抗微生物性ナノ粒子
本発明の第一の態様によると、クロルヘキシジン塩を含む抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を提供し、ここで、該塩の中のアニオンは、リン、炭素、窒素、及び硫黄のオキソアニオン及び部分的に水素化されたオキソアニオンから選択される。好ましくは、アニオンは、リン、炭素、窒素、及び硫黄のオキソアニオンから選択され、そして、より好ましくは、アニオンは、ホスファート、カルボナート、ニトラート又はスルファートから選択される少なくとも1つである。このリストから選択された少なくとも1つのアニオンがCHXと共に化合物中で使用されるとき、難溶性であるMNPが形成される。この難溶性は、本発明のMNPがオーダーメイドの放出プロフィールを実証できることを意味している。いくつかの態様において、プロフィールは、持続放出プロフィールであり、長期間にわたり周囲の液体環境中に安定したレベルのCHXを放出する。他の態様において、CHXの放出は、先に述べたように、より速く及び/又はより大量である;例えば、場合によっては、CHXのみの溶液で処理された表面から達成可能であるものより、より速く且つより大量であった。
本発明では、「ホスファート」としては、酸素原子の共有によって連結された四面体的に配置されたオルトリン残基で構成され、且つ、リン酸の脱プロトン反応から得られる任意のリンベースのアニオンが挙げられる。
本発明に使用され得る特定のホスファートアニオンは、特に制限はないので、リン及び酸素原子を含む任意のアニオンを挙げることができる。好ましくは、ホスファートアニオンは、モノホスファート又はポリホスファートである。好ましくは、ホスファートアニオンは、直鎖、分岐又は環状構造を有する。好ましくは、ホスファートアニオンは、一般式HO(PO2OH)nH{式中、nは任意の整数であってもよいが、一般的に1〜最大数百、好ましくは1〜10、より好ましくは1〜6である}を有してポリリン酸からの1若しくは複数の水素原子の除去によって得られる。
より一層好ましくは、ホスファートはオルトホスファート、ピロホスファート、トリホスファート又はヘキサメタホスファートのうちの少なくとも1つから選択される。メタホスファート、とりわけヘキサメタホスファートが特に好ましい。
いくつかの態様において、本発明の抗微生物性MNPは、難溶性CHX塩を含む。MNPが難溶性を有する斯かる塩を含むとき、MNPから周囲の液体環境へのCHXの放出は長期にわたる。さらに、塩がこのように難溶性であるとき、MNPは、液体全体でより均一なMNPの分配をもたらし、且つ、ナノ粒子の荷電が材料表面へのそれらの吸着を容易にするので、ディップコーティングによる表面へのMNPの堆積に有利である水中コロイド懸濁液を形成する傾向がある。
いくつかの態様において、本発明の抗微生物性MNPは、長期間にわたる液体環境への可溶性CHXの徐放を実証する。これは少なくとも90日間であってもよい。他の態様において、本発明の抗微生物性MNPは、簡単なCHX溶液を使用した表面の処置で達成できるより高いレベルでのCHXの放出を実証する。これは、短期間のみ(最大5日間、最大1日間、最大12時間、最大6時間、最大1時間、最大30分間、最大10分間又は最大1分間の期間)にわたるものであっても、又は長期間(最大90日間、最大60日間、最大30日間、又は最大10日間など期間)にわたる徐放であってもよい。
特に好ましくは、クロルヘキシジン塩がクロルヘキシジンヘキサメタリン酸塩(CHX−HMP)である。CHX−HMPは難溶性であり、そのためMNPのコロイド懸濁液を形成する。これらのMNPは、次いで、物品をコートするのに使用されても、又は複合材料に組み入れられてもよい。CHX−HMPの相対的不溶性とは、CHXがゆっくりと途切れることなく周囲の環境に放出されることを意味する。CHX−HMPはCHXの放出に関して持続放出プロフィールを示す。
好ましくは、本発明の抗微生物性MNPは、少なくとも7日間、好ましくは20日間、より好ましくは少なくとも30日間、より好ましくは少なくとも50日間、より好ましくは少なくとも60日間、より好ましくは少なくとも100日間、そして、状況によっては少なくとも6カ月間又は少なくとも12カ月間の期間にわたり、可溶性CHXの液体環境(好ましくは水溶液環境)への持続放出及び徐放を示す。この持続放出及び徐放とは、その期間の間中、CHXが継続的にMNPから放出されることを意味する。好ましくは、放出速度は、この期間を通じてほぼ一定であるが、放出速度が変化する、例えば時間が延びるほど遅くなる、実施形態が構想される。この徐放プロフィールは、付加的な介入の必要なしに長期間にわたって利用されるようなMNPの抗微生物特性を可能にする。
好ましくは、抗微生物性MNPは実質的にはCHX塩から成り、ここで、該塩の中のアニオンは、ホスファート、カルボナート、ニトラート又はスルファートのうちの少なくとも1つから選択される。これは、CHX塩が特定のMNP中に存在しているが、他の成分もまた存在し得ることを意味する。好ましくは、CHX塩は、抗微生物性MNPの少なくとも40wt%、より好ましくは少なくとも60wt%、より好ましくは少なくとも90wt%、特に好ましくは少なくとも99wt%を占める。状況によっては、CHX塩が抗微生物性MNPの100wt%を占めてもよい。MNP中の他の成分としては、1若しくは複数の重合体(ポリエチレングリコールなど)、増量剤、着色剤、そして、複合材料の表面への接着又はその中への取り込みを容易にする作用物質(例えば、シラン又はポリリシン)が挙げられる。MNP中の高レベルのCHX塩は、促進された(例えば、より強い、及び/又はより長く持続する)抗微生物効果をもたらす。
指定されたアニオンの組み合わせはまた、例えば、異なったアニオンの混合物とCHXカチオンの共沈によって、抗微生物性MNPを製造するのに使用されてもよい。例えば、高レベルのCHXの急速な放出を呈するMNPに通じるアニオンが、低レベルであるが長期間にわたるCHX放出を呈するMNPに通じるアニオンと組み合わせられてもよい。斯かる粒子は、例えば医療機器、特に初期の高レベルのCHX放出が外科手術自体に起因する細菌の存在を無効にし、そして、長期間の低レベルのCHX放出が長期間にわたって清潔な部位を維持する外科的に移植されるもので有用であり得る。好ましくは、抗微生物性MNPは、CHXの塩及び先に列挙したものから選択した1つのアニオンを含む。例えば、本構想としては、アニオンがオルトホスファート、ピロホスファート、トリホスファート、カルボナート、及びニトラートから選択されるCHX塩を含むMNPを伴った、CHXのヘキサメタリン酸塩を含むMNPの混合物が挙げられる。
いくつかの態様において、CHXカチオンに加えて、抗微生物性MNP中に1若しくは複数の追加カチオン、例えば1若しくは複数の金属カチオン、例えばCu又はAgが存在していてもよい。
場合によっては、本発明の抗微生物性MNPは、遅延放出粒子である、すなわち、基材の表面にMNPが塗布されるか又はそれらが複合材内に組みこまれた後に、CHXの放出がしばらく遅れる。この遅延期間の間、好ましくはMNPからCHXが全く放出されないか、又は場合によっては、この遅延期間のMNPからのCHXの放出が低速、例えば遅延期間直後の最終的な放出速度の10%未満、好ましくは5%未満と、より好ましくは1%未満である。好ましい場合では、MNPは環境条件の変化に感受性がある。斯かる場合には、MNPは「スマートな」特性を示すと言うこともできる。好ましくは、MNPからのCHX放出は環境条件における変化によって引き起こされる。例えば、pH、特定のトリガー成分の濃度、又は周囲環境の温度の変化である。より一層好ましくは、MNPは、pH低下(すなわち、酸性の増大)などの環境における変化によって引き起こされるCHX放出を伴うCHXの遅延放出を呈する。斯かるpH低下は、細菌性バイオフィルムの形成によって起こり得るので、MNPは細菌性バイオフィルムの存在に対応してCHXを放出する。これは、例えば前記のものなどの環境条件における変化に感受性のあるMNP成分の封入又はMNP上のコーティングによって達成されてもよい。あるいは、遅延放出特徴は、例えば適切な(単数若しくは複数の)アニオンの選択による、適切なCHX塩の選択によって調製されてもよく、該アニオンは、環境条件における所望の変化、例えばpH低下によってプロトン付加反応又は脱プロトン反応などの変化を呈する。好ましくは、MNPは、細菌性バイオフィルムの存在又は形成を原因とするpH低下によって引き起こされる固有のCHX遅延放出を示す。
場合によっては、本発明の抗微生物性MNPは固有の抗微生物特性を有する。言い換えれば、MNPは、環境への可溶性CHXの放出に関連した効果に加えて及びそれを増大させる抗微生物特性を実証する。観察された抗微生物効果は、溶液中に放出されたCHXによるだけではなく、MNP自体の存在にもよる。例えば、状況によっては、CHXヘキサメタホスファートのMNPは、固有の抗微生物特性を示すように見える。このように、本発明の抗微生物性MNPは、抗微生物性CHX水溶液、又はいずれかの抗微生物効果を示す媒介物の放出を伴わずに、環境へと抗微生物性CHXを単純に放出する組成物の抗微生物特性に加えて、抗微生物特性を提供し得る。
本発明の抗微生物性MNPは、様々な構造形態を有してもよい。それらは、粒子、(単一及び複数の壁を有する)チューブ、スクロール、ロッド、円錐、ハリネズミ形態、結晶、及び非結晶から選択されてもよい。好ましくは、MNPは、粒子又は結晶である。
本発明の抗微生物性MNPは、1nm〜100μm、好ましくは1nm〜10μm、好ましくは1nm〜1μm(すなわち、ナノ規模)、より好ましくは5nm〜500nm、より好ましくは20〜200nm、そしてより一層好ましくは20〜140nmのサイズを有する。
抗微生物性ナノ粒子のコロイド懸濁液
本発明の他の態様によれば、本明細書中に記載した抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を含むコロイド懸濁液を提供する。
好ましくは、本発明のコロイド懸濁液は水中のコロイド懸濁液である。水は簡単、且つ、一緒に働かせるのに安全な溶媒であり、その生物学的適合性は、その懸濁液を感受性用途に使用することを無難にしている。
より一層好ましくは、本発明のコロイド懸濁液は水溶液中のコロイド懸濁液である。これはCHXの水溶液であってもよい。溶液はまた、他の溶存イオン又は追加成分(例えば、界面活性剤、安定剤、保存料など)を含んでもよい。
好ましくは、本発明のコロイド懸濁液は、15mV以上、より好ましくは20mV以上、より一層好ましくは40mV以上、及び特に好ましくは50mV以上の大きさのゼータ(ζ)電位の絶対値を有する。ゼータ電位は、コロイド分散系の安定性及び凝集体を形成するそれらの傾向の基準である。高い絶対ゼータ電位値は、凝固又は凝集しそうにない安定した懸濁液を示す。これは、基材のディップコーティングによる調製がより容易な、より高い均一性を有するコーティングを作り出す望ましい特性である。
コロイド分散系のゼータ電位の絶対値又は係数が少なくとも30mVであるとき、分散液は凝固に関して許容される安定性を実証する。ゼータ電位の絶対値が少なくとも40mVであるとき、懸濁液の安定性は素晴らしく、懸濁液は、凝固しないと予想され、長期間にわたる堆積挙動を示すのみである。さらに、ゼータ電位の絶対値が少なくとも20mVであるとき、MNPは、望ましいコーティング特性を呈し、そして、抗微生物性MNPの表面コートを提供するために物品の表面に付着する。
医療用物品
本発明の更なる態様において、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを含む医療用物品を提供する。本発明の医療用物品は、特に制限されることはないので、外部的若しくは内部的のいずれかでの体との接触、又は病院若しくは医師の外科手術などの医療環境における使用を意図した任意の物品であってもよい。斯かる物品は、当業者にとって周知のものである。本構想では、代表的な物品は様々なタイプのカテーテル;歯科インプラント、義歯及びマウスガードなどの経口物品;創傷包帯又は医療品包装、を含んでいる。
好ましくは、本発明の医療用物品は、静脈カテーテル、尿道カテーテル、歯科インプラント、マウスガード、義歯、創傷包帯又は医療品包装である。斯かる物品には、有利なことには、例えば、物品上にMNPを含む表面コートを構築するための表面処理によって、又は物品自体の材料中へのMNPの取り込みによって、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを用いた機能化によって追加の抗微生物特性が提供されてもよい。
好ましくは、本発明の医療用物品はカテーテルである。いくつかの態様において、カテーテルは表面コートによって抗微生物性MNPを用いて機能化される。
他の態様において、抗微生物性MNPは、カテーテルを作るのに使用される材料の製造中にカテーテルの少なくとも一部の中に組み込まれる。メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)などの細菌によるカテーテル表面及び周辺組織のコロニー形成は重大な健康問題である。抗微生物性MNPで機能化した本発明のカテーテルでは、細菌によるコロニー形成は、MNPの抗微生物活性により予防又は低減される。
好ましくは、本発明の医療用物品は歯科インプラントである。歯科インプラントは、下顎又は上顎の天然の骨(顎骨)を置換又は増強するのに使用されるデバイスである。インプラントの支台歯部分は歯茎から突き出し、(単数若しくは複数の)人工歯がこれに取り付けられる。斯かるインプラントに関連する問題は、細菌によるインプラント表面のコロニー形成及び病原性の細菌性バイオフィルムの形成に起因する、媒質中での長期的なインプラントの不具合である。本発明の歯科インプラントでは、歯科インプラントは、抗微生物性MNP(表面コーティングとして又は歯科インプラント自体の材料に組み込まれるかのいずれか)を含み、そして、これがバイオフィルム形成の傾向を予防又は低減するので、感染傾向がより高くなる危険性なしにインプラントをうまく組み込める。
好ましくは、歯科インプラントは表面コートの形態で抗微生物性MNPを含む。より一層好ましくは、歯科インプラントの表面は抗微生物性MNPで薄くコートされる。例えば、25%以下、好ましくは15%以下、より好ましくは10%以下、より一層好ましくは5%以下の領域被覆率が好まれる。チタニウムは、骨とのオッセオインテグレートのためのチタニウムの有用な特性のため歯科インプラントを作製するのに使用されることが多い(骨自体と同じくらいの強度で材料と骨の間の接点を形成する)。オッセオインテグレーションがかなりの程度まで存在し続けながら、MNPに関連する抗微生物特性を提供し続けるので、チタニウム表面におけるMNPの薄いコーティングが有利である。濃過ぎるコーティングが使用された場合、オッセオインテグレーションはそれほど完全ではないので、インプラントと骨の間の接点がより弱い。薄過ぎるコーティングが使用された場合、MNPの抗微生物特性がそれほど明らかでない。
医療用物品はまた、創傷包帯であってもよい。本発明の抗微生物性MNPを含む創傷包帯は、普通の創傷包帯や他の既知の抗微生物性包帯より長続きする抗微生物効果を提供する。これは、急性及び外科的創傷、並びに慢性又は非回復期の創傷を含めた創傷の包帯に重要である。本発明の抗微生物性MNP、特にCHXヘキサメタホスファートMNPは、熱傷において最も一般的な感染性物質であるシュードモナス・エルギノーサ細菌に対して有効であり、そして、MRSA及びストレプトコッカス・ゴルドニイに対しても有効である。本発明の機能化創傷包帯は、火傷や他の同様の創傷を含めた創傷を手当てするのに使用されると、感染の危険を低減するのに役立つ。
本発明の医療用物品は、義歯又は口蓋栓塞子を含めた義歯製品であってもよい。義歯製品又は義歯は、欠けている歯及び/又は口蓋の部分を置換して、歯の機能を回復するために口腔内で使用されるデバイスである。口蓋に隣接する義歯の下側は、特に酵母カンジダ・アルビカンスによる感染の傾向がある。いくつかの態様において、本発明のMNP、特にCHXヘキサメタホスファートMNPは、C.アルビカンスを含めた様々な酵母に対して有効である。本発明の抗微生物性MNPを含む義歯製品が使用された場合、感染の危険性が大いに低減される。
本発明の医療用物品はマウスガードであってもよい。マウスガードは、歯を保護するためのスポーツでの使用、及び歯ぎしり(bruxism or teeth grinding)の予防としての使用を含めた様々な用途に使用される。これらのマウスガードは、エチレン酢酸ビニル(EVA)などの重合体で一般的に作られているので、表面に細菌性バイオフィルムが形成される傾向がある。本発明のマウスガードは、斯かるバイオフィルムの形成を予防するか又は遅らせ、感染から着用者を保護するのに有効である、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを(表面コーティングとしてか又はEVA重合体内に組み込むかのいずれかで)含む。
本発明の医療用物品は、医療品包装、手術室のトレー又は医療用ドレープであってもよい。医療品包装は、医療機器を梱包するか又は保護するのに使用されるあらゆる種類の包装である。手術室のトレーは、ステンレスで作られていることが多く、滅菌した外科用器具を運ぶのに使用される。医療用ドレープは、医療環境で使用されるいずれかのドレープ、カーテン、又は他の織物であり得る。本発明によると、これらのいずれも、細菌によるコロニー形成を低減又は予防するために本明細書中に記載した抗微生物性MNPを有利に含み得る。
抗微生物性MNPは、様々な方法で医療用物品に組み入れられてもよく、その方法は特に制限されない。
状況によっては、医療用物品としては、抗微生物性MNPの表面コーティングが挙げられる。表面コーティングは、ディップコーティング又はスプレーコーティングによって容易に塗布できる。表面コートは、細菌によってコロニーを形成されることが多い物品の外面の保護において有効である。
状況によっては、MNPは、物品内に一体化して組み込まれる。好ましくは、医療用物品は、その物品の外面の少なくとも一部の中に埋め込まれた抗微生物性MNPを含む。MNPは、製造中、例えば、重合体をカテーテルに加工している間又はカテーテル管の押出成形の間、物品を作製するのに使用される材料中に組み入れられてもよい。
いくつかの態様において、医療用物品を構成する1若しくは複数の材料にMNPを提供してもよい;例えば、それらはMNPでディップコートされてもよい。いくつかの態様において、材料は、次の:医療用シリコーンや、EVAや、ポリウレタンなどの医療用又は消費者関連の重合体、チタニウムなどのインプラント材料、ガラス、或いは市販の創傷包帯を含む。
複合材料
更なる態様において、本発明は、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを含む複合材料を提供する。これらの抗微生物性MNPを含む複合材料は、MNP自体と関連して先に記載したように、長期間にわたってCHXを放出できる。これはこれらの材料に抗微生物特性を付与する。
本発明の複合材料は、特に制限されることはないので、その材料に抗微生物特性を付与するために抗微生物性MNPを組み込むあらゆる材料を含み得る。代表的な材料としては、これだけに限定されるものではないが、塗布剤(paint)、ペースト、重合体、ヒドロゲル、及び歯科用セメントが挙げられる。
好ましくは、本発明の複合材料は、グラスアイオノマーセメント、塗布剤又はオーラルケア組成物である。これらの材料は、それらの中に抗微生物性MNPを含むことによって追加の抗微生物特性を有利に提供されてもよい。次のMNP含有複合体:グラスアイオノマーセメント、アルギン酸塩フィルム、カルボキシメチルセルロースフィルム、塗布剤、及びオーラルケアリンス/局所トリートメント、が首尾よく作製された。
好ましくは、抗微生物性MNPは、最大60wt%、50wt%、40wt%又は30wt%で複合材料中に存在する。60wt%超のレベルでは、MNPの高い含有量のため、複合物はその意図された機能性又は構造特性の一部を失う可能性がある。好ましくは、抗微生物性MNPは、1wt%、5wt%、又は10wt%以上で複合材料中に存在する。
約1wt%を下回るレベルでは、MNPの存在による抗微生物特性が顕著に低減されるが、それでも一部の目的のためには適切であり得る。
好ましくは、本発明の複合材料は、グラスアイオノマーセメント(GIC)である。GICは、歯色の充填材料として、合着材や裏張り材として、非侵襲的修復治療(ART)において、歯肉縁の近くの修復において及び裂溝封止材としての使用、を含めた多くの目的で歯医者に使用される。GICが、口腔環境の中でイオン交換に従事できることが知られている。本明細書中に記載した抗微生物性MNPを含む複合材料がGICである場合、CHXはGICから浸出し、MNPからのCHXの持続放出がGIC処置を取り囲む領域における継発性齲蝕を予防するのに役立つ。CHX放出は、CHX−二酢酸塩又はCHX−二グルコン酸塩などの可溶性CHX塩を組み込んだ他のGICよりかなり長期にわたって維持される。いくつかの態様において、本発明のGICは、30日間より長く、好ましくは60日間より長く、さらに好ましくは90日間より長く、環境中にCHXを浸出し得る。
従来のGICは抗微生物効果を欠いているので、継発性齲蝕(充填した周り又はその下の齲蝕の再発生)がよくある問題であった。GICが本発明の抗微生物性MNPを含む場合、GICに付与された抗微生物が、継発性齲蝕を予防するのに役立つ。
好ましくは、本発明のGICは環境からCHXを吸収できる。このように、GICは、既存の供給量を使い果たした場合、GIC中の本来のCHX塩のMNPを再形成するためにCHXを「再充填」されてもよい。GICは、口腔からのフッ化物の取り込みに関してこのように作用することが知られている。このように、GICの抗微生物効果は、GICの耐用年限の間を通じて無期限に継続し、必要な場合には、CHX塩のMNPの供給量を補給し得る。本発明の抗微生物性MNPの使用は、CHXの持続放出のため、これらの補給の間隔が比較的長く、例えば少なくとも60又は100日、或いはさらに長くできることを意味する。
好ましくは、抗微生物性MNPは、1wt%〜30wt%、より好ましくは1wt%〜20wt%、最も好ましくは1wt%〜10wt%でGIC中に存在する。30wt%超のMNPレベルでは、GICの取扱適性及び引張り強度が悪い影響を受け、そして、約1wt%を下回るレベルでは、MNPの存在に起因する抗菌性作用が低減される。
本発明の複合材料は塗布剤であってもよい。抗微生物性塗布剤は、手術室、歯科及び医療用クリニック、育児室、ケアホーム、及び他の同様な環境で使用されてもよい。本発明の抗微生物性MNPによって実証された持続的な抗微生物特性を有する塗布剤を提供することは、非常に有利である。本発明の抗微生物性MNPは、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)を含めた様々な微生物に対して効果を生じる。本発明の抗微生物性MNPを含む塗布剤は、他の感染性微生物の中でもMRSAに対して耐性を提供し、そしてそれは、特に前記のような環境内で使用されるとき、非常に有利である。
本発明の複合材料は、本明細書中に記載した抗菌性MNPを含むオーラルケア組成物であってもよい。オーラルケア組成物は、一般的な衛生、又は齲歯若しくは特定の歯根膜感染の処置のを理由に口腔内での使用が意図される材料である。好ましくは、オーラルケア組成物は、歯磨き粉、保護ペースト、又は口内洗浄剤である。
抗微生物性ナノ粒子の作製方法
本発明の更なる態様において、CHXカチオンの水溶液を、リン、炭素、窒素、及び硫黄の1若しくは複数のオキソアニオン及び部分的に水素化されたオキソアニオンから選択されたアニオンと反応させることを含む、本明細書中に記載した抗微生物性MNPを作製する方法を提供する。好ましくは、アニオンはリン、炭素、窒素、及び硫黄のオキソアニオンから選択される、そして、より好ましくは、アニオンはホスファート、カルボナート、ニトラート、及びスルファートから選択される少なくとも1つである。好ましくは、マイクロ粒子又はナノ粒子のコロイド懸濁液を生じさせるための混合は、1:100〜100:1のCHXカチオン:選択されたアニオンのモル比である。
好ましくは、2種類の反応物が等モル濃度、すなわち、50:50で存在する。等モル反応物質濃度では、得られるコロイド懸濁液は、満足できるコロイドサイズとゼータ電位を有する。好ましくは、反応混合物中のCHXカチオンの濃度は約5mMである。好ましくは、先に記載するアニオンの反応混合物中での濃度は約5mMである。
好ましくは、前記方法は、CHXカチオンの水溶液をオルトホスファート、ピロホスファート、トリホスファート、及びヘキサメタホスファートから選択されたホスファートアニオンと反応させることを含む。より一層好ましくは、前記方法は、CHXカチオンの水溶液をヘキサメタホスファートアニオンと反応させることを含む。HMPを使用することで、良好なゼータ電位及びサイズ特性、並びに良好な溶解性を有するコロイド懸濁液が生じる。
好ましくは、HMP反応物は、使用前に試薬の好ましくない加水分解の危険を避けるために、例えば、使用前60分以降に準備された、新たに準備されたHMPである。いくつかの態様において、1若しくは複数の追加アニオンが反応混合物中に存在してもよい。いくつかの態様において、(CHXに加えて)1若しくは複数の追加カチオンもまた反応混合物中に存在してもよい。
追加成分もまた、反応混合物中に存在してもよい。これらは、MNP中に組み入れられることが意図される成分、又は例えば、形成後にMNPをコートすることによって、MNPの凝集を予防するのに役立つ成分であってもよい。好ましくは、ポリエチレングリコール(PEG)が凝集防止剤として反応混合物中に存在する。場合によっては、PEGは形成後にMNP表面にコートされる。
好ましくは、反応混合物は、混合プロセス及びMNP形成プロセスを通じて素早く撹拌されている。
特定の態様において、MNPは更なるステップにおいてコロイド懸濁液から回収される。これは、約21000gにて60分間の遠心分離と、それに続く上清の除去、そして、40〜60℃にて数日間の乾燥によって達成され得る。次に、得られた粒子は、取り出され、そして、微細な粉末まですりつぶされて、MNP凝集体を得る。
あるいは、約1Mの濃度のKCl溶液が懸濁液に加えられ、そして、約15分間静置されてもよい。これは電荷層の圧縮を作り出し、MNPが堆積する原因となる。上清の除去に続いて、約5000gにて10分間の遠心分離で、上清の除去後にペーストを得る。これを適宜乾燥させて、MNPを製造する。
抗微生物性ナノ粒子を使用する方法
本発明の更なる態様によると、物品をMNPのコロイド懸濁液中に浸漬すること、該物品を懸濁液から取り出すこと、そして、適宜、該物品を脱イオン水ですすぎ、乾燥させることを含む、本明細書中に記載した抗微生物性MNPの表面コーティングを形成する方法を提供する。
好ましくは、懸濁液中への物品の浸漬中、その懸濁液は、例えば、約150rpmで素早く撹拌される。
好ましくは、物品は1秒〜30分間の間、コロイド懸濁液中に浸漬される。達成されるMNP被覆は浸漬時間に関係するので、より濃い被覆が必要である場合、従って、浸漬時間は延長されなければならない。
適宜、物品は浸漬後に脱イオン水ですすがれる。すすぐことで物品の表面から余分なMNPを取り除く。好ましくは、物品は1秒〜30秒の間すすがれる。達成されるMNP被覆は、すすぎ時間に関係するので、より濃い被覆が必要である場合、従って、すすぎ時間は短縮されなければならないか、又はリンスステップが排除されてもよい。
CHX−HMP MNP、及び/又はCHX−HMP MNPで機能化された材料は、MRSA、E.コリ、P.エルギノーサ、K.ニューモニエ、A.バウマニイ(A. baumanii)、S.ゴルドニイ、P.ジンジバリス(P. gingivalis)、及びC.アルビカンス(C. albicans)を含めた多くの微生物に対して有効性を有する。総生細胞数のカウント(コロニー形成単位)、時間−死滅アッセイ、抑制域、生/死生存率試験、及び顕微鏡技術の範囲を使用した造影などの多くの方法及びアッセイが、抗微生物効果を評価するのに使用された。
今の説明で開示された数値域に関して、もちろん、正常な方法では、上限に対する技術的な評価基準は下限に対する技術的な評価基準と異なっている、すなわち、上限及び下限は内因的に別個の構想であることが理解される。
疑問の回避のために、上記の概説では、通常の方法におけるMNP、物品、組成物、及び方法の異なった特徴に関する一般的な好み及び選択肢が独立に記載されているので、それらが適合可能である限り、特徴の他の組み合わせで組み合わせ可能であることは確認されている。
以下の実施例は本発明の例証である。
実施例1−6;比較実施例1−3:機能化ホウケイ酸ガラス表面からのCHXの溶出
室温にて素早い撹拌下、100mLのクロルヘキシジン(10mMの濃度にて二グルコン酸塩の水溶液として)と100mLの水溶液の状態の様々なアニオンのうちの1つとを、同様にそれぞれの5mMの有効最終総濃度を達成するように、10mMの初期濃度にて組み合わせることによって、クロルヘキシジンベースの塩を調製した。使用したアニオンを、表1に示す。
そして、沈殿物を、ホウケイ酸ガラス製カバーガラス上に付着させた。カバーガラス(Agar Scientific, Stansted, UK)を、アセトンでの10分間の超音波処理と、それに続く工業用変性アルコールでの10分間の超音波処理によって清浄し、風乾させた。
それらを、先に記載した200mLの懸濁液中に、磁気撹拌プレートを使用して素早く撹拌しながら浸漬した。カバーガラスを、30秒間浸漬し、取り出し、脱イオン水に10秒間浸漬してすすぎ、ふき取って余分な液体を取り除き、そして、風乾させた。
CHXベースの沈着物を伴った得られたガラス表面を、走査型電子顕微鏡(SEM)と原子間力顕微鏡(AFM)を使用して調査した。窒化ケイ素カンチレバーを用いてタッピングモードで作動するベンチトップSEM(Phenom, Eindhoven, Netherlands)及び原子間力顕微鏡(Nanoscope IIIa, Digitial Instruments, CA, USA)を、表面を調べるのに使用した。標本を、SEM前にスパッタコーターを使用して金パラジウム層でコートした。
機能化ガラス表面からの可溶性CHXの溶出を、紫外線分光測光を使用して調べた。それぞれのタイプの8個の標本を、紫外線分光測光に好適な、個別に標識したキュベット内に入れた。2.5mLの脱イオン水をキュベットに加え、そして、それらをキュベットの蓋を使用してしっかり密閉した。これらを、150rpmで回転するオービタル振盪機でかき混ぜた。キュベットを密閉したままにし、14日間の間隔をおいてクロルヘキシジン濃度についてサンプル抽出した。
標本を脱イオン水中のみに浸漬した、及びそれらを25μM又は5mMのCHX溶液中のみに浸漬した対照セットを調製した;25μMはCHX−HMP懸濁液中に残った可溶性CHXの濃度であり、5mMは調製における(可溶性及び結合)CHXの総濃度である。
標本のSEM画像を図1〜2に示す。
標本のCHX溶出プロフィールを図3〜4に示す。すべての標本が可溶性CHXを放出した。
表2は、試験した種々のCHX塩のCHX放出特性を示す。
実施例1−CHX−オルトホスファート
CHX−オルトホスファート(CHX−OP)機能化標本は、自己構築型多孔質マトリックス沈着を有するいくつかの領域を示したが、図1b及び図3aに見られる異常構造も示した。これらは、中心部から発生し、この点から放射状に伸長する細長い微結晶の配列で構成されている(「ハリネズミ」型)。これらの構造は、概して直径30〜50μm、そして、個々の微結晶が約0.50〜1μmの幅であった。微結晶がわずかに曲がっていることも多かった。
実施例2−CHX−ピロホスファート;実施例3−CHX−トリホスファート;実施例4−CHX−ヘキサメタホスファート
CHX−ピロホスファート(CHX−PP)、CHX−トリホスファート(CHX−TP)及びCHX−HMPで機能化した標本はすべて、自己構築型多孔質マトリックスと同様の沈着を呈した。これは、密度とCHX−HMPに比べてCHX−PP及びCHX−TPの広範囲の被覆に現れた。
CHXのオルトホスファート、ピロホスファート、及びトリホスファートは最も高いCHX放出を呈した。これらは、短期間にわたるCHXの非常に大量の放出をもたらすことができ、そしてそれは、CHX溶液に単純にさらされた標本で観察される放出に比べ、非常に大量、且つ、迅速であった。最も高い放出はピロホスファートから見られ、中間レベルの放出はトリホスファートから見られ、及び最も低い放出はオルトホスファートから見られたが、それでも試験した他の標本から見られたCHX放出の大きさの約4倍であった。すべての場合において、放出は徐放に関する証拠もなく初期の時期に起こった。これらの粒子は、局所に多量の抗微生物剤投与量を必要とする材料に使用できる。例としては、口蓋栓塞子又は義歯などの医療機器の汚染除去処理である。
CHXのヘキサメタホスファートがどのアニオンでも最も低い総放出を呈したが、これは、実験の継続中(14日間)持続され、測定の結論の時点でもまだ進行中であった。他のより長い実験では、CHXヘキサメタホスファートは少なくとも90日間にわたる放出を示した。これらの粒子は、留置カテーテルや、カニューレや、インプラントなどのより長い期間にわたって抗微生物効果を有することが必要とされるそれらの材料での用途が見つかる。
実施例5−CHX−カルボナート;実施例6−CHX−ニトラート
CHX−カルボナート調製物に晒した標本は、ほぼ球形に配置された自然に形成されたナノチューブ構造を呈した(図2g)。それらは主に単一壁チューブであったが、いくつかの領域では、二重壁ナノチューブ、又はナノチューブの中のナノチューブが見られた。
CHX−ニトラート機能化標本で観察された沈着物は、まばらに分散し、そして、ほとんどの領域がSEMにおいて特徴がないように見えた。
CHXのニトラート及びカルボナートは、オルトホスファート、ピロホスファート、及びトリホスファートよりも少ないCHX放出を呈し、その放出が数日にわたり続いた。ニトラート及びカルボナートの標本は、CHXを放出し、そして、この放出が約48〜72時間継続した;この後、CHX濃度が安定したので、放出が完了したと見なすことができる。これらには、創傷包帯又は縫合糸など、この期間にわたって抗微生物効果を必要とする製品における用途が見つかる。
比較実施例1〜3
水又はCHX水溶液で処理したガラス表面は特徴がなく平らに見える(図1a)。CHX処理した標本は共にCHXを放出し、そして、この放出は約48〜72時間にわたり継続した;この後、CHXの濃度が安定したので、放出が完了したと見なすことができる(図4)。
実施例7〜14;比較実施例4−7:CHX−HMP機能化材料からのCHXの溶出
ナノ粒子の合成及び特徴づけ
それぞれ5及び5又は0.5及び0.5mMの最終総濃度をもたらすように、室温にて素早い撹拌下、CHX(二グルコン酸塩の水溶液として)とHMP(ナトリウム塩の水溶液として)とを組み合わせることによってCHX−HMPナノ粒子(NP)を調製した。これらは今後、CHX−HMP−5とCHX−HMP−0.5と呼ばれる。2種類の試薬を混合することで、コロイド懸濁液の形成はもたらした。コロイド懸濁液中のナノ粒子の粒度とゼータ電位は、時間と電気泳動度(Malvern Zetasizer, Malvern, UK)の係数として動的光散乱法(DLS)を使用して特徴づけられた。
ナノ粒子の調製と特徴づけ−機能化材料
様々な材料の標本をナノ粒子によってコートした。使用した材料を表3に示す。
200mLのコロイド懸濁液を、新たに調製した試薬(HMPの加水分解を予防するため)を使用して調製した。標本を、素早く撹拌しているコロイド中に30秒間浸漬し、次に、取り出し、脱イオン水中に10秒間浸漬してすすぎ、そして、ふき取って余分な液体を取り除き、風乾させた。
好適な表面を有するもの(ガラス、チタニウム)については、ナノ粒子で機能化した表面を、原子間力顕微鏡(AFM;Nanoscope IIIa, Digital Instruments, CA, USA)を使用して調べたが、非常に荒い又は不揃いな表面を有するもの(アルギン酸塩包帯、EVA重合体)については調べなかった。すべての標本を、スパッタコーティングユニット(SC7620, Emitech, Taiwan)を使用した金パラジウム合金でのコーティング後に、走査型電子顕微鏡(SEM)(Phenom, Eindhoven, Netherlands)を使用して調べた。ガラスもチタニウムも原子論的に平らな表面ではないので、小さい(<20nm)表面特徴と小さいナノ粒子を見分けることは難しかった;この理由から、CHX−HMP−5とCHX−HMP−0.5ナノ粒子も新たに固着した雲母上に堆積させて、それらの中で最も小さいものを決定した。
CHX−HMP−5及びCHX−HMP−0.5のナノ粒子でコートしたそれぞれの材料の8個の標本を、紫外線分光測光に好適な、個別に標識したキュベット内に入れた。
脱イオン水をキュベットに加え、そして、それらをキュベットの蓋を使用してしっかり密閉した。これらを、150rpmで回転するオービタル振盪機でかき混ぜた。キュベットを密閉したままにし、60〜90日間の間隔をおいてクロルヘキシジン濃度についてサンプル抽出した。標本を脱イオン水中に浸漬した、及びそれらを25μMのCHX溶液中に浸漬した対照セットを調製し、該25μMは、CHX−HMP−5コロイド懸濁液中に残ったCHX水溶液の濃度である。
コロイド懸濁液からのNPの任意の回収
反応が行われた後に、適宜、NPを懸濁液から回収してもよい。本実施例の場合にはこれをおこなわなかったが、しかしながら、以下の選択肢の1つによってそれを達成してもよい:
1)高g用遠心分離管又はEppendorf内に入れ、60分間、21000gにて遠心分離する。これにより適度な分離がもたらされる;わずかに濁っている液体として見られる上清中に残ったNPの痕跡がまだ存在する。上清を取り出して捨て、そして、NPペーストを使用するか、又はオーブン内、数日間にわたり40〜60度で乾燥させ、掻き出し、微細な白色粉末に粉砕し、NPの凝集体を得る。これらは、例えば歯科用セメント又はその他の材料に加えてもよい。
2)あるいは、250mLの5/5コロイド懸濁液に25mLの1M KCLを加え、15分間置くと、電荷層の圧縮のせいでNPのバルクが容器の底に沈殿する。デカントして、上清を捨て、底で濃密になった液体を遠心分離機容器の中に集める。5000gにて10分間、遠心分離する。これにより、NPの周りの電荷層の圧縮によるはるかに効果的な分離をもたらすので、より典型的な実験装置を用いてより大量のNPを加工するのに使用できる。上清を捨てた後で、ペーストを掻き出してもよく、例えば、塗布剤又はその他の材料に加えるために使用されてもよい。あるいは、ペーストを乾燥させて、先に記載したように使用してもよい。
CHX−HMP−0.5及びCHX−HMP−5懸濁液の主な粒度及びゼータ電位を表4に示す。
DLSは、はるかに小さい直径の第二のピークが約20〜60nmで観察されたいくつかの標本で二つのモードのサイズ分布を示した。ナノ粒子機能化表面のSEM画像を図5〜8に示し、機能化ガラス、チタニウム、及び雲母表面のAFMを図9〜11に示す。チタニウム及びガラス標本は、約40nmより小さい直径を有するナノ粒子と基板面を区別するのを不可能にするナノ規模の荒さを呈するが、対照雲母表面は、原子論的に平らであるので、これらの画像は典型的に20〜100nmの直径を有するナノ粒子の密集層の明確な表示をもたらす。
ナノ粒子で機能化された表面からのクロルヘキシジン溶出を図12〜15に示す。
調査した異種材料の標本は、CHX−HMPの抗微生物性ナノ粒子によって首尾よく機能化され、最大90日間の期間にわたる可溶性CHXのゆるやかな浸出を呈した。図5〜11のSEM及びAFM画像は、個々のナノ粒子の明確な視覚化をもたらし、そして、自然の自己構築型多孔質ナノ粒子がほとんどの表面で凝集している。
表5は、様々な機能化材料に関するCHX放出期間を示す。CHX放出量に関しては、図12〜15を参照のこと。
実施例7−CHX−HMP−5で機能化したガラス
実施例8−CHX−HMP−0.5で機能化したガラス
比較実施例4−対照25μMのCHX溶液に晒したガラス
ナノ粒子で機能化されたガラス表面は、実験期間を通じてCHXを放出し(図13)、放出されたCHXは、ナノ粒子の初期密度及びナノ粒子凝集体に関連し、より密にコートされているCHX−HMP−5の表面ほど、より低い密度でコートしたCHX−HMP−0.5の表面に比べて、より高い、より持続した放出を呈する(図6)。CHX−HMP−0.5標本に関して、可溶性CHXの放出は約20〜25日後に止まったが、一方で、CHX−HMP−5標本に関して、放出は90日の時点でまだ続いていた。25μMのCHXで処理した対照群は、CHX放出を全く示さず、すすぎステップで可溶性CHXが完全に取り除かれ、そのため、ナノ粒子で機能化された標本で観察されたCHX放出が、これらのナノ粒子の存在によることを示した。
この知見は、セメント材料に埋め込まれたガラス粒子を含む歯科充填用材料であるグラスアイオノマーセメントなどの持続した抗微生物機能性の利益を得るガラス含有及びガラス様生物医療用品、並びに消費者製品における用途を見つけることができる。
実施例9−CHX−HMP−5で機能化したアルギン酸塩創傷包帯
実施例10−CHX−HMP−0.5で機能化したアルギン酸塩創傷包帯
比較実施例5−対照25μMのCHX溶液に晒したアルギン酸塩創傷包帯
表面積で標準化すると、最も高いCHX放出は、アルギン酸塩創傷包帯からであった(図12)。SEM画像は、CHX−HMP−5ナノ粒子によるほとんどすべての繊維におけるナノ粒子凝集体の濃いコーティングを明確に示し、そして、CHX−HMP−0.5ナノ粒子でコートした標本のよりまばらな分配を明確に示した(図5)。対照25μMのCHX溶液で処理した標本からのCHXの何らかの放出があったが、材料は溶液からいくらかの可溶性CHXを吸収したが、対照標本から放出されたCHXの量はナノ粒子で機能化された標本で見られたそれよりはるかにわずかであることを示す(図12)。用量−反応相関があり、これより、CHX−HMP−5標本がCHX−HMP−0.5標本より多くの放出を呈し、これはCHX−HMP−5調製物を用いたナノ粒子の広範囲の被覆と関連する(図5)。CHX−HMP−5及びCHX−HMP−0.5標本の両方に関して、放出は実験の結論の時点でまだ進行中であり、この時点でナノ粒子が使い果たされていないことを示す。これらの知見は、慢性又は非回復期創傷を感染から保護する創傷包帯を開発するのに有用であり得る。
実施例11−CHX−HMP−5で機能化したEVA重合体
実施例12−CHX−HMP−0.5で機能化したEVA重合体
比較実施例6−対照25μMのCHX溶液に晒したEVA重合体
CHX−HMP−5でコートしたEVA重合体表面は、ガラスやアルギン酸塩創傷包帯上で観察されるのと同じ特徴的なナノ粒子凝集体を示したが、被覆は他の基材のそれより概していくらか低い密度であった(図7)。EVA CHX−HMP−0.5標本は非常に低く長続きしない可溶性CHX放出を示した。しかしながら、CHX−HMP−5標本は、最大で少なくとも80日間、CHXの持続放出を示し(図14)、表面積に対して標準化した場合、これはガラス標本で見られた放出に匹敵していたが、それよりわずかに高かった。これらの知見は、静脈カテーテルや尿カテーテルなどの抗微生物性重合体ベースの医療機器の開発、及びスポーツ用マウスガードや歯ぎしり用マウスガードなどの脱着可能なポリマー製品向けの抗菌性コーティングの周期的な局所使用における用途を見つけることができる。
実施例13−CHX−HMP−5で機能化したチタニウム
実施例14−CHX−HMP−0.5で機能化したチタニウム
比較実施例7−対照25μMのCHX溶液に晒したチタニウム
チタニウム表面は、図8で見られるように、CHX−HMPナノ粒子の凝集に関する明らかな証拠を示した。CHX−HMP−5で機能化された標本は、実験期間にわたって可溶性CHXの連続放出及び徐放を示した;数の上では、この放出はガラス及び重合体表面から見られるものの約二倍であった。CHX−HMP−0.5で機能化させた表面は、わずかなCHXしか放出せず、この放出は約5日後に止まった。CHX−HMP−5ナノ粒子には、チタニウム若しくはチタニウム合金から作られた歯科又は整形外科用インプラントのための抗菌性コーティングの開発における用途が見つかり、そして、ナノ粒子が非連続的なコーティングを作り出していて、多くのチタニウムがまだ晒されているので、骨芽細胞によるコロニー形成に利用可能である、従来の抗菌性コーティングを超える利点をもたらす。
実施例15〜18;比較実施例8〜10:微生物学試験
微生物学:菌株
メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA;NCTC13142)をミューラー−ヒントン(MH)培地で培養した。シュードモナス・エルギノーサNCIMB8626(ATCC9027)を栄養培地(NB)又は栄養寒天培地(NA)で培養した。すべての培養物を、試験を通じて好気的に37℃にてインキュベートした。
微生物学:最小発育阻止濃度
プランクトン様細菌に対して対照である25μMのクロルヘキシジン水溶液及びCHX−HMP−5コロイドの最小発育阻止濃度(MIC)を、(British Society for Antimicrobial Chemotherapy methodology for determining MICに従って)96ウェルマイクロタイタープレート内、全容積100μLの適切な培地中に連続倍加希釈(0〜25μM)によって測定した。培養物を好気性条件で37℃にて16時間インキュベートし、吸光度(OD)測定値を、標準的なマイクロタイタープレートリーダ(SpectroStar Nano; BMG Labtech)を使用して620nm(A620)で評価した。
微生物学:総生細胞数のカウント
サンプルを、マイクロタイタプレートのウェルから採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で連続的に希釈した(10-1〜10-6);10μlのアリコートを、非選択的培地としてMH又はNAを用いるMiles及びMisraの総生細胞(TVC)カウント法(Hyg (Lond), vol. 38, pp. 732-749, 1938を参照)を使用して数えた。回収細胞数をcfu ml-1として計算した。
微生物学:固定バイオフィルムモデル
菌株をまず16時間培養し、これらの定常期培養物を遠心分離で集菌し、そして、OD650=0.1に調整した。バイオフィルムを、50μLの適切な培地中で好気的に37℃にて48時間培養し、次に、培地を取り出して捨てた。バイオフィルムを100μlのPBSで二度洗浄することによって、緩く付着している細菌を取り除いた。PBS中に希釈したクロルヘキシジン又はクロルヘキシジンナノ粒子を、先に記載したように倍加希釈(0〜25μM)を使用してバイオフィルムに加えた。プレートを37℃にて2時間インキュベートした;生物量を評価するために、連結していない細胞をそっと吸引して捨て、接着細胞を、PBSで二度洗浄し、そしてクリスタルバイオレット(0.25% w/v)で10分間染色した;PBSで更に二回洗浄を続け、細胞が結合したクリスタルバイオレットを7%の酢酸で再可溶化し、そして、吸光度を595nm(A595)で計測した。
微生物学:ナノ機能化EVAポリマー標本上のバイオフィルム
MRSA及びP.エルギノーサの前培養を、適切な培地中、37℃にて16時間好気的に培養した。ポリマー片上での増殖に関するアッセイを、24ウェルMTPのウェル内に各キューブを置き、そして、(ポリマー標本を覆うのに十分な)1mlの適切な液体培地を加えることによって測定した。ポリマー標本は、IMS中での10分間の超音波処理と、それに続く、処置なし(対照)、撹拌したCHX−HMP−5中への30秒間の浸漬と、それに続く、脱イオン水中への10秒間の浸漬(低いNP)、及びすすぎを伴わない撹拌したCHX−HMP−5中への30秒間の浸漬(高いNP)のいずれかによって清浄した、表3のEVA重合体であった。各ウェルに10μlのMRSA又はP.エルギノーサの前培養物のいずれかを植え付け、次に、37℃にて24時間インキュベートした。ポリマー標本をウェルから無菌の鉗子を使用して取り出し、1mlのPBSを入れた微小遠心チューブに移した。チューブを1分間ボルテックス処理し、付着細菌を取り外し、そして、細胞懸濁液を連続的に希釈(10-1〜10-6)し、細菌を、Miles及びMisraの方法を使用して数えた。
表6は対照及びCHX−HMP−5培地についてMICを示す。
表7は、MRSA及びP.エルギノーサの固定細菌性バイオフィルムに対する異なった培地の効果を示す。
表8は、ナノ機能化EVAポリマー標本の抗菌性作用を示す。
CHX−HMP−5コロイド懸濁液に関するMRSAのMICは、コロイドの8×希釈であることがわかり、それは、0.625mMの総(可溶性及び結合)CHX濃度及び3.12μMの可溶性CHX濃度に相当する。MRSAのMICは25μMのクロルヘキシジンについて確立されず、この溶液がMRSAに対して効果を生じなかったことを示している(図19)。P.エルギノーサに関して、CHX−HMP−5に関するMICは、コロイドの16×希釈であることがわかり、それは、試験した最小の濃度であった;これは、0.312mMの総CHX濃度及び1.56μMの可溶性CHX濃度に相当する。25μMのクロルヘキシジン濃度に関するMICは、無希釈溶液、すなわち、25μMであり、P.エルギノーサがMRSAよりナノ粒子に対して感受性を有することを示している(図20)。MRSA未処理対照について1.5×1012cfu ml-1を回収し、且つ、CHX−HMP−5コロイドの8×及び4×希釈物を用いて培養したサンプルからまったく細菌を回収できず、MICもまた殺菌性を有することが示唆されたTVCは、MICデータを裏付けた。同様に、P.エルギノーサに関して、未処理対照で1.34×109cfuml-1を回収したのと比較して、CHX−HMP−5コロイドの16×及び8×希釈物を用いて培養したサンプルから細菌を回収できなかった。
MRSAのバイオフィルムは、CHX−HMP−5コロイドによって破損し、25μMのクロルヘキシジン水溶液によってある程度破損した(図21)。CHX−HMP−5コロイドもまた、16×〜4×の希釈における25μMのクロルヘキシジン水溶液に比べ、より効率的にP.エルギノーサのバイオフィルム(図22)を破損させた;2×及び未希釈レベルにおいて、25μMのクロルヘキシジン及びナノ粒子は等しく有効であった。ナノ機能化EVA重合体上でのバイオフィルム増殖に関して、対照重合体について、標本から回収したP.エルギノーサ細菌細胞は使用した希釈の全てにおいてカウントできないくらい非常に多かった;MRSAでは5×105cfu ml-1が回収された。低濃度のナノ粒子でコートしたポリマー片に関して、細菌細胞は、P.エルギノーサについては、すべての希釈でカウントできないくらい非常に多かったが、MRSAについては、細胞がまったく回復できなかった。P.エルギノーサについて、多数の細菌が回収されたにもかかわらず、周囲の液体培地は対照(より少ない増殖を示す)ほど濁っておらず、そして、MRSAについては、周囲の培地は透明であり、ゼロ増殖を示したことに注意しなければならない。高濃縮のナノ粒子でコートしたポリマー片に関して、MRSA又はP.エルギノーサのいずれについても細菌は回収できず、周囲の培地は両方の事例で透明であった。
微生物学実験は、CHX−HMP−5コロイドが生体外において浮遊状態で(planktonically)に培養したMRSA及びP.エルギノーサに対して効果を生じること、並びにこの効果がコロイドを洗う溶液中の残った25μMの可溶性CHXの存在によるものでないことを示した。さらに、バイオフィルム試験は、CHX−HMP−5コロイドが生体外においてMRSA及びP.エルギノーサのバイオフィルムに対して効果を生じることを示した。さらに、CHX−HMP−5ナノ粒子でコートしたEVAポリマー標本は、MRSA及びP.エルギノーサのバイオフィルムに対する有効性を呈した。
実施例19〜24;比較実施例11:CHX−HMP NPで置換したグラスアイオノマーセメント
CHX−HMPナノ粒子の合成及び調製
クロルヘキシジン二グルコン酸塩とヘキサメタリン酸ナトリウム(共にSigma Aldrich)水溶液の原液を、終濃度が4mMのCHX及び5mMになるように脱イオン水中で混合した。得られたコロイド懸濁液を、徹底的に混合し、次に21000gにて60分間遠心分離した。上清を取り出して捨て、そして、NPペレットを少なくとも48時間40℃にて乾燥させた。そして、ペレットを遠心分離管から取り出し、乳鉢と乳棒を使用して微細な白色粉末に粉砕した。この粉末をガラス粉末との置き換えによってGICに加えた。
ナノ機能化グラスアイオノマーセメント
市販のGIC(Diamond Carve (TM), Kemdent, Purton, UK)を出発物質として使用した。製造業者の取扱説明書に従ってGICを混合し、取り出し易くなるように薄層のワセリンでコートしたPerspex鋳型内で押し固めることによって、6mmの直径と3mmの高さの公称寸法を有する円筒GIC標本を形成した。混合は、GIC調製の広範囲の経験を有する個人によって行われた。それぞれの標本の正確な寸法を、ノギスを使用して測定し、記録した。NP粉末を、0、1、2、5、10、20及び30wt%の置換にてGICガラス粉末のアリコートと混合した。それぞれの置換の10個の標本を作製して、合計70個の標本を得た。それらを60分以内に鋳型から取り出し、標本と直接接触しないようにウェットティッシュペーパーを入れた個々の小さく、密封されたプラスチック容器内に置いて、100%の湿度の雰囲気を達成したが、重要な設定の初期相中の溶解をもたらす場合がある液状の水と標本との接触を予防した。これらは37℃にて7日間保存した。
この後、標本をそれぞれ5個の標本から成る2つのセットに分割した。それぞれの置換の一方のセットを引張り強度及び形態学的試験のためにとっておき、もう片方のセットをセメントからのクロルヘキシジン及びフッ化物の浸出を調査するのに使用した。
クロルヘキシジン及びフッ素放出の調査のために、各標本を37℃にて個別に標識した容器内の1mLの人工唾液中に浸漬した。人工唾液は、CaCl2・2H2O 0.103gL-1、MgCl2 0.019gL-1、KH2PO4 0.544gL-1、C81824S(HEPESバッファー酸性型)4.77gL-1、KCl 2.24gL-1、1.80mLの1M HCl、6.8のpHを得るために滴定したKOHから構成される。クロルヘキシジン及びフッ化物濃度のためにサンプル抽出される可能性がある状況で人工唾液と標本がインキュベートされるように、標本を定期的に取り出し、そして、新鮮な人工唾液の入った二連のチューブに入れた。予備実験をおこない、サンプリング期間が適切に選択されて、且つ、測定値間の大き過ぎるずれを除外することによって、フッ化物塩による溶出物の飽和による誤った測定値を得ないことを確実にするために、容器内のフッ化物濃度の飽和限界を確立した。この予備実験から知見を使用して、サンプリングは、初日の間、1時間おきにおこない、続いて4時間の間隔でおこない、その後は毎日、そして、その後は毎週おこなった。GIC標本を含まず人工唾液のみを含む対照も同じようにサンプル抽出した。
クロルヘキシジンの測定値
人工唾液中のクロルヘキシジン濃度を、紫外線(UV)分光測光を使用して計測した。1mLの人工唾液を、紫外波長下で透過性のセミマイクロキュベット内に入れ、そして分光光度計を使用して、吸収を255nmにて計測した。測定値を、それぞれの計測サイクルの最初と最後に計測した5、10、20、30、40、50μmol.l-1クロルヘキシジンの較正基準を基準にしてクロルヘキシジン濃度に変換した。濃度を、各標本の個々の寸法測定を基準にして、GIC標本の単位表面積あたり放出されたクロルヘキシジンのモル数に変換した。
フッ素化合物の測定値
人工唾液中のフッ化物濃度を、0.5mLの人工唾液を0.5mLのTISAB溶液と混ぜることによってイオン選択電極を使用して計測した。データ出力を、同様に等量のTISABで希釈した0.1、0.5、1、2及び5mg/LのF-の較正基準を基準にしてmg/Lフッ素イオンに変換した。
引張り強度の測定値
破断が起こるまで円筒状試料に直径方向の圧縮力をかけ、破断時点の負荷を記録し、そして、これを使用して引張り強度を計算することによって、間接的な引張り強度を計測した。
統計解析
1時間、24時間、8日間、15日間及び33日間の時点での累積CHX及びフッ素放出、並びに間接的な引張り強度を、テューキーの正直有意差ポストhoc検定(Tukey honestly significant difference post-hoc test)を用いた一元配置ANOVAを使用して比較した。
形態及び構造
引張り強度について試験した標本を、金パラジウム(SC7620, Emitech, Taiwan)の薄層でコートし、走査型電子顕微鏡(Phenom, Eindhoven, Netherlands)で調べた。画像を400、1000及び5000×の公称倍率にて得た。
表9は置換したGIC及び非置換GICの特性を示す。
表10は累積CHX放出を示す。各時点の範囲内では、文字が統計的に均質な群を示すので、異なった文字を含む図面はその時点で95%の信頼度で統計的に有意差がある。
表11は累積フッ素放出を示す。各時点の範囲内では、文字が統計的に均質な群を示すので、異なった文字を含む図面はその時点で95%の信頼度で統計的に有意差がある。
概説
ガラス粉末の1、2、5、10及び20wt%のCHX−HMPナノ粒子による置換を伴うGIC標本を首尾よく作製し、未処理GIC(0wt%置換)と比較した。CHX−HMPナノ粒子の30wt%置換を伴うものはもろく、且つ、取り扱いが難しかったので、破棄した。
クロルヘキシジン放出
表面積に対して標準化した、791h(33日間)にわたるCHX放出は、図16で見られる。CHX放出は、試験の継続期間の間、持続し、且つ、最後の計測時点では明らかな安定期に入っていなかった。用量−応答は、CHX−NPのより高度な置換を有する標本がより大きいCHX放出を呈したが、相関は正比例していなかった。
6つの標本群に関する1及び24時間、並びに8、15及び33日間の累積CHX放出、そして、統計的分析の結果を表10に示す。結果は、それぞれの時点について、0wt%及び1wt%が互いに統計的に有意差がなかったこと、そして、1wt%及び2wt%が互いに統計的に有意差がなかったことは同じであったが、その他のすべての組み合わせで有意差があり、すべての計測時点においてナノ粒子置換の増大に関連するクロルヘキシジン放出の明らかな増大を示した。
フッ化物放出
表面積に対して標準化した、791h(33日間)にわたるフッ化物放出は、図17で見られる。GIC標本のすべてが実験の継続期間を通じて持続してフッ化物を放出した。初期の放出速度が最も速く、これが実験期間を通して次第に遅くなった。
6つの標本群に関する1及び24h時間、並びに8、15及び33日間の累積フッ素放出、そして、統計解析の結果を表11に示す。1時間では、未処理GICが置換フッ化物よりもかなり多くのフッ化物を放出したが、別の置換との間に統計的な有意差はなかった。それ以降の時間において、わずかしか違いがなく、且つ、フッ素放出は、すべてのGIC標本で非常に類似していたので、ナノ粒子置換の効用としての変化はなかった。
引張り強度
6つの標本群に関する直径方向の引張り強度を表3に示す。ANOVAにより0.054のp値を得、10及び20wt%置換セメントに関して低い引張り強度に向かう数字上の傾向があったが、これらの値及び他のGICの値の間には、統計学的な有意差はなかったことを示す。
形態及び構造
代表的なGIC標本の走査型電子顕微鏡写真を図18に示す。
異なったナノ粒子置換によるGIC標本の外観はガラス充填剤粒子と周囲のマトリックスがはっきりと見え、区別がつかなかった。20wt%ナノ粒子置換のみ、より小さい粒子又はナノ粒子凝集体の徴候を有する、わずかに異なった外観を呈した(図18f)。
結論
市販のGICにCHX−HMPナノ粒子を加えることによって、用量依存性様式で長期間にわたりCHXを放出する材料を作製することが可能であることが判明した。CHXは様々な細菌及び酵母に対して効果があるので、これがこれらの新しいナノ機能化歯科充填材料に抗微生物性及び抗齲蝕特性を与える。最大5wt%の置換は、セメントの引張り強度(表9)に有意な有害影響を有していないように見えた。より高度な置換は引張り強度の低下につながる可能性があるが、これは統計的に有意でなかった;20wt%では、セメント構造内にいくつかの異なった形態を見ることができ(図18)、ナノ粒子及びナノ粒子凝集体の存在を示した。これらのより高い置換は強度の低下につながる場合がある。なぜなら、それらはガラス充填剤粒子と同様の方法でポリ酸と相互作用すると思えないからである。ナノ機能化GICは、未処理セメントと同じフッ化物放出プロフィールを示した。
本明細書中に記載したCHX−HMPナノ粒子の使用は、すりつぶした(ground up)CHX二酢酸塩やCHX二グルコン酸塩水溶液の使用などの他のアプローチと対照的に、CHX放出がGICを用いるよりかなり長期間持続される利点を示す(図16)。
本明細書中で見られた少なくとも33日間の持続放出と比較して、粉末化したCHX二酢酸塩を補ったコンポジットレジンは、約7日後に安定期に入るCHX放出を示した(Dent Mater, vol. 28, pp. 573-583, 2012)。
CHX二酢酸塩粉末又はCHX二グルコン酸塩溶液を補ったGICが報告され(J Esthet Restor Dent, vol. 20, pp. 29-44; discussion 45, 2008)、これらはいくつかの口腔微生物の増殖を阻害した。これらのGICからのCHX放出は直接的に計測されなかった。ほとんどの標本では60〜90日後には抗微生物性挙動を示さなかった。これらの既知のGICの有効性のピークは、すべてのGIC標本で最初の24時間であり、ほとんどのCHXがこの初期期間の間に放出されることを示している。本構想のMNPを組み込んだGICで観察されたさらに延長されたCHX放出は、より持続した抗微生物効果につながる。
実施例25−CHXナノ粒子で機能化したEVAサンプルにおける微生物学
EVA標本を、水中のCHX−HMP−5のコロイド懸濁液中に30秒間浸漬し、続いて脱イオン水中に10秒間浸漬するか(「低濃度」)又はその後脱イオン水中への浸漬をせず(「高濃縮」)、機能化した。そして、これらのサンプルをMRSA細菌の培養物に晒した。次に、それらを、1mLの増殖培地中に浸漬し、そして、18時間インキュベートした。放出実験によれば、今回、EVA標本は1m2材料あたり約6μMを放出しなければならない。標本の表面積が0.000182m2なので、予想総放出は1mL中に1.1nMのCHXでなければならず、1.1μMのCHXの結果濃度をもたらす。
約1.1μMのCHX濃度をもたらすこれらの標本では、回収可能なMRSAがなかった。しかしながら、(CHX−HMP−5懸濁液と対照的に)25μMのCHX溶液を使用した同様の処置は、MRSAに対して効果がなかった。これらの結果は、ナノ粒子がMRSAに対して有効であり、且つ、ナノ粒子自体が、放出したCHXに起因する効果に加えて何らかの追加的な抗菌性効果を呈し得ることを示している。これは、材料の表面に最も近い、CHXの局在化した非常に高い濃度に起因するか;及び/又はナノ粒子が固有の抗微生物活性を有している。
実施例26−CHXナノ粒子によって機能化したチタニウムサンプルの微生物学
CHX−HMP−5で機能化したチタニウム標本もまた、ストレプトコッカス・ゴルドニイ細菌の培養物に晒した。サンプルを、2mLの増殖培地に浸漬し、最大48時間インキュベートした。放出実験によると、これは1m2あたり約7μMの放出しなければならない。標本の表面積が0.00024m2なので、予想される放出は2mL中に1.7nMのCHXでなければならず、0.8μMのCHXの結果濃度をもたらす。
ナノ粒子で機能化されたチタニウム表面はサンプル中の細菌を排除した。
S.ミュータンス(S. mutans)(S.ゴルドニイに類似したグラム陽性ストレプトコッカス細菌もまた齲歯に関係した)のためのMICが、約1.4mMに相当する、すなわち今標本で作用するCHX濃度より4桁高い、質量で0.125%のCHX二グルコン酸塩と報告された。
これらの結果は、ナノ粒子自体がバルク溶液中への可溶性CHXの放出に加えて、何らかの固有の抗菌性作用を呈することを示唆している。
実施例27−CHX−HMP MNPの特性
CHX−HMP MNPの組成、化学量論性、サイズ、及び凝集特性に関する直接的な証明を本明細書中に提供する。
MNP、具体的には、CHX−HMP−5及びCHX−HMP−0.5組成物のTEM解析をおこなった(図23)。CHX−HMP−5及びCHX−HMP−0.5 NPを炭素コートした銅格子(Agar Scientific Ltd., Essex, UK)上に置き、TEM及びEDX(Jeol 120 kV 1200 Mk2; Jeol, Tokyo, Japan)にかけた。TEM格子を、2秒間NP懸濁液に浸漬し、2秒間脱イオン水ですすぎ、風乾させた。
MNPは、幅広いサイズで凝集体を見つけることが多かった。図23は左側にCHX−HMP−0.5のサンプル、そして、右側にCHX−HMP−5のサンプルの実施例を示す。高濃度サンプルの画像は、個々のナノ粒子の良好な可視性を有する凝集体の周縁部でMNPが見られることを示す(画像の右上部)。矢印は別々の、個々のナノ粒子の2つの例を示す。TEMは、MNPが一緒に融合することが多く、静電気的に固定されているだけではないことを示す(特に低濃度サンプルの画像を参照)。いくつかの非常に小さい凝集体もまた観察された。
EDXをTEM格子上のCHX−HMP MNPにおこなって、MNPの組成物を調査した。Cl(CHXから)及びP(HMPから)の両方をスペクトル中に観察し、MNPがCHXとHMPから構成されていることを確認した。Cu及びAuからのシグナルはMNPを乗せたTEM格子に起因する。
動的光散乱法(DLS)及びゼータ電位測定(Zetasizer NanoZS; Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)をおこなった(それぞれ図24及び図25)。CHX−HMP−5懸濁液はある程度の堆積した凝集体を含んでいたので、上清を分析する前に標本を沈殿させた。報告したそれぞれの数値は、図示した3つの測定の平均である;各計測を異なったナノ粒子懸濁液でおこなった。DLSを使用して計測した粒度は、CHX−HMP−5及びCHX−HMP−0.5において異なっており、それぞれ202及び140nmの平均値を得た。DLSによって得られた値は、TEMによって明らかになった値(TEM解析は約40〜80nmの値を示唆した)よりわずかに大きく、それは、TEMによって観察された凝集の結果であろうと思われた(先に考察した)。このことは、粒子が高濃度懸濁液中でより大きい凝集体を一般的に形成するという観察によって支持される。ゼータ電位測定は、MNPの濃縮物が両方とも陰性荷電であることを明らかにした;CHX−HMP−5はCHX−HMP−0.5より大きい正味電荷を有していた(それぞれ−50.8及び−42.2mV)。
CHX−HMP−5堆積物の元素分析は、ナノ粒子が3イオンのCHX対1イオンのHMPの比で構成されることを示した。
実施例28〜29及び比較実施例12〜13−複合材料:創傷包帯フィルム
天然多糖類CMC(比較実施例12)及びアルギン酸塩(比較実施例13)の膜を作製した。同等なフィルムに、CHX−HMP−5ナノ粒子を様々な用量で組み込んだ(実施例28〜29)。これらのフィルムは新規抗微生物性創傷包帯における使用のために有望である。
アルギン酸塩の5wt%水溶液を、乾燥アルギン酸塩(Protanal LF 10/60 FT, FMC Biopolymers)を、6wt%、3wt%又は0wt%に相当するクロルヘキシジンヘキサメタリン酸塩ナノ粒子の素早く撹拌した水性懸濁液に加えることによって調整した。これらの溶液をペトリディッシュ(90Φ=mm)に注ぎ入れ、室温で3日間水を蒸発させた。CaCl2(30mL、2wt%aq.)をペトリディッシュに追加し、25分間、架橋させた。架橋アルギン酸塩フィルムを、次に、ペトリディッシュから取り出し、蒸留水で洗浄し、パラフィルム上で風乾させた。
カルボキシメチルセルロース(CMC)の5wt%水溶液を、乾燥CMC(3タイプ:Mw=90,000、250,000、及び700,000であり、それぞれ無水グルコース単位あたり0.7、0.7、及び0.9個のCM基を有する)を、6wt%、3wt%又は0wt%に相当するクロルヘキシジンヘキサメタリン酸塩ナノ粒子の素早く撹拌した水性懸濁液に加えることによって調整した。これらの溶液をペトリディッシュ(90Φ=mm)に注ぎ入れ、室温で4日間水を蒸発させた。15mLのエタノールは、各フィルムを覆うように加え、蒸発するまで室温で放置した。フィルムを取り出せるように15mLのエタノールから成る第二のカバーをペトリディッシュに加えた。それらを、それに続いてパラフィルム上に置いて風乾させた。
フィルムの3.32mm2(アルギン酸塩)又は5.00mm2(CMC)の小片をセミマイクロキュベットに入れ、水(2.2mL)で覆い、そして、キュベットを蓋とパラフィルムで密封した。キュベットをオービタル振盪機(150rpm)によって撹拌し、吸光度(255nm)を24時間に1度計測し、標準プロトコールに従って、クロルヘキシジン二グルコン酸塩基準のものと比べた。CHX−HMP NPがアルギン酸塩フィルム内の架橋プロセスを免れることを示し、1492cm-1のピーク及びCHX−HMPスペクトルの2つのメインピークに相当する1530cm-1の肩部の存在によってFT−IRで確認された。
CMCが、水中への浸漬により素早く溶解し、崩壊し、そして、約10分間の期間にわたってすべてのCHXを放出することがわかった。CHX放出は、数分以内に完了し、そしてそれは、より高いwt%のMNP含有フィルムが放出を完了するためにより長い時間を示す用量依存性を有する(図26)。
対照的に、アルギン酸塩は崩壊せず、7日間の期間にわたってCHXを放出した(図27)。CHX放出は、5〜7日間の期間にわたって続き、より多くのMNPを組み込むほどより高いCHX放出で放出する用量依存性があった。これは、MNPの適切な用量を選択することによって放出を制御する可能性を提供する。
実施例30及び比較実施例14−創傷包帯の抗微生物効果
実施例28のアルギン酸塩MNPフィルムを抗微生物性アッセイで試験した。試験微生物は、創傷感染に非常に関連があると考えられる:MRSA、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、及びアセニトバクター・バウマニイ(Acenitobacter baumanii)。[アセニトバクター・バウマニイは、細胞膜中のイオン輸送チャンネルによってCHXに対して耐性を有することが報告された最初の微生物である。それは、広範囲の病原菌でないが、特に軍隊の病院で見られる。]
フィルムはまた、銀ナノ粒子を含む市販の包帯の小片に対しても試験した(比較実施例14)。
表12は、市販の銀ベースの包帯と比較した、5種類の創傷関連病原菌に関する実験的なCHX−HMP MNPアルギン酸塩複合包帯の抑制域を示し、そして、MRSA、E.コリ、P.エルギノーサ、及びK.ニューモニエに関して、MNP包帯が、市販の包帯より細菌増殖をより強く阻害することを示す。
銀包帯は、A.バウマニイに関してMNP包帯より大きい抑制域を有するが、A.バウマニイがCHXに対して広く認められている耐性を有することを考えれば、NPフィルムはこの微生物の増殖を阻害することを促すと思われる。
実施例31−複合材料:グラスアイオノマーセメント
CHX−HMP MNPを含むグラスアイオノマーセメントを製造した。MNPを封鎖し、そして、GIC中への封入に好適なそれらをレンダリングする2つの方法を開発した:
(i)MNPがコロイドから沈殿物を生じさせ、そして、操作者に上清をデカントさせ、濃厚な白色ペーストを残すために、遠心処理が使用される湿式法、及び
(ii)乾燥させ、続いてボールミルで粉砕して、白色粉末を得た。これらの方法の両方の生成物は様々な特性の計測のために市販のGIC中に組み入れられた。
実施例32−表面をコートした材料:ポリウレタンカテーテル
ポリウレタン基材及びカテーテルをCHX−HMP−5MNPでコートした。
CHXの長期間(>3カ月)放出を実証することが、この適用に望ましい。少なくとも85日間のCHX放出があると実証した(図28)。
試薬濃度(50mMのCHX及びHMP)及びディップコーティングの型(1、5、10回の浸漬の繰り返し)を変更することによって、コート密度を調査した。より長い浸漬時間がより多くの放出をもたらし、大抵の場合、50mMのNP濃度が5mM超の濃度を放出することがわかった。より多くの浸漬がより高いコート密度をもたらす(図29)。初期データは、場合によっては、CHXのより少ない放出がより密にコートした標本に関して観察されたことを示唆し、そしてそれは、いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、より厚くコートした標本には孔が少ない可能性があり、そのため、環境に対して活性物質のより少ない表面積しか提示していないか、或いは、それはコーティングのはげに関係し得るが、これは直接的に観察されていない。
反復したディップコート及び/又はディップコーティングの時間を変更は、MNP用量の制御を可能にする。
実施例33〜36及び比較実施例15〜22−ポリウレタン含有標本に関する微生物阻害有効性
大規模な微生物学作業も終了した。表13は、様々な表面処理を伴うポリウレタン標本に関して、細菌増殖培地中での24時間のインキュベーション後の微生物の増殖を示す。凡例:−完全阻害;+わずかな増殖(10-1〜10-3の希釈のときに観察された増殖);++中程度の増殖(10-4〜10-6の希釈のときに観察された増殖);+++高い増殖(10-7〜10-12の希釈のときに観察された増殖)。CHX−HMP−50でコートしたポリウレタン標本は、MRSA、E.コリ、及びP.エルギノーサの増殖を示さず、水(比較実施例15〜18)又は水溶液のCHX溶液(比較実施例19〜22)で処理した対照と比較して、K.ニューモニエ(実施例33〜36)の増殖の低下を示した。
実施例37〜44及び比較実施例23〜26−生−死染色
生−死染色もまた、先の実施例33〜36に挙げた微生物を使用しておこなった。最初に、ポリウレタン小片を、
30秒間ディップコーティングし、そして10秒間すすぐことによってNP(CHX−HMP−5及びCHX−HMP−50)でコートし、次に関連細菌懸濁液に24時間浸漬した。SYTO9及びヨウ化プロピジウム生/死染色を染色に使用した。
図30のより明るい領域は、微生物増殖の領域を示す。それで、高レベルの微生物の増殖が未処理対照(比較実施例23〜26、図30の一番左の列)で見られる。これらの画像は、微生物増殖(図30の真ん中及び右側の列)に対するMNPの効果を示し、そして、微生物増殖がいずれの濃度においてもMNPの存在によって根本的に低減されることを示す(実施例37〜44)。MNP自体がある程度の蛍光色素を溶かし、そしてそれが、CHX−HMP−50画像において明るい領域に見える可能性がある(実施例41〜44)ことに注意する。
実施例45〜50及び比較実施例27〜32−表面をコートした材料:医療用シリコーン
シリコーンを、全身のプロテーゼ及び他の生体材料デバイスとして使用する。この実施例の特定の注目点は、口腔、口蓋栓塞子の構築(外科手術又は発生異常のため口蓋内の欠陥を修正するために使用されるデバイス)及び義歯に使用されるシリコーンである。
これらのシリコーンは、病原菌及び酵母、特にカンジダ・アルビカンスによって容易にコロニー形成されるようになる。医療用シリコーンへのCHX−X MNPの接着を調査した。これらのデバイスに対する微生物負荷は特に高く、このため、CHXのより高い用量が必要とされ得る。それで、CHX−HMP以外の配合物を開発した。
3種類の配合物(CHX−HMP−5、CHX−TMP−5、及びCHX−TP−5)からのCHX放出を、1分間〜6時間の様々な時間について、経口シリコーンのディップコーティング後に調査した。本体(B)及び密封材(S)は、供給された2種類の異種シリコーンを表す。あらゆる飽和が説明できるように、溶出媒質は8週間で新しくした。
具体的には、義歯の柔軟な裏打ち材及び栓塞子構築中に使用される「本体」及び「密封材(sealant)」シリコーンの標本(Mucopren Soft; Kettenbach, Eschenburg, Germany)を5×8×2.5mmを区画するシリコーン鋳型を使用して作製した。ワセリンを使用して鋳型をグリースアップし、シリコーンをその鋳型に詰め込み、そして、室温で15分間硬化させた。次に、標本を鋳型から取り出し、70%のエタノール中で10分間超音波処理し、15分間風乾し、そして、密閉容器内に乾燥状態で保存した。
3種類の配合物(CHX−HMP−5、CHX−TMP−5、及びCHX−TP−5)からのCHX放出を、1分間〜6時間の様々な時間について、経口シリコーンのディップコーティング後に調査した。
標本を、割り当てられた時間の間、撹拌したNP懸濁液(TMPを除く、TMPは撹拌できない粘度の高い、粘着性の物質を形成する)に浸漬し、脱イオン水中で10秒間すすぎ、そして、風乾した。n=10標本から成る更なる群を、25μMのクロルヘキシジン二グルコン酸塩溶液(ナノ粒子形成後の水溶液中のクロルヘキシジンの残留濃度)に6時間浸漬して、正の対照を提供した。これをCHX−Cと表した。
図31に示すように、CHX−HMP MNPコートした標本は、実験期間を通じてCHXのゆるやかな放出を呈した。放出速度は時間と共に低下したが、人工唾液を置換すると、速度は再び上昇し、人工唾液が新しくする前では、CHX塩に関する人工唾液の飽和度がCHX放出を妨げていたことが示唆された。以下で考察した他の2種類の塩とは対照的に、CHXの放出を持続させた。CHX−HMPコートした標本からのCHXの放出はコーティング時間によって変化し、コーティング時間が長いほど観察されるCHXが増大する(しかし、相関は直線的でなかった)。より多くのCHX放出を、密封材シリコーンより本体シリコーンから観察した。
図32に示すように、CHX−TP MNPコートした標本は、CHX放出の大部分又はすべてが最初の24時間以内に観察される、CHX−HMP MNPとはかなり異なったCHX放出プロフィールを呈した。わずかな追加的なCHX放出が人工唾液交換後に観察されたが、人工唾液が導入された後の最初の24時間以内に、このわずかな放出も同様に完了した。従って、MNPのこの配合物は、CHX−HMPに比べて約3倍のCHX放出がある高い放出を示したが、この放出は短期間であった。CHX−TPコートした標本からのCHX放出はコーティング時間により変化し、コーティング時間が長いほどCHXが増大した(しかし、この場合も相関は直線的でなかった)。CHXの放出は本体及び密封材シリコーンからで類似していた。
図33に示すように、CHX−TMP MNPコートした標本は、CHX−TP MNPコートした標本のように、開始時及び人工唾液を新しくした後の両方で、人工唾液にさらした最初の24時間以内に大部分又はすべてのCHX放出を呈した。コーティング時間がCHX放出に影響するが、他の塩とは異なった様式である:最大のCHX放出は30分間コートした標本で観察されたが、2時間及び6時間コートした標本は、中程度のCHX放出しか示さず、1分間コートした標本で最少のCHX放出があった。本体シリコーンに比べて、密封材シリコーンからより多くのCHX放出を観察した。
異なったアニオン(HMP、TMP、TP)及び浸漬時間を選択することによってCHX放出の用量及び持続期間を制御するための範囲があるように思えたことは注目に値する。MNPでシリコーンをコートすることがそれらの水の吸い上げを大きく増強しなかったことにも注目した;水の吸い上げは、これらのシリコーンの性能に有害なので、抗微生物特性をそれらに与える他の試みの副作用として観察した。これは、本発明のMNPによって実証された更なる利点である。
MNPの抗真菌性を調査した。初期実験は、CHX−HMP MNPとの播種後のC.アルビカンスの用量−依存性の増殖阻害を一貫して示し、真菌増殖が1時間で低下し、そして、4時間で増殖がなくなった。
実施例51及び比較実施例33−表面をコートした材料:チタニウム製インプラント
チタニウムをコートするためにCHX−HMP MNPを使用して、インプラントの抗真菌性コーティングを開発した。
CHX−HMP−5 MNP−コートしたチタニウム基板(CHX−HMP−5懸濁液中に30秒間浸漬し、脱イオン水で10秒間すすぎ、次に、乾燥させることによって製造した)は、ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)及びポリフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)の増殖を阻害することを示した。さらに、チタニウム基板を、口内にあるあらゆる物質をコートするタンパク様フィルムである唾液の薄膜でコートしたときにも、抗真菌作用は妨げられない。CHX−HMP MNPを伴う(実施例51)及び伴わない(比較実施例33)チタニウム表面上のS.ゴルドニイに関する代表的なコロニー形成単位のデータを図34に示す。
実施例52〜54及び比較実施例34〜36−オーラルケア製品及び局所トリートメント
水溶液のCHXは歯医者が既に使用している。それは、プラーク及び歯周病/歯茎の炎症をコントロールするのに好適な2.2mMの経口リンスとしてスーパーマーケットや薬局で入手可能である。それはまた、さらに進行した歯周病、口腔手術中、歯内治療中などの多くの用途における局所抗微生物剤としても使用される。
この実施例は、水溶液でというよりむしろCHX−HMP MNPとしてCHXを送達することで、CHXの放出が変化することを示す。
ヒドロキシアパタイトディスク(1群あたりn=6)を歯組織の代替物として使用した。3種類のCHX二グルコン酸塩水溶液、1、2.2、及び5mM(それぞれ比較実施例34〜36)を調製した。3種類のCHX−HMP MNP懸濁液を、相応の総濃度を用いて、従って1、2.2、5mMのCHX及びHMP(それぞれ実施例52〜54)を用いて調製した。ヒドロキシアパタイトディスクを調製物中に15秒間浸漬し、すすぎ、そして、CHX放出を時間の関数として観察した(図35)。
水溶液に比べて、より持続し、且つ、全体的に見てより多くのCHX放出を、MNP懸濁液で処理したディスクから観察した。CHX−HMP MNP処理したディスクは、より持続した、より大量のCHX放出を示し、溶液の状態で送達されるときよりもMNPの形態のときの方がより多くのCHXが保持されたことを示した。このことは、店頭販売のオーラルケア製品、及び/又は非常に長く持続する抗微生物性口腔環境をもたらすための専門家向けの局所治療薬の開発に可能性を与えた。
実施例55及び比較実施例37−抗微生物性塗布剤
抗微生物性塗布剤での使用のための好適なペーストとしてMNPを封鎖する方法を実施し、エマルジョン塗布剤の状態の25質量%のMNPペーストを用いてプロトタイプを作製し、市場のトップにある抗微生物性塗布剤(Dulux Sterishield)と比較した。
200mLの10mM CHX二グルコン酸塩を200mLの10mMHMPナトリウムと室温で混合し、そして、激しく混合している間、圧力をかけることによって400mLのCHX−HMP−5を調製することによって、NPペーストを作製した。約50mLの1M KClは加え、次に、撹拌はやめた。得られた混合物を沈殿させ、そして、上部〜300mLの透明な上清を捨てた。残った液体をベンチトップ遠心分離機により5000rpmで20分間遠心分離し、それが上清と、塗布剤と歯磨き粉とで一致している粘着性の白いペーストの分離をもたらした。再び上清を捨て、ペーストをチューブから取り出して、使用した。
実験の塗布剤は実用的であり(実施例55、図36、右側の画像)、(目視により)外見上正常に乾燥し、そして、未処理塗布剤と類似した表面の仕上がりだった(比較実施例37、図36、左側の画像)。
実施例56〜57及び比較実施例38〜41−抗微生物性塗布剤の微生物阻害効果
MRSA及びE.コリの増殖を、細菌培養物中での24時間のインキュベーション後、陰性対照(未処理の乳濁液、比較実施例38〜39)、実験用(NP添加)及び陽性対照(Sterishield、比較実施例40〜41)塗布剤に対して調査した。ガラス製カバーガラスを塗布剤の単回コートで両面コートし、そして、乾燥させた。
MRSAに関しては、SterishieldはMRSA増殖の10分の1の低減に作用したが、MNP塗布剤は同じように1000分の1の低減を生じさせた(図37)。
E.コリに関しては、Sterishieldは細菌増殖に対して効果がなかったが、MNP塗布剤は回収できる細菌がないほどE.コリの増殖を排除した(図37)。

Claims (13)

  1. クロルヘキシジン塩を含む抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子であって、ここで、前記塩のアニオンが:
    ピロホスファート及びトリホスファートから選択されるポリホスファートである、抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子。
  2. 前記塩のアニオンがトリホスファートある、請求項1に記載の抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子。
  3. 前記マイクロ粒子又はナノ粒子の少なくとも1つの粒径が、20〜200nmである、請求項1又は2に記載の抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子。
  4. 請求項1〜のいずれか1項に記載の抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を含むコロイド懸濁液。
  5. 前記コロイドが、水又は水性溶液中に分散している、請求項に記載のコロイド懸濁液。
  6. ゼータ(ζ)電位の絶対値が少なくとも20mVである、請求項又はに記載のコロイド懸濁液。
  7. 請求項1〜のいずれか1項に記載の抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を含む医療用物品。
  8. 前記物品が、静脈カテーテル、尿道カテーテル、歯科インプラント、マウスガード、義歯、創傷包帯又は医療品の包装である、請求項に記載の医療用物品。
  9. 請求項1〜のいずれか1項に記載の抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を含む複合材料。
  10. 前記複合材料が、歯科用セメント、塗布剤又はオーラルケア組成物である、請求項に記載の複合材料。
  11. 前記複合材料が、複合材料全体の1重量%〜60重量%の量で抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を含む、請求項又は10に記載の複合材料。
  12. 前記複合材料が、グラスアイオノマーセメント(GIC)である、請求項11のいずれか1項に記載の複合材料。
  13. 抗微生物性マイクロ粒子又はナノ粒子を製造する方法であって、
    クロルヘキシジンカチオンを含む水溶液を、以下の:
    ピロホスファート及びトリホスファートから選択されるアニオンと、1:100〜100:1の比で反応させて、マイクロ粒子又はナノ粒子のコロイド懸濁液を製造する
    ことを含む、方法。
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