JP6474477B2 - Marker gene - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子の機能解析などのために、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法に関し、さらには、かかる方法により発見された新規のマーカー遺伝子、かかる方法を特定の遺伝子の破壊に適用することにより得られた、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株等に関する。 The present invention relates to a method for disrupting a specific gene in the genome of a uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus that is a kind of basidiomycete yeast for functional analysis of the gene and the like. The present invention relates to a novel marker gene, a uracil-requiring strain of Cryptococcus genus having an increased frequency of homologous recombination obtained by applying such a method to the destruction of a specific gene.
近年、遺伝子組換え技術の発展により、原核生物や真核生物を宿主として利用して産業上有用なタンパク質を大量に生産することが可能になった。原核生物の宿主としては、大腸菌などの細菌が一般的に使用されており、真核生物の宿主としては、サッカロミセス属やピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）などの酵母が一般的に使用されている。 In recent years, the development of gene recombination technology has made it possible to produce industrially useful proteins in large quantities using prokaryotes and eukaryotes as hosts. Bacteria such as Escherichia coli are generally used as prokaryotic hosts, and yeasts such as Saccharomyces and Pichia pastoris are generally used as eukaryotic hosts.
酵母は、一般的に細菌と比べて増殖速度が速いため、細菌よりも高い細胞密度で培養することができる。また、酵母は、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であるため、生産されたタンパク質の抽出精製工程を簡単にすることができる。このため、酵母は、遺伝子組換え技術による有用タンパク質の生産宿主として使用されることが多くなっている。 Since yeast generally has a higher growth rate than bacteria, it can be cultured at a higher cell density than bacteria. In addition, since yeasts can be easily separated from bacterial cells and culture fluids compared to bacteria, the process of extracting and purifying the produced protein can be simplified. For this reason, yeast is increasingly used as a production host for useful proteins by genetic recombination techniques.
かかる酵母の有用性に鑑み、出願人らは、種々の酵母の中から、αアミラーゼ、酸性キシラナーゼ、クチナーゼなどのタンパク質を大量に生産して細胞外に分泌する特性を有するクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｓ−２株（担子菌酵母の一種であり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１として平成７年９月５日に国際寄託済）を選抜した（非特許文献１参照）。 In view of the usefulness of such yeast, the applicants have been able to produce a large amount of proteins such as α-amylase, acid xylanase, and cutinase from various yeasts and secrete them outside the cell. S-2 strain (a kind of basidiomycetous yeast, which was deposited internationally on September 5, 1995 as deposit number FERM BP-10961 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)) Patent Document 1).
また、出願人らは、この菌株の細胞外タンパク質の生産性の高さを利用して、酵母が本来生産するタンパク質以外の異種タンパク質を大量生産することを提案し、さらに、外来遺伝子を導入された形質転換体の選抜を一層効率的にするため、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の自然変異により、ウラシル要求性株（Ｕ５株）を取得し、この菌株と、マーカー遺伝子としてのＵＲＡ５遺伝子を組合せて用いることによって、形質転換体を選抜する方法を提案した（非特許文献２参照）。 In addition, the applicants have proposed to mass-produce heterologous proteins other than the proteins originally produced by yeast using the high productivity of extracellular proteins of this strain. In order to make the selection of transformants more efficient, Cryptococcus sp. A method for selecting a transformant by obtaining a uracil auxotrophic strain (U5 strain) by natural mutation of the S-2 strain and using this strain in combination with the URA5 gene as a marker gene has been proposed (non-) Patent Document 2).
Ｕ５株を用いることによる異種タンパク質の発現について、様々な菌株からラッカーゼ遺伝子を取得し、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株を宿主として組換え発現効率を検討したところ、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びガエウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）由来のラッカーゼ遺伝子を組換え発現させた場合、ピキア・パストリスを宿主として用いた場合より大幅に高い生産性を示すことが記載されている（非特許文献３参照）。 Regarding the expression of heterologous proteins by using the U5 strain, laccase genes were obtained from various strains, and Cryptococcus sp. S-2. Recombinant expression efficiency was examined using the U5 strain as a host. When the laccase gene derived from Trametes versicolor and Gaeumanomyces graminis was recombinantly expressed, Pichia pastoris was used as the host. It is described that the productivity is significantly higher (see Non-Patent Document 3).
また、特許文献１には、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼについて、特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼについて、コドンユーセージをクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株に合わせて最適化し、さらに分泌シグナル配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株由来の配列に置換することによって、効率的に酵素を発現させることが可能になることが記載されている。 Patent Document 1 discloses peroxidase derived from horseradish, and Patent Document 2 discloses a codon usage for flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae. Optimized for the S-2 strain, and the secretory signal sequence was further changed to Cryptococcus sp. It is described that the enzyme can be efficiently expressed by substituting the sequence derived from the S-2 strain.
上記のように、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株は、異種タンパク質を効率的に発現させるための宿主として、ますます有用になってきている。 As described above, cryptococcus sp. The S-2 strain has become increasingly useful as a host for efficiently expressing heterologous proteins.
一方、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株における遺伝子組換えマーカー遺伝子としては、ウラシル要求性遺伝子マーカーであるＵＲＡ５遺伝子が報告されているのみである。ＵＲＡ５遺伝子は、ｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードしており、本遺伝子を遺伝子マーカーとして用いて、ウラシル要求性株であるＵ５株に形質転換を行うことにより、ウラシル要求性の有無を指標として形質転換体を選抜することが可能である。 On the other hand, cryptococcus sp. As a gene recombination marker gene in the S-2 strain, only the URA5 gene, which is a uracil-requiring gene marker, has been reported. The URA5 gene encodes orophosphate phosphoryltransferase, and this gene is used as a gene marker to transform the U5 strain, which is a uracil auxotrophic strain, so that the transformant can be expressed using the presence or absence of uracil auxotrophy as an index. It is possible to select.
また、５−ＦＯＡ（５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ）は、ｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを合成する酵母細胞に対してのみ致死作用を示すため、５−ＦＯＡの存在下で培養を行うことにより、ウラシル要求性株のポジティブスクリーニングを行うことが可能である（非特許文献４参照）。 Moreover, since 5-FOA (5-Fluoroacid) exhibits a lethal action only on yeast cells that synthesize orophosphate phosphoryltransferase, positive uracil-requiring strains can be obtained by culturing in the presence of 5-FOA. Screening can be performed (see Non-Patent Document 4).
この５−ＦＯＡの性質を利用して、ピキア・パストリスにおけるＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ遺伝子破壊法が報告されている（非特許文献５参照）。この方法では、まず、ウラシル要求性マーカー遺伝子とターゲット塩基配列を連結して宿主ゲノム中に導入する。次に、導入したターゲット塩基配列と、宿主の染色体上に存在する塩基配列との間で相同組換えを起こさせ、ウラシル要求性マーカー遺伝子とともにターゲット配列を除去する。この方法によれば、ウラシル要求性マーカー遺伝子をリサイクルすることが可能になるため、遺伝子の多重破壊が可能になる。 Using this 5-FOA property, a Pop-in / Pop-out gene disruption method in Pichia pastoris has been reported (see Non-Patent Document 5). In this method, first, a uracil auxotrophic marker gene and a target base sequence are linked and introduced into the host genome. Next, homologous recombination is caused between the introduced target base sequence and the base sequence present on the host chromosome, and the target sequence is removed together with the uracil-requiring marker gene. According to this method, the uracil auxotrophic marker gene can be recycled, so that multiple gene disruption is possible.
しかし、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株に外来遺伝子、若しくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来の塩基配列を導入した場合、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の染色体上にランダムに遺伝子が導入されることが非特許文献２に示されており、ターゲットとする位置に外来遺伝子を導入することは非常に困難である。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株において相同組換え効率が低い原因は、外来遺伝子の導入時に、非相同末端結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ Ｊｏｉｕｎｉｎｇ）が起こっているためであると考えられ、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株には非相同組換え機構が備わっていると考えられる。 However, cryptococcus sp. S-2 strain contains a foreign gene or cryptococcus sp. When the base sequence derived from S-2 was introduced, cryptococcus sp. Non-patent document 2 shows that a gene is randomly introduced onto the chromosome of the S-2 strain, and it is very difficult to introduce a foreign gene at a target position. Cryptococcus sp. The reason why the homologous recombination efficiency is low in the S-2 strain is considered to be that non-homologous end joining occurs at the time of introduction of a foreign gene, and cryptococcus sp. S-2 strain is considered to have a heterologous recombination mechanism.
真核生物において、二本鎖ＤＮＡの切断が修復される過程で働く非相同末端結合機構は、Ｋｕ７０―Ｋｕ８０ヘテロダイマー、ＤＮＡリガーゼＩＶ−Ｘｒｃｃ４複合体を介して進行することが報告されており（非特許文献５参照）、Ｋｕ遺伝子変異体において、ターゲッティング頻度が向上することが、アカパンカビＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（非特許文献７、特許文献３参照）、コウジカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ（非特許文献８、特許文献４参照）などの真核生物において報告されている。 In eukaryotes, it has been reported that the non-homologous end joining mechanism that works in the process of repairing double-strand DNA breaks proceeds via the Ku70-Ku80 heterodimer, DNA ligase IV-Xrcc4 complex ( In the Ku gene mutant, the targeting frequency is improved in the red spider mold Neurospora crassa (see Non-Patent Document 7, Patent Document 3), Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae (Non-Patent Document 8, Patent Document) 4)) in eukaryotes.
さらに、非特許文献９には、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）において、遺伝子の相同組換え効率が非常に低いことが示されており、Ｋｕ遺伝子の破壊により、遺伝子の相同組換え効率が飛躍的に向上したことが示されている。 Furthermore, Non-Patent Document 9 shows that the homologous recombination efficiency of the gene is very low in Cryptococcus neoformans, which is a kind of basidiomycetous yeast. It has been shown that homologous recombination efficiency has improved dramatically.
上述するように、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株は、異種タンパク質発現の宿主として非常に有用な微生物であり、この菌株の特性のさらなる改良を目的とした育種のために、遺伝子の機能解析は重要である。 As described above, cryptococcus sp. The S-2 strain is a very useful microorganism as a host for expressing a heterologous protein, and gene function analysis is important for breeding with the aim of further improving the characteristics of this strain.
しかしながら、クリプトコッカス・ネオホルマンスが有性世代を持つのに対し、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株はこれまでのところ有性世代が確認されていない。そのために、菌株間の交配等の手段によって、新たな変異株を作製することができず、遺伝学的研究が困難であり、産業的に極めて有用な菌であるにも関わらず、遺伝的解析は遅れていた。 However, Cryptococcus neoformans has a sexual generation, whereas Cryptococcus sp. The sexual generation of S-2 strain has not been confirmed so far. Therefore, new mutants cannot be produced by means such as crossing between strains, genetic research is difficult, and genetic analysis is extremely useful despite being industrially extremely useful. Was late.
このような有性世代を有さない生物の遺伝子の機能解析には、遺伝子ターゲッティングによる遺伝子破壊あるいは遺伝子置換が特に重要な技術となるが、そのために必要な遺伝子マーカーは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株についてはウラシル要求性マーカーが取得されているのみであった。さらに、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の相同組換え頻度は非常に低いものであるため、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株を用いて遺伝子破壊株を取得すること、あるいは任意の位置での相同組換え株を取得することは極めて困難であった。 For the functional analysis of a gene of an organism having no sexual generation, gene disruption or gene replacement by gene targeting is a particularly important technique, and a gene marker necessary for this purpose is cryptococcus sp. Only the uracil-requiring marker was acquired for the S-2 strain. Furthermore, cryptococcus sp. Since the homologous recombination frequency of the S-2 strain is very low, Cryptococcus sp. It was extremely difficult to obtain a gene-disrupted strain using the S-2 strain, or to obtain a homologous recombination strain at an arbitrary position.
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的はクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の新規の遺伝子マーカー、効率的な遺伝子破壊方法、及びかかる方法を利用した相同組換えの頻度の増大方法を提供することにある。 The present invention has been invented in view of the current state of the prior art, and the object thereof is cryptococcus sp. It is to provide a novel gene marker of S-2 strain, an efficient gene disruption method, and a method for increasing the frequency of homologous recombination using such a method.
本発明者らは、上記目的を達成するために、他の酵母における遺伝子破壊法のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株への応用について鋭意検討した結果、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株においても、ピキア・パストリスと同様に、ウラシル要求性マーカー遺伝子を用いたＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ法により、効率的に遺伝子を破壊することができることを見出した。また、かかる方法を用いて、形質転換体の選抜に有用な新たな遺伝子マーカーを取得することができること、さらには、かかる方法を用いて、非相同末端結合機構に関与するＫｕ遺伝子を破壊することにより、相同組換えの頻度を増大させることができることを見出し、本発明の完成に至った。 In order to achieve the above-mentioned object, the inventors of the present invention have used a method for gene disruption in other yeasts such as Cryptococcus sp. As a result of intensive studies on application to the S-2 strain, Cryptococcus sp. In the S-2 strain, as in Pichia pastoris, it was found that the gene can be efficiently destroyed by the Pop-in / Pop-out method using a uracil-requiring marker gene. In addition, a new gene marker useful for selection of transformants can be obtained using such a method, and further, Ku gene involved in the non-homologous end joining mechanism can be destroyed using such a method. Thus, it was found that the frequency of homologous recombination can be increased, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は、以下の［１］〜［７］の構成を有するものである。
［１］以下の工程を含むことを特徴とする、クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法：
（１）前記特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と、ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と、前記特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部とをこの順序で含み、さらに、前記特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列の間及び／又は前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と前記特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部の間に、前記特定の遺伝子の５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部が挿入されている遺伝子コンストラクトを作製する工程；
（２）前記ウラシル要求性の菌株を前記遺伝子コンストラクトで形質転換し、ウラシル非含有培地で培養して、前記菌株のゲノム中の前記特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって前記遺伝子コンストラクトが挿入された第１の形質転換体を選抜する工程；及び
（３）５−ＦＯＡを含有する培地で前記第１の形質転換体を培養し、相同配列の染色体内部での相同組換えによりウラシル要求性マーカー遺伝子がゲノム中から除去された第２の形質転換体を選抜する工程。
［２］クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１として国際寄託されているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］配列番号１で示される塩基配列、又は配列番号１で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
［４］配列番号２で示される塩基配列、又は配列番号２で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列をプロモーターとしてさらに含むことを特徴とする、［３］に記載のマーカー遺伝子。
［５］相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法であって、［１］又は［２］に記載の方法によってクリプトコッカス属の菌株のゲノム中のＫｕ遺伝子を破壊する工程を含むことを特徴とする方法。
［６］クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１として国際寄託されているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株であり、Ｋｕ遺伝子が、配列番号３で示される塩基配列、又は配列番号３で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつＫｕ遺伝子活性を有する塩基配列からなることを特徴とする、［５］に記載の方法。
［７］相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株であって、［５］又は［６］に記載の方法により得られることを特徴とする菌株。
That is, the present invention has the following configurations [1] to [7].
[1] A method for disrupting a specific gene in the genome of a cryptococcus uracil-requiring strain characterized by comprising the following steps:
(1) including at least a part of the 5 ′ sequence of the specific gene, a uracil-requiring marker gene sequence, and at least a part of the 3 ′ sequence of the specific gene in this order; Between at least a part of the 5′-side sequence of the gene and the uracil-requiring marker gene sequence and / or between the uracil-requiring marker gene sequence and at least a part of the 3′-side sequence of the specific gene, Creating a gene construct into which at least another part of the 5 'or 3' sequence of a specific gene has been inserted;
(2) The uracil-requiring strain is transformed with the gene construct, cultured in a uracil-free medium, and the gene is subjected to double homologous recombination at the site where the specific gene is present in the genome of the strain. Selecting the first transformant having the construct inserted therein; and (3) culturing the first transformant in a medium containing 5-FOA, and performing homologous recombination within the chromosome of the homologous sequence. A step of selecting a second transformant from which the uracil auxotrophic marker gene has been removed from the genome.
[2] A uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus is Cryptococcus sp., Which has been internationally deposited as FERM BP-10961. S-2. The method according to [1], which is a U5 strain.
[3] A protein having 90% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase activity A marker gene comprising a nucleotide sequence encoding
[4] The promoter further comprises, as a promoter, a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence having 90% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having promoter activity. The marker gene according to [3].
[5] A method for obtaining a Cryptococcus uracil-requiring strain having an increased frequency of homologous recombination, wherein the Ku gene in the genome of the Cryptococcus strain is obtained by the method according to [1] or [2] A method comprising the step of destroying.
[6] A uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus is Cryptococcus sp., Which has been internationally deposited as FERM BP-10961. S-2. It is a U5 strain, and the Ku gene has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and having Ku gene activity. The method according to [5], wherein
[7] A uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus having an increased frequency of homologous recombination, wherein the strain is obtained by the method according to [5] or [6].
本発明によれば、機能解析や改変の対象となる標的遺伝子の破壊や相同組換え、及び形質転換体の選択を効率的に行うことができるため、クリプトコッカス属の菌株における遺伝子の多重破壊や遺伝子組換えの効率を飛躍的に向上させることができる。従って、本発明は、クリプトコッカス属の菌株の遺伝子の機能解析やそれに基づく育種のために極めて有用である。 According to the present invention, it is possible to efficiently perform target gene destruction or homologous recombination, and selection of transformants for functional analysis and modification, so that multiple gene disruption and genes in cryptococcus strains can be performed. The efficiency of recombination can be dramatically improved. Therefore, the present invention is extremely useful for the functional analysis of the gene of the genus Cryptococcus and the breeding based thereon.
以下、本発明の遺伝子破壊方法、かかる方法によって得られるマーカー遺伝子、かかる方法を特定の遺伝子の破壊に適用することにより得られる、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法、及びかかる取得方法により得られる菌株について説明する。 Hereinafter, a gene disruption method of the present invention, a marker gene obtained by such a method, a uracil-requiring strain of Cryptococcus genus having an increased frequency of homologous recombination obtained by applying this method to the disruption of a specific gene A method for obtaining the strain and a strain obtained by the obtaining method will be described.
本発明は、遺伝子の機能解析などのためにクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法を提供するものである。この方法は、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを作製する工程（１）、このコンストラクトを用いてＰｏｐ−ｉｎを行い、特定の遺伝子を破壊する工程（２）、及びＰｏｐ−ｏｕｔを行い、ウラシル要求性マーカー遺伝子を除去する工程（３）を含むものである。 The present invention provides a method for disrupting a specific gene in the genome of a uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus for gene function analysis and the like. In this method, a step (1) for producing a Pop-in / Pop-out construct, a step (2) for performing Pop-in using this construct to destroy a specific gene, a Pop-out, and uracil It includes a step (3) of removing the requirement marker gene.
工程（１）では、特定の遺伝子コンストラクト（Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクト）を作製するが、この遺伝子コンストラクトは、特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と、ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と、特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部とをこの順序で含むことが必要であり、さらに、特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部とウラシル要求性マーカー遺伝子配列の間及び／又はウラシル要求性マーカー遺伝子配列と特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部の間に、特定の遺伝子の５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部が挿入されていることが必要である。 In step (1), a specific gene construct (Pop-in / Pop-out construct) is prepared. This gene construct is composed of at least a part of the 5′-side sequence of a specific gene and a uracil-requiring marker gene sequence. And at least part of the 3 'sequence of the specific gene in this order, and between at least part of the 5' sequence of the specific gene and the uracil-requiring marker gene sequence and / Or at least a part of the 5 ′ side of the specific gene or another part of the 3 ′ side of the specific gene is inserted between the uracil-requiring marker gene sequence and at least a part of the 3 ′ side sequence of the specific gene is necessary.
工程（１）によって作製されるＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの一例は、図１の下側に示される三つのコンストラクト（ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ，ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ，及びａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂ）である。図１からわかるように、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトは、破壊対象の特定の遺伝子のＯＲＦの代わりにウラシル要求性マーカー遺伝子のＯＲＦが、この特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と３′側配列の少なくとも一部の間に挟まれた構造を有する。これは、工程（２）において、相同組換えによって特定の遺伝子を破壊するためである。また、本来存在する５′側又は３′側配列（の少なくとも一部）に加えて、５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部が、本来存在する５′側又は３′側配列（の少なくとも一部）とウラシル要求性マーカー遺伝子のＯＲＦとの間に挿入されている。これは、工程（３）において、５′側又は３′側配列の少なくとも一部と、５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部との間で、相同配列の染色体内部での相同組換えを生じさせて、ウラシル要求性マーカー遺伝子をゲノム中から除去するためである。 An example of the Pop-in / Pop-out construct produced by the step (1) is the three constructs (ade1-Upop1000a, ade1-Upop500a, and ade1-Upop1000b) shown on the lower side of FIG. As can be seen from FIG. 1, in the Pop-in / Pop-out construct, the ORF of the uracil-requiring marker gene is used instead of the ORF of the specific gene to be destroyed, and at least a part of the 5 ′ sequence of this specific gene. And a structure sandwiched between at least a part of the 3'-side sequence. This is because a specific gene is destroyed by homologous recombination in the step (2). In addition to the 5 ′ or 3 ′ side sequence (at least a part thereof) which is originally present, at least another part of the 5 ′ side or 3 ′ side sequence is a 5 ′ side or 3 ′ side sequence which is originally present. (At least a part thereof) and the ORF of the uracil requirement marker gene. This is because, in step (3), homology within the chromosome of the homologous sequence between at least a part of the 5 'or 3' sequence and at least another part of the 5 'or 3' sequence. This is because recombination occurs to remove the uracil auxotrophic marker gene from the genome.
「ウラシル要求性マーカー遺伝子」は、ウラシルの合成に関与する遺伝子であり、例えばｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードする遺伝子が挙げられる。その具体的な例としては、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＵＲＡ５遺伝子を挙げることができる。この遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ４７０５２６．１に公開されている。 The “uracil auxotrophic marker gene” is a gene involved in the synthesis of uracil, and examples thereof include a gene encoding orophosphate phosphoryltransferase. Specific examples thereof include Cryptococcus sp. Mention may be made of the URA5 gene of S-2. The sequence of this gene is published in GenBank: AB470526.1.
ＵＲＡ５遺伝子がコードするｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによって、５−ＦＯＡ（フルオロオロチン酸）は分解される。その結果、ｏｒｏｔａｔｅの代わりにウラシル合成経路に取り込まれ、最終的に正常なＲＮＡの合成を阻害し、細胞の成育を抑制する。一方、ＵＲＡ５遺伝子が抑制または除去された菌株は５−ＦＯＡを分解しないため、５−ＦＯＡの存在下でも生育することができる。従って、５−ＦＯＡを用いることで、ウラシル要求性マーカーが抑制または除去された菌株を選抜することが可能である。 5-FOA (fluoroorotic acid) is degraded by orophosphate phosphoryltransferase encoded by the URA5 gene. As a result, it is incorporated into the uracil synthesis pathway instead of orotate, and finally inhibits normal RNA synthesis and suppresses cell growth. On the other hand, a strain in which the URA5 gene has been suppressed or removed does not degrade 5-FOA and can therefore grow even in the presence of 5-FOA. Therefore, by using 5-FOA, it is possible to select a strain in which the uracil requirement marker is suppressed or removed.
工程（２）では、ウラシル要求性の菌株を遺伝子コンストラクトで形質転換し、ウラシル非含有培地で培養して、菌株のゲノム中の特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって遺伝子コンストラクトが挿入された第１の形質転換体を選抜する。これは、一般的な形質転換工程と同様である。 In step (2), a uracil-requiring strain is transformed with a gene construct, cultured in a uracil-free medium, and the gene construct is formed by double homologous recombination at a site where a specific gene is present in the genome of the strain. The inserted first transformant is selected. This is the same as the general transformation process.
工程（１）で作製された遺伝子コンストラクトは、ウラシル要求性マーカー遺伝子を含む。従って、工程（２）で、形質転換処理後の菌体をウラシル非含有培地で培養すると、菌株のゲノム中の特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって遺伝子コンストラクトが挿入された形質転換体のみが生育することができ、目的とする形質転換体（第１の形質転換体）を選抜することができる。 The gene construct produced in step (1) contains a uracil auxotrophic marker gene. Therefore, when the transformed bacterial cells are cultured in a uracil-free medium in step (2), the trait in which the gene construct is inserted by double homologous recombination at the site where the specific gene exists in the genome of the strain. Only the transformant can grow and the target transformant (first transformant) can be selected.
工程（３）では、５−ＦＯＡを含有する培地で第１の形質転換体を培養し、相同配列の染色体内部での相同組換えによりウラシル要求性マーカー遺伝子がゲノム中から除去された第２の形質転換体を選抜する。 In step (3), the first transformant is cultured in a medium containing 5-FOA, and the uracil-requiring marker gene is removed from the genome by homologous recombination inside the chromosome of the homologous sequence. A transformant is selected.
工程（２）で菌株のゲノム中に遺伝子コンストラクトが挿入されたが、この遺伝子コンストラクトは、５′側配列及び３′側配列の少なくとも一方を少なくとも部分的に重複して含むため、必ずしも安定ではない。従って、図４に示されるように、形質転換後の培養中に、これらの相同配列の間で染色体内部での相同組換えが一定頻度で生じ、それによりウラシル要求性マーカー遺伝子が除去された形質転換体が一定頻度で出現する。これがＰｏｐ−ｏｕｔと称される現象である。一方、上述の通り、５−ＦＯＡの存在下では、ウラシル要求性マーカー遺伝子を有さない菌株のみが生育することができる。従って、工程（２）の後の形質転換体を工程（３）において５−ＦＯＡを含む培地中で培養することにより、染色体内部での相同組換えが生じてウラシル要求性マーカー遺伝子が除去された形質転換体（第２の形質転換体）を選抜することができる。この形質転換体は、特定の遺伝子が破壊されており、しかもウラシル要求性マーカー遺伝子が除去されているため、遺伝子の多重破壊が可能であり、遺伝子の機能解析や育種のために極めて有用である。 In step (2), a gene construct was inserted into the genome of the strain. This gene construct is not necessarily stable because it contains at least one of the 5 ′ sequence and the 3 ′ sequence at least partially overlapping. . Therefore, as shown in FIG. 4, during the culture after transformation, homologous recombination within these chromosomes occurs at a certain frequency between these homologous sequences, thereby eliminating the uracil-required marker gene. The converter appears at a certain frequency. This is a phenomenon called Pop-out. On the other hand, as described above, in the presence of 5-FOA, only a strain having no uracil-requiring marker gene can grow. Therefore, by culturing the transformant after step (2) in a medium containing 5-FOA in step (3), homologous recombination inside the chromosome occurred and the uracil-required marker gene was removed. A transformant (second transformant) can be selected. Since this transformant has a specific gene disrupted and the uracil-required marker gene has been removed, it is possible to perform multiple gene disruptions and is extremely useful for functional analysis and breeding of genes. .
クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株は、特に限定されないが、例えばクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２，クリプトコッカス・リクエファシエンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ），クリプトコッカス・フラヴス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｕｓ），クリプトコッカス・カルバツス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）などから自然変異により取得されるものを使用することができる。これらの菌は、市販品として、または、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの公的寄託機関から入手することができる。特に好ましいクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１として国際寄託されているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株である。 Although the uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus is not particularly limited, for example, Cryptococcus sp. S-2, Cryptococcus lifaciens, Cryptococcus flavus, Cryptococcus curvatus, etc. which can be obtained by natural mutation can be used. These bacteria can be obtained as commercial products or from public deposit institutions such as the American Type Culture Collection (ATCC). A particularly preferred uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus is Cryptococcus sp., Which is internationally deposited as FERM BP-10961. S-2. U5 stock.
また、本発明は、配列番号１で示される塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子を提供する。 The present invention also provides a marker gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
配列番号１で示される塩基配列は、Ａｄｅ１遺伝子に相当する。この遺伝子は、アデニンの合成に関与するホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子である。この遺伝子がコードするアミノ酸配列は、既に知られているクリプトコッカス・ネオホルマンスのＡｄｅ１遺伝子に対して７７％の同一性を有する。 The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the Ade1 gene. This gene is a gene encoding a phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase involved in the synthesis of adenine. The amino acid sequence encoded by this gene has 77% identity to the already known Cryptococcus neoformans Ade1 gene.
本発明では、マーカー遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列のものに限定されず、配列番号１で示される塩基配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列（いわゆる均等の範囲の配列）も包含する。かかる均等の範囲の配列は、配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列又はその一部のプローブとして、ストリンジェントな条件（例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件）下でハイブリダイゼーションを行い、得られた塩基配列を遺伝子発現させてその機能を確認することにより、容易に得ることができる。なお、塩基配列間の同一性は、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、Ｂｌａｓｔを用いて決定することができる。 In the present invention, the marker gene is not limited to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, but has 90% or more, preferably 95% or more identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, In addition, a base sequence encoding a protein having phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase activity (so-called equivalent range of sequences) is also included. Such a sequence in the equivalent range has a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a probe of a part thereof as stringent conditions (for example, at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C., a sodium concentration of 150 to 900 mM). And preferably 600 to 900 mM and pH 6 to 8), and the resulting base sequence is gene-expressed to confirm its function. The identity between base sequences can be determined using an algorithm known to those skilled in the art, for example, Blast.
配列番号１は、Ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦのみの配列であるため、配列番号１又はその均等の範囲の配列を実際にマーカー遺伝子として機能させるためには、その５′側に適切なプロモーター配列を配置することが望ましい。かかるプロモーター配列としては、従来公知のいかなるものも使用することができるが、特に配列番号２で示される塩基配列、又は配列番号２で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列（いわゆる均等の範囲の配列）を使用することが、マーカー遺伝子の全長を最小限に抑えながらもマーカー遺伝子としての機能を奏させるために好ましい。なお、均等の範囲の配列の取得方法は、配列番号１の場合と同様である。配列番号２は、「ＴＥＦ１プロモーター」と称されるものであり、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａをコードする遺伝子の５′側の塩基配列である。 Since SEQ ID NO: 1 is an ORF-only sequence of the Ade1 gene, an appropriate promoter sequence is placed on the 5 ′ side in order to actually function the sequence of SEQ ID NO: 1 or an equivalent range thereof as a marker gene. It is desirable. As the promoter sequence, any conventionally known promoter sequence can be used, and in particular, it has 90% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. In addition, it is preferable to use a base sequence having promoter activity (so-called an equivalent range of sequences) in order to exhibit a function as a marker gene while minimizing the total length of the marker gene. The method for obtaining an array in an equal range is the same as in the case of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 is referred to as “TEF1 promoter” and is the 5 ′ base sequence of a gene encoding translation elongation factor 1 alpha.
「ＴＥＦ１プロモーター」は、遺伝子の発現のために誘導剤を必要としないため、形質転換に用いるマーカー遺伝子（例えば、上述したＡｄｅ１遺伝子）や、異種タンパク質遺伝子（例えば、特許文献２に示されるアスペルギルス・オリゼ由来フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ））などの発現に好適である。 Since “TEF1 promoter” does not require an inducing agent for gene expression, a marker gene used for transformation (for example, the above-mentioned Ade1 gene) or a heterologous protein gene (for example, Aspergillus It is suitable for expression of oryzae-derived flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase (FAD-GDH)) and the like.
また、本発明は、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法を提供する。この方法は、上述の遺伝子破壊方法によってクリプトコッカス属の菌株のゲノム中のＫｕ遺伝子を破壊する工程を含むものである。 The present invention also provides a method for obtaining a uracil-requiring strain of Cryptococcus having an increased frequency of homologous recombination. This method includes the step of disrupting the Ku gene in the genome of a cryptococcus strain by the gene disruption method described above.
Ｋｕ遺伝子は、真核生物において、二本鎖ＤＮＡの切断が修復される過程で働く非相同末端結合機構に関与する。従って、Ｋｕ遺伝子を本発明の方法により破壊することにより、非相同末端結合機構を抑制することができ、相同組換えの頻度を増大することができる。 The Ku gene is involved in a non-homologous end joining mechanism that works in the process of repairing double-strand DNA breaks in eukaryotes. Therefore, by destroying the Ku gene by the method of the present invention, the non-homologous end joining mechanism can be suppressed and the frequency of homologous recombination can be increased.
Ｋｕ遺伝子としては、従来公知のいかなるものも使用することができるが、特に配列番号３で示される塩基配列、又は配列番号３で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつＫｕ遺伝子活性を有する塩基配列（いわゆる均等の範囲の配列）を使用することが好ましい。なお、均等の範囲の配列の取得方法は、配列番号１の場合と同様である。 As the Ku gene, any conventionally known gene can be used, and in particular, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 90% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, In addition, it is preferable to use a base sequence having a Ku gene activity (so-called equivalent range of sequences). The method for obtaining an array in an equal range is the same as in the case of SEQ ID NO: 1.
配列番号３のＫｕ遺伝子は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株のＫｕ７０遺伝子に相当する。この遺伝子がコードするアミノ酸配列は、既に知られているクリプトコッカス・ネオホルマンスのＫｕ７０遺伝子に対して５９％の同一性を有する。このように、この遺伝子は既知の配列に対して同一性が低く、機能未知の配列であった。 The Ku gene of SEQ ID NO: 3 is a Cryptococcus sp. It corresponds to Ku70 gene of S-2 strain. The amino acid sequence encoded by this gene has 59% identity to the already known Cryptococcus neoformans Ku70 gene. Thus, this gene was low in identity to the known sequence and was a sequence whose function was unknown.
また、本発明は、上述の方法により得られる、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を提供する。この菌株は、非相同組換え機構が抑制されているため、遺伝子ターゲッティング法又は標的遺伝子組換え法（細胞にＤＮＡを導入し、相同組換え体を選択することにより、標的とする特定遺伝子に突然変異を導入する方法）において非常に高いターゲッティング率が得られるものである。従って、かかる菌株は、遺伝子破壊（ノックアウト）株、遺伝子欠失株、遺伝子置換又は挿入株、又は染色体改変株等の、所望の各種目的株を容易に取得するために極めて有用である。 The present invention also provides a uracil-requiring strain of the genus Cryptococcus having an increased frequency of homologous recombination obtained by the method described above. In this strain, since the heterologous recombination mechanism is suppressed, the gene targeting method or the target gene recombination method (by introducing DNA into the cell and selecting the homologous recombination, the target gene is suddenly In the method of introducing mutation, a very high targeting rate can be obtained. Therefore, such a strain is extremely useful for easily obtaining various desired strains such as a gene disruption (knockout) strain, a gene deletion strain, a gene substitution or insertion strain, or a chromosome modification strain.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（Ａ）Ａｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの作製
クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子破壊株を作製するために、Ａｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを作製した。Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの作製には、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子の上流約２ｋｂｐと、下流約２ｋｂｐを使用した。Ａｄｅ１遺伝子の上流配列を配列番号４に、Ａｄｅ１遺伝子の下流配列を配列番号５に示す。
(A) Production of Pop-in / Pop-out construct of Ade1 gene Cryptococcus sp. In order to produce an Ade1 gene disrupted strain of S-2, a Pop-in / Pop-out construct of the Ade1 gene was produced. For the production of the Pop-in / Pop-out construct, cryptococcus sp. About 2 kbp upstream and about 2 kbp downstream of the S-2 Ade1 gene were used. The upstream sequence of the Ade1 gene is shown in SEQ ID NO: 4, and the downstream sequence of the Ade1 gene is shown in SEQ ID NO: 5.
まず、ａｄｅ１遺伝子の上流約２ｋｂｐとＡｄｅ１遺伝子のＯＲＦと、ａｄｅ１遺伝子の下流約２ｋｂｐを含む領域を、配列番号６（Ａｄｅ１Ｐ２ｋ＿Ｆ）のプライマーと、配列番号７（Ａｄｅ１Ｔ２ｋ＿Ｒ）のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター中にクローニングした。インサートが導入されたプラスミドを取得し、ｐＣＲ−ａｄｅ１と命名した。 First, a region including about 2 kbp upstream of the ade1 gene and ORF of the Ade1 gene and about 2 kbp downstream of the ade1 gene is amplified by PCR using a primer of SEQ ID NO: 6 (Ade1P2k_F) and a primer of SEQ ID NO: 7 (Ade1T2k_R) And cloned into the pCR-Blunt vector using Zero Blunt (registered trademark) PCR Cloning Kit (Invitrogen). A plasmid into which the insert was introduced was obtained and named pCR-ade1.
次に、ｐＣＲ−ａｄｅ１ベクターから、配列番号８（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｆ）のプライマーと、配列番号９（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ）のプライマーを用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ部分を除去したＰＣＲ産物を作製した。さらに、非特許文献２に記載のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２組換えベクターであるｐＣｓＵＲＡ５から、配列番号１０（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｆ）のプライマーと配列番号１１（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｒ）のプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株由来のＵｒａ５遺伝子を増幅した。このようにして作製した２つのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて融合させ、ａｄｅ１遺伝子が破壊されたベクターであるｐＣＲ−ａｄｅ１−ｕｒａ５を作製した。 Next, from the pCR-ade1 vector, inverse PCR was performed using the primer of SEQ ID NO: 8 (pCR-ade1-PT-F) and the primer of SEQ ID NO: 9 (pCR-ade1-PT-R), and the ade1 gene A PCR product from which the ORF portion was removed was prepared. Furthermore, Cryptococcus sp. From the S-2 recombinant vector pCsURA5, PCR was performed using the primer of SEQ ID NO: 10 (ura5-ade1-F) and the primer of SEQ ID NO: 11 (ura5-ade1-R), and Cryptococcus sp. The Ura5 gene derived from the S-2 strain was amplified. The two PCR products thus prepared were fused using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to prepare pCR-ade1-ura5, a vector in which the ade1 gene was disrupted. .
次に、ｐＣＲ−ａｄｅ１−ｕｒａ５ベクターから、以下の３通りのＰＣＲ及びｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。
すなわち、配列番号８（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｆ）のプライマーと配列番号９（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物と、配列番号１０（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｆ）と配列番号１１（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応させて、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａベクターを作製し、
配列番号１５（Ａｄｅ１−５００Ｆ）のプライマーと配列番号１２（Ｕｒａ５ ７０８−６８８Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物と、配列番号１６（Ａｄｅ１−１４３６Ｆ）と配列番号１７（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ３）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応させて、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａベクターを作製し、
配列番号１８（Ａｄｅ１−１０００Ｆ）のプライマーと配列番号１２（Ｕｒａ５ ７０８−６８８Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物と、配列番号１３（Ａｄｅ１＋９３６Ｆ）と配列番号１９（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ４）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応させて、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂベクターを作製した。
Next, the following three PCR and in-fusion reactions were performed from the pCR-ade1-ura5 vector.
That is, the PCR product amplified with the primer of SEQ ID NO: 8 (pCR-ade1-PT-F) and the primer of SEQ ID NO: 9 (pCR-ade1-PT-R), SEQ ID NO: 10 (ura5-ade1-F) and the sequence A PCR product amplified with the primer of No. 11 (ura5-ade1-R) was subjected to an in-fusion reaction to prepare an Ade1-Upop1000a vector,
PCR product amplified with the primer of SEQ ID NO: 15 (Ade1-500F) and the primer of SEQ ID NO: 12 (Ura5 708-688R), SEQ ID NO: 16 (Ade1-1436F) and SEQ ID NO: 17 (pCR-ade1-PT-R3) The PCR product amplified with the primers of in-fusion was subjected to an in-fusion reaction to prepare an Ade1-Upop500a vector,
PCR product amplified with the primer of SEQ ID NO: 18 (Ade1-1000F) and the primer of SEQ ID NO: 12 (Ura5 708-688R), the primer of SEQ ID NO: 13 (Ade1 + 936F) and SEQ ID NO: 19 (pCR-ade1-PT-R4) The PCR product amplified in step 1 was subjected to an in-fusion reaction to prepare an Ade1-Upop1000b vector.
このようにして、Ａｄｅ１遺伝子の上流、ＯＲＦ、及び下流を含むｐＣＲ−ａｄｅ１ベクター、Ａｄｅ１の破壊ベクターであるｐＣＲ−ａｄｅ１−ｕｒａ５、並びにＡｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔベクターであるＡｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ，Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ，及びＡｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂをそれぞれ完成させた。これらのベクター（遺伝子コンストラクト）の詳細な構造を図１に示す。 Thus, pCR-ade1 vector including upstream, ORF and downstream of Ade1 gene, pCR-ade1-ura5 which is a disruption vector of Ade1, and Ade1-Upop1000a which is a Pop-in / Pop-out vector of Ade1 gene , Ade1-Upop500a, and Ade1-Upop1000b were completed. The detailed structure of these vectors (gene constructs) is shown in FIG.
（Ｂ）Ａｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ
組換え宿主としては、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株を使用した。本菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１として国際寄託されている。本菌株は、形質転換体の選択のために、ウラシル要求性となっており、ウラシルマーカーであるＵＲＡ５遺伝子を含むプラスミドを形質転換することにより、ウラシル要求性の有無を指標として形質転換体を選抜することが可能である。
(B) Pop-in / Pop-out of Ade1 gene
As a recombinant host, Cryptococcus sp. S-2. U5 strain was used. This strain has been deposited internationally as FERM BP-10961. This strain is uracil-requiring for selection of transformants. By transforming a plasmid containing the URA5 gene, which is a uracil marker, transformants are selected using the presence or absence of uracil-requiring as an indicator. Is possible.
形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９９２ Ｍａｒ；６０（３）：１１０１−８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。具体的には、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定した。次に、この培養液を２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に、培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．１Ａｂｓになるように植菌して、培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が約１．０Ａｂｓになるまで２５℃で培養を行った。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁して懸濁液を調製した。次に、上記（Ａ）で作製した三つのＡｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔベクター（Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ，Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ，及びＡｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂ）を予めＫｐｎＩによって制限酵素処理して直鎖化したもの１０μｇ（〜５μｌ）を、懸濁液１００μｌに添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ；Ｖ＝０．４７ｋＶに設定した。通電後の液中に、６００μｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）を添加し、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートとしては、ＹＮＢ−ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、０．０７８％ −ｕｒａ ＤＯ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。 Transformation was performed using Infect Immun. 1992 Mar; 60 (3): 1101-8. (Varma et al.). Specifically, cryptococcus sp. S-2. The U5 strain was cultured in a 20 ml YM medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, polypeptone 0.5%, glucose 1.0%) at 25 ° C. for 48 hours. The absorbance (OD 660 nm) of the obtained culture broth was measured. Next, this culture solution was added to a 200 ml liquid medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, polypeptone 0.5%, glucose 1.0%), and the absorbance (OD660 nm) of the culture solution was 0.1 Abs. And incubating at 25 ° C. until the absorbance of the culture solution (OD660 nm) reached about 1.0 Abs. Next, this culture solution is centrifuged to collect the cells, and the cells are washed twice with Wash buffer (270 mM sucrose, 1 mM magnesium chloride, 4 mM DTT, 10 mM Tris-HCl pH 7.6), and Electroporation buffer is used. A suspension was prepared by suspending in (270 mM sucrose, 1 mM magnesium chloride, 10 mM Tris-HCl pH 7.6) so that the absorbance was OD660 = 50 Abs. Next, the Pop-in / Pop-out vectors (Ade1-Upop1000a, Ade1-Upop500a, and Ade1-Upop1000b) of the three Ade1 genes prepared in (A) above were linearized by restriction enzyme treatment with KpnI in advance. 10 μg (˜5 μl) of the product was added to 100 μl of the suspension, transferred to a cuvette for electroporation, and then energized using Gene Pulser Xcell (BIO-RAD). The energization conditions were set to C = 25 μF; V = 0.47 kV. 600 μl Electroporation buffer (270 mM sucrose, 1 mM magnesium chloride, 10 mM Tris-HCl pH 7.6) was added to the solution after energization and spread on the selection plate. As the selection plate, YNB-ura agar medium (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 0.078% -ura DO supplement, 2% glucose, 1% agar powder) was used. The inoculated plate was statically cultured at 25 ° C. for 1 week, and growing colonies were selected.
形質転換で得られた形質転換体については、配列番号６のＡｄｅ１−Ｐ２Ｋ及び配列番号７のＡｄｅ１−Ｔ２Ｋ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより、遺伝子コンストラクト（ベクター）の導入を確認した。その結果を図２に示す。 The transformant obtained by transformation was subjected to colony PCR with KOD-Fx (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using Ade1-P2K of SEQ ID NO: 6 and Ade1-T2K_R of SEQ ID NO: 7 as primers. The introduction of (vector) was confirmed. The result is shown in FIG.
図２からわかるように、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ形質転換体については、５株中２株が（図２の１と５）、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ形質転換体については、５株中１株が（図２の６）、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂ形質転換体については３株中１株が（図２の１２）、ａｄｅ１遺伝子座でＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを二重相同組換えにより導入されていた。 As can be seen from FIG. 2, for Ade1-Upop1000a transformants, 2 out of 5 strains (1 and 5 in FIG. 2), and for ade1-Upop500a transformant, 1 strain out of 5 (see FIG. 2). 6) As for the ade1-Upop1000b transformant, 1 out of 3 strains (12 in FIG. 2), the Pop-in / Pop-out construct was introduced by double homologous recombination at the ade1 locus.
さらに、得られた形質転換体を、ＹＮＢ＋ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、 ５００ｍＭ ウラシル、２％グルコース、１％寒天粉末）及びＹＮＢ＋ｕｒａ＋ａｄｅ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、５００ｍＭ ウラシル、５００ｍＭ アデニン、２％グルコース、１％寒天粉末）培地にそれぞれ植菌し、菌体の生育の有無により、各形質転換体の栄養要求性を確認した。その結果を図３に示す。 Furthermore, the obtained transformant was added to YNB + ura agar medium (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 500 mM uracil, 2% glucose, 1% agar powder) and YNB + ura + ade agar medium (0.67% Yeast Nitrogen). Base W / O amino acid, 500 mM uracil, 500 mM adenine, 2% glucose, 1% agar powder) medium was inoculated, and the auxotrophy of each transformant was confirmed based on the presence or absence of the growth of the cells. The result is shown in FIG.
図３からわかるように、コロニーＰＣＲでａｄｅ１遺伝子座へのＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの二重相同組換えが確認された株（図３中の番号１，５，６，１２）では、アデニン非存在下で生育が確認されず、アデニンを添加した培地でのみ生育が確認された。本結果から、得られた形質転換体は、ａｄｅ１遺伝子が破壊され、アデニン要求性となっていることが確認された。 As can be seen from FIG. 3, in the strains (numbers 1, 5, 6, and 12 in FIG. 3) in which double-homologous recombination of the Pop-in / Pop-out construct to the adel locus was confirmed by colony PCR, Growth was not confirmed in the absence of adenine, and growth was confirmed only in a medium supplemented with adenine. From this result, it was confirmed that the obtained transformant was adenine-requiring because the ade1 gene was disrupted.
次に、本形質転換体に関して、Ｐｏｐ−ｏｕｔを行った。Ｐｏｐ−ｏｕｔとは、図４に示すように、各Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを導入した形質転換体の染色体において、相同配列の染色体内部での相同組換えが起こり、Ｕｒａ５マーカー遺伝子が除去された形質転換体が、ある一定の頻度で出現する現象のことである。Ｕｒａ５マーカー遺伝子が除去された形質転換体は、５−ＦＯＡ存在下で生育することができるようになるため、形質転換体の培養液を５−ＦＯＡを含む培地中で生育させ、生育コロニーを選抜することでＰｏｐ−ｏｕｔ株を選抜することが可能である。 Next, Pop-out was performed on this transformant. Pop-out, as shown in FIG. 4, homologous recombination within the chromosome of the homologous sequence occurs in the chromosome of the transformant introduced with each Pop-in / Pop-out construct, and the Ura5 marker gene is removed. This is a phenomenon in which the transformed transformant appears at a certain frequency. Since the transformant from which the Ura5 marker gene has been removed can grow in the presence of 5-FOA, the culture solution of the transformant is grown in a medium containing 5-FOA, and the growing colonies are selected. By doing so, it is possible to select the Pop-out strain.
Ｐｏｐ−ｏｕｔは、以下の手順で行った。形質転換体を５ｍｌＹＮＢ＋ＵＲＡ培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、０．０７８％−ｕｒａ ＤＯ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５００ｍＭ ウラシル、２％グルコース）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液０．１ｍｌを５−ＦＯＡ選択プレート（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、０．０７８％−ｕｒａ ＤＯ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５００ｍＭ ウラシル、０．２％ ５−ＦＯＡ、２％グルコース、１％寒天粉末）に植菌した。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。生育したコロニーについては、配列番号６のＡｄｅ１−Ｐ２Ｋ及び配列番号７のＡｄｅ１−Ｔ２Ｋ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより、遺伝子のＰｏｐ−ｏｕｔを確認した。その結果の一例を図５に示す。 Pop-out was performed according to the following procedure. The transformant was cultured at 25 ° C. for 48 hours in 5 ml YNB + URA medium (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 0.078% -ura DO supplement, 500 mM uracil, 2% glucose). 0.1 ml of the obtained culture broth was added to a 5-FOA selection plate (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 0.078% -ura DO supplement, 500 mM uracil, 0.2% 5-FOA, 2% Glucose, 1% agar powder). The inoculated plate was statically cultured at 25 ° C. for 1 week, and growing colonies were selected. About the grown colony, Pop-out of the gene was confirmed by performing colony PCR by KOD-Fx (Toyobo Co., Ltd.) using Ade1-P2K of SEQ ID NO: 6 and Ade1-T2K_R of SEQ ID NO: 7 as primers. . An example of the result is shown in FIG.
図５に示すように、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトがＰｏｐ−ｏｕｔされた場合、コロニーＰＣＲによって、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ａとａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−５００ａについては３７９７ｂｐ、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ｂについては２７９７ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ａ形質転換体のＰｏｐ−ｏｕｔ候補株では、１６株中１６株がＰｏｐ−ｏｕｔされており、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−５００ａ形質転換体のＰｏｐ−ｏｕｔ候補株では、１６株全てでＰｏｐ−ｏｕｔされていなかった。また、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ｂ形質転換体のＰｏｐ−ｏｕｔ候補株では１６株中１５株がＰｏｐ−ｏｕｔされていた。以上のことから、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトのＰｏｐ−ｏｕｔのためには、少なくとも１０００ｂｐの長さの相同配列が必要であることが判明した。 As shown in FIG. 5, when the Pop-in / Pop-out construct was Pop-outed, it was determined by colony PCR that 3797 bp for ade1-Upop-1000a and ade1-Upop-500a, and 2797 bp for ade1-Upop-1000b. PCR product is obtained. In the pop-out candidate strains of the adel1-Upop-1000a transformant, 16 out of 16 strains are Pop-out, and in the pop-out candidate strains of the adel1-Upop-500a transformant, all 16 strains are Pop-out. -It was not out. In addition, 15 out of 16 pop-out candidates were pop-out of the adel-Upop-1000b transformant. From the above, it was found that a homologous sequence having a length of at least 1000 bp is necessary for Pop-out of the Pop-in / Pop-out construct.
さらに、得られたＰｏｐ−ｏｕｔ株を、ＹＮＢ＋ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、５００ｍＭ ウラシル、２％グルコース、１％寒天粉末）とＹＮＢ＋ａｄｅ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、５００ｍＭ アデニン、２％グルコース、１％寒天粉末）培地、及び５−ＦＯＡ選択プレート（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、０．０７８％−ｕｒａ ＤＯ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５００ｍＭ ウラシル、０．２％ ５−ＦＯＡ、２％グルコース、１％寒天粉末）にそれぞれ植菌し、菌体の生育を確認した。生育の結果を図６に示す。 Furthermore, the obtained Pop-out strain was mixed with YNB + ura agar medium (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 500 mM uracil, 2% glucose, 1% agar powder) and YNB + ade agar medium (0.67% Yeast agar). Nitrogen Base W / O amino acid, 500 mM adenine, 2% glucose, 1% agar powder) medium, and 5-FOA selection plate (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 0.078%-ura DO supplement , 500 mM uracil, 0.2% 5-FOA, 2% glucose, 1% agar powder), and the growth of the cells was confirmed. The growth results are shown in FIG.
図６に示すように、Ｐｏｐ−ｏｕｔ株では、アデニン要求性に加えて、ウラシル要求性になっていることが確認された。また、Ｐｏｐ−ｏｕｔ株は、５−ＦＯＡを含む培地でも生育した。このようにして得られたＰｏｐ−ｏｕｔ株をＡ１Ｕ５株と命名して、以下の検討に用いた。 As shown in FIG. 6, it was confirmed that the Pop-out strain had uracil requirement in addition to adenine requirement. The Pop-out strain also grew on a medium containing 5-FOA. The Pop-out strain thus obtained was named A1U5 strain and used for the following examination.
（Ｃ）Ａｄｅ１遺伝子に基づくマーカー遺伝子の設計
Ａｄｅ１遺伝子を実際にマーカー遺伝子として機能させるためには、Ａｄｅ１遺伝子が発現されてＡｄｅ１タンパク質が生産されることが必要である。そこで、Ａｄｅ１遺伝子を発現するために好適なプロモーターの種類を検討した。
まず、上記（Ａ）で作製したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子の上流約２ｋｂｐと、ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ領域、及びＡｄｅ１遺伝子の下流約２ｋｂｐを含む、ｐＣＲ−ａｄｅ１を検討に用いた。配列番号２０（Ａｄｅ１Ｕ１ＫＦ）と配列番号２１（Ａｄｅ１ｔｅｒＲ）を用いてＰＣＲを行い、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子の上流１ｋｐと、ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ領域、Ａｄｅ１遺伝子の下流０．３ｋｂｐを含む領域を増幅した産物をＴａｒｇｅｔ−ｃｌｏｎｅ ｐｌｕｓ（東洋紡製）にクローニングして、ｐＴＡｄｅ１＋１ｋ−０．３ｋを作製した。さらに、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２２（ＣｓＥＦ１ｐ＿Ｆ（Ｍｕｎ））と、配列番号２３（ＥＦ１ｐＡｄｅ１＿ｆＲ）のプライマーを用いて増幅したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来ＴＥＦ１プロモーター配列のＰＣＲ産物と、配列番号２４（ＥＦ１ｐＡｄｅ１＿ｆＦ）と配列番号２１（Ａｄｅ１ｔｅｒＲ）のプライマーを用いて増幅した、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ領域とａｄｅ１遺伝子の下流領域０．３ｋｂｐを含むＰＣＲ産物をＦｕｓｉｏｎ−ＰＣＲし、得られた産物をＴａｒｇｅｔ−ｃｌｏｎｅ ｐｌｕｓ（東洋紡製）にクローニングして、ｐＴＴｅｆ１ｐ−Ａｄｅ１を作製した。上述のようにして作製したコンストラクト（プラスミド）の構造を図７に示す。
(C) Design of marker gene based on Ade1 gene In order for the Ade1 gene to actually function as a marker gene, it is necessary that the Ade1 gene is expressed and the Ade1 protein is produced. Therefore, the type of promoter suitable for expressing the Ade1 gene was examined.
First, the cryptococcus sp. PCR-ade1 containing about 2 kbp upstream of the S-2 Ade1 gene, the ORF region of the ade1 gene, and about 2 kbp downstream of the Ade1 gene was used in the study. PCR was performed using SEQ ID NO: 20 (Ade1U1KF) and SEQ ID NO: 21 (Ade1terR), and Cryptococcus sp. A product obtained by amplifying the region containing 1 kp upstream of the Ade1 gene of S-2, the ORF region of the ade1 gene, and the region containing 0.3 kbp downstream of the Ade1 gene into Target-clone plus (manufactured by Toyobo), pTAde1 + 1k-0.3k Was made. Furthermore, cryptococcus sp. Using the genomic DNA of the S-2 strain as a template, cryptococcus sp. Amplified using the primers of SEQ ID NO: 22 (CsEF1p_F (Mun)) and SEQ ID NO: 23 (EF1pAde1_fR). Cryptococcus sp. Amplified using the PCR product of the S-2 derived TEF1 promoter sequence and the primers of SEQ ID NO: 24 (EF1pAde1_fF) and SEQ ID NO: 21 (Ade1terR). A PCR product containing the ORF region of S-2 ade1 gene and the downstream region of 0.3 kbp of the ade1 gene is Fusion-PCR, and the resulting product is cloned into Target-clone plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain pTTef1p-Ade1. Produced. The structure of the construct (plasmid) prepared as described above is shown in FIG.
次に、作製したプラスミドを用いて、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２ Ａ１Ｕ５株に形質転換を行った。形質転換は、上記（Ｂ）に示す方法で行い、選択培地には、ＹＮＢ＋ｕｒａ培地を用いた。その結果、ｐＣＲ−ａｄｅ１及び、ｐＴＴｅｆ１ｐ−Ａｄｅ１を形質転換に用いた場合は、形質転換体を取得することができたが、ｐＴＡｄｅ１＋１ｋ−０．３ｋを形質転換に用いた場合は、形質転換体を得ることができなかった（結果は図示せず）。本結果から、ａｄｅ１遺伝子の発現には、５′ＵＴＲの長さが１ｋｂｐでは不十分であり、少なくとも２ｋｂｐ必要であることが明らかとなった。一方で、Ｔｅｆ１プロモーターを用いた場合は、１ｋｂｐの長さしかなくてもａｄｅ１遺伝子の発現には十分であることが明らかとなった。 Next, using the prepared plasmid, Cryptococcus sp. S-2 A1U5 strain was transformed. Transformation was performed by the method shown in (B) above, and YNB + ura medium was used as the selective medium. As a result, when pCR-ade1 and pTTef1p-Ade1 were used for transformation, transformants could be obtained, but when pTAde1 + 1k-0.3k was used for transformation, transformants were obtained. Could not be obtained (results not shown). From this result, it became clear that the length of 5′UTR is not sufficient for the expression of the ade1 gene, and that at least 2 kbp is required. On the other hand, when the Tef1 promoter was used, it was revealed that even if it had a length of 1 kbp, it was sufficient for the expression of the ade1 gene.
（Ｄ）Ｋｕ７０遺伝子Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの作製
非相同末端結合機構に関与するＫｕ７０遺伝子の破壊を行うため、非特許文献２に記載の、ｐＣｓＵＲＡ５ベクターをベースとして、Ｋｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを作製した。
まず、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２５（Ｋｕ７０Ｕ２ｋＦ（ＳｂｆＩ））のプライマーと配列番号２６（Ｋｕ７０Ｕ２ｋＲ（ＳｂｆＩ））のプライマーを用いてＫｕ７０遺伝子のＯＲＦの上流約２ｋｂｐを増幅し、Ｓｂｆ１で制限酵素処理した後、同じくＳｂｆ１処理したｐＣｓＵＲＡ５に挿入して、ｐＣｓＵ−Ｋｕ７０Ｕ２Ｋを作製した。
(D) Production of Ku70 gene Pop-in / Pop-out construct In order to destroy the Ku70 gene involved in the non-homologous end joining mechanism, based on the pCsURA5 vector described in Non-Patent Document 2, the Pop-pop of Ku70 gene An in / Pop-out construct was made.
First, cryptococcus sp. Using the genomic DNA of S-2 as a template, the primer of SEQ ID NO: 25 (Ku70U2kF (SbfI)) and the primer of SEQ ID NO: 26 (Ku70U2kR (SbfI)) were used to amplify about 2 kbp upstream of the ORF of Ku70 gene, and Sbf1 After the restriction enzyme treatment, it was inserted into pCsURA5 similarly treated with Sbf1 to prepare pCsU-Ku70U2K.
次に、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２７（Ｋｕ７０ｐｏｐＦ（ＥｃｏＲＩ））のプライマーと配列番号２８（Ｋｕ７０Ｄ２ｋＲ（ＥｃｏＲＩ））のプライマーを用いてＫｕ７０遺伝子のＯＲＦの上流約１ｋｂｐを増幅した産物と、配列番号２９（Ｋｕ７０ｐｏｐｆＦ）のプライマーと配列番号３０（Ｋｕ７０ｐｏｐｆＲ）のプライマーを用いてＫｕ７０遺伝子のＯＲＦの下流約２ｋｂｐを増幅した産物をＦｕｓｉｏｎ−ＰＣＲによって融合させ、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理した後、同じくＥｃｏＲＩで処理したｐＣｓＵ−Ｋｕ７０Ｕ２Ｋに挿入して、ｐＣｓＫｕ７０Ｕｐｏｐを作製した。ｐＣｓＫｕ７０Ｕｐｏｐのプラスミドマップを図８に示す。 Next, cryptococcus sp. A product obtained by amplifying about 1 kbp upstream of the ORF of the Ku70 gene using the primer of SEQ ID NO: 27 (Ku70popF (EcoRI)) and the primer of SEQ ID NO: 28 (Ku70D2kR (EcoRI)) using the genomic DNA of S-2 as a template, A product obtained by amplifying about 2 kbp downstream of the ORF of the Ku70 gene using the primer of SEQ ID NO: 29 (Ku70popfF) and the primer of SEQ ID NO: 30 (Ku70popfR) was fused by Fusion-PCR, treated with restriction enzyme with EcoRI, and then treated with EcoRI. Was inserted into pCsU-Ku70U2K treated with the above to prepare pCsKu70Upop. A plasmid map of pCsKu70Upop is shown in FIG.
（Ｅ）Ｋｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ
Ｋｕ７０のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔを行う組換え宿主としては、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２． Ｄ１１株を使用した。本菌株は、特許文献５に記載されており且つ、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８２として国際寄託された、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の細胞外多糖類低生産変異体である。Ｄ１１株はＡ１Ｕ５株からＵＶ変異によって単離された変異体であり、ウラシル及びアデニン要求性株である。
(E) Pop-in / Pop-out of Ku70 gene
As a recombinant host for performing Pop-in / Pop-out of Ku70, cryptococcus sp. S-2. D11 strain was used. This strain is described in Patent Document 5 and has been internationally deposited as FERM BP-11482, Cryptococcus sp. It is a low extracellular polysaccharide production mutant of the S-2 strain. The D11 strain is a mutant isolated from the A1U5 strain by UV mutation, and is a uracil and adenine-requiring strain.
ｐＣｓＫｕ７０ＵｐｏｐのＤ１１株への形質転換は上記（Ｂ）に示すとおりの方法で行い、選択培地には、ＹＮＢ−ｕｒａ培地を用いた。取得したＫｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ株からのＰｏｐ−ｏｕｔについても、上記（Ｂ）に示すとおりの方法で行い、Ｐｏｐ−ｏｕｔ候補株を得た。得られた候補株について、配列番号３１（ＣｓＫｕ７０ｃｏｌｏＰ＿Ｆ）と、配列番号３２（ＣｓＫｕ７０ｃｏｌｏＰ＿Ｒ）を用いてコロニーＰＣＲを行い、Ｋｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔを確認した。その結果を図９に示す。図９に示すように、Ｋｕ７０遺伝子がＰｏｐ−ｏｕｔされた株を取得し、ＤＫ１９１株と命名した。 Transformation of pCsKu70Upop into the D11 strain was performed by the method shown in (B) above, and a YNB-ura medium was used as the selection medium. Pop-out of the obtained Ku70 gene from the Pop-in strain was also performed by the method shown in (B) above to obtain a Pop-out candidate strain. The obtained candidate strain was subjected to colony PCR using SEQ ID NO: 31 (CsKu70coloP_F) and SEQ ID NO: 32 (CsKu70coloP_R) to confirm the Pop-in / Pop-out of the Ku70 gene. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 9, a strain in which the Ku70 gene was Pop-out was obtained and named DK191 strain.
（Ｆ）Ｋｕ７０破壊株のＡｄｅ１遺伝子座へのターゲッティング率（相同組換えの頻度）の検討
Ｋｕ７０遺伝子の破壊が、遺伝子座へのターゲッティング率に影響を与えるかを確認するため、Ｋｕ７０破壊株であるＤＫ１９１株にｐＣＲ−ａｄｅ１を形質転換し、ａｄｅ１遺伝子座への導入効率を検討した。対照として、Ｋｕ７０が破壊されていないＤ１１株へも同様に形質転換を行った。得られた形質転換体の確認は、配列番号６（Ａｄｅ１Ｐ２ｋ＿Ｆ）のプライマーと配列番号７（Ａｄｅ１Ｔ２ｋ＿Ｒ）のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行うことによって確認した。その結果を図１０に示す。
(F) Examination of targeting rate (frequency of homologous recombination) of Ku70 disruption strain to Ade1 locus In order to confirm whether the disruption of Ku70 gene affects the targeting rate to the locus, it is a Ku70 disruption strain PCR-ade1 was transformed into the DK191 strain, and the introduction efficiency into the ade1 locus was examined. As a control, transformation was similarly performed on the D11 strain in which Ku70 was not destroyed. Confirmation of the obtained transformant was confirmed by performing colony PCR using a primer of SEQ ID NO: 6 (Ade1P2k_F) and a primer of SEQ ID NO: 7 (Ade1T2k_R). The result is shown in FIG.
図１０から、Ｄ１１株を宿主とした場合は、３２株中９株でａｄｅ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入されたことが確認され、ターゲティング率は２８％であった。それに対して、ＤＫ１９１株を宿主とした場合は、３２株中２９株でａｄｅ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入されたことが確認され、ターゲティング率は、９１％であった。本結果から、Ｋｕ７０遺伝子の破壊により、ターゲティング率は３．４倍向上したことが明らかとなった。 From FIG. 10, it was confirmed that DNA was introduced by double homologous recombination into the ade1 locus in 9 out of 32 strains when the D11 strain was used as a host, and the targeting rate was 28%. On the other hand, when DK191 strain was used as a host, it was confirmed that DNA was introduced into the ade1 locus by double homologous recombination in 29 strains out of 32 strains, and the targeting rate was 91%. From this result, it became clear that the targeting rate was improved by 3.4 times due to the disruption of the Ku70 gene.
（Ｇ）Ｋｕ７０破壊株のＸｙｌ１遺伝子座へのターゲッティング率（相同組換えの頻度）の検討
上記（Ｆ）では、遺伝子座の相同配列部分として上流２ｋｂｐと下流２ｋｂｐを使用したため、相同配列部分が長く、Ｋｕ７０遺伝子が機能しているＤ１１株でもターゲッティング率は２８％と比較的高い値となった。そこでＫｕ７０遺伝子破壊の効果をさらに厳格な条件下で確認するため、相同配列部分が短いコンストラクトを用いて、ターゲティング率の検証を行った。
(G) Examination of targeting rate (frequency of homologous recombination) of Ku70-disrupted strain to Xyl1 locus In the above (F), since the upstream 2 kbp and the downstream 2 kbp were used as the homologous sequence portion of the locus, the homologous sequence portion was long. Even in the D11 strain in which the Ku70 gene is functioning, the targeting rate was a relatively high value of 28%. Therefore, in order to confirm the effect of Ku70 gene disruption under more stringent conditions, the targeting rate was verified using a construct having a short homologous sequence portion.
ターゲティング率の検証には、Ｘｙｌａｎａｓｅ遺伝子をコードするＸｙｌ１遺伝子座を用いた。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株は酸性キシラナーゼを多量に分泌生産することが、非特許文献２において記載されている。 For the verification of the targeting rate, the Xyl1 locus encoding the Xylanase gene was used. Cryptococcus sp. Non-patent document 2 describes that the S-2 strain secretes and produces a large amount of acid xylanase.
まず、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３３（ＸｙｌＵ２ｋＦ）のプライマーと配列番号３４（ＸｙｌＤ１ｋＲ）のプライマーによりＰＣＲを行い、キシラナーゼ遺伝子の上流２ＫｂｐとＯＲＦ、及び下流１ｋｂｐを含む領域を増幅し、Ｔａｒｇｅｔ ｃｌｏｎｅ ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇを行い、ｐＴ−ＸｙｌＵ２Ｋ−ＯＲＦ−Ｄ１Ｋを作製した。 First, cryptococcus sp. Using the genomic DNA of S-2 as a template, PCR was performed with the primer of SEQ ID NO: 33 (XylU2kF) and the primer of SEQ ID NO: 34 (XylD1kR) to amplify a region containing 2 Kbp and ORF upstream of the xylanase gene and 1 kbp downstream, TA-cloning was performed using Target clone plus (Toyobo Co., Ltd.) to prepare pT-XylU2K-ORF-D1K.
次に、ｐＴ−ＸｙｌＵ２Ｋ−ＯＲＦ−Ｄ１Ｋを鋳型として、配列番号３５（ＸｙｌＵｐｐｅｒ１ｋｉＲ）のプライマーと配列番号３６（ＸｙｌｔｅｒｉＦ（ＳｂｆＭｕｎ））のプライマーを用いてインバースＰＣＲを行い、キシラナーゼ遺伝子の上流約１ｋｂｐとキシラナーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を除去したｐＴ−ＸｙｌＵｐ１Ｋ−Ｄ１Ｋを作製した。 Next, inverse PCR was performed using pT-XylU2K-ORF-D1K as a template and a primer of SEQ ID NO: 35 (XylUpper1kiR) and a primer of SEQ ID NO: 36 (XylteriF (SbfMun)), and about 1 kbp upstream of the xylanase gene and xylanase PT-XylUp1K-D1K from which the ORF portion of the gene was removed was prepared.
次に、上記（Ｃ）に記載の、ｐＴＴｅｆ１ｐ−Ａｄｅ１を鋳型として、配列番号２２（ＣｓＥＦ１ｐ＿Ｆ（Ｍｕｎ））のプライマーと配列番号３７（Ａｄｅ１＿Ｒ（ＭｕｎＩ））のプライマーによりＰＣＲを行い、Ｔｅｆ１プロモーターとａｄｅ１のＯＲＦを含む領域を増幅し、制限酵素ＭｕｎＩで処理した。その後、同じくＭｕｎＩで処理したｐＴ−ＸｙｌＵｐ１Ｋ−Ｄ１Ｋに導入し、ｐＴＸｙｌｐｄｅｌＡを作製した。ｐＴＸｙｌｐｄｅｌＡのプラスミドマップを図１１に示す。 Next, using pTTef1p-Ade1 described in (C) above as a template, PCR was performed with the primer of SEQ ID NO: 22 (CsEF1p_F (Mun)) and the primer of SEQ ID NO: 37 (Ade1_R (MunI)), and the Tef1 promoter and ade1 The region containing the ORF was amplified and treated with the restriction enzyme MunI. Then, it introduce | transduced into pT-XylUp1K-D1K similarly processed with MunI, and produced pTXyllpdelA. The plasmid map of pTXylpdelA is shown in FIG.
次に、上記（Ｆ）で示すように、Ｋｕ７０破壊株であるＤＫ１９１株及び対照としてのＤ１１株を用いて形質転換を行い、形質転換体のターゲティング率を算出した。形質転換体の確認は、配列番号３８（ＸｙｌＵｐｐｅｒＦ）のプライマーと配列番号３９（ｐＣｓＵＸ＿Ｒ）のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行うことによって行った。その結果を図１２に示す。 Next, as shown in (F) above, transformation was performed using the DK191 strain, which is a Ku70-disrupted strain, and the D11 strain as a control, and the targeting rate of the transformant was calculated. The transformant was confirmed by performing colony PCR using the primer of SEQ ID NO: 38 (XylUpperF) and the primer of SEQ ID NO: 39 (pCsUX_R). The result is shown in FIG.
図１２からわかるように、Ｄ１１株を宿主とした場合は、３２株の全てでｘｙｌ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入された株は全く取得できなかった。それに対して、ＤＫ１９１株を宿主とした場合は、３２株中２２株でｘｙｌ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入されたことが確認され、ターゲティング率は、６９％であった。本結果から、Ｋｕ７０遺伝子の破壊により、ターゲティング率は飛躍的に向上していることが明らかとなった。 As can be seen from FIG. 12, when the D11 strain was used as the host, all 32 strains in which DNA was introduced into the xyl1 locus by double homologous recombination could not be obtained at all. On the other hand, when the DK191 strain was used as a host, it was confirmed that 22 of 32 strains had DNA introduced into the xyl1 locus by double homologous recombination, and the targeting rate was 69%. From this result, it became clear that the targeting rate was dramatically improved by the disruption of the Ku70 gene.
本発明によれば、機能解析や改変の対象となる標的遺伝子の破壊や相同組換え、及び形質転換体の選択を効率的に行うことができるため、クリプトコッカス属の菌株における遺伝子の多重破壊や遺伝子組換えの効率を飛躍的に向上させることができる。従って、本発明は、クリプトコッカス属の菌株の遺伝子の機能解析やそれに基づく育種のために極めて有用である。 According to the present invention, it is possible to efficiently perform target gene destruction or homologous recombination, and selection of transformants for functional analysis and modification, so that multiple gene disruption and genes in cryptococcus strains can be performed. The efficiency of recombination can be dramatically improved. Therefore, the present invention is extremely useful for the functional analysis of the gene of the genus Cryptococcus and the breeding based thereon.
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