JP6050609B2 - Skin elasticity improving material and protein solution for improving skin elasticity - Google Patents
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Description
本発明は、皮膚弾性向上材及び皮膚弾性向上用タンパク質溶液に関する。 The present invention relates to a skin elasticity improving material and a protein solution for improving skin elasticity.
皮膚の老化（皮膚弾性の低下）は、加齢や紫外線等のストレスによって進行する。皮膚弾性低下の具体的な組織学的現象としては、真皮中のエラスチン、コラーゲン及びグリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分の変化（変性や量の減少等）が挙げられる。
これまで皮膚外用剤の分野では、かかる皮膚弾性低下を防止するべく、多くの検討がなされている。例えば、真皮組織の主成分であるコラーゲンの変化について、真皮線維芽細胞を賦活し、加齢やストレスにより低下したコラーゲンの産生を促進又は亢進するような成分の探索（特許文献１及び特許文献２）や、コラーゲンの分解を抑制するような成分の探索（特許文献３）が盛んに行われている。しかしながら、コラーゲンの産生促進・減少抑制だけでは、皮膚弾性の向上・低下抑制には不十分である。皮膚弾性は、コラーゲン線維をエラスチン線維が支えることで得られるものであり、エラスチンの変化も皮膚弾性に大きく寄与するためである。
そこで、エラスチンの量の減少を抑える方法についての検討も行われている。例えば、エラスチンを分解する酵素であるエラスターゼの活性を阻害する皮膚外用材がある。しかしながら、加齢等で生体内機能が低下したためエラスチンが生体内で生合成される量が少ない場合は、エラスターゼの活性阻害だけでは皮膚弾性低下抑制の効果が望めないのが現状である。したがって、生体内機能に頼らず、外部から直接適用（注入）でき、エラスチンと同様の機能を持つ皮膚弾性向上のための成分（皮膚弾性向上材）が望まれている。
Skin aging (decrease in skin elasticity) proceeds due to stress such as aging and ultraviolet rays. Specific histological phenomena of skin elasticity reduction include changes in the extracellular matrix components such as elastin, collagen and glycosaminoglycan in the dermis (degeneration, reduction in amount, etc.).
In the field of topical skin preparations, many studies have been made so as to prevent such skin elasticity reduction. For example, for changes in collagen, which is the main component of dermal tissue, search for components that activate dermal fibroblasts and promote or enhance the production of collagen that has decreased due to aging or stress (Patent Documents 1 and 2) ) And search for components that suppress collagen degradation (Patent Document 3). However, collagen production promotion / decrease suppression alone is insufficient to improve skin elasticity. This is because skin elasticity is obtained by supporting collagen fibers with elastin fibers, and changes in elastin greatly contribute to skin elasticity.
In view of this, a method for suppressing a decrease in the amount of elastin has also been studied. For example, there is an external skin material that inhibits the activity of elastase, an enzyme that degrades elastin. However, when the amount of elastin biosynthesized in vivo is small due to a decrease in in vivo function due to aging or the like, it is the current situation that the effect of suppressing skin elasticity reduction cannot be expected only by inhibiting the activity of elastase. Therefore, there is a demand for a component (skin elasticity improving material) for improving skin elasticity that can be directly applied (injected) from the outside without depending on in vivo functions and has the same function as elastin.
本発明は、皮膚に適用することで、皮膚弾性を向上することができる皮膚弾性向上材を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the skin elasticity improving material which can improve skin elasticity by applying to skin.
本発明の皮膚弾性向上材は、アミノ酸配列が、配列（１３）［配列表の配列番号（１３）に記載のアミノ酸配列］、配列（１２）［配列表の配列番号（１２）に記載のアミノ酸配列］、配列（１７）［配列表の配列番号（１７）に記載のアミノ酸配列］、配列（１４）［配列表の配列番号（１４）に記載のアミノ酸配列］又は配列（１６）［配列表の配列番号（１６）に記載のアミノ酸配列］である人工タンパク質（Ａ）からなる皮膚弾性向上材である。
なお、本明細書において、「配列（数字）」と記載されている場合には、「配列（数字）［配列表の配列番号（数字）に記載のアミノ酸配列］」と読み替える。
In the skin elasticity improving material of the present invention, the amino acid sequence is sequence (13) [amino acid sequence described in SEQ ID NO: (13) in the sequence listing], sequence (12) [amino acid described in SEQ ID NO: (12) in the sequence listing. Sequence], Sequence (17) [Amino acid sequence described in SEQ ID NO: (17)], Sequence (14) [Amino acid sequence described in SEQ ID NO: (14)] or Sequence (16) [Sequence List] A skin elasticity improving material comprising an artificial protein (A) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: (16) .
In this specification, when “sequence (number)” is described, it is read as “sequence (number) [amino acid sequence described in SEQ ID NO: (number) in the sequence listing]”.
本発明の皮膚弾性向上材は、皮膚弾性を向上させることができる。 The skin elasticity improving material of the present invention can improve skin elasticity.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、人工タンパク質（Ａ）を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。 In the present invention, the artificial protein (A) is artificially produced in order to eliminate animal-derived components, and includes organic synthesis methods (enzymatic methods, solid phase synthesis methods, liquid phase synthesis methods, etc.) and genes. It can be produced by a recombinant method. For organic synthesis methods, see "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.)" or "Second Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry" (Lower) (May 20, 1987, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.), etc. Regarding the gene recombination method, the method described in Japanese Patent No. 3338441 can be applied. Although both the organic synthesis method and the gene recombination method can produce the artificial protein (A), the gene recombination method is preferable from the viewpoint that the amino acid sequence can be easily changed and mass production can be performed at low cost.
本発明の皮膚弾性向上材は、人工タンパク質（Ａ）からなるものであって、（Ａ）が、下記アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．５である皮膚弾性向上材である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）又はＧＶＧＶＰ配列（３）。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
The skin elasticity improving material of the present invention comprises an artificial protein (A), wherein (A) is a polypeptide chain (Y) having 2 to 200 consecutive amino acid sequences (X) below and / or a poly It has a peptide chain (Y ′), the total number of (Y) and (Y ′) in (A) is 1 to 100, and the hydrophobicity of (A) is 0.2 to 1.5. It is a skin elasticity improving material.
Amino acid sequence (X): VPGVG sequence (2) or GVGVP sequence (3).
Polypeptide chain (Y ′): A polypeptide chain in which 0.1 to 5% of all amino acids in (Y) are substituted with lysine and / or arginine, and the total number of substituted lysine and arginine is 1 to 100.
本発明においてポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）b配列又は（ＧＶＧＶＰ）c配列である。（なお、ｂ及びｃは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
人工タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）b配列又は（ＧＶＧＶＰ）c配列を有しても良く、（ＶＰＧＶＧ）b配列及び（ＧＶＧＶＰ）c配列を有しても良い。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ｂ及びｃが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、（Ｘ）の連続する個数ｂ及びｃが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
In the present invention, the polypeptide chain (Y) is specifically a (VPGVG) b sequence or a (GVGVP) c sequence. (Note that b and c are the number of consecutive amino acid sequences (X), respectively, and are integers of 2 to 200).
When one molecule of the artificial protein (A) has a plurality of polypeptide chains (Y), it may have a (VPGVG) b sequence or a (GVGVP) c sequence, and (VPGVG) b sequence and (GVGVP) c It may have an array.
When the amino acid sequence (X) has a plurality of polypeptide chains (Y) of the same type in the artificial protein (A), the number of consecutive (X) s may be the same or different for each (Y). Also good. That is, the above b and c may have a plurality of the same polypeptide chains (Y), or may have a plurality of polypeptide chains (Y) having different consecutive numbers b and c of (X).
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ及びｃがそれぞれ２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、皮膚弾性を長期的に向上させる観点から、連続する個数は２〜５０個（上記ｂ及びｃがそれぞれ２〜５０）が好ましく、さらに好ましくは２〜３０個（上記ｂ及びｃがそれぞれ２〜３０）である。 The polypeptide chain (Y) is a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) are continuous (b and c are each 2 to 200). From the viewpoint of improving skin elasticity in the long term, the polypeptide chain (Y) is continuous. The number is preferably 2 to 50 (b and c are 2 to 50, respectively), more preferably 2 to 30 (b and c are 2 to 30 respectively).
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、（Ｙ）の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖である。具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部が、下記アミノ酸配列（Ｘ’）に置換され、（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がＫ及び／又はＲで置換されたものとなったポリペプチド鎖である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜５個のアミノ酸がＫ及び／又はＲで置換され、アミノ酸の置換の割合［｛（Ｋ及び／又はＲで置換された個数）｝／｛（Ｘ’）のアミノ酸の個数｝×１００％］が２０〜８０％であるアミノ酸配列。
In the present invention, in the polypeptide chain (Y ′), 0.1 to 5% of all amino acids in (Y) are substituted with lysine and / or arginine, and the total number of substituted lysine and arginine is 1 to 100. A polypeptide chain. Specifically, part or all of the amino acid sequence (X) constituting the polypeptide chain (Y) is substituted with the following amino acid sequence (X ′), and 1 to 100 amino acids in (Y) are K And / or a polypeptide chain substituted with R.
Amino acid sequence (X ′): 1 to 5 amino acids in amino acid sequence (X) are substituted with K and / or R, and the percentage of amino acid substitution [{(number of K and / or R substituted)} / {The number of amino acids of (X ′)} × 100%] is 20 to 80%.
アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の数（Ｋ及び／又はＲで置換された数）は、人工タンパク質の水への溶解性の観点から、１〜４個が好ましく、さらに好ましくは１〜３個である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の割合［｛（Ｋ及び／又はＲで置換された個数）｝／｛（Ｘ’）のアミノ酸の個数｝×１００％］は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、２０〜６０％が好ましい。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（４）、ＧＫＧＫＰ配列（５）、ＧＫＧＲＰ配列（６）及びＧＲＧＲＰ配列（７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（４）及びＧＫＧＫＰ配列（５）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
In the amino acid sequence (X ′), the number of amino acid substitutions in the amino acid sequence (X) (the number substituted with K and / or R) is 1 to 4 from the viewpoint of solubility of the artificial protein in water. Is preferable, and more preferably 1 to 3.
Further, in the amino acid sequence (X ′), the ratio of substitution of amino acids in the amino acid sequence (X) [{(the number replaced with K and / or R)} / {number of amino acids in (X ′)} × 100 %] Is preferably 20 to 60% from the viewpoint of solubility of the artificial protein (A) in water.
The amino acid sequence (X ′) is from GKGVP sequence (4), GKGKP sequence (5), GKGRP sequence (6) and GRGRP sequence (7) from the viewpoint of solubility of artificial protein (A) in water. At least one sequence selected from the group consisting of the above is preferable, and at least one sequence selected from the group consisting of the GKGVP sequence (4) and the GKGKP sequence (5) is more preferable.
人工タンパク質（Ａ）はアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有するので、コラーゲンとの親和性が高い。また、コラーゲンとの親和性が高いことで、後述する本発明の皮膚弾性向上材及び水を含む皮膚弾性向上用タンパク質溶液を作成し、皮膚に適用（投与等）した際に、（Ａ）がエラスチンと同様に機能し、真皮中のコラーゲンに絡みつき、皮膚弾性を向上させることができると推察される。 Since the artificial protein (A) has an amino acid sequence (X) and / or an amino acid sequence (X ′), it has a high affinity for collagen. In addition, because of its high affinity with collagen, when a skin elasticity improving protein solution containing the skin elasticity improving material of the present invention and water described later is prepared and applied (administered, etc.) to the skin, (A) It is presumed that it functions in the same way as elastin, entangles with collagen in the dermis, and can improve skin elasticity.
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ｖ又はＰ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、（Ｙ）中の置換されるアミノ酸の数は、（Ａ）の水への溶解性及びコラーゲンとの親和性の観点から、１〜７０個が好ましく、さらに好ましくは１〜３０個である。
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、（Ｙ）の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であるが、（Ａ）の水への溶解性の観点から、０．１〜４％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜３％である。
Whether it is a polypeptide chain (Y ′) or not is determined by replacing all K and R in the sequence of the artificial protein (A) with another amino acid (G, V or P). ).
In the polypeptide chain (Y ′), the number of amino acids to be substituted in (Y) is preferably 1 to 70, more preferably from the viewpoint of the solubility in water of (A) and the affinity for collagen. Is 1-30.
The polypeptide chain (Y ′) is a polypeptide chain in which 0.1 to 5% of all amino acids in (Y) are substituted with lysine and / or arginine. In view of the above, 0.1 to 4% is preferable, and 0.5 to 3% is more preferable.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である人工タンパク質である。（Ａ）が、（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、（Ｙ）の個数はその合計である。（Ｙ’）も同様である。 In the present invention, the artificial protein (A) has a polypeptide chain (Y) and / or the following polypeptide chain (Y ′), and the total number of (Y) and (Y ′) in (A) is 1 to 100 artificial proteins. When (A) has (Y) with different types and / or consecutive numbers of (X), each is counted as one, and the number of (Y) is the total. The same applies to (Y ′).
人工タンパク質（Ａ）は、（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を合計１〜１００個有するものであるが、皮膚弾性向上の観点から、１〜８０個が好ましく、特に好ましくは１〜６０個である。
人工タンパク質（Ａ）において、同じアミノ酸配列（Ｘ）が繰り返し結合している部分はポリペプチド鎖（Ｙ）１個とし、（Ｘ）とは異なる配列が結合するまでを１個とする。例えば、（ＧＶＧＶＰ）100ＧＡＧＡＧＳ（ＶＰＧＶＧ）20である場合、ポリペプチド鎖（Ｙ）は（ＧＶＧＶＰ）100と（ＶＰＧＶＧ）20との２個である。また、人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ｖ又はＰ）に置きかえたときに、アミノ酸配列（Ｘ）が繰り返し結合しているものとなる部分をポリペプチド鎖（Ｙ’）１個とし、（Ｘ）とは異なる配列が結合するまでを１個とする。例えば、（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3ＧＡＧＡＧＳ（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3には、２個のポリペプチド鎖（Ｙ’）である（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3がある。
The artificial protein (A) has (A) 1 to 100 polypeptide chains (Y) and / or polypeptide chains (Y ′) in one molecule, but from the viewpoint of improving skin elasticity, 1 -80 are preferable, and 1-60 are particularly preferable.
In the artificial protein (A), the portion where the same amino acid sequence (X) is repeatedly bonded is one polypeptide chain (Y), and one portion until a sequence different from (X) is bonded is one. For example, in the case of (GVGVP) 100 GAGAGS (VPGVG) 20 , there are two polypeptide chains (Y), (GVGVP) 100 and (VPGVG) 20 . In addition, when all K and R in the sequence of the artificial protein (A) are replaced with other amino acids (G, V, or P), a portion in which the amino acid sequence (X) is repeatedly bonded One polypeptide chain (Y ′) is used, and one is used until a sequence different from (X) is bound. For example, (GVGVP) to 4 GKGVP (GVGVP) 3 GAGAGS ( GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 may be two polypeptide chains (Y ') (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．５であるが、（Ａ）の水への溶解性及びコラーゲンとの親和性の観点から、０．２５〜１．４が好ましく、さらに好ましくは０．３〜１．３であり、次にさらに好ましくは０．３５〜１．２である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（レ−ニンジャ−の新生化学 上，ｐ．３４６−３４７）に下記の数値が記載されている。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭT）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭT：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１０）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
In the present invention, the hydrophobicity of the artificial protein (A) is 0.2 to 1.5, but from the viewpoint of the solubility of (A) in water and the affinity with collagen, 0.25 to 1. 4 is preferable, more preferably 0.3 to 1.3, and still more preferably 0.35 to 1.2.
The degree of hydrophobicity in (A) indicates the degree of hydrophobicity of the molecule (A). (A) The number of amino acids constituting the molecule (Mα), the degree of hydrophobicity of each amino acid (Nα) And (A) The total number of amino acids in one molecule can be calculated by applying the following formula. The hydrophobicity of each amino acid is described in the following numerical values in non-patent literature (Leninger's new chemistry, p.346-347).
Hydrophobicity = Σ (Mα × Nα) / (M T )
Mα: (A) Number of each amino acid in one molecule Nα: Hydrophobicity of each amino acid M T : (A) Total number of amino acids in one molecule A (alanine): 1.8
R (arginine): −4.5
N (asparagine): -3.5
D (aspartic acid): -3.5
C (cysteine): 2.5
Q (glutamine): −3.5
E (glutamic acid): −3.5
G (glycine): -0.4
H (histidine): -3.2
I (isoleucine): 4.5
L (leucine): 3.8
K (lysine): -3.9
M (methionine): 1.9
F (phenylalanine): 2.8
P (proline): -1.6
S (serine): -0.8
T (threonine): -0.7
W (tryptophan): -0.9
Y (tyrosine): -1.3
V (valine): 4.2
For example, when (A) is (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequence (10), the degree of hydrophobicity of (A) = {16 (number of G) × (−0.4) +15 (number of V ) × 4.2 + 8 (number of P) × (−1.6) +1 (number of K) × (−3.9)} / 40 (total number of amino acids) = 1.00.
本発明においては、人工タンパク質（Ａ）が上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有していることで、コラーゲンとの親和性が高く、皮膚弾性向上作用に優れた皮膚弾性向上材となる。また、上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、且つ（Ａ）の疎水性度が上記範囲内であることにより、人工タンパク質（Ａ）を水に溶解することができ、生体内での適用性に優れ、皮膚真皮に容易に適用させることができるものとなる。 In the present invention, since the artificial protein (A) has the polypeptide chain (Y) and / or the polypeptide chain (Y ′), the affinity for collagen is high and the skin elasticity improving action is excellent. It becomes a skin elasticity improving material. In addition, the artificial protein (A) is dissolved in water by having the polypeptide chain (Y) and / or the polypeptide chain (Y ′) and the hydrophobicity of (A) being within the above range. And can be easily applied to the skin dermis.
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有していてもいい。（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有していると、（Ａ）が生体内で分解されにくくなり、長期的に皮膚弾性向上作用を得ることができる。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）は、生体内難分解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜１００個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、配列（１）が連続する数は、生体内難分解性の観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、次にさらに好ましくは３〜４０個であり、特に好ましくは４〜３０個である。
（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、（Ａ）１分子中に（Ｓ）を１つ以上有すればよいが、生体内難分解性の観点から、１〜２０個が好ましく、さらに好ましくは３〜１０個である。
In the present invention, the artificial protein (A) may further have a GAGAGS sequence (1). When (A) has the GAGAGS sequence (1), (A) becomes difficult to be decomposed in the living body, and an effect of improving skin elasticity can be obtained in the long term.
The GAGAGS sequence (1) preferably has a polypeptide chain (S) in which 2 to 100 GAGAGS sequences (1) are continuously linked from the viewpoint of in vivo degradability.
In the polypeptide chain (S), the number of consecutive sequences (1) is preferably 2 to 100, more preferably 2 to 50, and still more preferably 3 from the viewpoint of in vivo degradability. It is -40 pieces, Especially preferably, it is 4-30 pieces.
In (A), when it has a polypeptide chain (S), (A) it is sufficient to have one or more (S) in one molecule, but 1 to 20 is preferable from the viewpoint of in vivo degradability. More preferably, it is 3-10.
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、アミノ酸１個、アミノ酸配列（Ｘ）１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、生体内難分解性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１８）、ＧＡＡＧＹ配列（１９）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。 When the artificial protein (A) has a total of two or more polypeptide chains (Y), polypeptide chains (Y ′) and polypeptide chains (S), it is interposed between the polypeptide chains and the polypeptide chains. It may have an amino acid sequence (Z). (Z) is a peptide sequence in which one amino acid, one amino acid sequence (X), or two or more amino acids are linked. The number of amino acids constituting (Z) is preferably 1-30, more preferably 1-15, and particularly preferably 1-10, from the viewpoint of in vivo degradability. Specific examples of (Z) include VAAGY sequence (18), GAAGY sequence (19) and LGP sequence.
人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。（Ｔ）は、アミノ酸１個、アミノ酸配列（Ｘ）１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体内難分解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（８）等が挙げられる。 Each of the polypeptide chain (Y), polypeptide chain (Y ′) and polypeptide chain (S) at both ends in the artificial protein (A) has a terminal amino acid sequence (T) at the N and / or C terminus. You can do it. (T) is a peptide sequence in which one amino acid, one amino acid sequence (X), or two or more amino acids are linked. The number of amino acids constituting (T) is preferably 1 to 100, more preferably 1 to 50, and particularly preferably 1 to 40 from the viewpoint of in vivo degradability. Specific examples of (T) include MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPPFASDPM sequence (8) and the like.
人工タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製または検出を容易にするために、（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
In addition to the above (T), the artificial protein (A) is a protein having a special amino acid sequence at the N and / or C terminus of (A) in order to facilitate purification or detection of expressed (A) or Peptides (hereinafter referred to as “purification tags”) may be included. As the purification tag, an affinity purification tag is used. Such purification tags include polyhistidine 6 × His tag, V5 tag, Xpress tag, AU1 tag, T7 tag, VSV-G tag, DDDDK tag, S tag, CruzTag09 ™ , CruzTag22 ™ , CruzTag41 ™ , Glu. -Glu tag, Ha. There are 11 tags and KT3 tags.
An example of a combination of each purification tag (i) and a ligand (ii) that recognizes and binds the tag is shown below.
(I-1) glutathione-S-transferase (GTS) (ii-1) glutathione (i-2) maltose binding protein (MBP) (ii-2) amylose (i-3) HQ tag (ii-3) nickel ( i-4) Myc tag (ii-4) Anti-Myc antibody (i-5) HA tag (ii-5) Anti-HA antibody (i-6) FLAG tag (ii-6) Anti-FLAG antibody (i-7) 6 XHis tag (ii-7) Nickel or cobalt As a method for introducing the purified tag sequence, the nucleic acid encoding the purified tag is inserted into the 5 ′ or 3 ′ end of the nucleic acid encoding the artificial protein (A) in the expression vector. And a method using a commercially available purification tag introduction vector.
人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、コラーゲンとの親和性の観点から、（Ａ）の分子量を基準として１０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは１５〜７５重量％である。 The total content (% by weight) of the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X ′) in one molecule of the artificial protein (A) is 10 to 10 based on the molecular weight of (A) from the viewpoint of affinity with collagen. 80 weight% is preferable, More preferably, it is 15 to 75 weight%.
人工タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、人工タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、人工タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を測定する。
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛（Ａ）の分子量｝×１００
The total content of the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X ′) in the artificial protein (A) can be determined by a protein sequencer. Specifically, it can be determined by the following measurement method.
<Method for Measuring Content of Amino Acid Sequence (X) and Amino Acid Sequence (X ′)>
The artificial protein (A) is decomposed to about 30 residues or less by using two or more cleavage methods that can be cleaved by specific amino acid residues. Then, after separating by high performance liquid chromatography (HPLC), the amino acid sequence is read with a protein sequencer. Peptide mapping is performed from the obtained amino acid sequence to determine the entire sequence of the artificial protein (A). Thereafter, the total content of the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X ′) is measured by the measurement formula described below.
Total content (%) of amino acid sequence (X) and amino acid sequence (X ′) = [{molecular weight of amino acid sequence (X)} × {number of amino acid sequence (X)} + {molecular weight of amino acid sequence (X ′) } × {number of amino acid sequences (X ′)}] / {molecular weight of (A)} × 100
タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数とアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数：アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の合計個数）は、（Ａ）の水への溶解性及びコラーゲンとの親和性の観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。 Ratio of the number of GAGAGS sequences (1) and the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) in one molecule of protein (A) (number of GAGAGS sequences (1): amino acid sequence (X) and The total number of (X ′) is preferably from 1: 2 to 1:20, more preferably from 1: 2 to 1:10, from the viewpoint of the solubility in water of (A) and the affinity with collagen. is there.
人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、長期的に皮膚弾性向上機能を発揮する観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは１５〜１００ｋＤａである。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
The molecular mass of the artificial protein (A) is preferably 15 to 200 kDa, more preferably 15 to 100 kDa, from the viewpoint of exhibiting the function of improving skin elasticity over the long term.
The molecular mass of the artificial protein (A) is determined by a method in which a measurement sample is separated by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and the migration distance is compared with a standard substance.
好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）の人工タンパク質
（１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１０）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（９）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１１）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１３）である。
具体的には、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（９）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１０）（Ｙ’１１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１１）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１３）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６１８）；ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１１）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１０）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１２）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７１８）等である。
（１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）を有する人工タンパク質（Ａ２）であり、さらに好ましくは、ＧＶＧＶＰ配列（３）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個連続したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）を有する人工タンパク質（Ａ２１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ２１）とポリペプチド鎖（Ｓ２−１）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−１）が２９個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約９３ｋＤａの配列（１４）の人工タンパク質（ＳＬＰ４．１、疎水性度０．４７）である。
（１−３）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の２個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’３）を有する人工タンパク質（Ａ３）であり、さらに好ましくは、ＧＫＧＶＰ配列（４）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ’３１）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が１０個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−２）を有する人工タンパク質（Ａ３１）である。
具体的には、ポリペプチド鎖（Ｓ２−１）にポリペプチド鎖（Ｙ’３１）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｓ２−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−２）が１０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約７３ｋＤａの配列（１５）の人工タンパク質（ＳＬＰ４．２、疎水性度０．２）等である。
A part of preferable artificial protein (A) is illustrated below.
(1) Amino acid sequence (X) is an artificial protein of GVGVP sequence (3) (1-1) One amino acid in a polypeptide chain (Y1) in which GVGVP sequence (3) is continuous is substituted with K (lysine) A polypeptide chain (Y′11) and (GAGAGS), which is an artificial protein (A1) having a polypeptide chain (Y′1), and more preferably a (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequence (10) 4 Artificial protein (A11) having polypeptide chain (S1-1) of sequence (9), polypeptide chain (Y'11) and polypeptide chain (S1-2) of (GAGAGS) 2 sequence (11) And an artificial protein (A12) having a polypeptide chain (Y′11), a polypeptide chain (S1-1) and a polypeptide chain (S1-2) 13).
Specifically, 12 polypeptide chains (S1-1) of 4 GAGAGS sequences (1) (GAGAGS) 4 sequences (9) and 8 polypeptide chains (3) of GVGVP sequence (3) ( YG) has 13 (GVGVP) 4 GKGVP (GVGVP) 3 sequences (10) (Y′11) in which one of V (valine) in Y11) is replaced by K (lysine). A sequence having a molecular mass of about 80 kDa having a structure in which one polypeptide chain (S1-2) of a sequence (GAGAGS) 2 sequence (11) is chemically bonded to a combination of two GAGAGS sequences (1) (13) Artificial protein (SELP8K, hydrophobicity 0.618); polypeptide chain (S1-2) and (GVGVP) of (GAGAGS) 2 sequence (11) having two consecutive GAGAGS sequences (1) 4 GKGVP (GVGVP) 3 Artificial sequence (12) having a structure comprising 17 polypeptide chains (Y′11) each having the sequence (10), and having these chemically linked alternately, and a molecular mass of about 82 kDa Protein (SELP0K, hydrophobicity 0.718) and the like.
(1-2) GVGVP sequence (3) is an artificial protein (A2) having a continuous polypeptide chain (Y2), more preferably a polypeptide chain (Y21) having two continuous GVGVP sequences (3) and It is an artificial protein (A21) having a polypeptide chain (S2-1) having six continuous GAGAGS sequences (1). Specifically, the polypeptide chain (Y21) and the polypeptide chain (S2-1) bind to each other. The artificial protein (SLP4.1, hydrophobicity 0.47) having a structure (14) having a molecular mass of about 93 kDa and having a structure in which 29 amino acid blocks (L-1) are chemically bonded repeatedly.
(1-3) An artificial protein (A3) having a polypeptide chain (Y′3) in which two amino acids in a continuous polypeptide chain (Y1) of the GVGVP sequence (3) are substituted with K (lysine) More preferably, a polypeptide chain (Y′31) in which two GKGVP sequences (4) are continuous, a polypeptide chain (S2-1) in which six GAGAGS sequences (1) are linked, and a GAGAGS sequence (1). It is an artificial protein (A31) having 10 polypeptide chains (S2-2) linked.
Specifically, the amino acid block (L-2) in which the polypeptide chain (Y′31) is bonded to the polypeptide chain (S2-1) and the polypeptide chain (S2-2) is further bonded is repeated 10 times. An artificial protein (SLP4.2, hydrophobicity 0.2) having sequence (15) having a combined structure and a molecular mass of about 73 kDa.
（２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）の人工タンパク質
（２−１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ４）を有する人工タンパク質（Ａ４）であり、具体的には、ＶＰＧＶＧ配列（２）が１６０個連続したポリペプチド鎖（Ｙ４１）を有する分子質量が約６５ｋＤａの配列（１６）の人工タンパク質（ＥＬＰ１、疎水性度１．２）である。
（２−２）ＶＰＧＶＧ配列（２）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）及びＶＰＧＶＧ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）を有する人工タンパク質（Ａ５）であり、さらに好ましくは、ＶＰＧＶＧ配列（２）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）、ＶＰＧＶＧ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有する人工タンパク質（Ａ５１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ５−１）にＧＡＧＡＧＳ配列（１）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｙ５−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−３）が４０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約２２０ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質（ＥＬＰ１．１、疎水性度１．１２）である。
(2) an artificial protein (A4) having a polypeptide chain (Y4) in which the amino acid sequence (X) is a VPGVG sequence (2) (2-1) and the VPGVG sequence (2) is a continuous polypeptide chain. , An artificial protein (ELP1, hydrophobicity of 1.2) having a polypeptide mass (Y41) of 160 VPGVG sequences (2) and a molecular mass of about 65 kDa (16).
(2-2) An artificial protein (A5) having a polypeptide chain (Y5-1) in which four VPGVG sequences (2) are continuous and a polypeptide chain (Y5-2) in which eight VPGVG sequences (2) are continuous More preferably, a polypeptide chain (Y5-1) in which four VPGVG sequences (2) are continuous, a polypeptide chain (Y5-2) in which eight VPGVG sequences (2) are continuous, and a GAGAGS sequence (1). Specifically, an amino acid block (L-3) in which GAGAGS sequence (1) is bound to polypeptide chain (Y5-1) and polypeptide chain (Y5-2) is further bound. ) Is an artificial protein (ELP1.1, hydrophobicity 1.12) of sequence (17) with a molecular mass of about 220 kDa having a structure in which 40 are chemically bonded.
本発明の皮膚弾性向上材の適用方法としては、特に限定はないが、下記に一例を示す。
（１）人工タンパク質（Ａ）及び水を所定量含む、後述する皮膚弾性向上用タンパク質溶液を４〜２５℃で作製する。皮膚弾性向上用タンパク質溶液には、必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもよい。また、皮膚弾性向上用タンパク質溶液は、必要により皮膚に適用する直前に温めてもよい。
（２）皮膚に皮膚弾性向上用タンパク質溶液を適用する。
Although there is no limitation in particular as an application method of the skin elasticity improvement material of this invention, an example is shown below.
(1) A protein solution for improving skin elasticity, which will be described later, containing a predetermined amount of artificial protein (A) and water is prepared at 4 to 25 ° C. The protein solution for improving skin elasticity may contain an inorganic salt and / or phosphoric acid (salt) as necessary. The protein solution for improving skin elasticity may be warmed immediately before application to the skin, if necessary.
(2) A protein solution for improving skin elasticity is applied to the skin.
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中の各成分の量は、後述する本発明の皮膚弾性向上用タンパク質溶液と同様であり、好ましい範囲も同様である。
また、皮膚に適用する際の皮膚弾性向上用タンパク質溶液の温度は、皮膚弾性向上材の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
The amount of each component in the protein solution for improving skin elasticity is the same as that of the protein solution for improving skin elasticity of the present invention described later, and the preferred range is also the same.
In addition, the temperature of the protein solution for improving skin elasticity when applied to the skin is preferably 4 to 80 ° C, more preferably 4 to 60 ° C, from the viewpoint of thermal stability and handling properties of the skin elasticity improving material. More preferably, it is 25-50 degreeC, Most preferably, it is 30-40 degreeC.
皮膚弾性向上用タンパク質溶液の皮膚への適用方法としては、注射器やマイクロニードルで皮膚内部又は外部に投与する方法等が挙げられる。
本発明において皮膚は、身体の外皮または被膜を意味し、真皮および表皮からなり、皮下組織上にあるものを意味する。
また、皮膚は、人の皮膚に限定されることなく、動物（ペットや家畜）の皮膚にも使用することができる。
Examples of the method for applying the protein solution for improving skin elasticity to the skin include a method of administering the protein solution inside or outside the skin with a syringe or a microneedle.
In the present invention, the skin means the outer skin or coat of the body, and is composed of the dermis and epidermis and is on the subcutaneous tissue.
Further, the skin is not limited to human skin, but can also be used on the skin of animals (pets and domestic animals).
本発明の皮膚弾性向上材は、動物由来の血清等が含まれていないので、抗原性が低いと推察される。また、人工タンパク質（Ａ）は、生物由来配列を有するので、生体適合性が高いと推察される。さらに、人工タンパク質（Ａ）は大腸菌等の細菌により、安価に大量生産できるので、皮膚弾性向上材を容易に入手できる。
また、本発明の皮膚弾性向上材は、水に溶解できるので、皮膚弾性向上材を含む水溶液を皮膚内部又は外部に投与することで、老化により低下した皮膚弾性の向上や皺を消失・予防することができ、顔面や腕部、脚部、胸部、頚部等の身体部分の緩み弛んだ肌を引き締めることができる。
The skin elasticity improving material of the present invention is presumed to have low antigenicity because it does not contain animal-derived serum or the like. Moreover, since artificial protein (A) has a biological origin arrangement | sequence, it is guessed that biocompatibility is high. Furthermore, since the artificial protein (A) can be mass-produced at low cost by bacteria such as Escherichia coli, a skin elasticity improving material can be easily obtained.
In addition, since the skin elasticity improving material of the present invention can be dissolved in water, the skin elasticity improvement and wrinkles that have decreased due to aging are eliminated or prevented by administering an aqueous solution containing the skin elasticity improving material inside or outside the skin. It is possible to tighten the loosened and loosened skin of body parts such as the face, arms, legs, chest, and neck.
本発明の皮膚弾性向上用タンパク質溶液は、皮膚弾性向上材及び水を含有する皮膚弾性向上用タンパク質溶液であって、皮膚弾性向上材及び水の合計重量を基準として、皮膚弾性向上用タンパク質溶液中の皮膚弾性向上材の含有量が５〜３０重量％、水の含有量が７０〜９５重量％である皮膚弾性向上用タンパク質溶液である。
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中の人工タンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、効率よく皮膚弾性向上機能を発揮する観点から、皮膚弾性向上材及び水の合計重量を基準として、１０〜３０が好ましく、さらに好ましくは１５〜３０である。
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中の水の含有量（重量％）は、人工タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から、７０〜９０が好ましく、さらに好ましくは７０〜８５である。
The protein solution for improving skin elasticity of the present invention is a protein solution for improving skin elasticity containing a skin elasticity improving material and water, and is based on the total weight of the skin elasticity improving material and water in the protein solution for improving skin elasticity. Is a protein solution for improving skin elasticity, in which the content of the skin elasticity improving material is 5 to 30% by weight and the content of water is 70 to 95% by weight.
The content (% by weight) of the artificial protein (A) in the protein solution for improving skin elasticity is 10 to 30 based on the total weight of the skin elasticity improving material and water from the viewpoint of efficiently exhibiting the function of improving skin elasticity. Is more preferable, and 15-30 is more preferable.
The content (% by weight) of water in the protein solution for improving skin elasticity is preferably 70 to 90, more preferably 70 to 85, from the viewpoint of solubility of the artificial protein (A).
本発明の皮膚弾性向上用タンパク質溶液において、皮膚弾性向上材は、上記皮膚弾性向上材であり、皮膚弾性向上用タンパク質溶液に使用する皮膚弾性向上材として好ましいものは、上記皮膚弾性向上材として好ましいものと同様である。 In the protein solution for improving skin elasticity of the present invention, the skin elasticity improving material is the above skin elasticity improving material, and those preferable as the skin elasticity improving material used in the protein solution for improving skin elasticity are preferable as the above skin elasticity improving material. It is the same as that.
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中の水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。 The water in the protein solution for improving skin elasticity is not particularly limited as long as it is sterilized. As a sterilization method, water passing through a microfiltration membrane having a pore size of 0.2 μm or less, ultrafiltration Water that has passed through a membrane, water that has passed through a reverse osmosis membrane, ion-exchanged water that has been sterilized by heating at 121 ° C. for 20 minutes in an autoclave, and the like can be used.
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中には、上記皮膚弾性向上材及び水以外に無機塩及びリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中の塩の含有量（重量％）は、人間の体液と同等にするというの観点から、皮膚弾性向上用タンパク質溶液の重量を基準として０〜１．３が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．３であり、次にさらに好ましくは０．７〜１．１であり、特に好ましくは０．８５〜０．９５である。
The protein solution for improving skin elasticity may contain an inorganic salt and phosphoric acid (salt) in addition to the skin elasticity improving material and water.
Examples of the inorganic salt include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, calcium hydrogen carbonate, and magnesium hydrogen carbonate. Phosphate is not included in inorganic salts.
The content (% by weight) of the salt in the protein solution for improving skin elasticity is preferably 0 to 1.3 on the basis of the weight of the protein solution for improving skin elasticity, from the viewpoint of making it equivalent to human body fluid. Preferably it is 0.5 to 1.3, then more preferably 0.7 to 1.1, and particularly preferably 0.85 to 0.95.
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
皮膚弾性向上用タンパク質溶液中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、タンパク質溶解性の観点から、皮膚弾性向上用タンパク質溶液の重量を基準として０〜０．３０が好ましく、さらに好ましくは０．１０〜０．３０であり、次にさらに好ましくは０．１２〜０．２８であり、特に好ましくは０．１４〜０．２６である。
Phosphoric acid (salt) means phosphoric acid and / or phosphate.
Examples of phosphoric acid (salt) in the protein solution for improving skin elasticity include phosphoric acid and phosphate.
Examples of the salt include alkali metal salts and alkaline earth metal salts, and specific examples include sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts.
From the viewpoint of protein solubility, the content (% by weight) of phosphoric acid (salt) in the protein solution for improving skin elasticity is preferably 0 to 0.30, more preferably based on the weight of the protein solution for improving skin elasticity. Is 0.10 to 0.30, then more preferably 0.12 to 0.28, and particularly preferably 0.14 to 0.26.
皮膚弾性向上用タンパク質溶液のｐＨは、組織親和性の観点から、５〜９が好ましく、さらに好ましくは６〜８である。 From the viewpoint of tissue affinity, the pH of the protein solution for improving skin elasticity is preferably 5-9, more preferably 6-8.
また、皮膚弾性向上用タンパク質溶液には、上記以外に、コラーゲン、ヒアルロン酸等を含んでもいい。 In addition to the above, the protein solution for improving skin elasticity may contain collagen, hyaluronic acid and the like.
本発明の皮膚弾性向上用タンパク質溶液は、上記皮膚弾性向上材を含んでいるので、顔面や腕部、脚部、胸部、頚部等の身体部分において、老化により弾性が低下した皮膚の皮膚弾性を向上させたり、皺のある皮膚や緩み弛んだ肌を引き締めるために皮膚に投与する溶液として有効である。 Since the protein solution for improving skin elasticity of the present invention contains the above skin elasticity improving material, the skin elasticity of the skin whose elasticity has decreased due to aging in the body parts such as the face, arms, legs, chest, and neck is reduced. It is effective as a solution to be applied to the skin to improve or tighten wrinkled skin or loose and loose skin.
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example and a comparative example explain the present invention further, the present invention is not limited to these.
＜実施例１＞
○ＳＥＬＰ８Ｋの生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液がＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間インキュベートした。該培養体を氷上で冷却し、培養液のＯＤ６００を測定した。大腸菌を遠心分離で集めた。集菌した大腸菌から人工タンパク質を取り出すために、超音波破砕（４℃、３０秒×１０回）をして溶菌した。
この大腸菌により産生された人工タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ポリフッ化ビニリデン膜にトランスファーした。その後、一次抗体に抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体、２次抗体に抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いたウエスタンブロット分析を行なった。該生成物の見かけ分子量は約８０ｋＤａであった。よってＳＥＬＰ８Ｋ生産株は、見かけ分子質量８０，０００の抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体反応性を有するＳＥＬＰ８Ｋを生成したことが分かった。
<Example 1>
Production of SELP8K A plasmid pPT0345 encoding SELP8K was prepared according to the method described in Examples of Japanese Patent No. 4088341.
The prepared plasmid was transformed into E. coli to obtain a SELP8K production strain.
An overnight culture of SELP8K producing strain grown at 30 ° C. was used to inoculate 50 ml of LB medium in a 250 ml flask. Kanamycin was added to a final concentration of 50 μg / ml, and the culture was incubated at 30 ° C. with stirring (200 rpm). When the culture solution reached OD600 = 0.8 (absorbance meter UV1700, manufactured by Shimadzu Corporation), 40 ml was transferred to a flask pre-warmed to 42 ° C. and incubated at the same temperature for about 2 hours. The culture was cooled on ice and the OD600 of the culture was measured. E. coli was collected by centrifugation. In order to take out the artificial protein from the collected E. coli, lysis was carried out by ultrasonic disruption (4 ° C., 30 seconds × 10 times).
The artificial protein produced by this E. coli was subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and then transferred to a polyvinylidene fluoride membrane. Thereafter, Western blot analysis was performed using an anti-rabbit SELP8K antibody as a primary antibody and an anti-rabbit IgG HRP-labeled antibody (manufactured by GE Healthcare) as a secondary antibody. The apparent molecular weight of the product was about 80 kDa. Therefore, it was found that the SELP8K producing strain produced SELP8K having an anti-rabbit SELP8K antibody reactivity with an apparent molecular mass of 80,000.
○ＳＥＬＰ８Ｋの精製
上記で得たＳＥＬＰ８Ｋを、菌体溶解、遠心分離による不溶性細片の除去、及びアフィニティークロマトグラフィーにより大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、皮膚弾性向上材である分子量が約８０ｋＤａの人工タンパク質（Ａ−１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。
Purification of SELP8K The SELP8K obtained above was purified from E. coli biomass by cell lysis, removal of insoluble debris by centrifugation, and affinity chromatography. Thus, an artificial protein (A-1) (SELP8K) having a molecular weight of about 80 kDa, which is a skin elasticity improving material, was obtained.
○ＳＥＬＰ８Ｋの同定
得られた人工タンパク質（Ａ−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗ラビット６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。見かけ分子質量８０，０００のタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７％），アラニン（１２．３％），セリン（５．３％），プロリン（１１．７％）及びバリン（２１．２％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、ＳＥＬＰ８Ｋ（Ａ−１）がＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）であり、（Ｙ）中のＶのうち１個がＫに置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１０）（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（９）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１１）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）が化学結合した構造を有する配列（１３）の人工タンパク質であることを確認した。
○ Identification of SELP8K The obtained artificial protein (A-1) was identified by the following procedure.
The analysis was performed by Western blotting using an anti-rabbit SELP8K antibody and an anti-rabbit 6 × His antibody (Roland) against a 6 × His tag of the C-terminal sequence. A protein band with an apparent molecular mass of 80,000 showed antibody reactivity to each antibody. As a result of subjecting the obtained protein to amino analysis, the product was found to contain glycine (43.7%), alanine (12.3%), serine (5.3%), proline (11.7%) and valine. (21.2%). The product also contained 1.5% lysine. Table 1 below shows the correlation between the composition of the purified product and the predicted theoretical composition deduced from the synthetic gene sequence.
Therefore, SELP8K (A-1) is a polypeptide chain (Y) in which 8 GVGVP sequences (3) are continuous, and (GVGVP) 4GKGVP (GVGVP) in which one of V in (Y) is replaced with K. ) Having 12 polypeptide chains (S1-1) of (GAGAGS) 4 sequence (9), comprising 13 sequences (10) (Y′11) and 4 consecutive GAGAGS sequences (1), Artificial sequence (13) having a structure in which a polypeptide chain (S1-2) of (GAGAGS) 2 sequence (11), in which two GAGAGS sequences (1) are continuous, is chemically bonded to an alternately chemical bond. The protein was confirmed.
＜実施例２＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＥＬＰ０ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３６４」を用いる以外は同様にして、皮膚弾性向上材である分子質量が約８２ｋＤａの配列（１２）の人工タンパク質（Ａ−２）を得た。
<Example 2>
In the same manner as in Production Example 1, except that “plasmid pPT0364 encoding SELP0K” is used instead of “plasmid pPT0345 encoding SELP8K”, the sequence (12) having a molecular mass of about 82 kDa as a skin elasticity improving material is used. An artificial protein (A-2) was obtained.
＜実施例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、皮膚弾性向上材である分子質量が約９３ｋＤａの配列（１４）の人工タンパク質（Ａ−３）を得た。
<Example 3>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pSY1398-1 encoding SLP4.1” is used instead of “plasmid pPT0345 encoding SELP8K”, an array having a molecular mass of about 93 kDa, which is a skin elasticity improving material ( 14) The artificial protein (A-3) was obtained.
＜実施例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−１」を用いる以外は同様にして、皮膚弾性向上材である分子質量が約２２０ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質（Ａ−４）を得た。
<Example 4>
In the same manner as in Production Example 1, except that "plasmid pPT0102-1 encoding ELP1.1" is used instead of "plasmid pPT0345 encoding SELP8K", a sequence having a molecular mass of about 220 kDa as a skin elasticity improving material is used. The artificial protein (A-4) of (17) was obtained.
＜実施例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２」を用いる以外は同様にして、皮膚弾性向上材である分子質量が約６５ｋＤａの配列（１６）の人工タンパク質（Ａ−５）を得た。
<Example 5>
In the same manner as in Production Example 1, except that “plasmid pPT0345 encoding ELP1” is used instead of “plasmid pPT0345 encoding SELP8K”, the sequence (16) having a molecular mass of about 65 kDa, which is a skin elasticity improving material, is used. An artificial protein (A-5) was obtained.
＜比較例１＞
コラーゲン（井原水産社製）を比較用の皮膚弾性向上材として用いた。
<Comparative Example 1>
Collagen (Ihara Suisan Co., Ltd.) was used as a skin elasticity improving material for comparison.
＜皮膚弾性向上用タンパク質溶液の作成＞
人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）及びコラーゲンを、それぞれ水に溶解して２０重量％の濃度にした皮膚弾性向上用タンパク質溶液（Ｌ−１）〜（Ｌ−６）を作成した。
<Preparation of protein solution for improving skin elasticity>
Artificial proteins (A-1) to (A-5) and collagen were each dissolved in water to prepare protein solutions (L-1) to (L-6) for improving skin elasticity with a concentration of 20% by weight. .
＜モルモット背部での皮膚弾性評価＞
モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ系）７週齢の背部を剃毛し、皮膚弾性向上用タンパク質溶液（Ｌ−１）〜（Ｌ−６）１００μＬをそれぞれ皮内投与した。３日後、１４日後、２８日後、５６日後に背部を剃毛した後、皮膚弾性を測定した。皮膚弾性はキュートメーターＳＥＭ５７５（インテグラル社製）を用いて測定した。投与前の皮膚弾性を１００％とした相対値で表し、結果を表２にまとめた。
<Evaluation of skin elasticity on back of guinea pig>
Guinea pig (Hartley system) 7-week-old back was shaved, and 100 μL of skin elasticity improving protein solutions (L-1) to (L-6) were each administered intradermally. After 3 days, 14 days, 28 days, and 56 days, the back was shaved and the skin elasticity was measured. Skin elasticity was measured using a cut meter SEM575 (manufactured by Integral). The results are shown as relative values with the skin elasticity before administration as 100%, and the results are summarized in Table 2.
表２の皮膚弾性評価の結果から、コラーゲンを皮膚弾性向上材とした比較例１では、投与３日後に９５％と１００％未満であり、投与前よりも皮膚弾性が低下していることが分かる。特に、５６日後には加齢により９３％にまで皮膚弾性が低下しており、皮膚弾性向上効果が低いことが分かる。
一方、実施例１〜５の本発明の皮膚弾性向上材を投与したモルモットの皮膚弾性は１００％以上であり、投与前の皮膚弾性よりも向上していることが分かる。したがって、皮膚弾性向上効果が高いことがわかる。また、実施例１〜４においては、５６日後も１１２％以上であり、長期的に皮膚弾性を向上できることがわかる。
From the results of skin elasticity evaluation in Table 2, it can be seen that in Comparative Example 1 using collagen as a skin elasticity improving material, the skin elasticity is 95% and less than 100% 3 days after administration, and the skin elasticity is lower than before administration. . In particular, after 56 days, skin elasticity has decreased to 93% due to aging, indicating that the effect of improving skin elasticity is low.
On the other hand, the skin elasticity of the guinea pigs to which the skin elasticity improving materials of the present invention of Examples 1 to 5 are administered is 100% or more, and it can be seen that the skin elasticity before administration is improved. Therefore, it turns out that the skin elasticity improvement effect is high. Moreover, in Examples 1-4, it is 112% or more also after 56 days, and it turns out that skin elasticity can be improved in the long term.
本発明の皮膚弾性向上材は、老化により低下した皮膚弾性の向上や皺を消失・予防することができ、顔面や腕部、脚部、胸部、頚部等の身体部分の緩み弛んだ肌を引き締めることができる。また、本発明の皮膚弾性向上用タンパク質溶液は、顔面や腕部、脚部、胸部、頚部等の身体部分において、老化により弾性が低下した皮膚の皮膚弾性を向上させたり、皺のある皮膚や緩み弛んだ肌を引き締めるために皮膚に投与する溶液として有効である。 The skin elasticity improving material of the present invention can improve and improve skin elasticity that has decreased due to aging, and can eliminate and prevent wrinkles, and tightens loose and loose skin on the body part such as the face, arms, legs, chest, and neck. be able to. In addition, the protein solution for improving skin elasticity of the present invention improves skin elasticity of skin whose elasticity has decreased due to aging in body parts such as the face, arms, legs, chest, and neck, It is effective as a solution administered to the skin to tighten loosened and loosened skin.
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