JP6490614B2 - インドキシル硫酸の測定方法 - Google Patents
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クレアチニンによる補正以外では、尿の比重によって補正してもよい。
このとき、マイクロデバイスとして検体収容部(光学セル)を2つ設けたものを採用し、一方の検体収容部を蛍光強度測定用、他方の検体収容部をクレアチニン濃度測定用として用いてもよい。この際のクレアチニン測定法としては、例えば、前記した紫外部測定法(220〜250nm)を用いることができる。
本発明にマイクロデバイスを適用することにより、微量の検体(測定試料)で蛍光測定を行うことが可能となる。さらに、光学セルの光路長(セルの厚み、液厚)を小さくすることにより、濃い尿であっても希釈を行わずに、尿そのものを測定試料とすることが可能となる。この際のセルの厚みとしては、例えば100〜500μm程度とすることができる。
HPLC法(Clin Chem. 1988 Nov;34(11):2264-7. Accumulation of indoxyl sulfate, an inhibitor of drug-binding, in uremic serum as demonstrated by internal-surface reversed-phase liquid chromatography. Niwa T1, Takeda N, Tatematsu A, Maeda K)にて、各検体のインドキシル硫酸濃度を測定した。
各尿検体をPBSで100倍に希釈し、蛍光測定用の検体(測定試料)を調製した。各測定試料200μLを前処理等することなくそのまま蛍光測定用マイクロプレート(Greiner bio-one、762077)の各穴に入れ、マイクロプレートリーダー(Spectra Max Gemini EM; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)にて蛍光強度を測定した。励起波長を280nmとし、発光波長(蛍光波長)320nm〜500nmの範囲でスキャンした。図1に各測定試料の蛍光パターンを示す。いずれの測定試料でも発光波長390nmに蛍光強度のピークがあった。
精製されたインドキシル硫酸(Aldrich社)を水に溶解して、濃度100μMのインドキシル硫酸標準原液を作製した。この標準原液を1/2倍ずつ段階希釈して、0.196μM〜100μMのインドキシル硫酸標準溶液を作製した。この標準溶液を上記(2)と同様の直接蛍光法(励起波長280nm、発光波長400nm)に供して蛍光強度を測定し、インドキシル硫酸濃度と蛍光強度との関係をグラフ化した。その結果、0.196μM〜100μMの範囲でインドキシル硫酸濃度と蛍光強度との間に相関関係があり、検量線を作成することができた。特に、0.196μM〜25μMの範囲において、高い直線性が得られた(図2)。
精製されたインドキシル硫酸(Aldrich社)を水に溶解して、濃度10μMのインドキシル硫酸標準原液を作製した。この標準原液を1/2倍ずつ段階希釈して、0.156μM〜10μMのインドキシル硫酸標準溶液を作製した。この標準溶液を上記(2)と同様の直接蛍光法(励起波長280nm、発光波長320nm〜500nm)に供して蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度から検量線を作成した。図3に、励起波長280nm、発光波長400nmの場合の検量線を示す。
各検体の100倍希釈液の蛍光強度を並行して測定し、検量線から各測定試料のインドキシル硫酸濃度を算出した。得られたインドキシル硫酸濃度値と、上記(1)で得られたHPLC法による測定値とを比較した。得られた蛍光強度の値について、発光波長ごとに直接蛍光法とHPLC法との相関係数を、EXCELソフトウェア(Microsoft社)のCORREL関数を用いて算出した。
Claims (5)
- 尿を測定試料とするインドキシル硫酸の測定方法であって、
前記測定試料が尿そのもの又は尿の希釈物であり、
励起波長を260〜300nmの範囲から選択し、発光波長を、選択した励起波長よりも80〜180nm大きい波長としたときの前記測定試料の蛍光強度から、前記測定試料におけるインドキシル硫酸の濃度を算出することを特徴とするインドキシル硫酸の測定方法。 - 前記発光波長を380〜420nmの範囲から選択することを特徴とする請求項1に記載のインドキシル硫酸の測定方法。
- 前記励起波長を270〜290nmの範囲から選択し、前記発光波長を390〜410nmの範囲から選択することを特徴とする請求項1又は2に記載のインドキシル硫酸の測定方法。
- 前記励起波長を270〜290nmの範囲から選択し、前記発光波長を400〜420nmの範囲から選択することを特徴とする請求項1又は2に記載のインドキシル硫酸の測定方法。
- インドキシル硫酸の濃度が0.2〜25μMの範囲内である前記測定試料を、蛍光測定に直接供することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のインドキシル硫酸の測定方法。
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