JP6470967B2 - Mutant xylanase - Google Patents
Mutant xylanase Download PDFInfo
- Publication number
- JP6470967B2 JP6470967B2 JP2014262088A JP2014262088A JP6470967B2 JP 6470967 B2 JP6470967 B2 JP 6470967B2 JP 2014262088 A JP2014262088 A JP 2014262088A JP 2014262088 A JP2014262088 A JP 2014262088A JP 6470967 B2 JP6470967 B2 JP 6470967B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- xylanase
- position corresponding
- acid residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims description 227
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 110
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 106
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 70
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 63
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 39
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 37
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 12
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 49
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 25
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 15
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 102220558319 Olfactory receptor 2C3_R129S_mutation Human genes 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 12
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 11
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 8
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000135044 Thermobifida fusca YX Species 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 102220498322 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain_R40S_mutation Human genes 0.000 description 6
- 102220471613 Protein angel homolog 1_R56A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010335 hydrothermal treatment Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 3
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 3
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710166469 Endoglucanase Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000203780 Thermobifida fusca Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LMPDLIQFRXLCMO-UHFFFAOYSA-L dipotassium;hydrogen phosphate;phosphoric acid Chemical compound [K+].[K+].OP(O)(O)=O.OP([O-])([O-])=O LMPDLIQFRXLCMO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 2
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HBDJFVFTHLOSDW-DNDLZOGFSA-N (2r,3r,4r,5r)-2,3,5,6-tetrahydroxy-4-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanal;hydrate Chemical compound O.O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HBDJFVFTHLOSDW-DNDLZOGFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NAQWICRLNQSPPW-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C21 NAQWICRLNQSPPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 244000301850 Cupressus sempervirens Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 1
- 101710098246 Exoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001237728 Precis Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241001647802 Thermobifida Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241001105588 Xylanimonas Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 108010038658 exo-1,4-beta-D-xylosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003017 maltose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- -1 newspaper Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Description
本発明は、変異キシラナーゼに関する。 The present invention relates to mutant xylanases.
バイオマスは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源である。その中でもセルロース系バイオマスが注目を浴びている。セルロースを分解することで糖を製造し、得られた糖から化学変換や微生物を用いた発酵技術により石油資源の代替物やバイオ燃料などの有用資源を製造する技術の開発が、世界中で行われている。 Biomass is an organic resource derived from renewable organisms excluding fossil resources. Among them, cellulosic biomass is attracting attention. Development of technology to produce sugar by decomposing cellulose and producing useful resources such as alternatives to petroleum resources and biofuels by chemical conversion and fermentation technology using microorganisms from the obtained sugar It has been broken.
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを主成分として構成される。このようなバイオマスは、セルロースを分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを分解するヘミセルラーゼなどが相乗的に作用することにより、複雑なプロセスで分解されることが知られている。セルロース系バイオマスの有効活用にあたっては、セルロースやヘミセルロースを高効率に分解可能な糖化酵素の開発が必要となる。 Cellulosic biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose, and lignin. It is known that such biomass is decomposed in a complex process by synergistic action of cellulase that decomposes cellulose, hemicellulase that decomposes hemicellulose, and the like. For effective utilization of cellulosic biomass, it is necessary to develop a saccharifying enzyme capable of decomposing cellulose and hemicellulose with high efficiency.
セルロース系バイオマスの糖化においては、糖化酵素が基質であるセルロースやヘミセルロースに吸着し、それらを分解することによって糖が生産される。こうした糖の生産に関わるセルロースやヘミセルロース基質への該酵素の吸着は、生産的吸着と呼ばれる。対照的に、糖化酵素により分解されない成分、例えばリグニン、灰分、その他成分などへの該酵素の吸着は、非特異的吸着と呼ばれる。酵素の糖化効率は、酵素の比活性、耐熱性、非特異的吸着などの因子に左右されると考えられており、糖化酵素の開発にあたっては、これらの因子が着目される。 In saccharification of cellulosic biomass, saccharification enzyme is adsorbed on cellulose or hemicellulose as a substrate, and sugar is produced by decomposing them. Such adsorption of the enzyme to cellulose or hemicellulose substrate involved in sugar production is called productive adsorption. In contrast, adsorption of the enzyme to components that are not degraded by saccharifying enzymes, such as lignin, ash, and other components, is referred to as non-specific adsorption. The saccharification efficiency of an enzyme is considered to depend on factors such as the specific activity of the enzyme, heat resistance, and non-specific adsorption, and these factors are noted in the development of saccharifying enzymes.
セルロース系バイオマスを糖化酵素で糖化した後の残渣成分は、リグニンが主成分である。しかし、セルロース系バイオマス中のリグニンに糖化酵素が吸着することにより、糖化効率が低下することが知られている。セルロース系バイオマス糖化において、糖化酵素のリグニンへの非特異的吸着性は好ましくない性質である。 The residual component after saccharifying cellulosic biomass with a saccharifying enzyme is mainly composed of lignin. However, it is known that saccharification efficiency is reduced by adsorbing saccharifying enzymes to lignin in cellulosic biomass. In cellulosic biomass saccharification, nonspecific adsorption of saccharifying enzymes to lignin is an undesirable property.
リグニン存在下での酵素活性が向上した糖化酵素が報告されている。特許文献１には、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ等のセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）IIにおいて、負電荷のアミノ酸への置換、正電荷のアミノ酸の除去等の改変により、非セルロース素材への非特異的吸着が低減したことが開示されている。特許文献２には、リグニンによる不活性化が低減したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｆａｍｉｌｙ ６セルラーゼの変異体が開示されている。特許文献３には、リンカーペプチドを改変した、リグニン存在下での活性が向上及び／又はリグニンとの結合を抑えたセルラーゼ変異体が開示されている。特許文献４には、リグニン存在下での活性が向上及び／又はリグニンとの結合を抑えたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｃｅｌ６Ａの糖質結合モジュール（ＣＢＭ）の変異体が開示されている。また、特許文献５には、バイオマスの糖化効率の高い酵素として、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ由来のキシラナーゼが開示されている）。 A saccharifying enzyme with improved enzyme activity in the presence of lignin has been reported. Patent Document 1 discloses that cellobiohydrolase (CBH) II such as Thermobifida fusca reduces non-specific adsorption to non-cellulosic materials by modification of negatively charged amino acids and removal of positively charged amino acids. It has been disclosed. Patent Document 2 discloses a mutant of Trichoderma reesei Family 6 cellulase in which inactivation by lignin is reduced. Patent Document 3 discloses a cellulase mutant in which a linker peptide is modified to improve activity in the presence of lignin and / or suppress binding to lignin. Patent Document 4 discloses a variant of the carbohydrate binding module (CBM) of Trichoderma reesei Cel6A, which has improved activity in the presence of lignin and / or suppressed binding to lignin. Patent Document 5 discloses a xylanase derived from Xylanimonas cellulolytica as an enzyme having a high biomass saccharification efficiency).
グリコシドヒドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ）１１に属するキシラナーゼ（以下、ＧＨ１１キシラナーゼということがある）は、セルロース系バイオマスの糖化に利用可能なヘミセルラーゼである。しかし、ＧＨ１１キシラナーゼは、糖化残渣やリグニンへの吸着性が高いものが多く、バイオマス糖化に用いた場合、非特異的吸着による糖化率低下をもたらすという欠点がある。ＧＨ１１キシラナーゼが糖化残渣やリグニンに吸着するしくみの詳細は未だ不明である。 A xylanase belonging to the glycoside hydrolase family 11 (hereinafter sometimes referred to as GH11 xylanase) is a hemicellulase that can be used for saccharification of cellulosic biomass. However, many GH11 xylanases have high adsorptivity to saccharification residues and lignin, and when used for biomass saccharification, there is a disadvantage that the saccharification rate is reduced by nonspecific adsorption. The details of the mechanism by which GH11 xylanase adsorbs to saccharification residues and lignin are still unclear.
本発明者らは、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）由来のＧＨ１１キシラナーゼのアミノ酸配列において、特定部位の塩基性アミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基に置換することによって、当該酵素の糖化残渣又はリグニンへの吸着性を低減することができることを見出した。 The present inventors have replaced the glycation residue or lignin of the enzyme by substituting a basic amino acid residue at a specific site with a non-basic amino acid residue in the amino acid sequence of GH11 xylanase derived from Thermobifida fusca. It has been found that the adsorptivity to can be reduced.
したがって、一態様において本発明は、変異キシラナーゼであって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼを提供する。
Thus, in one aspect, the invention is a mutant xylanase comprising
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, provided that:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Having a non-basic amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of
A mutant xylanase is provided.
別の一態様において、本発明は、変異キシラナーゼの製造方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法を提供する。
In another aspect, the present invention provides a method for producing a mutant xylanase comprising:
In the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto, the following:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
別の一態様において、本発明は、キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法を提供する。
In another aspect, the present invention relates to a method for reducing xylanase saccharification residue adsorption,
In the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto, the following:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。 In a further aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding the above mutant xylanase.
さらなる態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。 In a further aspect, the present invention provides a vector comprising the above polynucleotide.
さらなる態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。 In a further aspect, the present invention provides a method for producing a transformant, which comprises introducing the polynucleotide or vector into a host.
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤を提供する。 In a further aspect, the present invention provides a biomass saccharifying agent comprising the above mutant xylanase.
さらなる態様において、本発明は、上記バイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。 In a further aspect, the present invention provides a method for producing sugar from biomass using the biomass saccharifying agent.
本発明は、糖化残渣やリグニンへの吸着性が低減した変異キシラナーゼを提供する。本発明の変異キシラナーゼを使用することにより、従来のキシラナーゼと比較して、リグニンを含むバイオマスをより効率的に糖化することができ、またより効率的かつ安価にバイオマスから糖を製造することができる。 The present invention provides a mutant xylanase with reduced adsorption to saccharification residues and lignin. By using the mutant xylanase of the present invention, biomass containing lignin can be saccharified more efficiently and sugar can be produced from biomass more efficiently and cheaply than conventional xylanases. .
（１．定義）
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
(1. Definition)
As used herein, nucleotide and amino acid sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to compare (ktup) as 2, using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
本明細書において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。 In the present specification, the “corresponding position” on the amino acid sequence or nucleotide sequence aligns the target sequence and a reference sequence (for example, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2) so as to give the maximum homology (alignment). ). Alignment of amino acid or nucleotide sequences can be performed using known algorithms, the procedures of which are known to those skilled in the art. For example, the alignment can be performed manually based on the above-described Lipman-Pearson method or the like, but the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). ) With default settings. Clustal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the Japan DNA Data Bank (DDBJ [www. ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]).
さらに、当業者であれば、必要に応じて、上記で得られたアラインメントを、最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, those skilled in the art can further fine-tune the alignment obtained above as necessary to obtain an optimal alignment. Such an optimal alignment is preferably determined in consideration of amino acid sequence similarity, frequency of inserted gaps, and the like. Here, the similarity of amino acid sequences means the ratio (%) of the number of positions where the same or similar amino acid residues exist in both sequences when two amino acid sequences are aligned to the total number of amino acid residues. . A similar amino acid residue means an amino acid residue having properties similar to each other in terms of polarity and charge among 20 kinds of amino acids constituting a protein and causing so-called conservative substitution. Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art, such as arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; And isoleucine, but are not limited thereto.
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基又はヌクレオチドは「相当する位置のアミノ酸残基」又は「相当する位置のヌクレオチド」と称される。 The position of the amino acid residue or nucleotide of the target sequence aligned with the position corresponding to any position of the reference sequence by the above alignment is regarded as the “corresponding position” to the position, and the amino acid residue or nucleotide Are referred to as “amino acid residues at corresponding positions” or “nucleotides at corresponding positions”.
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。本明細書において、「塩基性アミノ酸残基」とは、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されるアミノ酸残基をいう。本明細書において、「非塩基性アミノ酸残基」とは、上記に挙げた２０種のアミノ酸残基のうち、塩基性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基をいう。 In the present specification, the “amino acid residue” means 20 kinds of amino acid residues constituting a protein, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L) ), Lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W) , Tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V). In the present specification, “basic amino acid residue” refers to an amino acid residue selected from the group consisting of arginine, histidine and lysine. In the present specification, the “non-basic amino acid residue” refers to an amino acid residue other than the basic amino acid residue among the 20 types of amino acid residues listed above.
本明細書において、「グリコシドヒドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ）１１」（又はＧＨ１１ということがある）とは、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ−ＡＣＴＩＶＥ ＥＮＺＹＭＥ ＣＡＺＹ−Ｈｏｍｅ（［ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／］）にて分類されるファミリーの第１１族を意味する。本明細書において、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼ（又はＧＨ１１キシラナーゼ）とは、アミノ酸２００個程度のタンパク質でβジェリーロール構造を有し、エンド− β−１，４−キシラナーゼ活性又はエンド− β−１，３−キシラナーゼ活性を有するヘミセルラーゼファミリーである（バイオマス分解酵素研究の最前線−セルラーゼ・へミセルラーゼを中心として−近藤昭彦、天野良彦、田丸浩 株式会社シーエムシー出版）。 In this specification, the “glycoside hydrolase family 11” (or sometimes GH11) is a family classified by CARBOHYDRATE-ACTIVE ENZYME CAZY-Home ([www.casey.org/]). Means the 11th group. In the present specification, a xylanase (or GH11 xylanase) belonging to glycoside hydrolase family 11 is a protein having about 200 amino acids, has a β-jelly roll structure, and has endo-β-1,4-xylanase activity or endo-β-. It is a family of hemicellulases having 1,3-xylanase activity (the forefront of biomass degrading enzyme research-centering on cellulase and hemicellulase-Akihiko Kondo, Yoshihiko Amano, Hiroshi Tamaru Co., Ltd.)
本明細書において、「キシラナーゼ活性」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性をいう。タンパク質のキシラナーゼ活性は、キシランを基質として当該タンパク質と反応させ、キシラン分解産物の生成量を測定することによって決定することができる。例えば、タンパク質のキシラナーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて、キシランから生成した糖の還元末端を定量化することによって測定することができる。より詳細には、可溶キシラン、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び対象タンパク質を混合し、５０℃で反応させた後、ＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム、ジニトロサリチル酸、酒石酸ナトリウムカリウムを含む溶液）を添加して９９．９℃で反応させ、次いで反応液の波長５４０ｎｍでの吸光度を測定する。測定値を、キシロースを用いて作成した検量線により標準化することにより、生成糖の還元末端を定量化することができる。ＤＮＳ法によるキシラナーゼ活性測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。 In the present specification, “xylanase activity” refers to an activity of hydrolyzing a xylose β-1,4-glycoside bond in xylan. The xylanase activity of a protein can be determined by reacting with the protein using xylan as a substrate and measuring the amount of xylan degradation product produced. For example, the xylanase activity of a protein can be measured by quantifying the reducing end of a sugar produced from xylan by the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method. More specifically, soluble xylan, sodium acetate buffer (pH 5.0), and target protein are mixed, reacted at 50 ° C., and then DNS solution (solution containing sodium hydroxide, dinitrosalicylic acid, sodium potassium tartrate). Is added and allowed to react at 99.9 ° C., and then the absorbance of the reaction solution at a wavelength of 540 nm is measured. By standardizing the measured value with a calibration curve created using xylose, the reducing end of the produced sugar can be quantified. Specific procedures for measuring xylanase activity by the DNS method are described in detail in Examples below.
本明細書において、「キシラナーゼ」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を有する（すなわちキシラナーゼ活性を有する）ポリペプチドをいう。より詳細には、「キシラナーゼ触媒ドメイン（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ；ＣＤ）」、又はリンカーを介して結合されたＣＤと「糖質結合モジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ）」からなる酵素をいう。 As used herein, “xylanase” refers to a polypeptide having an activity of hydrolyzing a xylose β-1,4-glycoside bond in xylan (ie, having xylanase activity). More specifically, it refers to an enzyme consisting of a “Catalytic Domain (CD)” or a CD bound via a linker and a “Carbohydrate binding module (CBM)”.
本明細書において、「キシラナーゼ触媒ドメイン」又は単に「触媒ドメイン」（いずれもＣＤということがある）とは、キシラナーゼに含まれる、キシラナーゼ活性を保有するドメインをいう。 In the present specification, the term “xylanase catalytic domain” or simply “catalytic domain” (both may be referred to as CD) refers to a domain possessing xylanase activity, which is included in xylanase.
本明細書において、「糖質結合モジュール（ＣＢＭ）」とは、ＣＤにリンカーを介して共有結合されている、キシラナーゼの触媒反応の基質（例えば、キシラン）と結合するドメインをいう。 In the present specification, the “carbohydrate binding module (CBM)” refers to a domain that is covalently bound to CD via a linker and binds to a xylanase catalytic substrate (eg, xylan).
本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物又は粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類、藻類などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。 In the present specification, “biomass” refers to cellulosic and / or lignocellulosic biomass containing hemicellulose components produced by plants and algae. Specific examples of biomass include various types of wood obtained from conifers such as larch and cedar, and broad-leaved trees such as oil palm (stem) and cypress; processed or pulverized products of wood such as wood chips; wood pulp produced from wood Pulp such as cotton linter pulp obtained from fibers around cotton seeds; Paper such as newspaper, cardboard, magazines, fine paper; bagasse (sugar cane residue), palm empty fruit bunch (EFB), rice straw Stalks of plants such as corn stalks or leaves, leaves, fruit bunches, etc .; plant shells such as rice husks, palm husks, coconut husks, algae and the like. Among these, from the viewpoint of availability and raw material cost, wood, processed or pulverized wood, plant stems, leaves, fruit bunches and the like are preferable, bagasse, EFB, oil palm (stem) are more preferable, and bagasse is further. preferable. You may use the said biomass individually or in mixture of 2 or more types. The biomass may be dried.
本明細書において、「糖化残渣」とは、バイオマス中のセルロース、ヘミセルロースを糖化酵素で糖化した後の残存固形分をいう。キシラナーゼの「糖化残渣吸着性」の高さは、例えば、糖化残渣とキシラナーゼとを反応させて、該糖化残渣にキシラナーゼを吸着させた後、反応液の上清に残存するキシラナーゼ活性を測定し、該糖化残渣と反応させなかった場合のキシラナーゼ活性に対する相対活性を求めることによって算出することができる。例えば、糖化残渣吸着率は以下の式で表すことができる。
糖化残渣吸着率（％）＝１００−相対比活性（％）
相対比活性（％）＝（糖化残渣との反応後の酵素試料のキシラナーゼ活性／糖化残渣と未反応の酵素試料のキシラナーゼ活性）×１００
上記相対比活性がより低いキシラナーゼほど、より高い糖化残渣吸着性を有する。糖化残渣としては、例えば、リグニン、又は公知のセルラーゼ若しくはセルラーゼ製剤（例えば、ノボザイムズ社製Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２）を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣を用いることができる。糖化残渣とキシラナーゼとの反応には、例えば、５０℃で１時間の処理を採用することができる。キシラナーゼの糖化残渣吸着性の測定のための具体的手順の例は、後述の実施例に詳述されている。
In the present specification, the “saccharification residue” refers to a solid content remaining after saccharification of cellulose and hemicellulose in biomass with a saccharification enzyme. The xylanase “adsorbability of saccharification residue” is high, for example, by reacting the saccharification residue with xylanase, adsorbing xylanase to the saccharification residue, and then measuring the xylanase activity remaining in the supernatant of the reaction solution, It can calculate by calculating | requiring the relative activity with respect to xylanase activity when not making it react with this saccharification residue. For example, the saccharification residue adsorption rate can be expressed by the following formula.
Saccharification residue adsorption rate (%) = 100-relative specific activity (%)
Relative specific activity (%) = (xylanase activity of enzyme sample after reaction with saccharification residue / xylanase activity of enzyme sample unreacted with saccharification residue) × 100
A xylanase having a lower relative specific activity has a higher saccharification residue adsorbability. As the saccharification residue, for example, lignin or a solid residue after saccharification of an alkali mixed crushed bagasse at 50 ° C. for 24 hours using a known cellulase or cellulase preparation (for example, Cellic (registered trademark) CTec2 manufactured by Novozymes) is used. be able to. For the reaction between the saccharification residue and xylanase, for example, treatment at 50 ° C. for 1 hour can be employed. Examples of specific procedures for measuring xylanase saccharification residue adsorption are detailed in the examples below.
（２．変異キシラナーゼ及びその製造方法）
本発明は、糖化残渣吸着性が低減した変異キシラナーゼを提供する。本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するキシラナーゼを改変して、所定の位置の塩基性アミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基に置換することによって製造することができる。
(2. Mutant xylanase and production method thereof)
The present invention provides a mutant xylanase with reduced saccharification residue adsorption. The mutated xylanase of the present invention modifies the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a xylanase having 90% or more identity thereto to replace a basic amino acid residue at a predetermined position with a non-basic amino acid residue Can be manufactured.
したがって、一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、変異キシラナーゼを提供する。
Accordingly, in one embodiment, the present invention includes an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, provided that:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
A mutant xylanase having an abasic amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of:
別の態様において、本発明は、糖化残渣吸着性が低減した変異キシラナーゼの製造方法を提供する。当該方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む。
In another aspect, the present invention provides a method for producing a mutant xylanase with reduced saccharification residue adsorption. The method includes the following in the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
好ましくは、本発明の変異キシラナーゼにおいては、配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置のアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。 Preferably, in the mutant xylanase of the present invention, amino acid residues at positions corresponding to position 129 and position 158 of SEQ ID NO: 2 are substituted with non-basic amino acid residues.
また好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２の１２９位及び／又は１５８位に相当する位置のアミノ酸残基に加えて、配列番号２の１０位、４０位及び５６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。より好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２の１２９位及び１５８位に相当する位置のアミノ酸残基と、配列番号２の１０位、４０位及び５６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基とが、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。さらに好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位及び１５８位に相当する位置のアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換されている。 Also preferably, the mutant xylanase of the present invention has amino acid residues at positions corresponding to positions 129 and / or 158 of SEQ ID NO: 2, and positions corresponding to positions 10, 40 and 56 of SEQ ID NO: 2. At least one amino acid residue selected from the group consisting of is substituted with a non-basic amino acid residue. More preferably, the mutant xylanase of the present invention comprises an amino acid residue at positions corresponding to positions 129 and 158 of SEQ ID NO: 2 and a group consisting of positions corresponding to positions 10, 40 and 56 of SEQ ID NO: 2. At least one selected amino acid residue is substituted with a non-basic amino acid residue. More preferably, in the mutant xylanase of the present invention, amino acid residues at positions corresponding to positions 10, 40, 56, 129, and 158 of SEQ ID NO: 2 are substituted with non-basic amino acid residues. .
好ましくは、本発明の変異キシラナーゼにおける配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置のアミノ酸残基と置換される非塩基性アミノ酸残基は、セリン及びアラニンより選択される。より好ましくは、当該配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置の各アミノ酸残基と置換される非塩基性アミノ酸残基は、それぞれ以下のとおりである。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
Preferably, the non-basic amino acid residue substituted with the amino acid residue at the position corresponding to position 10, 40, 56, 129, or 158 of SEQ ID NO: 2 in the mutant xylanase of the present invention is serine and alanine. More selected. More preferably, the non-basic amino acid residues to be substituted with the respective amino acid residues at positions corresponding to positions 10, 40, 56, 129, or 158 of SEQ ID NO: 2 are as follows: .
Position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2; serine position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 56 of serine SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 129 of alanine SEQ ID NO: 2; serine SEQ ID NO: 2 position corresponding to position 158; serine
本明細書においては、上記アミノ酸置換を行う前の、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを、本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼ（又は単に親キシラナーゼ）ということがある。 In the present specification, the polypeptide having the xylanase activity comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence before the amino acid substitution described above is used as the mutant xylanase of the present invention. Of the parent xylanase (or simply the parent xylanase).
本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼの例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）ＹＸ由来キシラナーゼの触媒ドメインが挙げられる。 Examples of the parent xylanase of the mutant xylanase of the present invention include the catalytic domain of Thermobifida fusca YX-derived xylanase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
親キシラナーゼの別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつキシラナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。当該ポリペプチドの例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインが挙げられる。 Another example of the parent xylanase is at least 90%, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Include polypeptides having 99% or more sequence identity and having xylanase activity. Examples of the polypeptide include a catalytic domain of GH11 xylanase consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
親キシラナーゼのさらに別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキシラナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。なお、本明細書において、１〜数個とは、１〜１９個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。 Still another example of the parent xylanase is a polypeptide having an xylanase activity consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. . In the present specification, 1 to several means 1 to 19, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and further preferably 1 to 3.
好ましくは、親キシラナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置に、それぞれグルタミン酸残基を有する。これらの位置に存在するグルタミン酸残基は、キシラナーゼ活性に関与すると考えられている（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，２００６，６２：７８４−７９２）。 Preferably, the parent xylanase has a glutamic acid residue at a position corresponding to position 85 and / or a position corresponding to position 174 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Glutamate residues present at these positions are believed to be involved in xylanase activity (Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 2006, 62: 784-792).
また好ましくは、親キシラナーゼは、配列番号２の１２９位及び／又は１５８位に相当する位置に、塩基性アミノ酸残基を有する。より好ましくは、配列番号２の４０位、５６位、１２９位、及び１５８位に相当する位置に、塩基性アミノ酸残基を有する。さらに好ましくは、配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位、及び１５８位に相当する位置に塩基性アミノ酸残基を有する。親キシラナーゼの配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位及び１５８位に相当する位置の塩基性アミノ酸残基は、好ましくはヒスチジン又はアルギニンであり、より好ましくはアルギニンである。 Also preferably, the parent xylanase has a basic amino acid residue at a position corresponding to position 129 and / or position 158 of SEQ ID NO: 2. More preferably, it has basic amino acid residues at positions corresponding to positions 40, 56, 129, and 158 of SEQ ID NO: 2. More preferably, it has basic amino acid residues at positions corresponding to positions 10, 40, 56, 129, and 158 of SEQ ID NO: 2. The basic amino acid residues at positions corresponding to positions 10, 40, 56, 129, and 158 of SEQ ID NO: 2 of the parent xylanase are preferably histidine or arginine, and more preferably arginine.
本発明の変異キシラナーゼは、実質的にキシラナーゼの触媒ドメインからなるものであってもよいが、キシラナーゼ触媒ドメインのＣ末端側にリンカーを介して連結されたＣＢＭ（糖質結合モジュール）をさらに含んでいてもよい。あるいは、本発明の変異キシラナーゼは、キシラナーゼ触媒ドメインのＮ末端側に連結されたシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。 The mutant xylanase of the present invention may be substantially composed of the catalytic domain of xylanase, but further comprises a CBM (carbohydrate binding module) linked to the C-terminal side of the xylanase catalytic domain via a linker. May be. Alternatively, the mutant xylanase of the present invention may further include a signal peptide linked to the N-terminal side of the xylanase catalytic domain.
本発明の変異キシラナーゼがＣＢＭ又はシグナルペプチドを含む場合は、該変異キシラナーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインにおいて、上述した所定の位置のアミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基へと置換し、次いで該変異した触媒ドメインをＣＢＭ又はシグナルペプチドと連結することによって製造することができる。あるいは、触媒ドメインとＣＢＭ又はシグナルペプチドとを含むキシラナーゼのポリペプチドにおいて、上述した所定の位置のアミノ酸残基を非塩基性アミノ酸残基へと置換することによって、ＣＢＭ又はシグナルペプチドを含む本発明の変異キシラナーゼを製造することができる。 When the mutant xylanase of the present invention contains CBM or a signal peptide, the mutant xylanase is described above in the xylanase catalytic domain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto. It can be produced by substituting an amino acid residue at a predetermined position with a non-basic amino acid residue, and then linking the mutated catalytic domain with CBM or a signal peptide. Alternatively, in the xylanase polypeptide containing the catalytic domain and CBM or signal peptide, the amino acid residue at the predetermined position described above is substituted with a non-basic amino acid residue, thereby containing the CBM or signal peptide of the present invention. Mutant xylanases can be produced.
したがって、本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼは、実質的にキシラナーゼ触媒ドメインからなるキシラナーゼであってもよいが、キシラナーゼ触媒ドメインとそのＣ末端側にリンカーを介して連結されたＣＢＭとを含むキシラナーゼであってもよく、キシラナーゼ触媒ドメインとそのＮ末端側に連結されたシグナルペプチドとを含むキシラナーゼであってもよく、又はキシラナーゼ触媒ドメインと、そのＣ末端側及びＮ末端側にそれぞれ連結されたＣＢＭ及びシグナルペプチドを含むキシラナーゼであってもよい。 Therefore, the parent xylanase of the mutant xylanase of the present invention may be a xylanase consisting essentially of a xylanase catalytic domain, but is a xylanase comprising a xylanase catalytic domain and a CBM linked to the C-terminal side via a linker. It may be a xylanase comprising a xylanase catalytic domain and a signal peptide linked to its N-terminal side, or a xylanase catalytic domain and a CBM linked to its C-terminal side and its N-terminal side, respectively. It may be a xylanase containing a signal peptide.
本発明の変異キシラナーゼのためのＣＢＭの例としては、サーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼのＣＢＭ（配列番号５）、及びこれとアミノ酸配列において少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するＣＢＭが挙げられる。また、本発明の変異キシラナーゼのためのシグナルペプチドの例としては、サーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼのシグナルペプチド（配列番号６）、及びこれとアミノ酸配列において少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するシグナルペプチドが挙げられる。 Examples of CBMs for the mutated xylanases of the present invention include CBM (SEQ ID NO: 5) of Thermobifida fusca YX-derived xylanase, and at least 90%, for example 90% or more, preferably 95% or more in amino acid sequence with this. More preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably CBM having 99% or more identity. Examples of the signal peptide for the mutant xylanase of the present invention include the signal peptide (SEQ ID NO: 6) of Thermobifida fusca YX-derived xylanase, and its amino acid sequence, at least 90%, for example, 90% or more, preferably A signal peptide having an identity of 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more.
ＣＢＭ又はシグナルペプチドを含む親キシラナーゼの例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる、サーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼ、配列番号４の１〜２０２位で示されるアミノ酸配列からなる、キシラナーゼ触媒ドメインとシグナルペプチドを含むポリペプチド、配列番号４の４３〜３３８位で示されるアミノ酸配列からなる、キシラナーゼ触媒ドメインとＣＢＭを含むポリペプチド、及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるサーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼ遺伝子にコードされたポリペプチドが挙げられる。 Examples of the parent xylanase containing CBM or signal peptide are the Xylanase catalytic domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the Thermobifida fusca YX-derived xylanase, the amino acid sequence shown in positions 1 to 202 of SEQ ID NO: 4 And a signal peptide, a polypeptide comprising the amino acid sequence shown at positions 43 to 338 of SEQ ID NO: 4, a polypeptide containing a xylanase catalytic domain and CBM, and a thermobifida fuska YX consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 A polypeptide encoded by a xylanase gene can be mentioned.
（３．キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法）
本発明においては、親キシラナーゼのアミノ酸配列の上記に挙げた位置における塩基性アミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換する。これによって、親キシラナーゼの糖化残渣吸着性を低減することができる。
(3. Method for reducing xylanase saccharification residue adsorptivity)
In the present invention, the basic amino acid residues at the positions listed above in the amino acid sequence of the parent xylanase are replaced with non-basic amino acid residues. Thereby, the saccharification residue adsorption property of the parent xylanase can be reduced.
したがって、別の態様において、本発明は、キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法を提供する。当該方法は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む。上記アミノ酸置換に供されるべき親キシラナーゼ、上記置換すべき位置のうちの好ましい位置、上記置換すべき位置に加えて置換され得るさらなる位置、それらの位置における好ましい置換後のアミノ酸残基については、上述したとおりである。
Therefore, in another aspect, the present invention provides a method for reducing xylanase saccharification residue adsorption. The method includes the following in the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue. Regarding the parent xylanase to be subjected to the amino acid substitution, the preferred position among the positions to be substituted, the additional positions that can be substituted in addition to the positions to be substituted, and the preferred amino acid residues after substitution at those positions, As described above.
本発明の変異キシラナーゼは、変異前のキシラナーゼ（すなわち親キシラナーゼ）と比べて、糖化残渣吸着性が低減されている。より詳細には、後述の参考例４〜６に従って、ノボザイムズ社製セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣を糖化残渣とし、該糖化残渣１０ｍｇ／ｍＬと本発明の変異キシラナーゼとを５０℃で１時間反応させて糖化残渣吸着率を算出した場合、本発明の変異キシラナーゼの糖化残渣吸着率は、親キシラナーゼの糖化残渣吸着率を１００％としたときの相対値として、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、なお好ましくは６０％以下である。 The mutated xylanase of the present invention has reduced saccharification residue adsorptivity compared to the xylanase before the mutation (that is, the parent xylanase). More specifically, according to Reference Examples 4 to 6 to be described later, the solid residue after saccharifying the alkali mixed crushed bagasse at 50 ° C. for 24 hours using the cellulase preparation Cellic (registered trademark) CTec2 manufactured by Novozymes is used as the saccharification residue, When the saccharification residue adsorption rate is calculated by reacting saccharification residue 10 mg / mL with the mutant xylanase of the present invention at 50 ° C. for 1 hour, the saccharification residue adsorption rate of the mutant xylanase of the present invention is the saccharification residue adsorption rate of the parent xylanase. The relative value with respect to 100% is preferably 90% or less, more preferably 80% or less, still more preferably 70% or less, and still more preferably 60% or less.
（４．ベクター及び形質転換体）
本発明の変異キシラナーゼは、例えば、上記本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明の変異キシラナーゼは、当該変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。すなわち、当該変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有する本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドが発現して、本発明の変異キシラナーゼが生産される。生産された変異キシラナーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明の変異キシラナーゼを取得することができる。
(4. Vectors and transformants)
The mutant xylanase of the present invention can be produced, for example, by expressing a polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention. Preferably, the mutant xylanase of the present invention can be produced from a transformant introduced with a polynucleotide encoding the mutant xylanase. That is, if a vector containing a polynucleotide encoding the mutant xylanase is introduced into a host to obtain a transformant, and then the transformant is cultured in an appropriate medium, the mutation of the present invention contained in the transformant A polynucleotide encoding a xylanase is expressed to produce a mutant xylanase of the invention. By isolating or purifying the produced mutant xylanase from the culture, the mutant xylanase of the present invention can be obtained.
したがって、本発明はさらに、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。さらに本発明は、該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。さらに本発明は、当該形質転換体を培養することを含む、変異キシラナーゼの製造方法を提供する。 Therefore, the present invention further provides a polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention, and a vector comprising the same. The present invention further provides a method for producing a transformant, which comprises introducing a polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention or a vector containing the same into a host. Furthermore, the present invention provides a transformant containing the polynucleotide or vector. Furthermore, the present invention provides a method for producing a mutant xylanase, comprising culturing the transformant.
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、キシラナーゼ触媒ドメインのみをコードするポリヌクレオチドであってもよいが、キシラナーゼ触媒ドメイン及びＣＢＭをコードするポリヌクレオチドであってもよい。さらに該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする領域や、非翻訳領域（ＵＴＲ）などを含んでいてもよい。本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。 The polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention may be a polynucleotide encoding only the xylanase catalytic domain, or may be a polynucleotide encoding xylanase catalytic domain and CBM. Further, the polynucleotide may contain a region encoding a signal peptide, an untranslated region (UTR), and the like. The polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention may be in the form of single and double stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or may be cDNA or chemically synthesized DNA without introns.
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、該変異キシラナーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。例えば、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、親キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド（以下、親キシラナーゼ遺伝子ともいう）において、配列番号２の１２９位又は１５８位に対応する位置のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を、置換後の非塩基性アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）へと変異させることによって、調製することができる。当該変異したポリヌクレオチドを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基が所望の非塩基性アミノ酸残基に置換された変異キシラナーゼを得ることができる。 The polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention can be synthesized genetically or chemically based on the amino acid sequence of the mutant xylanase. For example, the polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention has an amino acid residue at a position corresponding to position 129 or 158 of SEQ ID NO: 2 in a polynucleotide encoding the parent xylanase (hereinafter also referred to as parent xylanase gene). It can be prepared by mutating the encoding nucleotide sequence (codon) to the nucleotide sequence (codon) encoding the abasic amino acid residue after substitution. By expressing the mutated polynucleotide, a mutated xylanase in which the amino acid residue to be substituted is replaced with a desired non-basic amino acid residue can be obtained.
親キシラナーゼ遺伝子への目的の変異の導入は、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。 Introduction of the target mutation into the parent xylanase gene can be performed using various site-specific mutagenesis methods well known to those skilled in the art. The site-directed mutagenesis method is performed by any method such as inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., “Revised 4th edition, New Genetic Engineering Handbook”, Yodosha, p. 82-88). Can do. Various commercially available site-specific mutagenesis kits such as QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit of Stratagene and QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit can also be used as necessary.
あるいは、親キシラナーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親キシラナーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後の非塩基性アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し、選択することができる。 Alternatively, site-directed mutagenesis into the parent xylanase gene can be performed using a mutation primer containing a nucleotide mutation to be introduced. Such a mutation primer is annealed to a region containing a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be substituted in the parent xylanase gene, and substituted in place of the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be substituted. What is necessary is just to design so that the nucleotide sequence which has a nucleotide sequence (codon) which codes a nonbasic amino acid residue after may be included. Those skilled in the art can appropriately recognize and select the nucleotide sequence (codon) encoding the substitution target and the substituted amino acid residue based on a normal textbook or the like.
例えば、親キシラナーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つの変異プライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７７（１），ｐ．６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。このＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた変異導入手順については、後述の実施例にも詳述している。 For example, site-directed mutagenesis into the parent xylanase gene involves DNA fragments obtained by amplifying the upstream and downstream sides of the mutation site by separately using two complementary mutation primers containing the nucleotide mutation to be introduced. (Splicing by overlap extension) -PCR (Horton RM et al., Gene (1989) 77 (1), p. 61-68) can also be used. This mutagenesis procedure using the SOE-PCR method is also described in detail in the examples below.
親キシラナーゼ遺伝子の例としては、配列番号２で示されるサーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼの触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、ならびに配列番号４で示されるサーモビフィダ・フスカＹＸ由来キシラナーゼの全長配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）が挙げられる。当該ポリヌクレオチドは、当該分野で用いられる任意の方法により取得することができる。例えば、サーモビフィダ・フスカＹＸの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１の配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的核酸を選択的に増幅し、増幅した核酸を精製することで、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。 Examples of a parent xylanase gene include a polynucleotide (SEQ ID NO: 1) encoding a catalytic domain of Thermobifida fusca YX-derived xylanase represented by SEQ ID NO: 2, and a full-length sequence of Thermobifida fusca YX-derived xylanase represented by SEQ ID NO: 4 And the polynucleotide encoding SEQ ID NO: 3. The polynucleotide can be obtained by any method used in the art. For example, after extracting the entire genomic DNA of Thermobifidida Husca YX, the target nucleic acid is selectively amplified by PCR using a primer designed based on the sequence of SEQ ID NO: 1, and the amplified nucleic acid is purified. A polynucleotide encoding the amino acid sequence shown by No. 2 can be obtained.
あるいは、親キシラナーゼ遺伝子の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるポリヌクレオチドに対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって調製することができる。例えば、配列番号１で示されるポリヌクレオチドに上記公知の方法で突然変異導入し、得られた変異ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのキシラナーゼ活性を調べ、所望のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異ポリヌクレオチドを選択することによって、親キシラナーゼ遺伝子を得ることができる。 Alternatively, examples of the parent xylanase gene include a polynucleotide encoding an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Such a polynucleotide can be prepared by introducing a mutation into the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 by a known mutagenesis method such as ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis. For example, a mutation encoding a polypeptide having a desired xylanase activity by introducing a mutation into the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 by the above known method, examining the xylanase activity of the polypeptide encoded by the obtained mutant polynucleotide By selecting a polynucleotide, the parent xylanase gene can be obtained.
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（いずれもタカラバイオ株式会社製）などを好適に用いることができる。 The type of the vector into which the polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention is to be introduced is not particularly limited, and examples of the vector generally used for protein production include plasmids, cosmids, phages, viruses, YACs, and BACs. Among these, plasmid vectors are preferable, and for example, commercially available plasmid vectors for protein expression such as shuttle vectors pHY300PLK, pUC19, pUC119, and pBR322 (all manufactured by Takara Bio Inc.) can be suitably used.
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、上記本発明の変異キシラナーゼをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、本発明のベクターを導入する宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養をコードする遺伝子を含むベクターを用いてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、当該遺伝子が当該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。 The vector may contain a DNA fragment containing a DNA replication initiation region or a DNA region containing a replication origin. Alternatively, in the vector, a promoter region for initiating transcription of the gene, a terminator region, or secretion for secreting the expressed protein to the outside of the gene encoding the mutant xylanase of the present invention. A control sequence such as a signal region may be operably linked. Alternatively, a marker gene (for example, a resistance gene of a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol) for selecting a host into which the vector is appropriately introduced may be further incorporated. Alternatively, when an auxotrophic strain is used as a host into which the vector of the present invention is introduced, a vector containing a gene encoding the required nutrition may be used. In this specification, a gene and a regulatory sequence are “operably linked” means that the gene and a regulatory region are arranged so that the gene can be expressed under the control of the regulatory region. Say.
キシラナーゼをコードする配列と上記制御配列やマーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法などの方法によって行うことができる。プラスミドベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。 The xylanase-encoding sequence can be linked to the control sequence or marker gene sequence by a method such as the SOE-PCR method described above. Procedures for introducing gene sequences into plasmid vectors are well known in the art. The types of control sequences such as the promoter region, terminator, and secretion signal region are not particularly limited, and a commonly used promoter or secretion signal sequence can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
上記制御配列の例としては、Ｓ２３７ｅｇｌプロモーター及びシグナル配列（Ｂｉｏｓｃｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，６４（１１）：２２８１−２２８９）、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。あるいは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、βキシロシダーゼなどの糖化酵素を発現するプロモーターを使用してもよい。あるいは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの代謝経路の酵素のプロモーターを使用してもよい。 Examples of the control sequences include S237egl promoter and signal sequence (Biosci, Biotechnol, Biochem, 2000, 64 (11): 2281-2289), and Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) or Bacillus sp. Examples thereof include a transcription initiation control region, a translation initiation region, and a secretory signal peptide region of a cellulase gene derived from KSM-64 strain (FERM BP-2886). Alternatively, a promoter that expresses a saccharifying enzyme such as cellobiohydrolase, endoglucanase, β-glucosidase, xylanase, and β-xylosidase may be used. Alternatively, promoters of metabolic pathway enzymes such as pyruvate decarboxylase, alcohol dehydrogenase, and pyruvate kinase may be used.
上記ベクターを導入する形質転換体の宿主の例としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５−１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７−１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられ、このうち、酵素生産性の観点からはトリコデルマ属が好ましい。 Examples of the transformant host into which the vector is introduced include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi. Examples of bacteria include Escherichia coli, Staphylococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus, and the like. Bacillus bacteria (for example, Bacillus subtilis or mutants thereof) are preferred. Examples of Bacillus subtilis mutants include J. Biosci. Bioeng. , 2007, 104 (2): 135-143, and a protease 9-deficient strain KA8AX described in Biotechnol. Lett. , 2011, 33 (9): 1847-1852, the D8PA strain in which the protein folding efficiency is improved in the 8-fold protease deficient strain. Examples of filamentous fungi include Trichoderma, Aspergillus, Rizhopus, etc. Among these, Trichoderma is preferable from the viewpoint of enzyme productivity.
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。 As a method for introducing a vector into a host, a method usually used in the art such as a protoplast method and an electroporation method can be used. By selecting an appropriately introduced strain using marker gene expression, auxotrophy, etc. as an index, the target transformant introduced with the vector can be obtained.
斯くして得られた、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、当該ベクター上の遺伝子が発現して、本発明の変異キシラナーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。 When the thus obtained transformant introduced with the vector containing the polynucleotide encoding the mutant xylanase of the present invention is cultured in an appropriate medium, the gene on the vector is expressed and the mutation of the present invention is expressed. Xylanase is produced. A medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of microorganism of the transformant.
あるいは、本発明の変異キシラナーゼは、無細胞翻訳系を使用して変異キシラナーゼ遺伝子又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。 Alternatively, the mutant xylanase of the present invention may be expressed from the mutant xylanase gene or a transcription product thereof using a cell-free translation system. “Cell-free translation system” refers to an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically destroying a host cell. Is configured.
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異キシラナーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドと分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたキシラナーゼは菌体外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたキシラナーゼは、公知の手段でさらに精製されてもよい。 The mutated xylanase of the present invention produced in the above culture or cell-free translation system is a general method used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography. Etc. can be isolated or purified alone or in combination. At this time, when the polynucleotide encoding the mutant xylanase and the secretory signal sequence are operably linked on the vector in the transformant, the produced xylanase is secreted outside the cells, so that the culture is easier. Can be recovered from. The xylanase recovered from the culture may be further purified by known means.
（５．バイオマス糖化方法又は糖の製造方法）
本発明の変異キシラナーゼは、糖化残渣の吸着率が低いため、バイオマスを効率よく糖化することができる。したがって、本発明の変異キシラナーゼは、バイオマスの糖化のため、又はバイオマスからの糖の製造のために好適に使用することができる。
したがって、本発明はさらに、上記本発明の変異キシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマス糖化方法を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
(5. Biomass saccharification method or sugar production method)
Since the mutant xylanase of the present invention has a low adsorption rate of saccharification residues, it can efficiently saccharify biomass. Therefore, the mutant xylanase of the present invention can be suitably used for saccharification of biomass or production of sugar from biomass.
Therefore, the present invention further provides a biomass saccharifying agent containing the mutant xylanase of the present invention as an active ingredient.
Furthermore, this invention provides the biomass saccharifying agent containing the mutant xylanase of the said invention.
Furthermore, the present invention provides a biomass saccharification method using the mutant xylanase of the present invention or the biomass saccharifying agent of the present invention.
Furthermore, the present invention provides a method for producing sugar from biomass using the mutant xylanase of the present invention or the biomass saccharifying agent of the present invention.
本発明の変異キシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤は、好ましくはバイオマス糖化用の酵素組成物（以下、本発明の酵素組成物ということもある）である。本発明の酵素組成物は、本発明の変異キシラナーゼを含み、また糖化効率の向上の観点から、好ましくはさらにセルラーゼを含む。ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。本発明の酵素組成物に使用されるセルラーゼの例としては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。本発明の酵素組成物において、これらのセルラーゼは、単独で使用されても２種以上の組合せで使用されてもよい。糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。 The biomass saccharifying agent containing the mutant xylanase of the present invention as an active ingredient is preferably an enzyme composition for biomass saccharification (hereinafter sometimes referred to as the enzyme composition of the present invention). The enzyme composition of the present invention contains the mutant xylanase of the present invention, and preferably further contains cellulase from the viewpoint of improving saccharification efficiency. Here, cellulase refers to an enzyme that hydrolyzes the glycosidic bond of β-1,4-glucan of cellulose, and is a generic term for enzymes called endoglucanase, exoglucanase or cellobiohydrolase, β-glucosidase, and the like. It is. Examples of the cellulase used in the enzyme composition of the present invention may include commercially available cellulase preparations and cellulases derived from animals, plants and microorganisms. In the enzyme composition of the present invention, these cellulases may be used alone or in combination of two or more. From the viewpoint of improving saccharification efficiency, the cellulase preferably contains one or more selected from the group consisting of cellobiohydrolase and endoglucanase.
本発明の変異キシラナーゼと併用され得るセルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＴＭＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、及びウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Specific examples of cellulase preparations that can be used in combination with the mutant xylanase of the present invention include Celcrust (registered trademark) 1.5 L (manufactured by Novozymes), TP-60 (manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.), Cellic (registered trademark) CTec2 ( Novozymes), AcceleraseTMDUET (Genencore), and Ultraflo (registered trademark) L (Novozymes) are not limited thereto.
本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、本発明の変異キシラナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、該変異キシラナーゼの触媒ドメインの質量に換算して、好ましくは０．５〜７０質量％、より好ましくは１〜５０質量％、さらに好ましくは２〜４０質量％、さらにより好ましくは２〜３０質量％である。 The content of the mutant xylanase of the present invention in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 0.5 to 70 in terms of the mass of the catalytic domain of the mutant xylanase from the viewpoint of improving saccharification efficiency. It is 1 mass%, More preferably, it is 1-50 mass%, More preferably, it is 2-40 mass%, More preferably, it is 2-30 mass%.
本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１０〜９９質量％、より好ましくは３０〜９５質量％、さらに好ましくは５０〜９５質量％である。また、本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、本発明の変異キシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１〜３０質量％、より好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．５〜２０質量％である。 The content of the cellulase in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 10 to 99% by mass, more preferably 30 to 95% by mass, and still more preferably 50 to 95% from the viewpoint of improving saccharification efficiency. % By mass. The content of hemicellulase other than the mutant xylanase of the present invention in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 0.01 to 30% by mass, more preferably 0, from the viewpoint of improving saccharification efficiency. 0.1 to 20% by mass, more preferably 0.5 to 20% by mass.
本発明の酵素組成物における、本発明の変異キシラナーゼと上記セルラーゼとのタンパク質量比は、糖化効率向上の観点から、[本発明のキシラナーゼの触媒ドメイン／セルラーゼ]の質量比として、好ましくは０．０１〜１００、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．０５〜１、よりさらに好ましくは０．０５〜０．５である。 In the enzyme composition of the present invention, the protein amount ratio between the mutant xylanase of the present invention and the cellulase is preferably set to a mass ratio of [catalyst domain / cellulase of the xylanase of the present invention] from the viewpoint of improving saccharification efficiency. It is 01-100, More preferably, it is 0.05-5, More preferably, it is 0.05-1, More preferably, it is 0.05-0.5.
本発明によるバイオマスからの糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明の変異キシラナーゼ又は上記本発明の酵素組成物で糖化する工程を含む。本発明の糖の製造方法では、糖化残渣吸着性の低い本発明の変異キシラナーゼを用いることによって、キシラナーゼの非特異的吸着が低減することによりキシラン糖化率が向上する。さらに本発明の糖の製造方法では、セルロース糖化効率も向上する。このセルロース糖化効率向上の理由は明らかではないが、本発明の変異キシラナーゼを用いることにより、バイオマス中のヘミセルロースが効率的に分解されて、糖化酵素がセルロースに接触しやすい状態となり、全体として糖化効率が向上するためであると推測される。 The method for producing sugar from biomass according to the present invention includes a step of saccharifying biomass with the mutant xylanase of the present invention or the enzyme composition of the present invention. In the sugar production method of the present invention, by using the mutant xylanase of the present invention having a low saccharification residue adsorptivity, non-specific adsorption of xylanase is reduced, thereby improving the xylan saccharification rate. Furthermore, in the sugar production method of the present invention, cellulose saccharification efficiency is also improved. The reason for this cellulose saccharification efficiency improvement is not clear, but by using the mutant xylanase of the present invention, the hemicellulose in the biomass is efficiently decomposed and the saccharification enzyme easily comes into contact with cellulose, and the saccharification efficiency as a whole Is presumed to be improved.
本発明の酵素組成物が適用される、又は本発明の糖の製造方法で用いられるバイオマスの例としては、（１．定義）の章で前述したとおりである。入手容易性、原料コスト、及び糖化効率向上の観点からは、当該バイオマスとしては、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉又は果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。当該バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また当該バイオマスは乾燥されていてもよい。 Examples of biomass to which the enzyme composition of the present invention is applied or used in the sugar production method of the present invention are as described above in the section (1. Definition). From the viewpoints of availability, raw material costs, and saccharification efficiency, the biomass is preferably wood, processed or crushed wood, plant stems, leaves, or fruit bunches. Bagasse, EFB, oil palm (stem) ) Is more preferable, and bagasse is more preferable. The said biomass may be used individually or in mixture of 2 or more types. The biomass may be dried.
本発明のバイオマス糖化方法、及び糖の製造方法は、バイオマスの粉砕効率向上、及び糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、バイオマスを本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物で糖化する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。 The biomass saccharification method and the sugar production method of the present invention are characterized in that the biomass is converted into the mutated xylanase or enzyme composition of the present invention from the viewpoint of improving the grinding efficiency of the biomass and improving the saccharification efficiency or the sugar production efficiency (that is, shortening the sugar production time). It is preferable to further include a step of pretreating the biomass before the step of saccharification with a product.
上記前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理及び水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行うことがより好ましい。 Examples of the pretreatment include one or more selected from the group consisting of alkali treatment, pulverization treatment, and hydrothermal treatment. As the pretreatment, alkali treatment is preferable from the viewpoint of improving saccharification efficiency, and from the viewpoint of further improving saccharification efficiency, alkali treatment and pulverization treatment are preferably performed, and alkali treatment and pulverization treatment are more preferably performed simultaneously. .
上記アルカリ処理とは、バイオマスを、後述する塩基性化合物と反応させることをいう。当該アルカリ処理の方法としては、バイオマスを、後述する塩基性化合物を含むアルカリ溶液に浸漬する方法（以下、「浸漬処理」ということがある）や、バイオマスと塩基性化合物とを混合して、後述する粉砕処理にかける方法（以下、「アルカリ混合粉砕処理」ということがある）などが挙げられる。 The alkali treatment refers to reacting biomass with a basic compound described later. Examples of the alkali treatment method include a method of immersing biomass in an alkali solution containing a basic compound to be described later (hereinafter sometimes referred to as “immersion treatment”), or a mixture of biomass and a basic compound. And the like (hereinafter, sometimes referred to as “alkali mixed pulverization process”).
上記粉砕処理とは、バイオマスを機械的に粉砕して小粒子化することをいう。バイオマスを小粒子化することにより、糖化効率がより向上する。また、当該粉砕処理により、バイオマスに含まれるセルロースの結晶構造が破壊されると、糖化効率がなお向上する。当該粉砕処理は公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、バイオマスを小粒子化することができる装置であればよい。当該粉砕処理は、上述した塩基性化合物によるアルカリ処理と組み合わせてもよい。当該粉砕処理は、アルカリ処理の前又は後に行ってもよく、あるいは、粉砕処理と並行してアルカリ処理、例えば上述したアルカリ混合粉砕処理を行ってもよい。アルカリ混合粉砕処理では、例えば、アルカリ溶液に浸漬したバイオマスを粉砕処理にかけてもよく（湿式粉砕）、又は固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけてもよいが（乾式粉砕）、このうち、乾式粉砕が好ましい。 The pulverization process means that the biomass is mechanically pulverized into small particles. By making the biomass into smaller particles, the saccharification efficiency is further improved. Moreover, when the crystal structure of the cellulose contained in biomass is destroyed by the pulverization process, the saccharification efficiency is still improved. The pulverization process can be performed using a known pulverizer. There is no restriction | limiting in particular in the grinder used, What is necessary is just an apparatus which can make biomass small particles. The grinding treatment may be combined with the alkali treatment with the basic compound described above. The pulverization process may be performed before or after the alkali treatment, or may be performed in parallel with the pulverization process, for example, the alkali mixed pulverization process described above. In the alkali mixed pulverization treatment, for example, biomass immersed in an alkali solution may be subjected to pulverization treatment (wet pulverization), or solid alkali and biomass may be pulverized together (dry pulverization). Grinding is preferred.
上記水熱処理とは、バイオマスを、水分の存在下で加熱処理することをいう。当該水熱処理は、公知の反応装置を用いて行うことができ、用いられる反応装置に特に制限はない。好ましくは、当該水熱処理では、バイオマスの粗粉砕物を、水に分散した水スラリーの状態とし、これを加熱処理する。水スラリー中のバイオマスの含有量は、スラリーの流動性向上の観点から、好ましくは１〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは８〜３００ｇ／Ｌである。 The hydrothermal treatment refers to heat treatment of biomass in the presence of moisture. The hydrothermal treatment can be performed using a known reaction apparatus, and the reaction apparatus used is not particularly limited. Preferably, in the hydrothermal treatment, the coarsely pulverized biomass is made into a water slurry dispersed in water, and this is heat-treated. From the viewpoint of improving the fluidity of the slurry, the content of biomass in the water slurry is preferably 1 to 500 g / L, more preferably 5 to 400 g / L, and still more preferably 8 to 300 g / L.
本発明のバイオマス糖化方法、及び糖の製造方法は、バイオマス、好ましくは上記前処理されたバイオマスを、本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物で糖化する工程（本明細書において「糖化処理」ということがある）を含む。 The biomass saccharification method and the sugar production method of the present invention include a step of saccharifying biomass, preferably the pretreated biomass with the mutant xylanase or enzyme composition of the present invention (referred to as “saccharification treatment” in the present specification). Is included).
上記糖化処理の条件は、本発明の変異キシラナーゼ及び併用するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定することができる。 The conditions for the saccharification treatment are not particularly limited as long as the mutant xylanase of the present invention and other enzymes used in combination are not inactivated. Appropriate conditions can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the type of biomass, the procedure of the pretreatment step, and the type of enzyme used.
上記糖化処理においては、バイオマスを含む懸濁液に、本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物を添加することが好ましい。懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５〜２０質量％、より好ましくは３〜１５質量％、さらに好ましくは５〜１０質量％である。 In the saccharification treatment, it is preferable to add the mutant xylanase or enzyme composition of the present invention to a suspension containing biomass. The content of the biomass in the suspension is preferably 0.5 to 20% by mass, more preferably 3 to 15% by mass, more preferably 3 to 15% by mass, from the viewpoint of improving saccharification efficiency or sugar production efficiency (that is, shortening the sugar production time). Preferably it is 5-10 mass%.
上記懸濁液に対する本発明の変異キシラナーゼ又は酵素組成物の使用量は、上記前処理条件、ならびに併用する酵素の種類及び性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、該変異キシラナーゼの触媒ドメインの質量に換算して、好ましくは０．０４〜６００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは０．１〜５０質量％である。 The amount of the mutant xylanase or enzyme composition of the present invention to be used for the suspension is appropriately determined depending on the pretreatment conditions and the type and properties of the enzyme used together. In terms of the mass of the domain, it is preferably 0.04 to 600% by mass, more preferably 0.1 to 100% by mass, and further preferably 0.1 to 50% by mass.
上記糖化処理の反応ｐＨとしては、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５〜７である。 The reaction pH for the saccharification treatment is preferably pH 4 to 9, more preferably pH 5 to 8, and further preferably pH 5 from the viewpoints of improving saccharification efficiency or sugar production efficiency (that is, shortening the sugar production time) and reducing production costs. ~ 7.
上記糖化処理の反応温度は、糖化効率の向上、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは２５〜８５℃、さらに好ましくは３０〜８０℃、さらにより好ましくは４０〜７５℃、なお好ましくは４５〜６５℃、なおより好ましくは５０〜６５℃、さらになお好ましくは５０〜６０℃である。当該糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類若しくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜４日間、さらに好ましくは１〜３日間である。 The reaction temperature of the saccharification treatment is preferably 20 to 90 ° C., more preferably 25 to 85, from the viewpoints of improvement of saccharification efficiency, improvement of saccharification efficiency or sugar production efficiency (that is, shortening of sugar production time), and reduction of production cost. ° C, more preferably 30 to 80 ° C, even more preferably 40 to 75 ° C, still more preferably 45 to 65 ° C, still more preferably 50 to 65 ° C, still more preferably 50 to 60 ° C. The reaction time of the saccharification treatment can be appropriately set according to the type or amount of biomass, the amount of enzyme, etc., but from the viewpoint of improving saccharification efficiency or saccharide production efficiency (that is, shortening saccharide production time) and reducing production costs. Therefore, it is preferably 1 to 5 days, more preferably 1 to 4 days, and further preferably 1 to 3 days.
上述した本発明の別の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。 As another exemplary embodiment of the present invention described above, the following is further disclosed herein.
＜１＞変異キシラナーゼであって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼ。
<1> a mutant xylanase,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, provided that:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Having a non-basic amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of
Mutant xylanase.
＜２＞好ましくは、上記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置に、非塩基性アミノ酸残基を有する、＜１＞記載の変異キシラナーゼ。 <2> The mutant xylanase according to <1>, preferably having a non-basic amino acid residue at a position corresponding to position 129 and position 158 of SEQ ID NO: 2.
＜３＞好ましくは、さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置；
配列番号２の４０位に相当する位置；及び
配列番号２の５６位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置に非塩基性アミノ酸残基を有する、上記＜１＞又は＜２＞記載の変異キシラナーゼ。
<3> Preferably, further:
A position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2;
A position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 56 of SEQ ID NO: 2;
The mutant xylanase according to the above <1> or <2>, which has an abasic amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of:
＜４＞好ましくは、上記非塩基性アミノ酸残基がセリン及びアラニンより選択される、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。 <4> Preferably, the mutant xylanase according to any one of <1> to <3> above, wherein the non-basic amino acid residue is selected from serine and alanine.
＜５＞好ましくは、上記配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置の非塩基性アミノ酸残基が、以下のアミノ酸残基である、上記＜４＞記載の変異キシラナーゼ。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
<5> Preferably, the abasic amino acid residue at the position corresponding to position 10, 40, 56, 129, or 158 of SEQ ID NO: 2 is the following amino acid residue, <4> The mutant xylanase described.
Position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2; serine position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 56 of serine SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 129 of alanine SEQ ID NO: 2; serine SEQ ID NO: 2 position corresponding to position 158; serine
＜６＞好ましくは、さらに糖質結合モジュールを含む、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。 <6> Preferably, the mutant xylanase according to any one of the above <1> to <5>, further comprising a carbohydrate binding module.
＜７＞好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ。 <7> Preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a glutamic acid residue at a position corresponding to position 85 and / or a position corresponding to position 174, <1> to <6> Mutant xylanase.
＜８＞変異キシラナーゼの製造方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法。
<8> A method for producing a mutant xylanase,
In the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto, the following:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
＜９＞好ましくは、上記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換される、上記＜８＞記載の方法。 <9> The method according to <8> above, wherein the amino acid residues at the position corresponding to position 129 and the position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2 are substituted with non-basic amino acid residues.
＜１０＞好ましくは、さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置；
配列番号２の４０位に相当する位置；及び
配列番号２の５６位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、上記＜８＞又は＜９＞記載の方法。
<10> Preferably, in addition:
A position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2;
A position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 56 of SEQ ID NO: 2;
The method according to <8> or <9> above, comprising substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
＜１１＞好ましくは、上記非塩基性アミノ酸残基がセリン及びアラニンより選択される、上記＜８＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。 <11> The method according to any one of <8> to <10>, wherein the non-basic amino acid residue is preferably selected from serine and alanine.
＜１２＞好ましくは、上記配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基を置換する非塩基性アミノ酸残基が、以下のアミノ酸残基である、上記＜１１＞記載の方法。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
<12> Preferably, the non-basic amino acid residue that substitutes an amino acid residue at a position corresponding to position 10, 40, 56, 129, or 158 of SEQ ID NO: 2 is the following amino acid residue: The method described in <11> above.
Position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2; serine position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 56 of serine SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 129 of alanine SEQ ID NO: 2; serine SEQ ID NO: 2 position corresponding to position 158; serine
＜１３＞好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜８＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。 <13> Preferably, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity to the position corresponding to position 85 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and The method of any one of <8>-<12> which has a glutamic acid residue in the position corresponding to // 174th position.
＜１４＞キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置、
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、方法。
<14> A method for reducing glycation residue adsorptivity of xylanase,
In the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto, the following:
A position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2,
Substituting an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
＜１５＞好ましくは、上記配列番号２の１２９位に相当する位置及び１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、非塩基性アミノ酸残基に置換される、上記＜１４＞記載の方法。 <15> The method according to <14> above, wherein the amino acid residues at the position corresponding to position 129 and the position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2 are substituted with non-basic amino acid residues.
＜１６＞好ましくは、さらに、以下：
配列番号２の１０位に相当する位置；
配列番号２の４０位に相当する位置；及び
配列番号２の５６位に相当する位置；
からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基を、非塩基性アミノ酸残基に置換することを含む、上記＜１４＞又は＜１５＞記載の方法。
<16> Preferably, in addition:
A position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2;
A position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; and a position corresponding to position 56 of SEQ ID NO: 2;
The method according to <14> or <15> above, comprising replacing an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of a non-basic amino acid residue.
＜１７＞好ましくは、上記非塩基性アミノ酸残基がセリン及びアラニンより選択される、上記＜１４＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。 <17> The method according to any one of <14> to <16>, wherein the nonbasic amino acid residue is preferably selected from serine and alanine.
＜１８＞好ましくは、上記配列番号２の１０位、４０位、５６位、１２９位又は１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基を置換する非塩基性アミノ酸残基が、以下のアミノ酸残基である、上記＜１７＞記載の方法。
配列番号２の１０位に相当する位置；セリン
配列番号２の４０位に相当する位置；セリン
配列番号２の５６位に相当する位置；アラニン
配列番号２の１２９位に相当する位置；セリン
配列番号２の１５８位に相当する位置；セリン
<18> Preferably, the non-basic amino acid residue that substitutes an amino acid residue at a position corresponding to position 10, 40, 56, 129, or 158 of SEQ ID NO: 2 is the following amino acid residue: The method described in <17> above.
Position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2; serine position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 56 of serine SEQ ID NO: 2; position corresponding to position 129 of alanine SEQ ID NO: 2; serine SEQ ID NO: 2 position corresponding to position 158; serine
＜１９＞好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の方法。 <19> Preferably, the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity to the position corresponding to position 85 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and The method of any one of <14>-<18> which has a glutamic acid residue in the position corresponding to // 174th position.
＜２０＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。 <20> A polynucleotide encoding the mutant xylanase described in any one of <1> to <7> above.
＜２１＞上記＜２０＞記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 <21> A vector comprising the polynucleotide according to <20> above.
＜２２＞上記＜２０＞記載のポリヌクレオチド又は上記＜２１＞記載のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。 <22> A method for producing a transformant comprising introducing the polynucleotide according to <20> above or the vector according to <21> above into a host.
＜２３＞上記＜２０＞記載のポリヌクレオチド又は上記＜２１＞記載のベクターを含む形質転換体。 <23> A transformant comprising the polynucleotide according to <20> above or the vector according to <21> above.
＜２４＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤。 <24> A biomass saccharifying agent comprising the mutant xylanase according to any one of <1> to <7> above.
＜２５＞好ましくはセルラーゼをさらに含む、＜２４＞記載のバイオマス糖化剤。 <25> The biomass saccharifying agent according to <24>, preferably further comprising cellulase.
＜２６＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼを用いる、バイオマス糖化方法。 <26> A biomass saccharification method using the mutant xylanase described in any one of <1> to <7> above.
＜２７＞好ましくはさらにセルラーゼを用いる、＜２６＞記載の方法。 <27> The method according to <26>, preferably further using cellulase.
＜２８＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼのバイオマス糖化のための使用。 <28> Use of the mutant xylanase according to any one of <1> to <7> above for biomass saccharification.
＜２９＞好ましくはセルラーゼと併用される、＜２８＞記載の使用。 <29> Use according to <28>, preferably in combination with cellulase.
＜３０＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ、又は上記＜２４＞若しくは＜２５＞記載のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。 <30> A method for producing sugar from biomass, using the mutant xylanase according to any one of <1> to <7> or the biomass saccharifying agent according to <24> or <25>.
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 EXAMPLES Hereinafter, an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely.
＜参考例１ ＰＣＲ反応＞
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）又はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマーとアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘを１０μＬ添加して、反応液総量を２０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５５〜６０℃で１０秒間及び７２℃で１０〜９０秒間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１０秒）の３段階の温度変化を３０回繰り返すことにより行った。
<Reference Example 1 PCR reaction>
In the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, an Applied Biosystems 2720 thermal cycler (Applied Biosystems) was used, and PrimeSTAR Max Premix (Takara Bio) or PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio). DNA amplification was performed using the attached reagents. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol each of sense primer and antisense primer, and 10 μL PrimeStar Max Premix, so that the total reaction solution volume was 20 μL. The PCR reaction conditions were 98 ° C. for 10 seconds, 55 to 60 ° C. for 10 seconds and 72 ° C. for 10 to 90 seconds (adjusted according to the target amplification product. The standard is 10 seconds per kb). This was done by repeating 30 times.
＜参考例２ タンパク質濃度測定 （Ｌｏｗｒｙ法）＞
タンパク質の定量にはＬｏｗｒｙ法を用いた。酵素溶液は適切な濃度にイオン交換水で希釈した後、ＤＣプロテインアッセイ（バイオラッド）を用いて定量した。Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ １ｍＬに対してＲｅａｇｅｎｔ Ｓを２０μＬの割合で混合し、タンパク質５μＬに対してこの混合液を２５μＬ添加した。さらにＲｅａｇｅｎｔ Ｂ（発色液）を１５８μＬ添加し、１５分間室温で静置した。マイクロプレートリーダー（Ｖｅｒｓａ ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で７５０ｎｍの吸光度を測定し、ＢＳＡの検量線からタンパク質の濃度を定量した。
<Reference Example 2 Protein Concentration Measurement (Lowry Method)>
The Lowry method was used for protein quantification. The enzyme solution was diluted with ion-exchanged water to an appropriate concentration, and then quantified using a DC protein assay (BioRad). Reagent S was mixed at a ratio of 20 μL to 1 mL of Reagent A, and 25 μL of this mixed solution was added to 5 μL of protein. Further, 158 μL of Reagent B (color developing solution) was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Absorbance at 750 nm was measured with a microplate reader (Versa max, Molecular Devices), and the protein concentration was quantified from a BSA calibration curve.
＜参考例３ キシラナーゼ活性の測定＞
キシラナーゼ活性の測定は３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて、生成糖の還元末端を定量化した。終濃度可溶キシラン１％（ｗ／ｖ）（２％（ｗ／ｖ）ｘｙｌａｎ ｆｒｏｍ ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１分間煮沸し、室温に静置後、遠心分離により得られた上清を可溶キシランとした）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、酵素１０μＬを混合し、５０℃で１０分間反応させた。反応終了後、１００μＬのＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム（和光純薬工業）１．６％（ｗ／ｖ）、ジニトロサリチル酸（和光純薬工業）０．５％（ｗ／ｖ）、酒石酸ナトリウムカリウム（和光純薬工業）３０．０％（ｗ／ｖ））を添加し、９９．９℃で１０分間反応させた。マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイスジャパン）で波長５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、生成糖の還元末端を定量化した。検量線にはキシロースを用いた。
<Reference Example 3 Measurement of Xylanase Activity>
The xylanase activity was measured by quantifying the reducing end of the produced sugar by the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method. Final concentration soluble xylan 1% (w / v) (2% (w / v) xylan from beechwood (Sigma Aldrich) is boiled for 1 minute, allowed to stand at room temperature, and then the supernatant obtained by centrifugation is soluble Xylan), 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0), and 10 μL of enzyme were mixed and reacted at 50 ° C. for 10 minutes. After the reaction, 100 μL of DNS solution (sodium hydroxide (Wako Pure Chemical Industries) 1.6% (w / v), dinitrosalicylic acid (Wako Pure Chemical Industries) 0.5% (w / v), sodium potassium tartrate ( 30.0% (w / v)) was added and reacted at 99.9 ° C. for 10 minutes. By measuring the absorbance at a wavelength of 540 nm with a microplate reader (Molecular Device Japan), the reducing end of the produced sugar was quantified. Xylose was used for the calibration curve.
＜参考例４ バイオマスの調製＞
（１）バガス調製
バガス（サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量７．０質量％）を減圧乾燥機ＶＯ−３２０（アドバンテック東洋）中に入れ、窒素流通下の条件で２時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量２．０質量％の乾燥バガスを得た。
（２）混合粉砕処理
得られた乾燥バガス１００ｇと粒径０．７ｍｍの粒状の水酸化ナトリウム「トーソーパール」（東ソー社製）８．８ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）を、バッチ式振動ミルＭＢ−１（中央化工機：容器全容積３．５Ｌ、媒体としてφ３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、断面形状が円形のＳＵＳ３０４製ロッドを１３本使用、ロッド充填率５７％）に投入し、２時間粉砕処理することでバガス粉砕物（平均粒子径約１６．６μｍ）を得た。
<Reference Example 4 Preparation of Biomass>
(1) Bagasse preparation Bagasse (sugar cane pomace, holocellulose content 71.3 mass%, crystallinity 29%, moisture content 7.0 mass%) is placed in a vacuum dryer VO-320 (Advantech Toyo). The dried bagasse was dried under reduced pressure for 2 hours under conditions of nitrogen flow to obtain a dry bagasse having a holocellulose content of 71.3% by mass, a crystallinity of 29% and a water content of 2.0% by mass.
(2) Mixing and grinding treatment 100 g of the obtained dry bagasse and 8.8 g of granular sodium hydroxide “Tosoh Pearl” (manufactured by Tosoh Corporation) with a particle size of 0.7 mm (0.5 mol with respect to 1 mol of AGU constituting holocellulose) Equivalent amount), batch type vibration mill MB-1 (Central Chemical Machine: Container total volume 3.5L, φ30mm, length 218mm as medium, 13 SUS304 rods with circular cross section, rod filling rate 57% ) And pulverized for 2 hours to obtain a bagasse pulverized product (average particle size of about 16.6 μm).
＜参考例５ 糖化残渣＞
参考例４で調製したアルカリ混合粉砕バガス５％（ｗ／ｖ）、セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社）５ｍｇ／ｇ−バイオマス、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン塩酸塩（ｗａｋｏ）、０．６μｇ／ｍＬエリスロマイシン（ｗａｋｏ）を含む１０ｍＬの液を、２５ｍＬの自立型遠沈管中で５０℃、１５０ｒｐｍ（タイテック：ＢＲ−４０Ｆ）にて２４時間反応させ、バガスを糖化させた。反応終了後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ×１０分）により上清を除去し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で２回洗浄し、固形分を回収した。得られた糖化残渣を（以下、ＣＴｅｃ２糖化残渣という）を、以下のキシラナーゼ吸着性解析に用いた。
<Reference Example 5 Saccharification Residue>
Alkaline mixed ground bagasse 5% (w / v) prepared in Reference Example 4, cellulase preparation Cellic (registered trademark) CTec2 (Novozymes) 5 mg / g-biomass, 30 μg / mL tetracycline hydrochloride (wako), 0.6 μg / 10 mL of the solution containing mL erythromycin (wako) was reacted in a 25 mL free-standing centrifuge tube at 50 ° C. and 150 rpm (Tytech: BR-40F) for 24 hours to saccharify bagasse. After completion of the reaction, the supernatant was removed by centrifugation (11000 rpm × 10 minutes) and washed twice with 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) to recover the solid content. The obtained saccharification residue (hereinafter referred to as CTec2 saccharification residue) was used for the following xylanase adsorptive analysis.
＜参考例６ 糖化残渣に対する吸着性解析＞
参考例５で調製した糖化残渣を基質として用い、キシラナーゼの吸着挙動を解析した。参考例５で調製した糖化残渣の質量を検量線より算出し、所定濃度の糖化残渣（基質）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、キシラナーゼ５０〜１５８μｇ／ｍＬを含む０．５〜１ｍＬの反応液を、２ｍＬのエッペンドルフチューブ又は９６穴ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＩＥＮＴＩＦＩＣ）で、５０℃、１５０ｒｐｍにて１時間振盪した。反応終了後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、キシラナーゼ活性を前述のＤＮＳ法で測定した。下記式で示すように、基質濃度０ｍｇ／ｍＬの場合の活性を１００とし、基質と反応させた反応液の上清のキシラナーゼ相対比活性を算出した。得られた活性値を１００から減算することでキシラナーゼの糖化残渣吸着率を算出した。
糖化残渣吸着率（％）＝１００−相対比活性（％）
相対比活性（％）＝（糖化残渣を添加した反応液上清のキシラナーゼ活性／糖化残渣未添加の反応液上清のキシラナーゼ活性）×１００
<Reference Example 6 Adsorbability Analysis for Saccharification Residue>
Using the saccharification residue prepared in Reference Example 5 as a substrate, the adsorption behavior of xylanase was analyzed. The mass of the saccharification residue prepared in Reference Example 5 is calculated from a calibration curve, and 0.5 mL to 1 mL of a reaction solution containing saccharification residue (substrate) at a predetermined concentration, 50 mM sodium acetate buffer, and xylanase 50 to 158 μg / mL is added to 2 mL. In an Eppendorf tube or a 96-well deep well plate (Thermo SIENTIFIC) and shaken at 50 ° C. and 150 rpm for 1 hour. After completion of the reaction, the supernatant was collected by centrifugation (11000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), and the xylanase activity was measured by the DNS method described above. As shown by the following formula, the activity at the substrate concentration of 0 mg / mL was defined as 100, and the xylanase relative specific activity of the supernatant of the reaction solution reacted with the substrate was calculated. By subtracting the obtained activity value from 100, the saccharification residue adsorption rate of xylanase was calculated.
Saccharification residue adsorption rate (%) = 100-relative specific activity (%)
Relative specific activity (%) = (xylanase activity of reaction supernatant with addition of saccharification residue / xylanase activity of reaction supernatant without addition of saccharification residue) × 100
＜実施例１ 変異キシラナーゼの調製＞
（１）キシラナーゼ遺伝子含有ベクターの作製
サーモビフィダ・フスカ ＹＸ株（Ｔｆｕ）をＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ培地（３．０％Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ、２．０％Ａｇａｒ）に植菌し、２８℃にて１日間培養した。培養で得られた菌体から、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＭｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
<Example 1 Preparation of Mutant Xylanase>
(1) Preparation of xylanase gene-containing vector Thermobifida fusca strain YX (Tfu) was inoculated in Trypticase Soy Agar medium (3.0% Trypticase Soy, 2.0% Agar) and cultured at 28 ° C for 1 day. Genomic DNA was obtained from the cells obtained by the culture using an UltraClean ™ Microbial DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.).
得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマーＴｆｕ−Ｘｙｎ Ｆ（配列番号８）とリバースプライマーＴｆｕ−Ｘｙｎ Ｒ（配列番号９）を用いて、Ｔｆｕキシラナーゼ（Ｔｆｕ−Ｘｙｎ）遺伝子領域（配列番号３）の約１．０ｋｂｐ断片（Ａ）を含むベクターを作製した。 Using the obtained genomic DNA as a template, the Tfu xylanase (Tfu-Xyn) gene region using the forward primer Tfu-Xyn F (SEQ ID NO: 8) and reverse primer Tfu-Xyn R (SEQ ID NO: 9) shown in Table 1 A vector containing about 1.0 kbp fragment (A) of (SEQ ID NO: 3) was prepared.
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のＢａｍＨＩ制限酵素切断点に、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７アルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号７）をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマーｐＨＹ−Ｓ２３７ Ｆ（配列番号１０）とリバースプライマーｐＨＹ−Ｓ２３７ Ｒ（配列番号１１）を用いてＳ２３７アルカリセルラーゼ構造遺伝子を除く領域の約５．６ｋｂｐ断片（Ｂ）を増幅した。増幅した遺伝子断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。 The S237 alkaline cellulase gene derived from the Bacillus bacterium KSM-S237 strain (FERM BP-7875) (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-210081) (SEQ ID NO: 7) at the BamHI restriction enzyme cleavage point of the shuttle vector pHY300PLK (Takara Bio) Using the recombinant plasmid pHY-S237 into which the DNA fragment to be encoded was inserted as a template, using the forward primer pHY-S237 F (SEQ ID NO: 10) and reverse primer pHY-S237 R (SEQ ID NO: 11) shown in Table 1, S237 An approximately 5.6 kbp fragment (B) in the region excluding the alkaline cellulase structural gene was amplified. The amplified gene fragment was purified with High Pure PCR Product Purification kit (Roche).
精製されたＤＮＡ断片（Ａ）１μＬとＤＮＡ断片（Ｂ）１μＬ、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）に含まれる５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉ×２μＬ、ＤＮａｓｅフリーの水６μＬを混合し、５０℃で１５分反応させ、キシラナーゼ遺伝子の断片をベクターにクローニングした。その後、反応液２μＬを用いて、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。形質転換体の再生培地には、５０ｐｐｍアンピシリンナトリウム（和光純薬工業）、２．０％アガー（和光純薬工業）を含むＬＢ寒天培地を用いた。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体は同様のＬＢ寒天培地を用いて培養後（３７℃、１日間）、得られた菌体からプラスミドをＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて回収、精製した。 Purified DNA fragment (A) 1 μL and DNA fragment (B) 1 μL, 5 × In-Fusion® HD Enzyme Premi × 2 μL included in In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Takara Bio), DNase 6 μL of free water was mixed and reacted at 50 ° C. for 15 minutes, and the xylanase gene fragment was cloned into a vector. Then, using 2 μL of the reaction solution, competent cell E.I. 20 μL of E. coli DH5α (Takara Bio) was transformed. An LB agar medium containing 50 ppm ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries) and 2.0% agar (Wako Pure Chemical Industries) was used as the regeneration medium for the transformant. From the transformants obtained as ampicillin resistant strains, a strain carrying the plasmid into which the target gene was inserted was selected by colony PCR. The selected transformant was cultured using the same LB agar medium (37 ° C., 1 day), and then the plasmid was recovered and purified from the obtained bacterial cell using High Pure Plasmid Isolation kit (Roche).
（２）キシラナーゼ触媒ドメイン遺伝子の調製
キシラナーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）をコードする遺伝子の発現ベクターを作製するために、上述のＴｆｕ−Ｘｙｎ遺伝子が挿入された組み換えプラスミドを鋳型とし、表１に示したフォワードプライマーＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ Ｆ（配列番号１２）とリバースプライマーＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ Ｒ（配列番号１３）を用いたＰＣＲにて、Ｔｆｕ−ＸｙｎのＣＤをコードする遺伝子を含む約５．６〜６．０ｋｂｐ断片を増幅した。プライマーの作製はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のマニュアルに従った。遺伝子断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。精製したＰＣＲ断片２μＬを用いてコンピテンとセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。以下において、Ｔｆｕ由来キシラナーゼ触媒ドメインをＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎということがある。
(2) Preparation of xylanase catalytic domain gene In order to prepare an expression vector for a gene encoding a xylanase catalytic domain (CD), the recombinant plasmid inserted with the Tfu-Xyn gene described above was used as a template, and the forward shown in Table 1 About 5.6 to 6 containing a gene encoding CD of Tfu-Xyn by PCR using primer Tfu-CD-Xyn F (SEQ ID NO: 12) and reverse primer Tfu-CD-Xyn R (SEQ ID NO: 13) A 0.0 kbp fragment was amplified. Primers were prepared according to the manual of PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio). The gene fragment was purified with High Pure PCR Product Purification kit (Roche). Using 2 μL of the purified PCR fragment, competence and cell E. coli were used. 20 μL of E. coli DH5α (Takara Bio) was transformed. Hereinafter, the Tfu-derived xylanase catalytic domain is sometimes referred to as Tfu-CD-Xyn.
（３）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
Ｔｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎの変異キシラナーゼを作製した。上記（２）のＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表２記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、それぞれ、配列番号２の１２９位又は１５８位に相当する位置のアミノ酸の変異を含む変異キシラナーゼ（それぞれ、Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓと表記する）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。すなわち、Ｒ１２９Ｓについては、配列番号３の５１１〜５１３番ヌクレオチドｃｇｔ（アルギニン；Ｒ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。Ｒ１５８Ｓについては、配列番号３の５９８〜６００番ヌクレオチドａｇａ（アルギニン；Ｒ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。
さらに、Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓの両変異を含む変異キシラナーゼ（Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片も作製した。
次いで、上記（２）と同様の方法で、各変異体をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
(3) Preparation of mutant xylanase gene A mutant xylanase of Tfu-CD-Xyn was prepared. Positions corresponding to positions 129 and 158 of SEQ ID NO: 2, respectively, using the plasmid introduced with the gene encoding Tfu-CD-Xyn of (2) above as a template and using the primers shown in Table 2 DNA fragments encoding mutant xylanases containing the amino acid mutations (represented as R129S and R158S, respectively) were amplified. That is, for R129S, nucleotides c511 (arginine; R) of SEQ ID NO: 3 were substituted with tca (serine; S). For R158S, nucleotides a598 (arginine; R) of SEQ ID NO: 3 were substituted with tca (serine; S).
Furthermore, a DNA fragment containing a gene encoding a mutant xylanase (R129S / R158S) containing both R129S and R158S mutations was also prepared.
Next, in the same manner as in (2) above, DNAs encoding each mutant are ligated onto a plasmid vector in a predetermined order, and the resulting plasmid is used to transform E. coli, select transformants, and Plasmid purification was performed.
（４）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
表３記載のプライマーを用いて、上記（３）と同様の手順で、配列番号２の１０位、４０位、又は５６位に相当する位置のアミノ酸の変異を含む変異キシラナーゼ（それぞれ、Ｈ１０Ｓ、Ｒ４０Ｓ、及びＲ５６Ａと表記する）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。すなわち、Ｈ１０Ｓについては、配列番号３の１５４〜１５６番ヌクレオチドｃａｔ（ヒスチジン；Ｈ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。Ｒ４０Ｓについては、配列番号３の２４４〜２４６番ヌクレオチドａｇａ（アルギニン；Ｒ）をｔｃａ（セリン；Ｓ）へ置換した。Ｒ５６Ａについては、配列番号３の２９２〜２９４番ヌクレオチドｃｇｇ（アルギニン；Ｒ）をｇｃａ（アラニン；Ａ）へ置換した。
次いで、上記（２）と同様の方法で、各変異体をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
(4) Preparation of mutant xylanase gene In the same procedure as in (3) above, using the primers listed in Table 3, amino acid mutations at positions corresponding to positions 10, 40, or 56 of SEQ ID NO: 2 are included. DNA fragments encoding mutant xylanases (represented as H10S, R40S, and R56A, respectively) were amplified. That is, for H10S, nucleotides 154 to 156 of SEQ ID NO: 3 (histidine; H) were substituted with tca (serine; S). For R40S, nucleotides 244 to 246 in SEQ ID NO: 3 were substituted with tca (serine; S). For R56A, nucleotides 292 to 294 of SEQ ID NO: 3 (arginine; R) were substituted with gca (alanine; A).
Next, in the same manner as in (2) above, DNAs encoding each mutant are ligated onto a plasmid vector in a predetermined order, and the resulting plasmid is used to transform E. coli, select transformants, and Plasmid purification was performed.
（５）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
さらに、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表３記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓとともに、Ｈ１０Ｓ、Ｒ４０Ｓ又はＲ５６Ａの変異を含む変異キシラナーゼ（それぞれ、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ／Ｈ１０Ｓ、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ／Ｒ４０Ｓ、及びＲ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓ／Ｒ５６Ａと表記する）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
次いで、上記（２）と同様の方法で、各変異体をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
(5) Preparation of mutant xylanase gene Furthermore, PCR was carried out using the plasmid into which the gene encoding R129S / R158S was introduced as a template and using the primers shown in Table 3, and H10S, R40S or R56A mutations were performed together with R129S and R158S. A DNA fragment containing a gene encoding a mutant xylanase containing (represented as R129S / R158S / H10S, R129S / R158S / R40S, and R129S / R158S / R56A, respectively) was amplified.
Next, in the same manner as in (2) above, DNAs encoding each mutant are ligated onto a plasmid vector in a predetermined order, and the resulting plasmid is used to transform E. coli, select transformants, and Plasmid purification was performed.
（６）変異キシラナーゼ生産
上記（３）〜（５）で精製したプラスミドを、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）に従って、宿主菌に導入した。宿主には、枯草菌１６８株から９つの菌体外プロテアーゼを欠損させたＫＡ８ＡＸ、又は１６８株から８つの菌体外プロテアーゼを欠損させ、タンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を使用した。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有ＤＭ３再生寒天培地（バクトカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、コハク酸二ナトリウム六水和物（和光純薬工業）４．０５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二カリウム（和光純薬工業）０．３５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム（和光純薬工業）０．１５％（ｗ／ｖ）、グルコース（和光純薬工業）０．１％（ｗ／ｖ）、塩化マグネシウム（和光純薬工業）２０ｍＭ、牛血清アルブミン（和光純薬工業）０．０１％（ｗ／ｖ）、トリパンブルー０．００５％（ｗ／ｖ）（ＡＣＲＯＳ ＯＲＧＡＮＩＣＳ）、テトラサイクリン塩酸塩（和光純薬工業）０．００５％（ｗ／ｖ）、カルボキシメチルセルロース１．０％（ｗ／ｖ）、寒天１．０％（ｗ／ｖ））を用いた。
(6) Production of mutant xylanase The plasmid purified in the above (3) to (5) was introduced into a host bacterium according to the protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet., 1979, 168: 111-115). As a host, KA8AX in which 9 extracellular proteases were deleted from Bacillus subtilis 168 strain, or D8PA strain in which 8 extracellular proteases were deleted from 168 strain and protein folding efficiency was improved was used. Transformant regeneration medium includes tetracycline-containing DM3 regeneration agar medium (Bactocasamino acid (Difco) 0.5% (w / v), yeast extract (Difco) 0.5% (w / v), disodium succinate Hexahydrate (Wako Pure Chemical Industries) 4.05% (w / v), dipotassium monohydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries) 0.35% (w / v), dipotassium dihydrogen phosphate (wa) Kojun Pharmaceutical) 0.15% (w / v), Glucose (Wako Pure Chemical Industries) 0.1% (w / v), Magnesium Chloride (Wako Pure Chemical Industries) 20 mM, Bovine Serum Albumin (Wako Pure Chemical Industries) 0.01% (w / v), trypan blue 0.005% (w / v) (ACROS ORGANICS), tetracycline hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries) 0.005% (w / v), carboxymethylcellulose 1.0 % (W / v), cold 1.0% (w / v)) was used.
ＤＭ３再生寒天培地上に生育した形質転換体をＬＢ（１５μｇ／ｍＬテトラサイクリン・大試験管）５ｍＬに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで１６時間振盪培養した。培養液６００μＬを２×Ｌ Ｍａｌ培地３０ｍＬ（バクトトリプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１．０％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン五水和物（和光純薬工業）７５ｐｐｍ、マルトース一水和物（和光純薬工業）７．５％（ｗ／ｖ）、テトラサイクリン塩酸塩１５ｐｐｍ）に接種し、３０℃、１２０ｒｐｍにて２〜３日間振盪培養（ＰＲＥＣｉ：ＰＲＸＹｇ−５６−Ｒ型）した。得られた培養液は遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分）により上清を回収した。得られた上清はＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により脱塩、バッファー置換した。置換用のバッファーには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーを用いた。 The transformant grown on the DM3 regeneration agar medium was inoculated into 5 mL of LB (15 μg / mL tetracycline / large test tube) and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 16 hours. 600 μL of the culture solution was added to 30 mL of 2 × L Mal medium (bactotryptone 2% (w / v), yeast extract 1.0% (w / v), sodium chloride 1.0% (w / v), manganese sulfate pentahydrate Inoculated into Japanese product (Wako Pure Chemical Industries) 75ppm, maltose monohydrate (Wako Pure Chemical Industries) 7.5% (w / v), tetracycline hydrochloride 15ppm) at 30 ° C, 120rpm for 2-3 days Shaking culture (PRECi: PRXYg-56-R type) was performed. The supernatant of the obtained culture broth was collected by centrifugation (8000 rpm, 15 minutes). The obtained supernatant was desalted and buffer-substituted with Econo-Pac (registered trademark) 10DG Columns (BIO RAD). A 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer was used as a replacement buffer.
＜実施例２ 変異キシラナーゼの糖化残渣吸着性＞
実施例１で調製した変異キシラナーゼについて、参考例６記載の手順（糖化残渣濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）にて、糖化残渣に対する吸着率を解析した。結果を表４〜表６に示す。キシラナーゼ変異体Ｒ１２９Ｓ及びＲ１５８Ｓは、野生型（Ｔｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ）と比較して、糖化残渣吸着率が大きく低減していた。また、両変異を組み合わせた二重変異体Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓでは、糖化残渣吸着率はさらに低減した（表４）。キシラナーゼ変異体Ｒ４０Ｓ及びＲ５６Ａも、野生型と比較して糖化残渣吸着率が低減していた（表５）。Ｒ４０Ｓ又はＲ５６Ａと、Ｒ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓとを組み合わせた多重変異体では、糖化残渣吸着率の低減がさらに顕著であった（表６）。一方、Ｈ１０Ｓの単独変異体では、糖化残渣吸着率の低減は観察されなかった（表５）が、Ｈ１０ＳとＲ１２９Ｓ／Ｒ１５８Ｓとを組み合わせた多重変異体では、糖化残渣吸着率が顕著に低減した（表６）。
<Example 2 Adsorption property of saccharification residue of mutant xylanase>
With respect to the mutant xylanase prepared in Example 1, the adsorption rate to the saccharification residue was analyzed by the procedure described in Reference Example 6 (the saccharification residue concentration was 10 mg / mL). The results are shown in Tables 4-6. The xylanase mutants R129S and R158S had a greatly reduced saccharification residue adsorption rate compared to the wild type (Tfu-CD-Xyn). Moreover, in the double mutant R129S / R158S in which both mutations were combined, the saccharification residue adsorption rate was further reduced (Table 4). The xylanase mutants R40S and R56A also had reduced saccharification residue adsorption rates compared to the wild type (Table 5). In the multiple mutants combining R40S or R56A and R129S / R158S, the reduction of the saccharification residue adsorption rate was more remarkable (Table 6). On the other hand, in the single mutant of H10S, no reduction in glycation residue adsorption rate was observed (Table 5), but in the multiple mutants combining H10S and R129S / R158S, the glycation residue adsorption rate was significantly reduced ( Table 6).
Claims (15)
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置におけるセリン；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置におけるセリン、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、
変異キシラナーゼ。 A mutant xylanase,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, provided that:
Serine at position corresponding to position 158 of and SEQ ID NO: 2; serine at position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2
Having at least one amino acid residue selected from the group consisting of,
Mutant xylanase.
配列番号２の１０位に相当する位置におけるセリン；
配列番号２の４０位に相当する位置におけるセリン；及び
配列番号２の５６位に相当する位置におけるアラニン；
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項１又は２記載の変異キシラナーゼ。 In addition:
Serine at a position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2;
Serine at a position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; and alanine at a position corresponding to position 56 of SEQ ID NO: 2;
At least one having an amino acid residue, according to claim 1 or 2 mutations xylanase according selected from the group consisting of.
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、
方法。 A method for producing a mutant xylanase comprising:
In the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto, the following:
Substitution of an amino acid residue at a position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and substitution of an amino acid residue at a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2;
Is selected from the group consisting of include making the replacement of at least one amino acid residue,
Method.
配列番号２の１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；
配列番号２の４０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の５６位に相当する位置におけるアミノ酸残基のアラニンへの置換；
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、請求項５又は６記載の方法。 In addition:
Substitution of an amino acid residue with serine at a position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2;
Substitution of an amino acid residue at position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; and substitution of an amino acid residue at position corresponding to position 56 of SEQ ID NO: 2;
At least one amino involves the replacement of the acid residues, according to claim 5 or 6 method described is selected from the group consisting of.
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、以下：
配列番号２の１２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の１５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、
方法。 A method for reducing xylanase saccharification residue adsorption,
In the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto, the following:
Substitution of an amino acid residue at a position corresponding to position 129 of SEQ ID NO: 2; and substitution of an amino acid residue at a position corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 2;
Is selected from the group consisting of include making the replacement of at least one amino acid residue,
Method.
配列番号２の１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；
配列番号２の４０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のセリンへの置換；及び
配列番号２の５６位に相当する位置におけるアミノ酸残基のアラニンへの置換；
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を行うことを含む、請求項８又は９記載の方法。 In addition:
Substitution of an amino acid residue with serine at a position corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 2;
Substitution of an amino acid residue at position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2; and substitution of an amino acid residue at position corresponding to position 56 of SEQ ID NO: 2;
It comprises performing a substitution of at least one amino acid residue selected from the group consisting of, claim 8 or 9 the method described.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014262088A JP6470967B2 (en) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | Mutant xylanase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014262088A JP6470967B2 (en) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | Mutant xylanase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016119877A JP2016119877A (en) | 2016-07-07 |
| JP6470967B2 true JP6470967B2 (en) | 2019-02-13 |
Family
ID=56326378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014262088A Active JP6470967B2 (en) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | Mutant xylanase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6470967B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113613511A (en) * | 2019-03-29 | 2021-11-05 | 株式会社益力多本社 | Novel Bifidobacterium bacteria with high availability of dietary polysaccharides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5690721B2 (en) * | 2008-06-06 | 2015-03-25 | ダニスコ・ユーエス・インク | Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity for non-cellulose materials |
| JP2013243953A (en) * | 2012-05-24 | 2013-12-09 | Kao Corp | Xylanase and method for producing sugar therewith |
| JP2015167552A (en) * | 2014-03-11 | 2015-09-28 | 花王株式会社 | mutant xylanase |
-
2014
- 2014-12-25 JP JP2014262088A patent/JP6470967B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016119877A (en) | 2016-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7007645B2 (en) | Trichoderma fungus having a mutant BXL1 gene and a method for producing xylooligosaccharide and glucose using it. | |
| WO2016054176A1 (en) | Compositions comprising beta-mannanase and methods of use | |
| US10550376B2 (en) | Xylanase | |
| EP2928911A2 (en) | Compositions of beta-mannanase and methods of use | |
| CN113234695A (en) | GH61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same | |
| WO2015137334A1 (en) | Mutant xylanases | |
| JP7208762B2 (en) | A novel arabinofuranosidase | |
| CN111770996B (en) | Mutant beta-glucosidase | |
| JP6470967B2 (en) | Mutant xylanase | |
| WO2013176205A1 (en) | Xylanase, and method for producing sugar using same | |
| WO2017217453A1 (en) | Cellulase | |
| CN111757939B (en) | Mutant beta-glucosidase | |
| JP6849749B2 (en) | New xylanase | |
| WO2014088937A1 (en) | Compositions and methods of use | |
| WO2015076260A1 (en) | Heat-resistant xylanase | |
| EP3201329A1 (en) | Compositions comprising beta mannanase and methods of use | |
| EP3201333A1 (en) | Compositions comprising beta-mannanase and methods of use | |
| JP2023145205A (en) | Enzyme composition for biomass saccharification | |
| JP2023145206A (en) | Enzyme composition for biomass saccharification | |
| JP2013243953A (en) | Xylanase and method for producing sugar therewith | |
| JP2013243954A (en) | Xylanase and method for producing sugar therewith | |
| WO2016054194A1 (en) | Compositions comprising beta-mannanase and methods of use | |
| WO2016054205A1 (en) | Compositions comprising beta mannanase and methods of use | |
| EP3201331A1 (en) | Compositions comprising beta mannanase and methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170925 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180828 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181022 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190108 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190121 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6470967 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |