JP6912953B2 - Bodily fluid leakage inhibitor - Google Patents
Bodily fluid leakage inhibitor Download PDFInfo
- Publication number
- JP6912953B2 JP6912953B2 JP2017124941A JP2017124941A JP6912953B2 JP 6912953 B2 JP6912953 B2 JP 6912953B2 JP 2017124941 A JP2017124941 A JP 2017124941A JP 2017124941 A JP2017124941 A JP 2017124941A JP 6912953 B2 JP6912953 B2 JP 6912953B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- body fluid
- fluid leakage
- amino acid
- sequence
- polypeptide chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 title claims description 92
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 97
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 93
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 91
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 87
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 81
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 80
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 58
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 54
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 210000001819 pancreatic juice Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 claims description 12
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 10
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 82
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 12
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 5
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 5
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- LFTRJWKKLPVMNE-RCBQFDQVSA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]acetic acid Chemical group CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O LFTRJWKKLPVMNE-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 4
- 208000006809 Pancreatic Fistula Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000003890 fistula Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108700020482 Maltose-Binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229960000292 pectin Drugs 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、体液漏出防止剤に関する。 The present invention relates to a body fluid leakage inhibitor.
臓器、皮膚、血管といった組織の損傷部、切断面、穴及び吻合部などから漏出出した体液を止めるものとして、損傷部を塞ぐ治療基材が必要となる。この治療基材は損傷部、切断面、穴、吻合部もしくはその周囲の組織に対する強い接着性が用いられている。 A therapeutic base material that closes the injured part is required to stop the body fluid leaked from the injured part of the tissue such as an organ, the skin, and the blood vessel, the cut surface, the hole, and the anastomotic part. This therapeutic substrate is used for strong adhesion to injured parts, cut surfaces, holes, anastomotic parts or tissues around them.
これら損傷部等からの体液の漏出を防止する治療基材としては、非生分解性のもの、生分解性のもの、または両者を組み合わせたものがある。一般的に、こうした治療基材は必要な機能を果たした後、分解されることが望ましい。 As the therapeutic base material for preventing the leakage of body fluid from these damaged parts and the like, there are non-biodegradable ones, biodegradable ones, or a combination of both. In general, it is desirable that these therapeutic substrates perform the required function and then be degraded.
しかし、特に消化器系領域に生じた損傷部等には様々な細菌が存在するために、非生分解性の治療基材では、それ自体が細菌の温床となりやすく、通常は消化器系領域に生じた損傷部等の治療には生分解性を有した治療基材が用いられている。 However, since various bacteria are present especially in the damaged part generated in the digestive system region, the non-biodegradable therapeutic base material itself tends to be a hotbed of bacteria, and usually in the digestive system region. A biodegradable therapeutic base material is used for the treatment of the damaged part and the like.
また、消化器系領域で生じた損傷部等から漏出する体液は、その他の部位の体液に比べて消化酵素の量が多いため、治療基材がそれらの消化酵素への耐分解性を有していることが求められる。 In addition, since the amount of digestive enzymes in the body fluid leaking from the damaged part generated in the digestive system region is larger than that in the body fluids in other parts, the therapeutic base material has resistance to those digestive enzymes. Is required to be.
体液が漏出する消化器系領域に生じた損傷部等として膵液瘻が挙げられる。膵液瘻とは膵臓に瘻孔が生じ、膵液が持続的ないし断続的に漏出する状態である。膵液瘻は、最も頻度の高い膵臓手術後合併症の一つであり、膵炎（急性又は慢性）、外傷によって膵液瘻が発生することもある。膵液瘻は重篤な場合には死に至る難治性の疾患であるものの、従来の治療基材（例えば特許文献１）膵液に含まれる消化酵素に対する耐分解性が十分では無いため、膵液の漏出を止めることは困難であり、膵液の漏出を止めることができる新たな治療基材が切望されている。 Pancreatic fistula is an example of an injured part in the digestive system area where body fluid leaks. Pancreatic juice fistula is a condition in which a fistula is formed in the pancreas and pancreatic juice leaks continuously or intermittently. Pancreatic fistula is one of the most frequent post-surgery complications, and pancreatitis (acute or chronic) and trauma can cause pancreatic fistula. Although pancreatic fistula is an intractable disease that can lead to death in severe cases, it causes leakage of pancreatic juice because it is not sufficiently resistant to digestive enzymes contained in conventional therapeutic base materials (for example, Patent Document 1). It is difficult to stop, and a new therapeutic substrate that can stop the leakage of pancreatic juice is eagerly desired.
本発明は、膵液などの体液の漏出を止めることができる体液漏出防止剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a body fluid leakage preventive agent capable of stopping the leakage of body fluid such as pancreatic juice.
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有する人工タンパク質（Ａ）並びに水を含む体液漏出防止剤（Ｂ）であって、前記体液漏出防止剤が、体液が漏出する臓器の穴、又は、体液が漏出する吻合部を塞ぐために用いられる剤であり、前記体液が消化液であり、前記ポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＧＶＧＶＰ配列（１）であるアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個結合したポリペプチド鎖であり、前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）と、前記アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計個数で２〜２００個結合したポリペプチド鎖であり、人工タンパク質（Ａ）が、更にＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する体液漏出防止剤；並びにこの体液漏出防止剤（Ｂ）を乾燥してなるシートである。
The present inventor has arrived at the present invention as a result of repeated diligent research.
That is, the present invention is a body fluid leakage preventive agent (B) containing an artificial protein (A) having a polypeptide chain (Y) and / or a polypeptide chain (Y') and water, wherein the body fluid leak preventive agent is , An agent used to close a hole in an organ to which body fluid leaks, or an anastomotic site to which body fluid leaks, said body fluid is digestive juice, and the polypeptide chain (Y) is a GVGVP sequence (1) . A polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) are linked, and the polypeptide chain (Y') is 20 out of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X). 40% of Ri polypeptide chain der which the substituted amino acid sequence and (X ') are bonded from 2 to 200 in total number in each lysine (K) or arginine (R), artificial proteins (A) further GAGAGS sequence (7) is 2 to 50 consecutive bound polypeptide fluid leakage preventing agents that have a chain (S); and a sheet obtained by drying the fluid leakage preventing agent (B).
本発明の体液漏出防止剤は、優れた組織接着性を持ち、また膵液などの消化液に対しては容易に分解されない耐分解性を持つため、膵液の漏出を止めることができる。 The body fluid leakage inhibitor of the present invention has excellent tissue adhesiveness and has decomposition resistance that is not easily decomposed with digestive juice such as pancreatic juice, so that leakage of pancreatic juice can be stopped.
本発明の体液漏出防止剤は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有する人工タンパク質（Ａ）並びに水を含む。
前記のポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個結合したポリペプチド鎖である。
一方、前記のポリペプチド鎖（Ｙ’）は、前記のアミノ酸配列（Ｘ）と、別のアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計個数で２〜２００個結合したポリペプチド鎖であり、このアミノ酸配列（Ｘ’）はアミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列でである。
The body fluid leakage inhibitor of the present invention includes an artificial protein (A) having a polypeptide chain (Y) and / or a polypeptide chain (Y'), and water.
The polypeptide chain (Y) includes GVGVP sequence (1), PGVGV sequence (2), VPGVG sequence (3), GVPPGV sequence (4), VGVPG sequence (5), GPP sequence, GAP sequence and GAHGPAGPK sequence (6). It is a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) selected from the group consisting of) are linked.
On the other hand, the polypeptide chain (Y') is a polypeptide chain in which the amino acid sequence (X) and another amino acid sequence (X') are linked in a total number of 2 to 200, and this amino acid sequence. (X') is an amino acid sequence in which 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine (K) or arginine (R), respectively.
本願において、「体液漏出防止剤」とは、臓器、皮膚、血管といった組織の損傷部、切断面、穴、吻合部などから漏出した体液等を止めるものとして、塗布又は貼り付けされる医療機器を意味する。
また、本発明における体液とは胃液、膵液、胆汁、腸液等と言った消化液、血液、リンパ液、羊水、体腔内を満たす胸水、腹水を含む体内に存在する細胞内液、細胞外液、体腔液のことである。
In the present application, the "body fluid leakage preventive agent" refers to a medical device to be applied or attached to stop body fluids leaking from damaged parts, cut surfaces, holes, anastomotic parts, etc. of tissues such as organs, skin, and blood vessels. means.
The body fluid in the present invention includes digestive juice such as gastric juice, pancreatic juice, bile, intestinal juice, blood, lymph, sheep water, pleural fluid that fills the body cavity, and intracellular fluid including ascites, extracellular fluid, and body cavity. It is a liquid.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものである。製造方法としては、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等が挙げられる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。
有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質（Ａ）を製造できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点及び分子量の大きいタンパク質を生産する場合における生産性の観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
In the present invention, the artificial protein (A) is artificially produced in order to eliminate animal-derived components. Examples of the production method include an organic synthesis method (enzymatic method, solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.), a gene recombination method, and the like. Regarding the organic synthesis method, "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by Japan Biochemistry Society, published by Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.)" or "Sequel Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry" (Bottom) (May 20, 1987, edited by the Japan Society for Biochemistry, published by Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.) ”, etc. can be applied. As for the gene recombination method, the method described in Japanese Patent No. 3338441 can be applied.
Both the organic synthesis method and the gene recombination method can produce an artificial protein (A), but from the viewpoint that the amino acid sequence can be easily changed and mass production can be performed at low cost, and from the viewpoint of productivity in producing a protein having a large molecular weight, etc. Therefore, the gene recombination method is preferable.
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個結合したポリペプチド鎖である。
具体的には（ＧＶＧＶＰ）ａ配列（Ｙ１）、（ＰＧＶＧＶ）ｂ配列（Ｙ２）、（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列（Ｙ４）、（ＶＧＶＰＧ）ｅ配列（Ｙ５）、（ＧＰＰ）ｆ配列（Ｙ６）、（ＧＡＰ）ｇ配列（Ｙ７）及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｈ配列（Ｙ８）で表されるポリペプチド鎖等が挙げられる。
なお、添え字の記号のａ〜ｈはそれぞれアミノ酸配列（Ｘ）の個数であり、２〜２００の整数である。
人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖を１種有してもよく、２種以上有してもよい。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ａ〜ｈが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ａ〜ｈが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
In the present invention, the polypeptide chain (Y) is a GVGVP sequence (1), a PGVGV sequence (2), a VPGVG sequence (3), a GVPVGV sequence (4), a VGVPG sequence (5), a GPP sequence, a GAP sequence and a GAHGPAGPK sequence. It is a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) selected from the group consisting of (6) are linked.
Specifically, (GVGVP) a sequence (Y1), (PGVGV) b sequence (Y2), (VPPGVG) c sequence (Y3), (GVPVGV) d sequence (Y4), (VGVPG) e sequence (Y5), ( GPP) Polypeptide chains represented by f sequence (Y6), (GAP) g sequence (Y7) and (GAHGPAGPK) h sequence (Y8) can be mentioned.
The subscript symbols a to h are the number of amino acid sequences (X), respectively, and are integers of 2 to 200.
When a plurality of polypeptide chains (Y) are contained in one molecule of the artificial protein (A), one type of the above-mentioned polypeptide chain may be contained, or two or more types may be contained.
When the artificial protein (A) has a plurality of polypeptide chains (Y) of the same type in the amino acid sequence (X), the number of the above (X) may be the same or different for each (Y). .. That is, the above-mentioned a to h may have a plurality of the same polypeptide chains (Y), or a to h may have a plurality of different polypeptide chains (Y).
ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞との親和性及び細胞非接着性の観点から、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）及びＶＧＶＰＧ配列（５）が好ましく、更に好ましくはＧＶＧＶＰ配列（１）及びＶＰＧＶＧ配列（３）である。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点の観点から、（ＧＶＧＶＰ）ａ配列（Ｙ１）、（ＰＧＶＧＶ）ｂ配列（Ｙ２）、（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列（Ｙ４）及び（ＶＧＶＰＧ）ｅ配列（Ｙ５）が好ましく、更に好ましくは（ＧＶＧＶＰ）ａ配列（Ｙ１）及び（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）である。
The amino acid sequence (X) constituting the polypeptide chain (Y) includes GVGVP sequence (1), PGVGV sequence (2), VPGVG sequence (3), and GVPVGV from the viewpoint of cell compatibility and cell non-adhesion. The sequence (4) and the VGVPG sequence (5) are preferable, and the GVGVP sequence (1) and the VGVGVG sequence (3) are more preferable.
The polypeptide chain (Y) includes (GVGVP) a sequence (Y1), (PGVGV) b sequence (Y2), and (VPPGVG) from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. c sequence (Y3), (GVPVGV) d sequence (Y4) and (VGVPG) e sequence (Y5) are preferable, and (GVGVP) a sequence (Y1) and (VPPGVG) c sequence (Y3) are more preferable.
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、アミノ酸（Ｘ）と、アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計個数で２〜２００個結合したポリペプチド鎖である。
好ましくは２〜５０個、さらに好ましくは５〜３０個である。
In the present invention, in the polypeptide chain (Y'), 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid (X) and the amino acid sequence (X) is replaced with lysine (K) or arginine (R), respectively. It is a polypeptide chain in which a total of 2 to 200 amino acid sequences (X') are linked.
The number is preferably 2 to 50, more preferably 5 to 30.
アミノ酸配列（Ｘ’）としては、ＧＶＧＶＰ配列（１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’１）｛ＧＫＧＶＰ配列（８）、ＧＶＧＫＰ配列（９）及びＧＫＧＫＰ配列（１０）等｝、ＶＰＧＶＧ配列（３）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’２）｛ＫＰＧＶＧ配列（１１）、ＶＰＧＫＧ配列（１２）及びＫＰＧＫＧ配列（１３）等｝等が挙げられる。 The amino acid sequence (X') includes an amino acid sequence (X'1) in which the amino acid in the GVGVP sequence (1) is replaced with lysine (K) {GKGVP sequence (8), GVGKP sequence (9) and GKGKP sequence (10). ) Etc.}, the amino acid sequence (X'2) in which the amino acid in the VPGVG sequence (3) is replaced with lysine (K) {KPGVG sequence (11), VPGKG sequence (12), KPGKG sequence (13), etc.}, etc. Can be mentioned.
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（８）、ＧＶＧＫＰ配列（９）、ＧＫＧＫＰ配列（１０）、ＫＰＧＶＧ配列（１１）、ＶＰＧＫＧ配列（１２）及びＫＰＧＫＧ配列（１３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、更に好ましくはＧＫＧＶＰ配列（８）及びＫＰＧＶＧ配列（１１）からなる群から選ばれる少なくとも１種である。 The amino acid sequence (X') includes GKGVP sequence (8), GVGKP sequence (9), GKGKP sequence (10), and KPGVG sequence from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. 11), at least one sequence selected from the group consisting of the VPGKG sequence (12) and the KPGKG sequence (13) is preferable, and more preferably at least one selected from the group consisting of the GKGVP sequence (8) and the KPGVG sequence (11). It is a seed.
人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することにより、体温付近でゲル化することが可能となる。したがって、本発明の人工タンパク質（Ａ）及び水を含む体液漏出防止剤を、組織の損傷部、吻合部等に塗布することにより、体液の漏出を防止することができる。 By having the polypeptide chain (Y) and / or the polypeptide chain (Y'), the artificial protein (A) can be gelled near the body temperature. Therefore, by applying the body fluid leakage preventive agent containing the artificial protein (A) of the present invention and water to the damaged part, anastomotic part, etc. of the tissue, the leakage of the body fluid can be prevented.
人工タンパク質（Ａ）１分子中に含まれる上記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数は、２０個以下であり、好ましくは１〜２０個であり、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、さらに好ましくは３〜１８個である。 The total number of the amino acid sequences (X') contained in one molecule of the artificial protein (A) is 20 or less, preferably 1 to 20, and the solubility of (A) (particularly, solubility in water). From the viewpoint of sex) and gelation time, the number is more preferably 3 to 18.
人工タンパク質（Ａ）において、（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、５０〜２００個が好ましく、特に好ましくは９０〜１５０個である。 In the artificial protein (A), the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X') in one molecule (A) is 50 from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. The number is preferably ~ 200, and particularly preferably 90 to 150.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ゲル化時間の観点から、更にＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有することが好ましい。
（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有している場合、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が連続する個数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、２〜１０個が好ましく、更に好ましくは２〜８個であり、特に好ましくは２〜６個であり、最も好ましくは２〜４個である。
（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、（Ａ）１分子中に（Ｓ）を１個以上有すればよいが、ゲル化時間の観点から、２〜２０個が好ましく、更に好ましくは５〜１８個である。
In the present invention, the artificial protein (A) preferably further has the GAGAGS sequence (7) from the viewpoint of gelation time.
When (A) has the GAGAGS sequence (7), 2 to 50 GAGAGS sequences (7) are continuously arranged from the viewpoint of the solubility (particularly the solubility in water) and the gelation time of (A). It preferably has a bound polypeptide chain (S).
In the polypeptide chain (S), the number of consecutive GAGAGS sequences (7) is preferably 2 to 10 from the viewpoint of the solubility (particularly in water) and gelation time of (A), and more preferably. The number is 2 to 8, particularly preferably 2 to 6, and most preferably 2 to 4.
In (A), when having the polypeptide chain (S), it is sufficient that one or more (S) are contained in one molecule of (A), but from the viewpoint of gelation time, 2 to 20 are preferable, and further. The number is preferably 5 to 18.
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点のから、１〜１０個が好ましく、更に好ましくは１〜５個であり、特に好ましくは１〜３個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１４）、ＧＡＡＧＹ配列（１５）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
When the artificial protein (A) has a total of two or more polypeptide chains (Y), polypeptide chains (Y') and polypeptide chains (S), it is interposed between the polypeptide chains and the polypeptide chains. It may have an amino acid sequence (Z).
The intervening amino acid sequence (Z) is a peptide sequence in which one or more amino acids are linked, and is not a (Y), (Y') or (S) peptide sequence. The number of amino acids constituting (Z) is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, from the viewpoint of the solubility (particularly, solubility in water) and gelation time of (A). Particularly preferably, the number is 1 to 3. Specific examples of (Z) include a VAAGY sequence (14), a GAAGY sequence (15), an LGP sequence, and the like.
人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。
（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１〜１００個が好ましく、更に好ましくは５〜４０個であり、特に好ましくは１０〜３５個である。
（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１６）等が挙げられる。
The terminal amino acid sequence (T) is provided at the N and / or C-terminals of the polypeptide chain (Y), the polypeptide chain (Y') and the polypeptide chain (S) at both ends in the artificial protein (A). You can do it.
(T) is a peptide sequence in which one or more amino acids are bound, and is not a (Y), (Y') or (S) peptide sequence. The number of amino acids constituting (T) is preferably 1 to 100, more preferably 5 to 40, and particularly preferably 5 to 40, from the viewpoint of the solubility (particularly in water) and gelation time of (A). The number is preferably 10 to 35.
Specific examples of (T) include MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM sequence (16).
人工タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製または検出を容易にするために、（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ、ＫＴ３タグ、マルトース結合タンパク質、ＨＱタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
In addition to the above (T), the artificial protein (A) is a protein or a protein having a special amino acid sequence at the N-and / or C-terminal of (A) in order to facilitate purification or detection of the expressed (A). It may have peptides (hereinafter, these are referred to as "purification tags"). As the purification tag, a tag for affinity purification is used. Such purified tags include a 6 × His tag made of polyhistidine, a V5 tag, an Xpress tag, an AU1 tag, a T7 tag, a VSV-G tag, a DDDDK tag, an S tag, a CruzTag09TM, a CruzTag22TM, a CruzTag41TM, and a Glu-Glu tag. , Ha. There are 11 tags, KT3 tags, maltose-binding proteins, HQ tags, Myc tags, HA tags, FLAG tags and the like.
An example of a combination of each purified tag (i) and a ligand (ii) that recognizes and binds to the tag is shown below.
(I-1) Glutathione-S-transferase (GTS) (ii-1) Glutathione (i-2) Maltose-binding protein (MBP) (ii-2) Amylose (i-3) HQ tag (ii-3) Nickel (ii-3) i-4) Myc tag (ii-4) Anti-Myc antibody (i-5) HA tag (ii-5) Anti-HA antibody (i-6) FLAG tag (ii-6) Anti-FLAG antibody (i-7) 6 × His tag (ii-7) nickel or cobalt As a method for introducing the purified tag sequence, a nucleic acid encoding the purified tag is inserted at the 5'or 3'end of the nucleic acid encoding the artificial protein (A) in the expression vector. And a method of using a commercially available purification tag introduction vector and the like.
人工タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量（重量％）は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、（Ａ）の分子量を基準として、４０〜８０重量％が好ましく、更に好ましくは５０〜７０重量％である。 The total content (% by weight) of the polypeptide chain (Y) and the polypeptide chain (Y') in one molecule of the artificial protein (A) is determined from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. Based on the molecular weight of (A), it is preferably 40 to 80% by weight, more preferably 50 to 70% by weight.
人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量は、アミノ酸配列決定によって求めることができる。具体的には、下記の測定法によって求めることができる。 The total content of the polypeptide chains (Y) and (Y') in the artificial protein (A) can be determined by amino acid sequencing. Specifically, it can be obtained by the following measurement method.
＜ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量の測定法＞
津製作所社製ペプチドシーケンサー（プロテインシーケンサ）ＰＰＳＱ−３３Ａを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式（１）によりポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含量を求める。
ポリペプチド鎖（Ｙ）と（Ｙ’）の合計含有量＝Σ（γ×β）／Σ（α×β）×１００ （１）
α：人工タンパク質（Ａ）中の各アミノ酸の数
β：各アミノ酸の分子量
γ：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）中の各アミノ酸の個数
<Measurement method of total content of polypeptide chains (Y) and (Y')>
The amino acid sequence is determined using a peptide sequencer (protein sequencer) PPSQ-33A manufactured by Tsu Seisakusho. From the determined amino acid sequence, the total content of the polypeptide chains (Y) and (Y') is determined by the following mathematical formula (1).
Total content of polypeptide chains (Y) and (Y') = Σ (γ × β) / Σ (α × β) × 100 (1)
α: Number of each amino acid in artificial protein (A) β: Molecular weight of each amino acid γ: Number of each amino acid in polypeptide chain (Y) and (Y')
人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、（Ａ）の分子量を基準として４０〜８０重量％が好ましく、更に好ましくは５０〜７０重量％である。 The total content (% by weight) of the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X') in one molecule of the artificial protein (A) is (A) from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. ) Is preferably 40 to 80% by weight, more preferably 50 to 70% by weight, based on the molecular weight of.
（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、人工タンパク質（Ａ）中の各種アミノ酸配列の個数は、下記関係式（１）を満足することが好ましい。
１≦（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）／ｎ４≦２０ （１）
ここで、ｎ１はポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の個数；ｎ２はポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の個数；ｎ３はポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ’）の個数；ｎ４は人工タンパク質（Ａ）１分子中のＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数を表す。
さらに好ましくは、１≦（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）／ｎ４≦１０である。
From the viewpoint of the solubility of (A) (particularly the solubility in water) and the gelation time, the number of various amino acid sequences in the artificial protein (A) preferably satisfies the following relational expression (1).
1 ≤ (n 1 + n 2 + n 3 ) / n 4 ≤ 20 (1)
Here, n 1 is the number of amino acid sequences (X) constituting the polypeptide chain (Y); n 2 is the number of amino acid sequences (X) constituting the polypeptide chain (Y'); n 3 is the number of polypeptide chains. The number of amino acid sequences (X') constituting (Y'); n 4 represents the number of GAGAGS sequences (7) in one molecule of the artificial protein (A).
More preferably, 1 ≦ (n 1 + n 2 + n 3 ) / n 4 ≦ 10.
本発明において、（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有していると、ゲル化時間が更に良好になる。特に、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）とアミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）との比が上記範囲であることで、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間のバランスがとれる。 In the present invention, when (A) has the GAGAGS sequence (7), the gelation time is further improved. In particular, when the ratio of the GAGAGS sequence (7) to the amino acid sequences (X) and (X') is in the above range, the solubility (particularly the solubility in water) and the gelation time can be balanced.
人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、更に好ましくは６０〜８０ｋＤａである。この範囲であると、（Ａ）が分解されるまでの時間が適度である。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
The molecular weight of the artificial protein (A) is preferably 15 to 200 kDa, more preferably 60 to 80 kDa, from the viewpoint of solubility (particularly solubility in water) and gelation time. Within this range, the time until (A) is decomposed is appropriate.
The molecular weight of the artificial protein (A) is determined by a method of separating measurement samples by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and comparing the migration distance with a standard substance.
好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）の人工タンパク質（Ａ１−１）
アミノ酸配列（Ｘ）として、ＧＶＧＶＰ配列（１）を有し、アミノ酸配列（Ｘ’）としてＧＫＧＶＰ配列（８）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、更に好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１４）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１−１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１−２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１−３）である。
具体的には、下記人工タンパク質が挙げられる。
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）（Ｙ’１−１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１８）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（ｉｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約７７ｋＤａの配列（１９）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
（ｉｉｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を１６個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（１７）（Ｙ’１−２）を８個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−２）｝８の順で化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（２０）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ）
（ｉｖ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を６個、ＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（１７）（Ｙ’１−２）を６個、及びＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を６個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−１）｝６の順で化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ）
Some of the preferred artificial proteins (A) are illustrated below.
(1) Artificial protein (A1-1) whose amino acid sequence (X) is GVGVP sequence (1)
An artificial protein (A1) having a GVGVP sequence (1) as the amino acid sequence (X) and a GKGVP sequence (8) as the amino acid sequence (X'), more preferably (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP). 3 sequence (16) polypeptide chain (Y'1-1) and (GAGAGS) 4 sequence (14) polypeptide chain (S1-1) artificial protein (A1-1), polypeptide chain (GAGAGS) An artificial protein (A1-2) having a polypeptide chain (S1-2) having two sequences (15) of Y'1-1) and (GAGAGS), and a polypeptide chain (Y'1-1) and a polypeptide chain. It is an artificial protein (A1-3) having (S1-1) and a polypeptide chain (S1-2).
Specific examples include the following artificial proteins.
(I) 4 consecutive GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 12 consecutive polypeptide chains (S1-1) of 4 sequences (14) and 8 consecutive GVGVP sequences (1) polypeptide chains (Y1-) 1) One of V (valine) in 1) was replaced with K (lysine) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequences (16) (Y'1-1) 13 were alternated. The molecular mass having a structure in which two consecutive GAGAGS sequences (7) (GAGAGS ) and one polypeptide chain (S1-2) of two sequences (15) are chemically bonded to the one chemically bonded to is about 80 kDa. (18) Artificial protein (SELP8K)
(Ii) Two consecutive GAGAGS sequences (7) (GAGAGS) 2 sequences (15) polypeptide chains (S1-2) and (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequences (16) polypeptide chains (Y) The artificial protein (SELP0K) of the sequence (19) having a molecular weight of about 77 kDa having 17 each of '1-1) and having a structure formed by alternately chemically bonding them.
(Iii) 16 consecutive polypeptide chains (S1-2) of (GAGAGS) 2 sequences (15) with 2 consecutive GAGAGS sequences (7), and 16 consecutive polypeptide chains (Y1) with 16 consecutive GVGVP sequences (1). -1) One of V (valine) in (-1) was replaced with K (lysine) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 11 sequences (17) (Y'1-2), which have eight. {(S1-2) (Y'1-2) (S1-2)} An artificial protein (SELP415K) having a molecular weight of about 71 kDa, which is chemically bonded in the order of 8 (SELP415K).
(Iv) 6 polypeptide chains (S1-2) of 2 consecutive (GAGAGS) 2 sequences (15) of GAGAGS sequence (7) and 16 consecutive polypeptide chains (Y1-) of GVGVP sequence (1) 1) One of V (valine) in 1 was replaced with K (lysine) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 11 sequences (17) (Y'1-2), and GAGAGS sequence (7) ) Have 6 consecutive (GAGAGS) 4- sequence (14) polypeptide chains (S1-1), and these are {(S1-2) (Y'1-2) (S1-1)}. Artificial protein (SELP815K) of sequence (21) having a molecular weight of about 65 kDa formed by chemically bonding in the order of 6.
本発明の体液漏出防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む体液漏出防止剤である。
水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
The body fluid leakage preventive agent of the present invention is a body fluid leak preventive agent containing an artificial protein (A) and water.
The water is not particularly limited as long as it is sterilized, and the sterilization method includes water that has passed through a microfiltration membrane having a pore size of 0.2 μm or less, water that has passed through an ultrafiltration membrane, and reverse osmosis. Examples thereof include water that has passed through a membrane and ion-exchanged water that has been sterilized by heating at 121 ° C. for 20 minutes in an autoclave.
本発明の体液漏出防止剤は、さらに粘度調整剤（Ｃ）を含むことが好ましい。粘度調整剤を含むと損傷部への接着性が良好となり好ましい。
粘度調整剤（Ｃ）としては、ポリエチレングリコール、キサンタンガム、多糖類（デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン及びカルボキシメチルセルロース）並びにこれらのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
粘度調整剤は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
これらの内、ゲル化時間の調整及び安全性の観点から、多糖類（好ましくはアルギン酸、ヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロース）、前記の多糖類のアルカリ金属塩及び前記の多糖類のアルカリ土類金属塩が好ましい。
The body fluid leakage preventive agent of the present invention preferably further contains a viscosity modifier (C). It is preferable to include a viscosity modifier because the adhesiveness to the damaged portion is good.
Examples of the viscosity modifier (C) include polyethylene glycol, xanthan gum, polysaccharides (starch, alginic acid, hyaluronic acid, carrageenan, pectin and carboxymethyl cellulose), alkali metal salts or alkaline earth metal salts thereof.
As the viscosity modifier, one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
Of these, from the viewpoint of adjusting the gelation time and safety, polysaccharides (preferably alginic acid, hyaluronic acid and carboxymethyl cellulose), alkali metal salts of the above polysaccharides and alkaline earth metal salts of the above polysaccharides are used. preferable.
本発明の体液漏出防止剤が粘度調整剤を含有する場合、人工タンパク質（Ａ）、粘度調整剤及び水の重量割合は、ゲル化時間等の観点から、体液漏出防止剤の重量に基づいて、それぞれ、９．５〜４９．５重量％、０．５〜５重量％、５０〜９０重量％であることが好ましく、更に好ましくは１０〜３０重量％、２〜４重量％、６８〜８８重量％である。 When the body fluid leakage preventive agent of the present invention contains a viscosity modifier, the weight ratio of the artificial protein (A), the viscosity modifier and water is based on the weight of the body fluid leak preventive agent from the viewpoint of gelation time and the like. It is preferably 9.5 to 49.5% by weight, 0.5 to 5% by weight, and 50 to 90% by weight, respectively, and more preferably 10 to 30% by weight, 2 to 4% by weight, and 68 to 88% by weight, respectively. %.
本発明の体液漏出防止剤が含む水は、緩衝成分を含んだ緩衝液として用いてもいい。
緩衝成分としては、リン酸等有機酸やグッドバッファー等が挙げられる。
緩衝成分は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
ゲル状の体液漏出防止剤中の緩衝成分の含有量は、ゲル化時間の観点から、０〜５０ｍＭが好ましく、更に好ましくは０〜１０ｍＭである。
The water contained in the body fluid leakage preventive agent of the present invention may be used as a buffer solution containing a buffer component.
Examples of the buffer component include organic acids such as phosphoric acid and Good's buffer.
As the buffer component, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
The content of the buffer component in the gel-like body fluid leakage inhibitor is preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 10 mM from the viewpoint of gelation time.
本発明の体液漏出防止剤は、更に塩（例えばナトリウム塩等）を含んでいても良い。
塩の重量割合は、ゲル化の観点から、体液漏出防止剤の重量を基準として、０〜０．８重量％が好ましく、更に好ましくは０．７〜０．６重量％である。
塩は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
The body fluid leakage preventive agent of the present invention may further contain a salt (for example, a sodium salt or the like).
From the viewpoint of gelation, the weight ratio of the salt is preferably 0 to 0.8% by weight, more preferably 0.7 to 0.6% by weight, based on the weight of the body fluid leakage inhibitor.
The salt may be used alone or in combination of two or more.
本発明の体液漏出防止剤には、更に架橋剤（グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びカルボジイミド等）を併用することもできる。架橋剤を用いる場合、ゲル化時間及び安全性の観点から、グルタルアルデヒドが好ましい。
架橋剤は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
A cross-linking agent (glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, carbodiimide, etc.) can be further used in combination with the body fluid leakage preventive agent of the present invention. When a cross-linking agent is used, glutaraldehyde is preferable from the viewpoint of gelation time and safety.
The cross-linking agent may be used alone or in combination of two or more.
本発明の体液漏出防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水、並びに必要により用いる粘度調整剤（Ｃ）等を公知の方法で混合することで得ることができる。 The body fluid leakage preventive agent of the present invention can be obtained by mixing an artificial protein (A), water, a viscosity modifier (C) used if necessary, and the like by a known method.
本発明の体液漏出防止剤は、本発明の体液漏出防止剤を加温し、水分量を減らすことでシート状にし、用いることができる。
シート状の体液漏出防止剤とすることで、より強固に、体液の漏出を防止することができる。
シート状に成形して用いる場合、成形性等の観点から、人工タンパク質（Ａ）及び粘度調整剤の重量割合は、人工タンパク質（Ａ）及び粘度調整剤の合計重量を基準として、それぞれ７０〜９９重量％、１〜３０重量％含有することが好ましく、更に好ましくはそれぞれ９０〜９８、２〜１０重量％である。
The body fluid leakage preventive agent of the present invention can be used in the form of a sheet by heating the body fluid leakage preventive agent of the present invention and reducing the amount of water.
By using a sheet-shaped body fluid leakage preventive agent, it is possible to prevent the body fluid from leaking more firmly.
When molded into a sheet and used, the weight ratio of the artificial protein (A) and the viscosity modifier is 70 to 99, respectively, based on the total weight of the artificial protein (A) and the viscosity modifier from the viewpoint of moldability and the like. It is preferably contained in an amount of% by weight and 1 to 30% by weight, more preferably 90 to 98% by weight and 2 to 10% by weight, respectively.
シート状の体液漏出防止剤は、体液漏出防止剤を平底の容器（プラスチック容器等）に流し込み、循風乾燥機を用いる等公知の乾燥手段で、前記の容器中の体液漏出防止剤を乾燥することにより得ることができる。
乾燥時の温度としては、タンパク質の安定性の観点から、３０〜４５℃であることが好ましい。また、乾燥時間は、タンパク質の安定性の観点から、１２〜２４時間であることが好ましい。
The sheet-shaped body fluid leakage preventive agent is prepared by pouring the body fluid leakage preventive agent into a flat-bottomed container (plastic container, etc.) and drying the body fluid leakage preventive agent in the container by a known drying means such as using a circulation dryer. Can be obtained by
The drying temperature is preferably 30 to 45 ° C. from the viewpoint of protein stability. The drying time is preferably 12 to 24 hours from the viewpoint of protein stability.
シート状の体液漏出防止剤は、上記の乾燥工程後に、メタノールに浸漬させる処理を行うことが好ましい。シート状の体液漏出防止剤は、メタノールに浸漬させることで、耐分解性をより高めることができる。
シート状の体液漏出防止剤をメタノールに浸漬させる時間としては、１２〜３０時間であることが好ましい。
The sheet-shaped body fluid leakage preventive agent is preferably treated by immersing it in methanol after the above drying step. The sheet-shaped body fluid leakage inhibitor can be further enhanced in decomposition resistance by immersing it in methanol.
The time for immersing the sheet-shaped body fluid leakage preventive agent in methanol is preferably 12 to 30 hours.
シート状の体液漏出防止剤は、上記のメタノール処理工程後に、金属塩を添加することが好ましい。
シート状の体液漏出防止剤は、金属塩を添加することで、金属塩のカチオンとキレートを形成し、更に耐分解性を高めることができる。
金属塩のカチオンとしては、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン及び鉄イオン等が挙げられ、また、アニオンとしては、塩化物イオン、硫化物イオン及びリン酸イオン等が挙げられる。
金属塩として好ましいものとしては、塩化カルシウム等が挙げられる。
金属塩は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
また、シート状の体液漏出防止剤に金属塩を添加する方法としては、金属塩の水溶液にシート状の体液漏出防止剤を浸漬させる方法等が挙げられる。
金属塩水溶液中の金属塩の濃度は、０．５〜１０％であることが好ましい。また、シート状の体液漏出防止剤を金属塩水溶液に浸漬させる時間としては、１０〜２４時間であることが好ましい。
For the sheet-shaped body fluid leakage inhibitor, it is preferable to add a metal salt after the above-mentioned methanol treatment step.
By adding a metal salt, the sheet-shaped body fluid leakage inhibitor forms a chelate with the cation of the metal salt, and can further enhance the decomposition resistance.
Examples of the metal salt cation include alkali metal ion, alkaline earth metal ion, iron ion and the like, and examples of the anion include chloride ion, sulfide ion and phosphate ion.
Preferred metal salts include calcium chloride and the like.
As the metal salt, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
Further, as a method of adding the metal salt to the sheet-shaped body fluid leakage preventive agent, a method of immersing the sheet-shaped body fluid leakage preventive agent in an aqueous solution of the metal salt and the like can be mentioned.
The concentration of the metal salt in the aqueous metal salt solution is preferably 0.5 to 10%. The time for immersing the sheet-shaped body fluid leakage preventive agent in the metal salt aqueous solution is preferably 10 to 24 hours.
本発明の体液漏出防止剤は、体液が漏出する消化器系領域に生じた損傷部等に直接塗布または貼り付けて用いられる。
本発明の体液漏出防止剤は、消化酵素への耐分解性を有しているため、体液が消化液である場合の体液漏出防止剤として好ましく用いることができ、特に膵液に含まれる消光酵素に対しても耐分解性を有しているため、体液が膵液である場合の体液漏出防止剤として好ましく用いることができる。
The body fluid leakage preventive agent of the present invention is used by directly applying or adhering it to a damaged portion or the like generated in the digestive system region where the body fluid leaks.
Since the body fluid leakage preventive agent of the present invention has decomposition resistance to digestive enzymes, it can be preferably used as a body fluid leakage preventive agent when the body fluid is digestive juice, and particularly for a photochromic enzyme contained in pancreatic juice. On the other hand, since it has decomposition resistance, it can be preferably used as a body fluid leakage preventive agent when the body fluid is pancreatic juice.
以下、実施例及び比較例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。 Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto. Hereinafter, unless otherwise specified,% indicates a weight% and a part indicates a weight part.
＜製造例１＞
［タンパク質（Ａ１−１）の作製］
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（１８）のタンパク質（Ａ）であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。
<Manufacturing example 1>
[Preparation of protein (A1-1)]
Production of SELP8K protein (A1) A plasmid pPT0345 encoding SELP8K was prepared according to the method described in Examples of Japanese Patent No. 40883441.
The prepared plasmid was transformed into Escherichia coli to obtain a SELP8K-producing strain. Hereinafter, a method for producing the SELP8K protein (A1), which is the protein (A) of the sequence (18), will be shown using this SELP8K-producing strain.
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
Culture of SELP8K Protein (A1) An overnight culture of a SELP8K-producing strain grown at 30 ° C. was used to inoculate 50 ml of LB medium in a 250 ml flask. Kanamycin was added to a final concentration of 50 μg / ml, and the culture was incubated at 30 ° C. with stirring (200 rpm). When the culture solution had a turbidity of OD600 = 0.8 (absorbance meter UV1700: manufactured by Shimadzu Corporation), 40 ml was transferred to a flask preheated to 42 ° C. and cultured at the same temperature for about 2 hours. The cultured culture solution was cooled on ice, the turbidity OD600 of the culture solution was measured, and Escherichia coli was collected by centrifugation.
タンパク質（Ａ１−１）の精製
集菌した大腸菌を、（１）菌体溶解、（２）遠心分離による不溶性細片の除去、（３）硫安沈殿、（４）限外濾過、（５）陰イオン交換クロマトグラフィー、（６）限外濾過、（７）凍結乾燥を行うことにより大腸菌バイオマスから精製した。
このようにして、配列（１８）のタンパク質（Ａ）である精製したタンパク質（Ａ１−１）を得た。また、精製したタンパク質（Ａ１−１）の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により求めた結果、８０ＫＤａであった。
Purification of protein (A1-1) Collected Escherichia coli is (1) dissolved in cells, (2) removed by centrifugation, (3) freeze-precipitation, (4) ultrafiltration, (5) yin. It was purified from Escherichia coli biomass by ion exchange chromatography, (6) ultrafiltration, and (7) freeze-drying.
In this way, a purified protein (A1-1) which is the protein (A) of the sequence (18) was obtained. The molecular weight of the purified protein (A1-1) was 80 kDa as a result of obtaining it by the SDS-PAGE method.
（１）菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
(1) Bacterial dissolution 200 g of deionized water was added to 100 g of collected Escherichia coli, and the cells were dissolved with a high-pressure homogenizer (55 MPa) to obtain a bacterial cell lysate containing the dissolved cells. Then, the cell lysate was adjusted to pH 4.0 with glacial acetic acid.
（２）遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
(2) Removal of Insoluble Fragments by Centrifugation Further, the cell lysate was centrifuged (6300 rpm, 4 ° C., 30 minutes), and the supernatant was collected.
（３）硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
(3) Ammonium sulfate precipitation A saturated ammonium sulfate solution was added to the recovered supernatant so that the ammonium sulfate concentration was 25% by weight. Then, after allowing to stand for 8 to 12 hours, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered precipitate was dissolved in deionized water. Similarly, a saturated ammonium sulfate solution was added to the dissolved solution so that the ammonium sulfate concentration was 25% by weight. Then, after allowing to stand for 8 to 12 hours, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered precipitate was dissolved in deionized water to obtain a solution.
（４）限外濾過
（３）で得た溶液を分子質量３０,０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
(4) Ultrafiltration The solution obtained in (3) was subjected to an ultrafiltration device (holofer bar: manufactured by GE Healthcare) having a molecular weight of 30,000 cuts. The solution obtained in No. 3 was subjected to ultrafiltration using 10 times the amount of deionized water to obtain the protein after the ultrafiltration.
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ １０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
(5) Anion exchange chromatography The protein after ultrafiltration was dissolved in 10 mM sodium acetate buffer to 20 g / L, and an anion exchange column HiPrepSP XL16 / 10 (manufactured by GE Healthcare) was set in AKTAPlime (Amersham). Used by the company). The eluate fraction was recovered using 500 mM 10 mM sodium acetate buffer as the eluate.
（６）限外濾過
（５）で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
(6) Extrafiltration The solution obtained in (5) was treated in the same manner as in the above "4: Extrafiltration" to obtain a protein after ultrafiltration.
（７）凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して１０ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、８時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、７０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、１０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したタンパク質（Ａ１−１）を得た。
(7) Freeze-drying Protein is dissolved in deionized water to 10 g / L, and placed in a stainless steel vat so that the water level is 15 mm or less. Then, it is placed in a freeze-dryer (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.) and frozen at -40 ° C for 8 hours. After freezing, the purified protein (A1-1) is first dried at a vacuum degree of 8 Pa or less and -20 ° C for 70 hours, and secondarily dried at a vacuum degree of 8 Pa or less and 10 ° C. for 24 hours. Obtained.
タンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗ラビット６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。見かけ分子質量８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％），アラニン（１２．３重量％），セリン（５．３重量％），プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
Identification of protein (A1-1) The obtained protein (A1-1) was identified by the following procedure.
Analysis was performed by Western blotting using an anti-rabbit SELP8K antibody and an anti-rabbit 6 × His antibody (manufactured by Roland) against a 6 × His tag of the C-terminal sequence. A protein band with an apparent molecular weight of 80 kDa showed antibody reactivity with each antibody. As a result of amino analysis of the obtained protein, the products were glycine (43.7% by weight), alanine (12.3% by weight), serine (5.3% by weight), and proline (11.7% by weight). %) And valine (21.2% by weight). The product also contained 1.5% by weight lysine. Table 1 below shows the correlation between the composition of the purified product and the predicted theoretical composition inferred from the synthetic gene sequence.
したがって、タンパク質（Ａ１−１）はＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）（Ｙ’１−１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１８）のタンパク質〔含有するアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１３個［ポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）（ｎ２）は含まない］であることを確認した。
すなわち、ｎ１＝０、ｎ2＝９１、ｎ3＝１３、ｎ４＝４８であり、（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）／ｎ４は２．２であった。
Therefore, the protein (A1-1) has 12 consecutive GAGAGS sequences (7) (GAGAGS ), 12 polypeptide chains (S1-1) of 4 sequences (14), and 8 consecutive GVGVP sequences (1). 1 of V (valine) in the peptide chain (Y1-1) was replaced with K (lysine) (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequences (16) (Y'1-1) 13 The protein of the sequence (18) in which these are chemically bonded alternately [the total number of amino acid sequences (X') contained is 13 [amino acid sequence (X) constituting the polypeptide chain (Y')). (N 2 ) is not included].
That is, n 1 = 0, n 2 = 91, n 3 = 13, n 4 = 48, and (n 1 + n 2 + n 3 ) / n 4 was 2.2.
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５重量％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、分解吸収され、無くなったと判断した。
<Western blotting>
3 × SDS treatment buffer (150 mM Tris HCl (pH 6.8), 300 mM dithiothreitol, 6 wt% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.3 wt% bromophenol blue, and 30 wt% glycerol in 20 μL of Western blot sample. 10 μL was added and heated at 95 ° C. for 5 minutes to prepare a sample for electrophoresis. SDS-PAGE was performed using 15 μL of this electrophoresis sample. The gel after migration is transferred to a PVDF membrane, which is immersed in a blocking buffer (containing 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.1 wt% Tween 20, and 5 wt% skim milk) for 1 hour at room temperature. The membrane was blocked by shaking. After the blocking treatment, the membrane was washed with TBS-T (containing 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, and 0.1 wt% Tween 20) for 2 minutes. Next, the membrane was immersed in a primary antibody solution (primary antibody: anti-His-tag antibody (manufactured by Rockland) diluted 1/500 with TBS-T) and allowed to stand overnight at 4 ° C. to obtain the antibody. The reaction was carried out. After the reaction, this membrane was washed with TBS-T for 5 minutes four times, and then a solution of a secondary antibody that was capable of binding to the primary antibody and bound to horseradish peroxidase as a labeling enzyme (secondary antibody: ECL anti-). Immerse the membrane in a solution of mouse IgG HRP linked F (ab') 2 fragment (manufactured by GE Healthcare Bioscience) diluted to 1/2000 with TBS-T) and allow it to stand at room temperature for 30 minutes for antibody reaction. Was done. After the reaction, the membrane was washed with TBS-T for 5 minutes four times, and then an enzymatic reaction was carried out by ECL-Advance Western Blotting Detection Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience). The band was visualized by exposing it to a high-sensitivity instant black-and-white film (manufactured by FUJIFILM Corporation) using a luminometer ForECL (manufactured by Amersham Co., Ltd.). When the band could not be confirmed with the naked eye, it was judged that the band was decomposed and absorbed and disappeared.
＜実施例１＞
人工タンパク質（Ａ−１）を含有したゲル状の体液漏出防止剤（Ｂ−１）の作製
製造例１で得たタンパク質（Ａ１−１）を１２．５重量％となるように純水に溶解した。
この溶液がゲル化するまで３７℃にて加温、静置した後、凍結乾燥を行った。
この凍結乾燥物を再び１２．５重量％になるように純水に溶解させ、加温してゲル化した後、再び凍結乾燥する一連の工程を計４回繰り返して行い、人工タンパク質（Ａ−１）を得た。
得られた人工タンパク質（Ａ−１）を２０重量％、アルギン酸ナトリウム（粘度が３００〜４００ｃＰ）［和光純薬工業（株）製］を４重量％の濃度で脱イオン水に溶解し、ゲル状の体液漏出防止剤（Ｂ−１）を作製した。
<Example 1>
Preparation of Gel-like Body Fluid Leakage Prevention Agent (B-1) Containing Artificial Protein (A-1) The protein (A1-1) obtained in Production Example 1 was dissolved in pure water so as to be 12.5% by weight. did.
The solution was heated at 37 ° C. and allowed to stand until it gelled, and then freeze-dried.
This freeze-dried product is dissolved in pure water so as to be 12.5% by weight again, heated to gel, and then freeze-dried again by repeating a series of steps a total of 4 times to obtain an artificial protein (A-). 1) was obtained.
The obtained artificial protein (A-1) was dissolved in 20% by weight and sodium alginate (viscosity: 300 to 400 cP) [manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] at a concentration of 4% by weight in deionized water to form a gel. Body fluid leakage inhibitor (B-1) was prepared.
＜実施例２＞
人工タンパク質（Ａ−１）含有したゲル状の体液漏出防止剤（Ｂ−２）の作製
実施例１と同様にして得られた体液漏出防止剤（２）に対し、1重量％のデンプン（溶性）［和光純薬工業（株）製］を添加した体液漏出防止剤（Ｂ−２）を作成した。
<Example 2>
Preparation of Gel-like Body Fluid Leakage Prevention Agent (B-2) Containing Artificial Protein (A-1) 1% by weight of starch (soluble) with respect to the body fluid leakage prevention agent (2) obtained in the same manner as in Example 1. ) [Made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] was added to prepare a body fluid leakage preventive agent (B-2).
＜実施例３＞
人工タンパク質（Ａ−１）含有したゲル状の体液漏出防止剤（Ｂ−３）の作製
実施例１と同様にして得られた人工タンパク質（Ａ−１）を３０重量％、アルギン酸ナトリウムを３．５重量％の濃度で脱イオン水に溶解し体液漏出防止剤（Ｂ−３）を作製した。
<Example 3>
Preparation of gel-like body fluid leakage inhibitor (B-3) containing artificial protein (A-1) 30% by weight of artificial protein (A-1) obtained in the same manner as in Example 1 and sodium alginate 3. A body fluid leakage inhibitor (B-3) was prepared by dissolving in deionized water at a concentration of 5% by weight.
＜実施例４＞
人工タンパク質（Ａ−１）含有したゲル状の体液漏出防止剤（Ｂ−４）の作製
実施例１と同様にして得られた人工タンパク質（Ａ−１）を３０重量％、アルギン酸ナトリウムを３．５重量％、デンプンを1重量％の濃度で脱イオン水に溶解し、３７℃にて加温、静置してゲル化させ、体液漏出防止剤（Ｂ−４）を作製した。
<Example 4>
Preparation of gel-like body fluid leakage inhibitor (B-4) containing artificial protein (A-1) 30% by weight of artificial protein (A-1) obtained in the same manner as in Example 1 and sodium alginate 3. A body fluid leakage inhibitor (B-4) was prepared by dissolving 5% by weight and 1% by weight of starch in deionized water, heating at 37 ° C., and allowing to leave to gel.
＜実施例５＞
人工タンパク質（Ａ−１）含有したシート（Ｄ−１）の作製
実施例１と同様にして得られた人工タンパク質（Ａ１）とアルギン酸ナトリウムと水を１９：１：３８０の重量割合で混合し、４ｃｍ×６ｃｍの大きさの底面を有する平底のプラスチック容器に流し込み、４０℃に設定した循風乾燥機［ＥＹＥＬＡ製］を用いて１２時間乾燥させて、シート状に形成した。その後、プラスチック容器から取り出したシート状形成物をメタノールに２４時間浸漬させ、シート状の体液漏出防止剤（Ｄ−１）を作製した。
<Example 5>
Preparation of Sheet (D-1) Containing Artificial Protein (A-1) Artificial protein (A1) obtained in the same manner as in Example 1, sodium alginate and water were mixed at a weight ratio of 19: 1: 380. It was poured into a flat-bottomed plastic container having a bottom surface having a size of 4 cm × 6 cm, and dried for 12 hours using a circulation dryer [manufactured by EYELA] set at 40 ° C. to form a sheet. Then, the sheet-shaped product taken out from the plastic container was immersed in methanol for 24 hours to prepare a sheet-shaped body fluid leakage preventive agent (D-1).
＜実施例６＞
人工タンパク質（Ａ−１）含有したシート（Ｄ−２）の作製
アルギン酸ナトリウムに代えてデンプンを使用した以外は実施例６と同様に操作し、シート状の体液漏出防止剤組成物（Ｄ−２）を作製した。
<Example 6>
Preparation of Sheet (D-2) Containing Artificial Protein (A-1) The procedure was the same as in Example 6 except that starch was used instead of sodium alginate, and the sheet-shaped body fluid leakage inhibitor composition (D-2) was operated. ) Was prepared.
＜実施例７＞
人工タンパク質（Ａ−１）含有したシート状（Ｄ−３）の作製
実施例６と同様にして得られた人工タンパク質（Ａ−１）含有したシート状の体液漏出防止剤組成物（６）に対し、１％の塩化カルシウム水溶液に１２時間浸漬させ、人工タンパク質（Ａ１）含有したシート状の体液漏出防止剤組成物（Ｄ−３）を作製した。
<Example 7>
Preparation of Sheet-shaped (D-3) Containing Artificial Protein (A-1) In the sheet-shaped body fluid leakage inhibitor composition (6) containing artificial protein (A-1) obtained in the same manner as in Example 6. On the other hand, it was immersed in a 1% aqueous calcium chloride solution for 12 hours to prepare a sheet-shaped body fluid leakage inhibitor composition (D-3) containing an artificial protein (A1).
＜比較例１＞
ベリプラスト［ＣＬＳベーリング（株）製］を用いて、ベリプラスト付属説明書に従って調整したＡ液及びＢ液を比較用の体液漏出防止剤（Ｂ’−１）として用いた。
<Comparative example 1>
Using Beliplast [manufactured by CLS Bering Co., Ltd.], solutions A and B prepared according to the instructions attached to Beliplast were used as a body fluid leakage preventive agent (B'-1) for comparison.
＜ゲルの組織接着性の評価＞
組織表面のモデル系としてコラーゲンに対する接着性を評価した。
具体的には、大きさ２ｃｍ×５ｃｍのコラーゲンシートを用意し、接着面が２ｃｍ２となるようにゲル状の体液漏出防止剤（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）を１００ｍｇ塗布し、２枚のコラーゲンシートを接着させた。
ベリプラストを用いた（Ｂ’−１）についてはＡ液、Ｂ液５０ｍｇずつ順番に塗布し、２枚のコラーゲンシートを接着させた。
オードグラフ［ＡＧ−ＩＳ、（株）島津製作所製］にて２枚のコラーゲンシートを５ｃｍ／秒の速度で引っ張り、接着面がはがれる際の破断応力（Ｎ）を測定した。結果を表２に示す。
<Evaluation of gel tissue adhesiveness>
Adhesion to collagen was evaluated as a model system of the tissue surface.
Specifically, prepare a collagen sheet having a size of 2 cm x 5 cm, apply 100 mg of gel-like body fluid leakage preventive agents (B-1) to (B-4) so that the adhesive surface becomes 2 cm 2, and 2 A sheet of collagen was adhered.
For (B'-1) using beliplast, 50 mg each of solution A and solution B was applied in order, and two collagen sheets were adhered to each other.
Two collagen sheets were pulled at a speed of 5 cm / sec by an aud graph [AG-IS, manufactured by Shimadzu Corporation], and the breaking stress (N) when the adhesive surface was peeled off was measured. The results are shown in Table 2.
＜消化酵素に対する耐分解性評価＞
ガーゼにしみ込ませた１％パンクレアチン溶液に対し、ゲル状の体液漏出防止（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）２５０ｍｇ、シート状の及び体液漏出防止剤（Ｄ−１）〜（Ｄ−３）５０ｍｇを静置した。ベリプラスとの場合は５５ｍｇを使用した。
３７℃にて、７日間分解させ、分解度合いを評価した。消化液に対するに分解性の評価は以下の基準で評価した。結果は表２に示す。
<Evaluation of decomposition resistance to digestive enzymes>
Gel-like body fluid leakage prevention (B-1) to (B-4) 250 mg, sheet-like and body fluid leakage prevention agents (D-1) to (D-3), with respect to the 1% pancreatin solution soaked in gauze. ) 50 mg was allowed to stand. In the case of Veriplus, 55 mg was used.
It was decomposed at 37 ° C. for 7 days, and the degree of decomposition was evaluated. The evaluation of the degradability of digestive juices was based on the following criteria. The results are shown in Table 2.
なお、パンクレチアンは膵液に含まれる消化酵素であり、グレードの値が大きいほど、体液漏出防止剤に変化が無く、消化酵素への耐分解性が高いことを意味する。
グレード４：変化が無いか、形状を保たれている
グレード３：一部形状が変化し、部分的に分解されている。
グレード２：大部分の形状が変化し、ほとんどが分解されている。
グレード１：完全に分解され、目視で確認することができない。
Pancreatian is a digestive enzyme contained in pancreatic juice, and the larger the grade value, the more unchanged the body fluid leakage inhibitor and the higher the resistance to digestive enzymes.
Grade 4: No change or shape is maintained Grade 3: Partially changed shape and partially disassembled.
Grade 2: Most of the shape has changed and most have been disassembled.
Grade 1: Completely disassembled and cannot be visually confirmed.
表２の結果から、本発明のゲル状の体液漏出防止剤はベリプラストと比較して、ゲルの破断強度が大きいことがわかる。また、いずれの実施例のゲルとシートも、比較用の体液漏出防止剤と比較して、消化液に対する耐分解性が高いことが分かる。 From the results in Table 2, it can be seen that the gel-like body fluid leakage inhibitor of the present invention has a higher gel breaking strength than Veriplast. In addition, it can be seen that the gels and sheets of all the examples have higher decomposition resistance to digestive juices as compared with the comparative body fluid leakage inhibitor.
本発明の体液漏出防止剤は、従来の製品に比べ組織接着性が高いため、臓器、皮膚、血管といった組織の損傷部、切断面、穴、吻合部などから漏出出した体液を効果的に止めることができる。加えて、消化液に対する耐分解性を持っていることから、従来では治療の難しい症例に対して画期的な治療効果を提供することが可能となる。 Since the body fluid leakage preventive agent of the present invention has higher tissue adhesion than conventional products, it effectively stops body fluid leaked from damaged parts, cut surfaces, holes, anastomotic parts, etc. of tissues such as organs, skin, and blood vessels. be able to. In addition, since it has decomposition resistance to digestive juices, it is possible to provide an epoch-making therapeutic effect for cases that are difficult to treat in the past.
Claims (11)
前記体液漏出防止剤が、体液が漏出する臓器の穴、又は、体液が漏出する吻合部を塞ぐために用いられる剤であり、
前記体液が消化液であり、
前記ポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＧＶＧＶＰ配列（１）であるアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個結合したポリペプチド鎖であり、
前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）と、前記アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計個数で２〜２００個結合したポリペプチド鎖であり、
人工タンパク質（Ａ）が、更にＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する体液漏出防止剤。 An artificial protein (A) having a polypeptide chain (Y) and / or a polypeptide chain (Y'), and a body fluid leakage preventive agent (B) containing water.
The body fluid leakage preventive agent is an agent used to close a hole in an organ through which body fluid leaks or an anastomotic site in which body fluid leaks.
The body fluid is digestive juice,
The polypeptide chain (Y) is a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X), which are GVGVP sequences (1), are linked.
In the polypeptide chain (Y'), 20 to 40% of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X) was replaced with lysine (K) or arginine (R), respectively. polypeptide chain der of amino acid sequence (X ') are bonded from 2 to 200 in total number is,
Artificial proteins (A) further GAGAGS sequence (7) is fluid leakage preventing agents that have a polypeptide chain (S) bound 2-50 continuously.
１≦（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３）／ｎ４≦２０ （１）
但し、ｎ１はポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の個数；ｎ２はポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の個数；ｎ３はポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ’）の個数；ｎ４は人工タンパク質（Ａ）１分子中のＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数を表す。 The body fluid leakage preventive agent according to any one of claims 1 to 3, which satisfies the following relational expression (1).
1 ≤ (n 1 + n 2 + n 3 ) / n 4 ≤ 20 (1)
However, n 1 is the number of amino acid sequences (X) constituting the polypeptide chain (Y); n 2 is the number of amino acid sequences (X) constituting the polypeptide chain (Y'); n 3 is the number of polypeptide chains (X). The number of amino acid sequences (X') constituting Y'); n 4 represents the number of GAGAGS sequences (7) in one molecule of the artificial protein (A).
A sheet obtained by drying the body fluid leakage preventive agent (B) according to any one of claims 1 to 10.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016126934 | 2016-06-27 | ||
| JP2016126934 | 2016-06-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018000957A JP2018000957A (en) | 2018-01-11 |
| JP6912953B2 true JP6912953B2 (en) | 2021-08-04 |
Family
ID=60947067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017124941A Active JP6912953B2 (en) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | Bodily fluid leakage inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6912953B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114746128B (en) * | 2019-12-02 | 2023-04-28 | 国立大学法人京都大学 | Bronchial embolic material |
| CN116421772A (en) * | 2023-04-28 | 2023-07-14 | 北京瞬行生物科技有限公司 | Bi-component instantaneous in-situ adhesive based on bioengineering protein, and preparation method and application thereof |
| CN116570757B (en) * | 2023-07-05 | 2023-10-03 | 北京镧系生物科技有限公司 | Double-component in-situ adhesive based on super-charged protein, and preparation method and application thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1879606B1 (en) * | 2005-04-25 | 2013-06-12 | Massachusetts Institute of Technology | Self-assembling peptides for promoting hemostasis |
| JP6326326B2 (en) * | 2013-08-30 | 2018-05-16 | 三洋化成工業株式会社 | Wound healing agent |
| JP6498961B2 (en) * | 2014-02-27 | 2019-04-10 | 三洋化成工業株式会社 | Anti-adhesion agent and anti-adhesion composition |
| AU2017235871A1 (en) * | 2016-03-18 | 2018-09-27 | 3-D Matrix, Ltd. | Pancreatic fistula occlusion |
-
2017
- 2017-06-27 JP JP2017124941A patent/JP6912953B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018000957A (en) | 2018-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tang et al. | Collagen and its derivatives: From structure and properties to their applications in food industry | |
| JP6912953B2 (en) | Bodily fluid leakage inhibitor | |
| US5015677A (en) | Adhesives derived from bioadhesive polyphenolic proteins | |
| JP5870408B2 (en) | Temperature-responsive sheet exhibiting reversible properties and method for producing cell sheet using the same | |
| Leach Jr | Biochemistry of the organic matrix of the eggshell | |
| JP5979673B2 (en) | Protein aqueous solution | |
| EP1829890B1 (en) | Material for promoting the freezing of water or hydrous substance | |
| Liu et al. | Biofabricating functional soft matter using protein engineering to enable enzymatic assembly | |
| KR100679712B1 (en) | Process for preparing collagen from starfish | |
| JP6077316B2 (en) | Tissue regeneration material and tissue regeneration protein solution | |
| US10130675B2 (en) | Wound healing agent | |
| JP6982395B2 (en) | Interleukin 10 production increase agent | |
| WO2016178426A1 (en) | Agent having anti-ice nucleation activity | |
| JP2014177452A (en) | Wound healing agent | |
| JP6498961B2 (en) | Anti-adhesion agent and anti-adhesion composition | |
| González et al. | Modification strategies of proteins for food packaging applications | |
| Ventura | Characterisation of glycoproteins involved in sea urchin adhesion | |
| JP7429929B2 (en) | Materials for meniscal regeneration | |
| EP4071162A1 (en) | Bronchial embolization material | |
| Gohil et al. | Injectable hydrogels by enzymatic crosslinking | |
| JP6326287B2 (en) | Wound healing agent | |
| CN114058664A (en) | N-terminal precise grafting modification method of natural collagen | |
| CN104292328A (en) | Chymotrypsin inhibitor from urechis unicincts as well as application of gene and recombinant protein of chymotrypsin inhibitor | |
| AU605930B2 (en) | Adhesives derived from bioadhesive polyphenolic proteins | |
| JP2022096646A (en) | Adhesive polypeptides, liniments, and medical devices |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200107 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201110 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210105 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210226 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210406 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210604 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210706 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210709 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6912953 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |