JP6498961B2 - Anti-adhesion agent and anti-adhesion composition - Google Patents
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Description
本発明は、癒着防止剤及び癒着防止剤組成物に関する。 The present invention relates to an antiadhesive agent and an antiadhesive composition.
従来、癒着防止膜として、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース及び酸化再生セルロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のポリアニオン性多糖類からなるフィルム（特許文献１）が用いられており、科研製薬（株）製のセプラフィルム（登録商標）が市販されている。 Conventionally, a film made of at least one polyanionic polysaccharide selected from the group consisting of hyaluronic acid, carboxymethyl cellulose and oxidized regenerated cellulose (Patent Document 1) has been used as an anti-adhesion film, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Sepra film (registered trademark) is commercially available.
癒着防止膜は手術後に腹腔内の臓器に貼り付けられ、臓器同士の癒着を防止する目的で使用される。癒着を引き起こした場合、各臓器の根本的な機能に障害を起こし、生命の危機にさらされるなどの予後の不良を引き起こす原因となる。 The anti-adhesion membrane is affixed to an organ in the abdominal cavity after surgery, and is used for the purpose of preventing adhesion between organs. When adhesion is caused, the fundamental function of each organ is impaired, and it causes a poor prognosis such as being exposed to a life threat.
しかしながら、セプラフィルムを癒着防止膜として使用した場合、癒着防止効果が５０％前後と十分ではない。また、癒着防止膜が使用される腹腔内は凹凸のある構造を有しており、フィルムが貼り付け時に破れるなどハンドリング性が悪く、使用に際しては熟練を要する欠点がある。 However, when Sepra film is used as an anti-adhesion film, the anti-adhesion effect is not sufficient at around 50%. In addition, the intraperitoneal cavity where the anti-adhesion membrane is used has an uneven structure, and has poor handling properties such as tearing of the film when applied, and has the disadvantage of requiring skill in use.
本発明は、癒着防止効果が高く、ハンドリング性に優れた癒着防止剤及び癒着防止剤組成物を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an anti-adhesion agent and an anti-adhesion agent composition having a high anti-adhesion effect and excellent handling properties.
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。すなわち、本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤であって、（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）であるアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中に含まれる下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１〜２０個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２であり、（Ａ）がさらにＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する癒着防止剤。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。
As a result of intensive studies, the present inventors have reached the present invention. That is, the anti-adhesion agent of the present invention is an anti-adhesion agent containing an artificial protein (A) and water, wherein (A) is a sequence of 2 to 200 amino acid sequences (X) having the GVGVP sequence (1) . It has a polypeptide chain (Y) and / or the following peptide chain (Y ′), the total number of the following amino acid sequences (X ′) contained in (A) is 1 to 20, and the hydrophobicity of (A) sex degree Ri der 0.2-1.2, anti-adhesion barrier having (a) is further GAGAGS sequence (7) is a polypeptide chain linked 2-50 sequentially (S).
Amino acid sequence (X ′): An amino acid sequence in which 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine or arginine.
Peptide chain (Y ′): a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) are combined.
本発明の癒着防止剤は、癒着防止効果が高く、ハンドリング性に優れる。 The anti-adhesion agent of the present invention has a high anti-adhesion effect and is excellent in handling properties.
本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤であって、（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中に含まれる下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１〜２０個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である癒着防止剤である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。
The anti-adhesion agent of the present invention is an anti-adhesion agent comprising an artificial protein (A) and water, wherein (A) is a GVGVP sequence (1), a PGVGV sequence (2), a VPGVG sequence (3), a GVPPGV sequence (4) ), VGVPG sequence (5), GPP sequence, GAP sequence and GAHGPAGPK sequence (6), any one of the amino acid sequences (X) of 2 to 200 consecutive polypeptide chains (Y) and / or the following peptide chains (Y ′), the total number of the following amino acid sequences (X ′) contained in (A) is 1 to 20, and the hydrophobicity of (A) is 0.2 to 1.2 It is an anti-adhesion agent.
Amino acid sequence (X ′): An amino acid sequence in which 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine (K) or arginine (R), respectively.
Peptide chain (Y ′): a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) are combined.
「癒着防止剤」とは、手術により損傷を受けた臓器が、他の臓器と癒着することを防止するために、損傷を受けた臓器に塗布又は貼り付けされる医療機器を意味する。 “Anti-adhesion agent” means a medical device that is applied or affixed to a damaged organ in order to prevent an organ damaged by surgery from adhering to another organ.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものである。製造方法としては、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等が挙げられる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。
有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質（Ａ）を製造できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点及び分子量の大きいタンパク質を生産する場合における生産性の観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
In the present invention, the artificial protein (A) is artificially produced in order to eliminate animal-derived components. Examples of the production method include organic synthesis methods (enzyme method, solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.), gene recombination methods, and the like. For organic synthesis methods, see "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.)" or "Second Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry" (Lower) (May 20, 1987, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.), etc. Regarding the gene recombination method, the method described in Japanese Patent No. 3338441 can be applied.
Although both the organic synthesis method and the genetic recombination method can produce an artificial protein (A), the viewpoint that the amino acid sequence can be changed easily and can be mass-produced at low cost, and the viewpoint of productivity when producing a protein with a large molecular weight, etc. Therefore, the genetic recombination method is preferable.
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ）として、具体的には（ＧＶＧＶＰ）ａ配列（Ｙ１）、（ＰＧＶＧＶ）ｂ配列（Ｙ２）、（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列（Ｙ４）、（ＶＧＶＰＧ）ｅ配列（Ｙ５）、（ＧＰＰ）ｆ配列（Ｙ６）、（ＧＡＰ）ｇ配列（Ｙ７）及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｈ配列（Ｙ８）で表されるポリペプチド鎖等が挙げられる。（なお、ａ〜ｈはそれぞれアミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である。）
人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖を１種有してもよく、２種以上有してもよい。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ａ〜ｈが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ａ〜ｈが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
In the present invention, the polypeptide chain (Y) specifically includes (GVGVP) a sequence (Y1), (PGVGV) b sequence (Y2), (VPGVG) c sequence (Y3), (GVPPGV) d sequence (Y4) ), (VGVPG) e sequence (Y5), (GPP) f sequence (Y6), (GAP) g sequence (Y7) and (GAHGGPGPK) h polypeptide (Y8) and the like. (Here, a to h are the consecutive numbers of the amino acid sequence (X), respectively, and are integers of 2 to 200.)
When the artificial protein (A) has a plurality of polypeptide chains (Y) in one molecule, it may have one kind of the polypeptide chain or two or more kinds.
When the amino acid sequence (X) has a plurality of polypeptide chains (Y) of the same type in the artificial protein (A), the number of consecutive (X) s may be the same or different for each (Y). Also good. That is, a to h may have a plurality of the same polypeptide chains (Y), or a to h may have a plurality of different polypeptide chains (Y).
ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞との親和性及び細胞非接着性の観点から、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）及びＶＧＶＰＧ配列（５）が好ましく、さらに好ましくはＧＶＧＶＰ配列（１）及びＶＰＧＶＧ配列（３）である。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、癒着防止性、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点の観点から、（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列（Ｙ１）、（ＰＧＶＧＶ）ｂ配列（Ｙ２）、（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列（Ｙ４）及び（ＶＧＶＰＧ）ｅ配列（Ｙ５）が好ましく、さらに好ましくは（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列（Ｙ１）及び（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）である。
The amino acid sequence (X) constituting the polypeptide chain (Y) includes GVGVP sequence (1), PGVGV sequence (2), VPGVG sequence (3), and GVPPGV from the viewpoints of affinity with cells and cell non-adhesion. Sequence (4) and VGVPG sequence (5) are preferred, and GVGVP sequence (1) and VPGVG sequence (3) are more preferred.
As the polypeptide chain (Y), (GVGVP) b sequence (Y1), (PGVGV) b sequence (Y2) from the viewpoint of adhesion prevention, solubility (particularly solubility in water) and gelation time. , (VPGVG) c sequence (Y3), (GVPGV) d sequence (Y4) and (VGVPG) e sequence (Y5), more preferably (GVGVP) b sequence (Y1) and (VPGVG) c sequence (Y3) It is.
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、アミノ酸（Ｘ）と下記アミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれＫ又はＲで置換されたアミノ酸配列。
In the present invention, the polypeptide chain (Y ′) is a polypeptide chain in which a total of 2 to 200 amino acids (X) and the following amino acid sequence (X ′) are bound.
Amino acid sequence (X ′): An amino acid sequence in which 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) is substituted with K or R, respectively.
アミノ酸配列（Ｘ’）としては、ＧＶＧＶＰ配列（１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’１）｛ＧＫＧＶＰ配列（８）、ＧＶＧＫＰ配列（９）及びＧＫＧＫＰ配列（１０）等｝、ＶＰＧＶＧ配列（３）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’２）｛ＫＰＧＶＧ配列（１１）、ＶＰＧＫＧ配列（１２）及びＫＰＧＫＧ配列（１３）等｝等が挙げられる。 As the amino acid sequence (X ′), an amino acid sequence (X′1) in which an amino acid in the GVGVP sequence (1) is substituted with lysine (K) {GKGVP sequence (8), GVGKP sequence (9), and GKGKP sequence (10 ) Etc.}, amino acid sequence (X′2) {KPGVG sequence (11), VPGKG sequence (12), KPGKG sequence (13) etc.} in which the amino acid in VPGVG sequence (3) is substituted with lysine (K), etc. Can be mentioned.
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（８）、ＧＶＧＫＰ配列（９）、ＧＫＧＫＰ配列（１０）、ＫＰＧＶＧ配列（１１）、ＶＰＧＫＧ配列（１２）及びＫＰＧＫＧ配列（１３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（８）及びＫＰＧＶＧ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。 The amino acid sequence (X ′) includes GKGVP sequence (8), GVGKP sequence (9), GKGKP sequence (10), KPGVG sequence (from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. 11), preferably at least one sequence selected from the group consisting of VPGKG sequence (12) and KPGKG sequence (13), more preferably at least one selected from the group consisting of GKGVP sequence (8) and KPGVG sequence (11). It is a seed.
人工タンパク質（Ａ）はポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することにより、体温付近でゲル化することが可能となる。したがって、本発明の人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤を、臓器等に塗布することにより、癒着防止膜を形成し、臓器同士の癒着を防止することができる。また、貼付時に液状であるので、破れることがない。 Since the artificial protein (A) has a polypeptide chain (Y) and / or a polypeptide chain (Y ′), it can be gelled near the body temperature. Therefore, by applying the anti-adhesion agent containing the artificial protein (A) and water of the present invention to an organ or the like, an anti-adhesion film can be formed and adhesion between organs can be prevented. Moreover, since it is liquid at the time of sticking, it is not torn.
人工タンパク質（Ａ）１分子中に含まれる上記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数は、１〜２０個であり、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、好ましくは３〜１８個である。 The total number of the amino acid sequences (X ′) contained in one molecule of the artificial protein (A) is 1 to 20, and the solubility (particularly solubility in water) of (A) and the viewpoint of gelation time Therefore, the number is preferably 3 to 18.
人工タンパク質（Ａ）において、（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、５０〜２００個が好ましく、特に好ましくは９０〜１５０個である。 In the artificial protein (A), (A) the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) in one molecule is 50 from the viewpoints of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. -200 are preferable, Especially preferably, it is 90-150.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．２であるが、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、０．５〜１．２が好ましく、さらに好ましくは０．５〜０．８であり、次にさらに好ましくは０．５５〜０．７５であり、特に好ましくは０．６〜０．７２である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ.ネルソン、レ−ニンジャ−の新生化学 上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６−３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭＴ）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭＴ：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
In the present invention, the artificial protein (A) has a hydrophobicity of 0.2 to 1.2, but from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time, 0.5 to 1.2. Is preferable, more preferably 0.5 to 0.8, and still more preferably 0.55 to 0.75, and particularly preferably 0.6 to 0.72.
The degree of hydrophobicity in (A) indicates the degree of hydrophobicity of the molecule (A). (A) The number of amino acids constituting the molecule (Mα), the degree of hydrophobicity of each amino acid (Nα) And (A) The total number of amino acids in one molecule can be calculated by applying the following formula. The hydrophobicity of each amino acid is determined according to non-patent literature (Albert L. Leninger, David L. Nelson, Reininger's Shinsei Kagaku, Yodogawa Shoten, September 2010, p. 346-347). The following numerical values described in) are used.
Hydrophobicity = Σ (Mα × Nα) / (MT)
Mα: (A) Number of each amino acid in one molecule Nα: Hydrophobicity of each amino acid MT: (A) Total number of amino acids in one molecule A (alanine): 1.8
R (arginine): −4.5
N (asparagine): -3.5
D (aspartic acid): -3.5
C (cysteine): 2.5
Q (glutamine): −3.5
E (glutamic acid): −3.5
G (glycine): -0.4
H (histidine): -3.2
I (isoleucine): 4.5
L (leucine): 3.8
K (lysine): -3.9
M (methionine): 1.9
F (phenylalanine): 2.8
P (proline): -1.6
S (serine): -0.8
T (threonine): -0.7
W (tryptophan): -0.9
Y (tyrosine): -1.3
V (valine): 4.2
For example, when (A) is (GVGVP) 4GKGVP (GVGVP) 3 sequence (19), the hydrophobicity of (A) = {16 (number of G) × (−0.4) +15 (number of V) * 4.2 + 8 (number of P) * (-1.6) +1 (number of K) * (-3.9)} / 40 (total number of amino acids) = 1.00.
本発明においては、上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、且つ（Ａ）の疎水性度が上記範囲内であることにより、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点が向上する。
（Ａ）は配列（Ｘ）を有する場合、細胞との親和性および細胞非接着性は高いが、疎水性度が上記範囲外となり、溶解性（特に水への溶解性）の低下及びゲル化時間が増加する場合がある。その場合、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の一部をＫ又はＲで置換することにより、疎水性度を小さくすることができ、溶解性（特に水への溶解性）の向上及びゲル化時間を短縮でき、癒着防止膜として有用になる。
In the present invention, the above-mentioned polypeptide chain (Y) and / or polypeptide chain (Y ′) has a solubility (particularly in water) because the hydrophobicity of (A) is within the above range. The viewpoints of solubility and gelation time are improved.
When (A) has the sequence (X), it has high affinity with cells and non-adhesiveness to cells, but the hydrophobicity is outside the above range, so that solubility (particularly solubility in water) decreases and gelation occurs. Time may increase. In that case, the degree of hydrophobicity can be reduced by substituting a part of the amino acid in the amino acid sequence (X) with K or R, so that the solubility (particularly the solubility in water) is improved and the gelation time is increased. And can be useful as an adhesion prevention film.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ゲル化時間の観点から、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有することが好ましい。（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有している場合、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜１０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が連続する数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、２〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２〜８個であり、次にさらに好ましくは２〜６個であり、特に好ましくは２〜４個である。
（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、（Ａ）１分子中に（Ｓ）を１つ以上有すればよいが、ゲル化時間の観点から、２〜２０個が好ましく、さらに好ましくは５〜１８個である。
In the present invention, the artificial protein (A) preferably further has a GAGAGS sequence (7) from the viewpoint of gelation time. When (A) has a GAGAGS sequence (7), from the viewpoint of the solubility (particularly solubility in water) and gelation time of (A), 2 to 10 GAGAGS sequences (7) are consecutive. It preferably has a linked polypeptide chain (S).
In the polypeptide chain (S), the number of consecutive GAGAGS sequences (7) is preferably 2 to 10, more preferably, from the viewpoint of the solubility (particularly solubility in water) and gelation time of (A). 2 to 8, more preferably 2 to 6, and particularly preferably 2 to 4.
In (A), when having a polypeptide chain (S), (A) it is sufficient to have one or more (S) in one molecule, but from the viewpoint of gelation time, 2 to 20 are preferable. Preferably it is 5-18 pieces.
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点のから、１〜１０個が好ましく、さらに好ましくは１〜５個であり、特に好ましくは１〜３個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１４）、ＧＡＡＧＹ配列（１５）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。 When the artificial protein (A) has a total of two or more polypeptide chains (Y), polypeptide chains (Y ′) and polypeptide chains (S), it is interposed between the polypeptide chains and the polypeptide chains. It may have an amino acid sequence (Z). (Z) is a peptide sequence in which one or more amino acids are bound, and is not (Y), (Y ′) or (S). The number of amino acids constituting (Z) is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, in view of the solubility of (A) (particularly solubility in water) and the gelation time. Especially preferably, it is 1-3. Specific examples of (Z) include VAAGY sequence (14), GAAGY sequence (15), and LGP sequence.
人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは５〜４０個であり、特に好ましくは１０〜３５個である。
（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１６）等が挙げられる。
Each of the polypeptide chain (Y), polypeptide chain (Y ′) and polypeptide chain (S) at both ends in the artificial protein (A) has a terminal amino acid sequence (T) at the N and / or C terminus. You can do it. (T) is a peptide sequence in which one or more amino acids are bound, and is not (Y), (Y ′) or (S). The number of amino acids constituting (T) is preferably 1 to 100, more preferably 5 to 40, particularly from the viewpoint of the solubility (particularly solubility in water) and gelation time of (A). The number is preferably 10 to 35.
Specific examples of (T) include MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPPFASDPM sequence (16) and the like.
人工タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製または検出を容易にするために、（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ、ＫＴ３タグ、マルトース結合タンパク質、ＨＱタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
In addition to the above (T), the artificial protein (A) is a protein having a special amino acid sequence at the N and / or C terminus of (A) in order to facilitate purification or detection of expressed (A) or Peptides (hereinafter referred to as “purification tags”) may be included. As the purification tag, an affinity purification tag is used. Such purification tags include polyhistidine 6 × His tag, V5 tag, Xpress tag, AU1 tag, T7 tag, VSV-G tag, DDDDK tag, S tag, CruzTag09TM, CruzTag22TM, CruzTag41TM, Glu-Glu tag Ha. 11 tag, KT3 tag, maltose binding protein, HQ tag, Myc tag, HA tag, FLAG tag and the like.
An example of a combination of each purification tag (i) and a ligand (ii) that recognizes and binds the tag is shown below.
(I-1) glutathione-S-transferase (GTS) (ii-1) glutathione (i-2) maltose binding protein (MBP) (ii-2) amylose (i-3) HQ tag (ii-3) nickel ( i-4) Myc tag (ii-4) Anti-Myc antibody (i-5) HA tag (ii-5) Anti-HA antibody (i-6) FLAG tag (ii-6) Anti-FLAG antibody (i-7) 6 XHis tag (ii-7) Nickel or cobalt As a method for introducing the purified tag sequence, the nucleic acid encoding the purified tag is inserted into the 5 ′ or 3 ′ end of the nucleic acid encoding the artificial protein (A) in the expression vector. And a method using a commercially available purification tag introduction vector.
人工タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量（重量％）は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、（Ａ）の分子量を基準として、４０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜７０重量％である。 The total content (% by weight) of the polypeptide chain (Y) and polypeptide chain (Y ′) in one molecule of the artificial protein (A) is from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. Based on the molecular weight of (A), it is preferably 40 to 80% by weight, more preferably 50 to 70% by weight.
人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量は、アミノ酸配列決定によって求めることができる。具体的には、下記の測定法によって求めることができる。
＜ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量の測定法＞
津製作所社製ペプチドシーケンサー（プロテインシーケンサ）ＰＰＳＱ−３３Ａを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式（１）によりポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含量を求める。
ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量＝Σ（γ×β）／Σ（α×β）×１００ （１）
α：人工タンパク質（Ａ）中の各アミノ酸の数
β：各アミノ酸の分子量
γ：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）中の各アミノ酸の個数
The total content of the polypeptide chains (Y) and (Y ′) in the artificial protein (A) can be determined by amino acid sequencing. Specifically, it can be determined by the following measurement method.
<Measuring method of total content of polypeptide chains (Y) and (Y ′)>
The amino acid sequence is determined using a peptide sequencer (protein sequencer) PPSQ-33A manufactured by Tsu Seisakusho. From the determined amino acid sequence, the total content of the polypeptide chains (Y) and (Y ′) is determined by the following mathematical formula (1).
Total content of polypeptide chains (Y) and (Y ′) = Σ (γ × β) / Σ (α × β) × 100 (1)
α: number of each amino acid in the artificial protein (A) β: molecular weight of each amino acid γ: number of each amino acid in the polypeptide chains (Y) and (Y ′)
人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、（Ａ）の分子量を基準として４０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜７０重量％である。 The total content (% by weight) of the amino acid sequence (X) and amino acid sequence (X ′) in one molecule of the artificial protein (A) is determined from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. ) To 40 to 80% by weight, and more preferably 50 to 70% by weight.
人工タンパク質（Ａ）１分子中のＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数とポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数）は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。 The number of GAGAGS sequences (7) in one molecule of the artificial protein (A) and the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) constituting the polypeptide chain (Y) and polypeptide chain (Y ′) Ratio (number of GAGAGS sequences (7): total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) constituting polypeptide chains (Y) and (Y ′)) is the solubility of (A) ( In particular, from the viewpoint of solubility in water and gelation time, 1: 2 to 1:20 is preferable, and 1: 2 to 1:10 is more preferable.
本発明において、（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有していると、ゲル化時間がさらに良好になる。特に、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）とアミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）との比が上記範囲であることで、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間のバランスがとれる。 In the present invention, when (A) has a GAGAGS sequence (7), the gelation time is further improved. In particular, when the ratio of the GAGAGS sequence (7) to the amino acid sequences (X) and (X ′) is within the above range, the balance between solubility (particularly solubility in water) and gelation time can be achieved.
人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは６０〜８０ｋＤａである。この範囲であると、（Ａ）が分解されるまでの時間が適度である。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
The molecular mass of the artificial protein (A) is preferably 15 to 200 kDa, more preferably 60 to 80 kDa, from the viewpoints of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. Within this range, the time until (A) is decomposed is appropriate.
The molecular mass of the artificial protein (A) is determined by a method in which a measurement sample is separated by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and the migration distance is compared with a standard substance.
好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）の人工タンパク質（Ａ１−１）
アミノ酸配列（Ｘ）としてＧＶＧＶＰ配列（１）を有し、アミノ酸配列（Ｘ’）としてＧＫＧＶＰ配列（８）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１−１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１−２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１−３）である。具体的には、下記人工タンパク質が挙げられる。
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）（Ｙ’１−１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約７０ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６１８）
（ｉｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）のポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約７７ｋＤａの配列（２２）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７１８）
（ｉｉｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を１６個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を８個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−２）｝８の順で化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（２３）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ、疎水性度０．６９３）
（ｉｖ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を６個、ＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を６個、及びＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を６個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−１）｝６の順で化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ、疎水性度０．６０７）
A part of preferable artificial protein (A) is illustrated below.
(1) Artificial protein having an amino acid sequence (X) of GVGVP sequence (1) (A1-1)
An artificial protein (A1) having the GVGVP sequence (1) as the amino acid sequence (X) and the GKGVP sequence (8) as the amino acid sequence (X ′), more preferably (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 Artificial protein (A1-1) having polypeptide chain (Y'1-1) which is sequence (19) and polypeptide chain (S1-1) which is 4 sequence (17), polypeptide chain (Y '1-1) and (GAGAGS) 2 artificial sequence protein (A1-2) having polypeptide chain (S1-2) which is sequence (18), polypeptide chain (Y'1-1), polypeptide chain ( It is an artificial protein (A1-3) having S1-1) and a polypeptide chain (S1-2). Specifically, the following artificial proteins can be mentioned.
(I) 4 consecutive GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 12 polypeptide chains (S1-1) of 4 sequences (17) and 8 consecutive GVGVP sequences (1) (Y1- 1) Among the V (valine) in 1), 13 (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequences (19) (Y′1-1) substituted with K (lysine), which are alternately The molecular mass having a structure in which two polypeptide chains (S1-2) of two (GAGAGS) sequences (18) are chemically bonded to each other is chemically bonded to about 70 kDa. (21) artificial protein (SELP8K, hydrophobicity 0.618)
(Ii) polypeptide chain (S1-2) and (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequence (19) polypeptide chain (Y) with two consecutive GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 2 sequence (18) The artificial protein (SELP0K, hydrophobicity 0.718) having a sequence (22) of about 77 kDa having a structure comprising 17 each of '1-1) and alternately chemically bonding them
(Iii) 16 polypeptide chains (S1-2) of (GAGAGS) 2 sequence (18) having 2 continuous GAGAGS sequences (7) and 16 polypeptide chains (Y1) of GVGVP sequence (1) (Y1 -1) 8 (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 11 sequence (20) (Y′1-2) in which one of V (valine) in K is replaced by K (lysine), {(S1-2) (Y'1-2) ( S1-2)} engineered protein (SELP415K order by a chemical bond and molecular masses comprising the sequence of approximately 71kDa 8 (23), hydrophobicity 0.693 )
(Iv) Two polypeptide chains (S1-2) of (GAGAGS) 2 sequence (18) in which two GAGAGS sequences (7) are continuous, and 16 polypeptide chains (Y1-) in GVGVP sequence (1) (Y1- (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 11 sequence (20) (Y′1-2) 6 in which one of V (valine) in 1) is substituted with K (lysine), and GAGAGS sequence (7 ) Has 4 consecutive (GAGAGS) 4 polypeptide chains (S1-1) of sequence (17), which are {(S1-2) (Y′1-2) (S1-1)} Artificial protein (SELP815K, hydrophobicity 0.607) of sequence (24) having a molecular mass of about 65 kDa formed by chemical bonding in the order of 6
人工タンパク質（Ａ）は、細胞非接着性の観点から、下記細胞接着率が０〜２０％であることが好ましく、さらに好ましくは５〜２０％であり、次にさらに好ましくは１０〜２０％である。
細胞接着率：１ｃｍ２当たり２．５μｇの人工タンパク質（Ａ）を有する基材を作製し、基材にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種したとき、基材に接着するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の割合。
細胞接着率は、疎水性度を高くすることによって高くすることができる。また、人工タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列中に細胞接着性のアミノ酸配列｛ＲＧＤ配列等｝を組み込む等により、高くすることができる。
なお、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性のアミノ酸配列としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
From the viewpoint of cell non-adhesiveness, the artificial protein (A) preferably has the following cell adhesion rate of 0 to 20%, more preferably 5 to 20%, and further preferably 10 to 20%. is there.
Cell adhesion rate: The ratio of MC3T3-E1 cells that adhere to the substrate when a substrate having 2.5 μg of artificial protein (A) per 1 cm 2 is prepared and MC3T3-E1 cells are seeded on the substrate.
The cell adhesion rate can be increased by increasing the degree of hydrophobicity. Further, it can be increased by incorporating a cell-adhesive amino acid sequence {RGD sequence or the like} into the amino acid sequence of the artificial protein (A).
“Cell adhesion” means a property in which a specific minimum amino acid sequence is recognized by a cell integrin receptor, and the cell easily adheres to a substrate (Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center, Vol. 8, Vol. 1). No. 58-66, 1992).
Examples of cell-adhesive amino acid sequences include “Pathophysiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990” and “Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center Magazine, Vol. 8, No. 1, pp. 58-66”. , "1992" is used.
細胞接着率は、具体的には、下記測定法により測定される。
＜細胞接着率の測定方法＞
（１）細胞接着率測定用プレートの作成
人工タンパク質（Ａ）１ｍｇを０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する：以下、ＰＢＳと記載）１ｍＬに溶解し、さらに、ＰＢＳで希釈して、溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）｛溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）中の人工タンパク質（Ａ）の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ｄ１）：０．０１、（Ｄ２）：１、（Ｄ３）：１０、（Ｄ４）：１００｝を作製する。この溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳで１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）を作成する。
Specifically, the cell adhesion rate is measured by the following measurement method.
<Method for measuring cell adhesion rate>
(1) Preparation of plate for measuring
（２）コーティング量の測定
次に、細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の表面のポリペプチドによるコーティング量を測定する。Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得る。細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置する。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量（μｇ／ｃｍ２）を得る。
(2) Measurement of coating amount Next, the coating amount of the surface of the cell adhesion rate measurement plates (P1) to (P5) with the polypeptide is measured. A mixed solution (C) of Reagent A solution: Reagent B solution: Reagent C solution = 25: 24: 1 attached to Micro BCATM protein assay kit (manufactured by THERMO Fisher Scientific) is obtained. 100 μL of the mixed solution (C) is added to each well of the cell adhesion measurement plates (P1) to (P5), and left at 37 ° C. for 2 hours.
Two hours later, the amount of chelate formed from bicinchoninic acid (BCA) and Cu + was measured using a plate reader (MTP-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (control wavelength: 630 nm). A coating amount (μg / cm 2 ) is obtained from a calibration curve prepared with albumin.
（３）細胞の接着及び細胞接着率の測定
血清を含まないＤＭＥＭ培地を５０μＬ／穴でプレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存する。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去する。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置する。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、それぞれ８穴分の平均データとする。
人工タンパク質（Ａ）の代わりにフィブロネクチンを用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行う。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量（Ｘ０）を測定する。（Ｘ０）が細胞接着率１００％であるとして、（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の細胞接着率を算出する。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロットし、近似直線を描き、コーティング量が２．５（μｇ／ｃｍ２）のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とする。
(3) Measurement of cell adhesion and cell adhesion rate DMEM medium without serum is added to each of plates (P1) to (P5) at 50 μL / well and stored in a 37 ° C. incubator for 1 hour. After 1 hour, MC3T3-E1 cells are added at 104 cells / 50 μL / well and left to stand for 2 hours in an incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5% by volume.
After completion of the culture, the medium is removed using an aspirator, and physiological saline is added at 100 μL / well, taking care not to directly contact the cells, and the physiological saline is removed using an aspirator. Next, PBS is added at 50 μL / well, Tetracolor One (Seikagaku Corporation) is added at 10 μL / hole, and left in an incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5 vol% for 4 hours.
After 4 hours, the amount of formazan produced (X) was measured with a plate reader (MTP-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (reference wavelength 630 nm), and each average data for 8 holes was obtained.
A comparative cell adhesion rate measurement plate is prepared using fibronectin instead of the artificial protein (A), and the same experiment as described above is performed. It is confirmed by microscopic observation that all the cells seeded on the comparative plate are adhered, and the formazan production amount (X0) is measured. Assuming that (X0) is a cell adhesion rate of 100%, (X) and (X0) are applied to the following formula, and the cell adhesion rates of the plates (P1) to (P5) are calculated.
Cell adhesion rate (%) = (X) / (X0) × 100
The obtained cell adhesion rate and the coating amount on the plate surface are plotted, an approximate straight line is drawn, and the cell adhesion rate when the coating amount is 2.5 (μg / cm 2 ) is defined as the above cell adhesion rate.
本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤である。
水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
The antiadhesive agent of the present invention is an antiadhesive agent containing an artificial protein (A) and water.
The water is not particularly limited as long as it is sterilized, and sterilization methods include water through a microfiltration membrane having a pore size of 0.2 μm or less, water through an ultrafiltration membrane, and reverse osmosis. Examples thereof include water passed through a membrane and ion-exchanged water heated at 121 ° C. for 20 minutes in an autoclave and sterilized by overheating.
水は、緩衝成分を含んだ緩衝液としてもいい。
緩衝成分としては、リン酸等有機酸やグッドバッファー等が挙げられる。
Water may be a buffer solution containing a buffer component.
Examples of the buffer component include organic acids such as phosphoric acid and Good buffer.
本発明の癒着防止剤中の人工タンパク質（Ａ）の含有量は、溶解性及びゲル化時間の観点から、５〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜２０重量％である。
癒着防止剤中の水の含有量は、ゲル化時間の観点から、７０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは８０〜９０重量％である。
癒着防止剤中の緩衝成分の含有量は、ゲル化時間の観点から、０〜５０ｍＭが好ましく、さらに好ましくは０〜１０ｍＭである。
The content of the artificial protein (A) in the adhesion preventing agent of the present invention is preferably 5 to 30% by weight, more preferably 10 to 20% by weight, from the viewpoints of solubility and gelation time.
From the viewpoint of gelation time, the content of water in the anti-adhesion agent is preferably 70 to 95% by weight, more preferably 80 to 90% by weight.
The content of the buffer component in the adhesion preventing agent is preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 10 mM, from the viewpoint of gelation time.
本発明において、癒着防止剤中にはさらに塩（例えばナトリウム塩等）を含んでいても良い。
ゲル化の観点から、塩の濃度は、０〜０．８重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜０．６重量％である。
In the present invention, the adhesion inhibitor may further contain a salt (for example, sodium salt).
From the viewpoint of gelation, the salt concentration is preferably 0 to 0.8% by weight, more preferably 0.7 to 0.6% by weight.
本発明の癒着防止剤の３７℃でのゲル化時間は、ハンドリング性の観点から、５００分以内が好ましく、さらに好ましくは５〜５００分であり、特に好ましくは１５〜２００分である。
ゲル化時間は、癒着防止剤中の人工タンパク質（Ａ）の濃度を高くしたり、人工タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（７）の比率を大きくすることにより短くすることができる。
The gelation time at 37 ° C. of the adhesion preventing agent of the present invention is preferably within 500 minutes, more preferably 5 to 500 minutes, and particularly preferably 15 to 200 minutes from the viewpoint of handling properties.
As for the gelation time, the concentration of the artificial protein (A) in the antiadhesive agent is increased, or the GAGAGS sequence (7) with respect to the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) in the artificial protein (A) This ratio can be shortened by increasing the ratio.
ゲル化時間は、具体的には、下記測定法により測定される。
＜ゲル化時間の測定＞
癒着防止剤１００μＬをマイクロチュブ（２ｍＬ）に量りとり、３７℃のインキュベーターに放置する。５分おきに、マイクロチューブを１８０度傾けて、癒着防止剤が垂れるかを確認する。癒着防止剤が垂れなくなった時間をゲル化時間とする。
Specifically, the gelation time is measured by the following measurement method.
<Measurement of gelation time>
Weigh 100 μL of the anti-adhesion agent in a microtube (2 mL) and leave it in a 37 ° C. incubator. Every 5 minutes, tilt the microtube 180 degrees to see if the anti-adhesive agent hangs down. The time when the antiadhesive agent does not sag is defined as the gel time.
本発明の癒着防止剤組成物は、癒着防止剤のほかに、添加物質を含んでいても良い。
添加物質としては、ゲル化時間を調整する観点や癒着防止性向上の観点から、増粘物質、架橋剤及び／又は抗炎症剤が好ましい。
The antiadhesive composition of the present invention may contain an additive substance in addition to the antiadhesive agent.
As the additive substance, a thickening substance, a crosslinking agent and / or an anti-inflammatory agent are preferable from the viewpoint of adjusting the gelation time and improving the adhesion prevention property.
増粘物質として、アルギン酸、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース及びこれらのアルカリ金属塩などが挙げられる。これらのうち、癒着防止剤組成物のゲル化時間の調整及び安全性の観点から、アルギン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース及びこれらのアルカリ金属塩が好ましい。 Examples of the thickening substance include alginic acid, polyethylene glycol, hyaluronic acid, xanthan gum, carrageenan, pectin, carboxymethylcellulose, and alkali metal salts thereof. Of these, alginic acid, hyaluronic acid, carboxymethylcellulose, and alkali metal salts thereof are preferable from the viewpoint of adjusting the gelation time of the antiadhesive composition and safety.
増粘物質の粘度としては、癒着防止剤組成物のゲル化時間を調整する観点から、１５０〜８００cpのものが好ましく、さらに好ましくは３００〜４００cpである。 The viscosity of the thickening substance is preferably 150 to 800 cp, more preferably 300 to 400 cp, from the viewpoint of adjusting the gelation time of the antiadhesive composition.
本発明の癒着防止剤組成物において、増粘物質の含有量としては、フィルム形成の観点及びゲル化時間を調整する観点から、癒着防止剤の重量に基づいて、好ましくは０．２５〜４重量％であり、さらに好ましくは０．５〜１重量％である。 In the anti-adhesion composition of the present invention, the content of the thickening substance is preferably 0.25 to 4% by weight based on the weight of the anti-adhesion agent from the viewpoint of film formation and adjusting the gelation time. %, More preferably 0.5 to 1% by weight.
架橋剤として、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル及びカルボジイミドなどが挙げられる。これらのうち、癒着防止剤組成物のゲル化時間の調整及び安全性の観点から、グルタルアルデヒドが好ましい。 Examples of the crosslinking agent include glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester and carbodiimide. Among these, glutaraldehyde is preferable from the viewpoint of adjusting the gelation time of the antiadhesive composition and safety.
抗炎症剤として、ステロイド系抗炎症剤、酸性抗炎症剤又は塩基性抗炎症剤などが挙げられる。
癒着防止剤のゲル化時間は、下記測定法によって測定する。
Examples of the anti-inflammatory agent include steroidal anti-inflammatory agents, acidic anti-inflammatory agents, basic anti-inflammatory agents, and the like.
The gelation time of the adhesion inhibitor is measured by the following measurement method.
本発明の癒着防止剤組成物の製造方法としては、室温で癒着防止剤溶液と添加物質溶液とを混合するなどが挙げられる。 Examples of the method for producing the antiadhesive composition of the present invention include mixing the antiadhesive agent solution and the additive substance solution at room temperature.
本発明の癒着防止剤及び癒着防止剤組成物は、外科的手術後に臓器同士、器官同士又は臓器若しくは器官と医療用器具との癒着を防止するために使用される。特に、複雑な臓器や器官の外科的手術や内視鏡手術などに好適に用いることができる。 The anti-adhesion agent and anti-adhesion composition of the present invention are used for preventing adhesion between organs, between organs, or between an organ or an organ and a medical instrument after surgical operation. In particular, it can be suitably used for surgical operations and endoscopic operations of complex organs and organs.
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example and a comparative example explain the present invention further, the present invention is not limited to these.
＜実施例１＞
○人工タンパク質（Ａ１）含有癒着防止剤（１）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製し、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）（Ｙ’１−１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約７０ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）（Ａ１）を得た。
人工タンパク質（Ａ１）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（１−１、１−２、１−３）を作製した。
<Example 1>
○ Production of artificial protein (A1) -containing anti-adhesion agent (1) According to the method described in the examples in JP-T-3-502935, produced by genetically modified Escherichia coli, purified by column chromatography, GAGAGS sequence (7) 4 consecutive (GAGAGS) 12 polypeptide chains (S1-1) of 4 sequences (17) and GVGVP sequence (1) 8 consecutive polypeptide chains (Y1-1) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 having 13 sequences (19) (Y′1-1) in which one of V (valine) in the above is replaced with K (lysine), and these are alternately chemically bonded Thus, two GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 2 (18) polypeptide chain (S1-2) has a structure in which one molecular chain is chemically bonded, and the molecular mass is about 70 kDa. The artificial protein (SELP8K) (A1) in row (21) was obtained.
The artificial protein (A1) was dissolved in PBS: deionized water = 7: 3 so as to have a concentration of 5, 20, and 30% by weight based on the weight of the anti-adhesion agent, respectively. 1-2, 1-3) were produced.
＜実施例２＞
○人工タンパク質（Ａ２）含有癒着防止剤（２）の作製
実施例１と同様にして、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）のポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約７７ｋＤａの配列（２２）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）（Ａ２）を作製した。
人工タンパク質（Ａ２）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（２−１、２−２、２−３）を作製した。
<Example 2>
Preparation of anti-adhesion agent (2) containing artificial protein (A2) In the same manner as in Example 1, two continuous GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 2 sequence (18) polypeptide chain (S1-2) And (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 each having 17 polypeptide chains (Y′1-1) of the sequence (19), and having a structure in which these are alternately chemically bonded, the molecular mass is about 77 kDa An artificial protein (SELP0K) (A2) having the sequence (22) was prepared.
The artificial protein (A2) was dissolved in PBS: deionized water = 7: 3 so as to have concentrations of 5, 20, and 30% by weight based on the weight of the anti-adhesion agent, respectively, and the anti-adhesion agent (2-1, 2-2, 2-3) were produced.
＜実施例３＞
○人工タンパク質（Ａ３）含有癒着防止剤（３）の作製
実施例１と同様にして、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を１６個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を８個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−２）｝８の順で化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（２３）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ）（Ａ３）を作製した。
人工タンパク質（Ａ３）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（３−１、３−２、３−３）を作製した。
<Example 3>
Preparation of anti-adhesion agent (3) containing artificial protein (A3) In the same manner as in Example 1, two continuous GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 2 sequence (18) polypeptide chain (S1-2) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 11 sequence in which one of V (valine) in a polypeptide chain (Y11) in which 16 GVGVP sequences (1) are continuous was substituted with K (lysine) (20) It has eight (Y′1-2), and the molecular mass formed by chemical bonding in the order of {(S1-2) (Y′1-2) (S1-2)} 8 is about An artificial protein (SELP415K) (A3) having a sequence (23) of 71 kDa was prepared.
The artificial protein (A3) was dissolved in PBS: deionized water = 7: 3 so as to have concentrations of 5, 20, and 30% by weight based on the weight of the anti-adhesion agent, respectively, and the anti-adhesion agent (3-1, 3-2 and 3-3) were produced.
＜実施例４＞
○人工タンパク質（Ａ４）含有癒着防止剤（４）の作製
実施例１と同様にして、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を６個、ＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を６個、及びＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を６個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−１）｝６の順で化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ）（Ａ４）を作製した。
人工タンパク質（Ａ４）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（４−１、４−２、４−３）を作製した。
<Example 4>
Preparation of an artificial protein (A4) -containing antiadhesive agent (4) In the same manner as in Example 1, two GAGAGS sequences (7) continued (GAGAGS) 2 sequence (18) polypeptide chain (S1-2) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 11 sequence in which one of V (valine) in a polypeptide chain (Y11) in which 16 GVGVP sequences (1) are consecutively substituted with K (lysine) 20) 6 (Y′1-2) and 4 polypeptide chains (S1-1) of 4 sequences (17) having 4 consecutive GAGAGS sequences (7), which are { (S1-2) (Y'1-2) (S1-1 )} sequentially with molecular mass formed by chemical bonding of 6 was produced artificial protein sequence of about 65kDa (24) (SELP815K) ( A4).
The artificial protein (A4) was dissolved in PBS: deionized water = 7: 3 so that the concentration was 5, 20, and 30% by weight based on the weight of the anti-adhesion agent, respectively, and the anti-adhesion agent (4-1, 4-2, 4-3) were produced.
＜実施例５＞
○人工タンパク質（Ａ１）含有癒着防止剤組成物（５）の作製
実施例１と同様にして得られた人工タンパク質（Ａ１）を癒着防止剤の重量に基づいて２０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、次いで、この溶液に粘度３００〜４００ｃｐのアルギン酸ナトリウムを癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ０．２５、１、４重量％の濃度となるように溶解し、癒着防止剤組成物（５−１、５−２、５−３）を作製した。
<Example 5>
Preparation of artificial protein (A1) -containing adhesion inhibitor composition (5) The artificial protein (A1) obtained in the same manner as in Example 1 was adjusted to a concentration of 20% by weight based on the weight of the adhesion inhibitor. PBS: deionized water = 7: 3 and then dissolved in this solution with a viscosity of 300-400 cp sodium alginate to a concentration of 0.25, 1, 4% by weight based on the weight of the anti-adhesive agent, respectively. It melt | dissolved and produced the adhesion prevention agent composition (5-1, 5-2, 5-3).
＜比較例１＞
セプラフィルム（科研薬社製）を比較用の癒着防止剤として用いた。
<Comparative Example 1>
Sepra film (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was used as an anti-adhesion agent for comparison.
＜評価：癒着防止能の測定＞
ラットを開腹し、盲腸を取り出した。ラット盲腸先端部位９点（直径約１ｍｍ）をハンダゴテで焼灼した。癒着防止剤（１）〜（４）及び癒着防止剤組成物（５）１００μｌを焼灼部位に塗布した。また、ラット盲腸末端部も同様に焼灼し、セプラフィルムを貼り付けた。その後、閉腹した。なお、癒着防止剤１種に対して３つの試験体を作成した。
７日間後、再び開腹し、癒着度合いを評価した。癒着の評価は以下の基準で評価し、３つの試験体のそれぞれの評価結果及び３つの平均を表１に示す。
グレード１：癒着なし
グレード２：容易に剥離可能な軽度の癒着
グレード３：軽度の牽引に耐えうる程度の癒着
グレード４：重度の癒着で剥離により一部の損傷を伴う（強い脂肪の癒着）
グレード５：強い臓器の癒着
<Evaluation: Measurement of adhesion prevention ability>
Rats were opened and the cecum was removed. Nine points (diameter: about 1 mm) of the rat cecal tip were cauterized with a soldering iron. Anti-adhesion agents (1) to (4) and anti-adhesion composition (5) (100 μl) were applied to the ablation site. In addition, the rat cecum end was cauterized in the same manner, and a Sepra film was attached. After that, I was closed. Three test specimens were prepared for one type of adhesion inhibitor.
After 7 days, the abdomen was opened again and the degree of adhesion was evaluated. The evaluation of adhesion was evaluated according to the following criteria, and the evaluation results and the average of the three specimens are shown in Table 1.
Grade 1: No adhesion Grade 2: Mild adhesion that can be easily peeled Grade 3: Adhesion that can withstand mild traction Grade 4: Severe adhesion with some damage due to peeling (strong fat adhesion)
Grade 5: Strong adhesion of organs
＜細胞接着率の測定＞
（１）細胞接着率測定用プレートの作成
実施例１〜４で得た人工タンパク質（Ａ１）〜（Ａ４）について、それぞれ１ｍｇを０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する：以下、ＰＢＳと記載）１ｍＬに溶解し、さらに、ＰＢＳで希釈して、それぞれ溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）｛溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）中の人工タンパク質（Ａ）の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ｄ１）：０．０１、（Ｄ２）：１、（Ｄ３）：１０、（Ｄ４）：１００｝を作製した。この溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳで１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、アスピレーターを用いて脱イオン水を除去して、基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）を作成した。また、（Ａ１）を実施例５で得た人工タンパク質（Ａ１）組成物に置き換えた以外は前記基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレートと同様にして（Ｐ５）を作成した。
<Measurement of cell adhesion rate>
(1) Preparation of plate for cell adhesion rate measurement About 1 mg of artificial proteins (A1) to (A4) obtained in Examples 1 to 4, 0.02M phosphate buffer (pH 7.2, 99.5% by weight), respectively. It contains 0.85% by weight of sodium chloride (hereinafter referred to as PBS), dissolved in 1 mL, further diluted with PBS, and each of solutions (D1) to (D4) {solutions (D1) to (D4) Artificial protein (A) concentration (μg / mL); (D1): 0.01, (D2): 1, (D3): 10, (D4): 100} were prepared. Each of these solutions (D1) to (D4) is poured into each of 8 holes in a 96-hole polystyrene plate (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) at 50 μL / hole and left at room temperature (about 25 ° C.) for 2 hours. After removing the solution using an aspirator, the plate is washed twice with PBS at 100 μL / hole, further washed with 100 μL / hole with deionized water, and deionized water is removed with an aspirator. Plates (P1) to (P4) for measuring cell adhesion rate having polypeptides were prepared. Further, (P5) was prepared in the same manner as the cell adhesion rate measurement plate having the polypeptide on the surface of the substrate except that (A1) was replaced with the artificial protein (A1) composition obtained in Example 5. .
（２）コーティング量の測定
次に、細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の表面のポリペプチドによるコーティング量を測定した。Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得た。細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量（μｇ／ｃｍ２）を得た。
(2) Measurement of coating amount Next, the coating amount of the surface of the cell adhesion rate measurement plates (P1) to (P5) with the polypeptide was measured. A mixed solution (C) of Reagent A solution: Reagent B solution: Reagent C solution attached to Micro BCATM protein assay kit (manufactured by THERMO Fisher Scientific) = 25: 24: 1 was obtained. 100 μL of the mixed solution (C) was added to each well of the cell adhesion measurement plates (P1) to (P5) and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours.
Two hours later, the amount of chelate formed from bicinchoninic acid (BCA) and Cu + was measured using a plate reader (MTP-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (control wavelength: 630 nm). A coating amount (μg / cm 2 ) was obtained from a calibration curve prepared with albumin.
（３）細胞の接着及び細胞接着率の測定
血清を含まないＤＭＥＭ培地を５０μＬ／穴でプレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存する。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）を１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、それぞれ８穴分の平均データとした。
人工タンパク質（Ａ）の代わりにフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、品名「フィブロネクチン溶液」）を用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行った。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量（Ｘ０）を測定した。（Ｘ０）が細胞接着率１００％であるとして、（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の細胞接着率を算出した。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロット（図１）し、近似直線を描き、コーティング量が２．５（μｇ／ｃｍ２）のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とした。結果を表２に示す。
(3) Measurement of cell adhesion and cell adhesion rate DMEM medium without serum is added to each of plates (P1) to (P5) at 50 μL / well and stored in a 37 ° C. incubator for 1 hour. After 1 hour, MC3T3-E1 cells (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were added at 104 cells / 50 μL / well and left to stand for 2 hours in an incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5 vol%.
After completion of the culture, the medium was removed using an aspirator, and physiological saline was added at 100 μL / well, taking care not to directly hit the cells, and the physiological saline was removed using an aspirator. Next, PBS was added at 50 μL / well, and Tetra Color One (Seikagaku Corporation) was added at 10 μL / hole, and left in an incubator with a carbon dioxide concentration of 5% by volume at 37 ° C. for 4 hours.
After 4 hours, the amount of formazan produced (X) was measured using a plate reader (MTP-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (reference wavelength: 630 nm), and each average data for 8 holes was obtained.
A comparative cell adhesion rate measuring plate was prepared using fibronectin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product name “Fibronectin solution”) instead of the artificial protein (A), and the same experiment as described above was performed. It was confirmed by microscopic observation that all cells seeded on the comparative plate were adhered, and the amount of formazan produced (X0) was measured. Assuming that (X0) has a cell adhesion rate of 100%, (X) and (X0) were applied to the following formula, and the cell adhesion rates of the plates (P1) to (P5) were calculated.
Cell adhesion rate (%) = (X) / (X0) × 100
The obtained cell adhesion rate and the coating amount on the plate surface are plotted (FIG. 1), an approximate straight line is drawn, and the cell adhesion rate when the coating amount is 2.5 (μg / cm 2 ) Rate. The results are shown in Table 2.
＜ゲル化時間の測定＞
実施例１〜５で得た癒着防止剤（１）〜（４）及び癒着防止剤組成物（５）をそれぞれ１００μＬ、マイクロチュブ（２ｍＬ）に量りとり、３７℃のインキュベーターに入れた。５分おきに、マイクロチューブを１８０度傾けて、癒着防止剤が垂れるかを確認した。癒着防止剤が垂れなくなった時間をゲル化時間とした。１つの癒着防止剤について、３つのサンプルを作成し、実験を行った。３つのサンプルのゲル化時間及び平均値を表３に示す。
<Measurement of gelation time>
The anti-adhesion agents (1) to (4) and the anti-adhesion composition (5) obtained in Examples 1 to 5 were weighed in 100 μL and microtube (2 mL), respectively, and placed in a 37 ° C. incubator. Every 5 minutes, the microtube was tilted 180 degrees to confirm whether the adhesion preventing agent dripped. The time when the adhesion preventing agent did not sag was defined as the gel time. Three samples were made for one anti-adhesion agent and the experiment was conducted. Table 3 shows the gel times and average values of the three samples.
表１の結果から、本発明の癒着防止剤は、比較例のセプラフィルムと比較して、癒着防止効果が高いことが分かる。特に、ゲル化時間が５００分以内の実施例１、２及び４の癒着防止剤は、癒着グレードが１．３３３以下と極めて癒着防止効果が高いことが分かる。また、本発明の癒着防止剤は、作製直後は溶液状であり、時間経過によりゲル化するものであるので、患部に塗布しやすく、ハンドリング性に優れる。実施例５の癒着防止剤組成物は、添加剤を０．２５〜４重量％加えることにより、簡単にゲル化時間を調整することができ、０．２重量％以下ではゲル化時間に変化はないことがわかる。 From the results of Table 1, it can be seen that the anti-adhesion agent of the present invention has a higher anti-adhesion effect than the Sepra film of the comparative example. In particular, it can be seen that the adhesion preventing agents of Examples 1, 2, and 4 having a gelation time of 500 minutes or less have an extremely high adhesion preventing effect with an adhesion grade of 1.333 or less. In addition, since the anti-adhesion agent of the present invention is in the form of a solution immediately after production and gels with time, it is easy to apply to the affected area and has excellent handling properties. In the anti-adhesion composition of Example 5, the gelation time can be easily adjusted by adding 0.25 to 4% by weight of the additive. I understand that there is no.
本発明の癒着防止膜は、癒着防止効果が高く、ハンドリング性が高いので、外科的手術後に臓器同士、器官同士又は臓器若しくは器官と医療用器具との癒着を防止するために使用することができる。特に、複雑な臓器や器官の外科的手術や内視鏡手術などに好適に用いることができる。 The adhesion-preventing film of the present invention has a high adhesion-preventing effect and high handling properties, and therefore can be used to prevent adhesion between organs, between organs, or between an organ or an organ and a medical instrument after surgical operation. . In particular, it can be suitably used for surgical operations and endoscopic operations of complex organs and organs.
Claims (10)
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。 An anti-adhesion agent comprising an artificial protein (A) and water, wherein (A) is a polypeptide chain (Y) having 2 to 200 consecutive amino acid sequences (X) that are GVGVP sequences (1) and / or It has a peptide chain (Y ′), the total number of the following amino acid sequence (X ′) contained in (A) is 1 to 20, and the hydrophobicity of (A) is 0.2 to 1.2. der is, anti-adhesion barrier having (a) is further GAGAGS sequence (7) is a polypeptide chain linked 2-50 sequentially (S).
Amino acid sequence (X ′): An amino acid sequence in which 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine or arginine.
Peptide chain (Y ′): a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) are combined.
細胞接着率：１ｃｍ２当たり２．５μｇの人工タンパク質（Ａ）を有する基材を作成し、基材にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種したとき、基材に接着するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の割合。 The adhesion preventing agent according to any one of claims 1 to 5 , wherein the cell adhesion rate of the artificial protein (A) is 0 to 20%.
Cell adhesion rate: Ratio of MC3T3-E1 cells that adhere to the substrate when a substrate having 2.5 μg of artificial protein (A) per 1 cm 2 was prepared and MC3T3-E1 cells were seeded on the substrate.
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