JP2013243953A - Xylanase and method for producing sugar therewith - Google Patents

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Nozomi Shibata
望 柴田
Kazuaki Igarashi
一暁 五十嵐
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Kao Corp
花王株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method which can more efficiently and economically saccharify biomass.SOLUTION: There is provided an isolated or purified protein which has xylanase activity and comprises an amino acid sequence selected from (a) to (c), i.e., (a) an amino acid sequence shown by a specific sequence, (b) an amino acid sequence having the same sequence of ≥85% as the amino acid sequence shown by the specific sequence, and (c) the amino acid sequence represented by the specific sequence, wherein at least one amino acid is deleted, replaced or added.

Description

本発明は、新規キシラナーゼおよび該キシラナーゼを用いた糖の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for manufacturing the sugar with novel xylanases and said xylanase.

セルロースを含有するバイオマス材料(以下、「バイオマス」ということがある)中のセルロースから糖を製造し、それを発酵法などでエタノールや乳酸などへ変換する技術は以前より知られている。 Biomass material (hereinafter sometimes referred to as "biomass") containing cellulose to produce glucose from cellulose in, convert it in such fermentation ethanol or lactic acid to such techniques previously known. さらに近年、環境問題への取り組みの観点から、バイオマスを資源として効率よく利用する技術の開発が注目されている。 Furthermore, in recent years, from the point of view of commitment to environmental issues, the development of technology for efficient use of biomass as a resource has been attracting attention.

バイオマスは、セルロース繊維と、それを取り巻くキシランを主に含むヘミセルロースおよびリグニンから構成されている。 Biomass is composed of cellulose fibers and, hemicellulose and lignin contains mainly xylan surrounding it. バイオマスにおけるセルロースやヘミセルロースの糖化効率を高めるためには、セルロースやヘミセルロースを加水分解する酵素の開発が必要である。 To increase the saccharification efficiency of cellulose and hemicellulose in the biomass, it is necessary to develop cellulose and hemicellulose hydrolyzing enzyme. また、当該バイオマスからリグニンを除去することが必要である。 Further, it is necessary to remove the lignin from the biomass.

バイオマスのセルラーゼによる糖化や、ヘミセルラーゼやリグニナーゼによるバイオマスの酵素分解は、従来から行われている。 Saccharification and with cellulase biomass, enzymatic degradation of biomass by hemicellulase or a ligninase is conventional. 例えば、セルラーゼにTrichoderma reesei由来のキシラナーゼやアラビノフラノシダーゼなどのヘミセルラーゼが添加された酵素組成物が開発されている(特許文献1)。 For example, an enzyme composition hemicellulase such as xylanase and arabinofuranosidase from Trichoderma reesei was added to the cellulase has been developed (Patent Document 1). また、バガス堆肥に存在する微生物群由来のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、および当該タンパク質とセルラーゼとをバイオマス資源に反応させることによる糖の製造方法が知られている(特許文献2)。 A method for manufacturing a sugar by reacting the protein with xylanase activity from microorganisms present in the bagasse compost, and the said protein and cellulase biomass resource is known (Patent Document 2). さらに、ノボザイムズ社(Novozymes社)が製造販売しているキシラナーゼ製剤(Cellic(登録商標)HTecなど)も知られている。 In addition, Novozymes xylanase preparation (Novozymes, Inc.) is manufactured and sold (such as Cellic (registered trademark) HTec) are also known.

特表2011−515089号公報 JP-T 2011-515089 JP 特開2012−029678号公報 JP 2012-029678 JP

しかしながら、従来のヘミセルラーゼやキシラナーゼを用いたバイオマスの糖化方法は、糖化効率や単糖の生産性、または酵素コストの面で未だ満足できるものではなかった。 However, the saccharification process biomass using conventional hemicellulase and xylanase, was not yet satisfactory in terms of productivity or enzyme cost, saccharification efficiency and monosaccharide. さらに、従来のキシラナーゼは、至適pH領域が比較的狭く、そのため適用用途が制限される場合があった。 Furthermore, the prior art xylanase, optimum pH region is relatively narrow, there is a case for application use is restricted.
本発明は、より効率的且つ経済的にバイオマスを糖化することができ、且つ広範囲のpHで作用でき汎用性に優れた新規キシラナーゼ、および該キシラナーゼを用いた糖の製造方法に関する。 The present invention is more efficient and economical to be saccharified biomass, and a wide range of novel xylanase Versatile can act pH, and a method for producing sugar with the xylanase.

本発明者らは、広いpH領域において高いキシラナーゼ活性を発揮し得る、Xylanimonas属細菌由来の新規キシラナーゼを見出し、また当該キシラナーゼを用いることによりバイオマスの糖化を効率よく行うことができることを見出したことによって、本発明を完成した。 The present inventors, can exhibit a high xylanase activity in a wide pH region by finding novel xylanase derived Xylanimonas bacteria, also found that it is possible to perform efficiently the saccharification of biomass by using the xylanase Thus, the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、下記(a)〜(c)から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有する、単離または精製されたタンパク質(以下、「本発明のキシラナーゼ」ということがある。)を提供する。 That is, the present invention consists of an amino acid sequence selected from the following (a) ~ (c), and having a xylanase activity, isolated or purified protein (hereinafter sometimes referred to as "xylanase of the present invention".) I will provide a.
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列 (b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列 (c)配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 (A) in the amino acid sequence represented by amino acid sequence (c) SEQ ID NO: 2 having the amino acid sequence 85% or more sequence identity represented by the amino acid sequence (b) SEQ ID NO: 2 represented by SEQ ID NO: 2, one to a plurality number of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence

また、本発明は、上記本発明のキシラナーゼを含む、バイオマス糖化用酵素製剤(以下、「本発明の酵素製剤」ということがある。)を提供する。 The invention also includes a xylanase of the present invention, the biomass saccharification enzyme preparation (hereinafter sometimes referred to as "enzyme preparation of the present invention".) Provides.

さらに、本発明は、バイオマスを、上記本発明の酵素製剤で糖化する工程を含む糖の製造方法(以下、「本発明の糖の製造方法」ということがある。)を提供する。 Furthermore, the present invention, biomass, method of producing sugars, including a step of saccharification enzyme preparation of the present invention to provide a (hereinafter,. It is referred to as "production method of the sugar of the present invention").

本発明は、広いpH領域において高いキシラナーゼ活性を有するキシラナーゼを提供する。 The present invention provides a xylanase with high xylanase activity in a wide pH range. 当該キシラナーゼを使用することによって、市販のキシラナーゼ製剤などの公知のキシラナーゼまたはそれを含む組成物を使用する場合と比べて、より効率のよいバイオマスの糖化を実現することができる。 By using the xylanase, as compared with the case of using the known xylanase or a composition comprising the same, such as the commercially available xylanase preparations, to realize a saccharification of efficient biomass. したがって、当該キシラナーゼを用いる本発明の酵素製剤および糖の製造方法によれば、バイオマスから効率的且つ安価に糖を製造することができる。 Therefore, according to the enzyme preparation and a method for producing sugar of the present invention using the xylanases can be produced efficiently and inexpensively sugar from the biomass.

各種酵素製剤によるバイオマスからの生成糖量。 Generation amount of sugar from the biomass by a variety enzyme preparation.

本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、Lipman−Pearson法(Science, 1985, 227:1435-1441)によって計算される。 As used herein, sequence identity of the nucleotide sequence and amino acid sequence, Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441) is calculated by. 具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。 Specifically, using the genetic homology analysis of the information processing software Genetyx-Win (Search homology) program, it is calculated by performing analysis Unit size to compare the (ktup) as 2.

また、本明細書において、「1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列」としては、1〜50個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜20個、さらにより好ましくは1〜10個、なお好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列が挙げられる。 Further, in the present specification, the "1 more amino acid deletion, substitution or addition of sequences", 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, even more preferably 1-10, still preferably 1 to 5 amino acids are deleted, and substituted or added in the sequence. 本明細書において、「1〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列」としては、1〜150個、好ましくは1〜120個、より好ましくは1〜90個、さらに好ましくは1〜60個、さらにより好ましくは1〜30個、なお好ましくは1〜15個、さらになお好ましくは1〜10個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列が挙げられる。 In the present specification, the "1 a plurality of nucleotides are deleted, substituted or added in the sequence" 1 to 150, preferably 1 to 120, more preferably 1 to 90 carbon atoms, more preferably 1 60, even more preferably 1-30, still preferably 1-15, and even more preferably 1 to 10 nucleotides are deleted, and substituted or added in the sequence.

本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系および/またはリグノセルロース系バイオマスをいう。 As used herein, "biomass" refers to cellulosic and / or lignocellulosic biomass containing hemicellulose components of production plants and algae. バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ(幹部)、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材;ウッドチップなどの木材の加工物または粉砕物;木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類;新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類;バガス(サトウキビの搾りかす)、パーム空果房(EFB)、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉などの植物の茎、葉、果房など;籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類、藻類などからなる群より選ばれる1種以上が挙げられる。 Specific examples of the biomass, and conifers such as larch and Numasugi, oil palm (executive), various timber obtained from such hardwood cypress like; workpiece or pulverized wood, such as wood chips; wood pulp produced from wood pulp such as cotton linter pulp obtained from fibers surrounding cotton seeds; newspaper, cardboard, magazines, paper such as quality paper; bagasse (pomace sugarcane), palm Sorahatebo (EFB), rice straw , it stems of plants such as corn Kukiwaka Shikuwa leaf, and bunch; chaff, palm shells, vegetable shells such as coconut shells, one or more can be mentioned selected from the group consisting of algae. このうち、入手容易性および原料コストの観点から、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)がより好ましく、バガスがさらに好ましい。 Of these, from the viewpoint of easy availability and cost of raw materials, wood, the workpiece or pulverized wood, stems, leaves, etc. bunch preferably plants, bagasse, EFB, more preferably oil palm (executive), bagasse more preferable. 上記バイオマスは、単独でまたは2種以上を混合して使用してもよい。 The biomass, may be used alone or in combination of two or more. また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。 The may be the biomass is dried.

本明細書において、「キシラナーゼ活性」とは、キシラン中のキシロースβ−1,4−グリコシド結合を加水分解する活性をいう。 In the present specification, "xylanase activity" refers to an activity of hydrolyzing xylose beta-1,4 glycosidic bonds in xylan. タンパク質のキシラナーゼ活性は、例えば、キシランを基質として当該タンパク質と反応させ、キシラン分解産物の生成量を測定することによって決定することができる。 Xylanase activity of the protein, for example, xylan is reacted with the protein as a substrate, it can be determined by measuring the production amount of xylan degradation products. キシラナーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。 Specific procedure for measuring the xylanase activity is described in detail in the examples below.

(1.キシラナーゼ) (1. xylanase)
本発明のキシラナーゼは、下記(a)〜(c): Xylanase of the present invention is represented by the following (a) ~ (c):
(a)配列番号2で示されたアミノ酸配列; (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(b)配列番号2で示されたアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;および、 (B) an amino acid sequence having the amino acid sequence 85% or more sequence identity set forth in SEQ ID NO: 2; and,
(c)配列番号2で示されたアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、 (C) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 1 plural amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence,
から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり得る。 Consisting of an amino acid sequence selected from may be a protein and having a xylanase activity.

本発明のキシラナーゼは、pH安定性の向上および糖化効率向上の観点から、配列番号2で示されるアミノ酸配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは92%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。 Xylanase of the present invention, from the viewpoint of improving the pH stability and saccharification efficiency, amino acid sequence having 85% or more of SEQ ID NO: 2, preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, still more preferably consists of an amino acid sequence with a sequence identity of 98% or more. また、本発明のキシラナーゼとしては、pH安定性の向上および糖化効率向上の観点から、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるXylanimonas属細菌(例えばXylanimonas cellulosilytica DSM15894)由来キシラナーゼが好ましい例として挙げられる。 As the xylanase of the present invention, pH from the viewpoint of improving the stability and saccharification efficiency, Xylanimonas bacterium (e.g. Xylanimonas cellulosilytica DSM15894) xylanase comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are preferred examples.

配列番号2で示されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質の例としては、配列番号2で示されるアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられ、例えば、上述した配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるXylanimonas属細菌由来キシラナーゼの天然または人工的に作製された変異体が挙げられる。 Consisting of an amino acid sequence having an amino acid sequence at least 85% sequence identity with SEQ ID NO: 2, as an example of a protein and having a xylanase activity, is 1 to several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and include proteins having xylanase activity, e.g., a natural or artificially created in Xylanimonas bacteria xylanase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 described above variants, and the like. 当該変異体は、例えば、上記Xylanimonas属細菌由来キシラナーゼをコードする遺伝子に対して紫外線照射や部位特異的変異導入(Site-Directed Mutagenesis)のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のキシラナーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。 The variants, for example, introducing a mutation by known mutagenesis such as UV irradiation and site-directed mutagenesis to the gene encoding the Xylanimonas bacteria xylanase (Site-Directed Mutagenesis), to express a gene having the mutation, by selecting the protein having the desired xylanase activity, it can be produced. このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。 Procedure of such variants produced are well known to those skilled in the art.

本発明のキシラナーゼは、従来単離または精製されているキシラナーゼと異なるアミノ酸配列を有する。 Xylanase of the invention has an amino acid sequence different from the xylanase are conventionally isolated or purified. 例えば、配列番号2で示される配列と最も配列同一性の高いアミノ酸配列を有する既知のキシラナーゼは、Xylanimicrobium pachnodae由来のキシラナーゼ(App. Environ. Microbiol., 1999, 65(9):4099-4107)であるが、配列番号2のキシラナーゼとの配列同一性は81%である。 For example, the known xylanase with the most sequence identity with high amino acid sequence to the sequence shown in SEQ ID NO: 2, Xylanimicrobium pachnodae derived xylanase (App Environ Microbiol, 1999, 65 (9):... 4099-4107) in there is, sequence identity with the xylanase of SEQ ID NO: 2 is 81%.

好ましくは、本発明のキシラナーゼは、さらに以下の酵素学的性質を有する。 Preferably, the xylanase of the present invention additionally have the following enzymatic properties.
(i)最適反応pH (I) optimum reaction pH
本明細書において、「キシラナーゼ活性における最適反応pH」とは、50℃においてキシランを分解したときの活性が最大となるpHを意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定される。 As used herein, "optimum reaction pH in xylanase activity" is meant a pH that activity is maximized when decomposing xylan at 50 ° C., specifically, measured by the method described in Examples set forth below It is.
本発明のキシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応pHは、pH安定性の向上、他酵素とのカクテル化を容易にする観点から、pH5.5〜8.5の範囲であることが好ましく、より好ましくはpH6.0〜8.0、さらに好ましくはpH6.0〜7.5、さらにより好ましくはpH6.0〜7.0である。 In xylanase of the present invention, the optimum reaction pH of the xylanase activity, improvement in pH stability, from the viewpoint of facilitating a cocktail of other enzymes, preferably in the range of PH5.5~8.5, more preferably the pH 6.0 to 8.0, more preferably PH6.0~7.5, even more preferably pH 6.0 to 7.0.
(ii) 最大活性 本明細書において、キシラナーゼの「最大活性」とは、50℃における最適反応pHにおけるキシラナーゼ活性をいう。 (Ii) in the maximum activity present specification, the "maximum activity" xylanase refers xylanase activity at optimum reaction pH at 50 ° C.. 本発明のキシラナーゼの「最大活性」は、糖化効率向上の観点から、好ましくは1000U/mgタンパク質以上、より好ましくは1100U/mgタンパク質以上、さらに好ましくは1200U/mgタンパク質以上、さらに好ましくは1300U/mgタンパク質以上、さらに好ましくは1400U/mgタンパク質以上、さらに好ましくは1500U/mgタンパク質以上である。 "Maximum activity" xylanase of the present invention, from the viewpoint of saccharification efficiency, preferably 1000 U / mg protein or more, more preferably 1100U / mg protein or more, more preferably 1200 U / mg protein or more, more preferably 1300U / mg protein or more, more preferably 1400u / mg protein or more, more preferably 1500 U / mg protein or more.
(iii)pH依存性 本発明のキシラナーゼは、pH安定性の向上および他酵素とのカクテル化を容易にする観点から、反応温度50℃、pH7.0〜9.0の範囲において最大活性の70%以上であることが好ましく、より好ましくは74%以上である。 (Iii) xylanase pH dependent present invention, from the viewpoint of facilitating the cocktail of the pH stability improved and other enzymes, the reaction temperature 50 ° C., 70 of maximum activity in the range of pH7.0~9.0 preferably at least% of, more preferably 74% or more. また、pH7.0〜8.5の範囲において最大活性の75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上である。 The maximum activity of 75% or more in the range of pH 7.0-8.5, is preferably 80% or more, more preferably 85% or more. ここで、「最大活性」とは、反応温度50℃での最適反応pHにおけるキシラナーゼ活性をいう。 Here, the "maximum activity" refers to the xylanase activity at the optimum pH of the reaction at a reaction temperature of 50 ° C..

(iv)最適反応温度 本明細書において、「キシラナーゼ活性における最適反応温度」とは、キシラナーゼ活性が最大となる温度を意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定される。 (Iv) at the optimum reaction temperature herein, the term "optimum reaction temperature in xylanase activity" means the temperature at which the xylanase activity is maximum, it is specifically measured by the method described in Examples set forth below . 本発明のキシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応温度は、好ましくは40℃以上70℃未満、より好ましくは45〜65℃、さらに好ましくは50〜65℃である。 In xylanase of the present invention, the optimum reaction temperature of xylanase activity is preferably 40 ° C. or higher than 70 ° C., more preferably 45 to 65 ° C., more preferably 50-65 ° C..

(2.キシラナーゼの生産方法) (2. xylanase method of production)
上記本発明のキシラナーゼは、例えば、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを微生物に導入して得られた形質転換体により生産され得る。 The xylanase of the present invention, for example, a vector comprising a gene encoding a xylanase of the present invention may be produced by transformants obtained by introducing into a microorganism. したがって、本発明は、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換体を培養する工程を含む、キシラナーゼの生産方法(以下、「本発明のキシラナーゼの生産方法」ということがある)を提供する。 Accordingly, the present invention includes the step of culturing a transformant containing a vector comprising a gene encoding the xylanase of the present invention, xylanase method of producing (hereinafter sometimes referred to as "method of producing the xylanase of the present invention" )I will provide a. すなわち、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有するベクター上にコードされた遺伝子が発現して、本発明のキシラナーゼが産生される。 That is, the when culturing transformants in a suitable medium and the expressed gene transformants were encoded on a vector containing, xylanases of the invention are produced. 産生されたキシラナーゼを該培養物から単離または精製することにより、本発明のキシラナーゼを取得することができる。 The produced xylanase by isolated or purified from the culture, it is possible to obtain the xylanase of the present invention.

本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号1で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。 The gene encoding the xylanase of the present invention, for example, genes comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. あるいは、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号1で示される塩基配列と85%以上、好ましくは90%以上、好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子、ならびに配列番号1で示される塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列が挙げられる。 Alternatively, the gene encoding the xylanase of the present invention, for example, nucleotide sequences having 85% or more of SEQ ID NO: 1, preferably 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more sequence identity 1 more nucleotides in the nucleotide sequence represented genes, as well as in SEQ ID NO: 1 comprising a nucleotide sequence having deletion, and substitution or addition of nucleotide sequences.

本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子は、Xylanimonas属細菌、例えばXylanimonas cellulosilytica(DSM15894)などから、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。 Gene encoding the xylanase of the present invention can be Xylanimonas bacterium, for example from such Xylanimonas cellulosilytica (DSM15894), is isolated using any method used in the art. 例えば、当該遺伝子は、Xylanimonas属細菌の全ゲノムDNAを抽出した後、配列番号1の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたPCRにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。 For example, the gene, after extracting the total genomic DNA of Xylanimonas bacterium, and selectively amplify by PCR a target gene using primers designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, purifying the amplified gene it can be obtained by. あるいは、当該遺伝子は、本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的または化学的に合成することができる。 Alternatively, the gene, based on the amino acid sequence of the xylanase of the present invention can be synthesized by genetic engineering or chemical.

またあるいは、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子は、上記の手順で単離または合成された遺伝子の塩基配列に対して、上述した紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。 Or alternatively, a gene encoding the xylanase of the present invention, with respect to the base sequence of the isolated or synthesized gene by the above procedure, known mutagenesis such as UV irradiation and site-directed mutagenesis described above by introducing a mutation, it is possible to produce. 例えば、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子は、配列番号1で示される塩基配列に公知の方法で突然変異導入し、得られた塩基配列を発現させてキシラン分解活性を調べ、所望のキシラン分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択することによって、得ることができる。 For example, the gene encoding the xylanase of the present invention is to mutagenesis in a manner known to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, to express the obtained nucleotide sequence by examining the xylanolytic activity, the desired xylanolytic activity by choosing a gene encoding a protein having a can be obtained.

本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、YAC、BACなどが挙げられる。 The types of vectors to be introduced a gene encoding a xylanase of the present invention is not particularly limited, the vector normally used for protein production, such as a plasmid, cosmid, phage, virus, YAC, BAC, and the like. プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターpHY300PLK、pUC19、pUC119、pBR322(いずれもタカラバイオ株式会社製)などを好適に用いることができる。 Plasmid vectors are preferred, for example, commercially available plasmid vectors for protein expression, for example, a shuttle vector pHY300PLK, pUC19, pUC119, pBR322 (both manufactured by Takara Bio Inc.) can be suitably used to.

上記ベクターは、DNAの複製開始領域を含むDNA断片、および複製起点を含むDNA領域を含み得る。 The vector may comprise a DNA region containing DNA fragment containing the replication initiation region of DNA, and the origin of replication. また上記ベクターにおいては、上記本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、発現されたタンパクを細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。 In the above vector, upstream of the gene encoding xylanase of the present invention, the control sequence of the promoter region to initiate transcription of the gene, the expressed proteins, such as secretion signal region for secretion into the extracellular There may be operably linked. あるいは、本発明のプラスミドが適切に導入された微生物を選択するための薬剤(アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなど)耐性遺伝子がさらに組み込まれていてもよい。 Alternatively, the agent for selecting a microorganism plasmid of the present invention is suitably introduced (ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.) resistance gene may be further incorporated. 上記制御配列の例としては、S237eglプロモーターおよびシグナル配列(Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, 64(11):2281-9)、ならびにBacillus sp. KSM−S237株(FERM BP−7875)およびBacillus sp. KSM−64株(FERM BP−2886)由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域および分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。 Examples of the above control sequences, S237egl promoter and signal sequence (Biosci Biotechnol Biochem, 2000, 64 (11):... 2281-9)., And Bacillus sp KSM-S237 strain (FERM BP-7875) and Bacillus sp . KSM-64 strain (FERM BP-2886) the transcription initiation regulatory region of a cellulase gene derived from include translational initiation region and secretion signal peptide region. あるいは、当該制御領域としては、配列番号3で示される塩基配列の塩基番号1〜662の塩基配列、配列番号4で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、またはこれらの塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の配列同一性を有し且つ転写開始制御機能、翻訳開始制御機能および分泌シグナルペプチドとしての機能を有する塩基配列が挙げられる。 Alternatively, the as the control region, the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1-662 of SEQ ID NO: 3, the nucleotide sequence of the nucleotide numbers 1 to 696 of cellulase gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, or they nucleotide sequence 70% or more with respect to the, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably and transcription initiation control function has 98% or more sequence identity, translation initiation control function and a base sequence having a function as a secretion signal peptides. キシラナーゼ遺伝子と上記制御配列、薬剤耐性遺伝子との連結は、SOE(splicing by overlap extension)−PCR法(Gene, 1989, 77:61-68)などの方法によって行うことができる。 Xylanase gene and the regulatory sequences, the connection between the drug resistance gene, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 1989, 77: 61-68) can be carried out by a method such as. プラスミドベクターへの遺伝子の導入手順は、当該分野で周知である。 Step Introduction of a gene into a plasmid vector are well known in the art.

本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように当該遺伝子が配置されていることをいう。 In the present specification, the gene control sequence "operably linked" means that the gene is located so as to express under the control of the control region.

次いで、構築された上記ベクターを微生物に導入し、形質転換体を得る。 Then, the vectors constructed was introduced into a microorganism to obtain a transformant. 導入のための微生物としては、Staphylococcus属、Enterococcus属、Listeria属、Bacillus属に属する細菌などが挙げられるが、このうち、Bacillus属細菌、例えば枯草菌またはその変異株(例えば、特開2006−174707号公報に記載のプロテアーゼ9重欠損株KA8AXなど)が好ましい。 Microorganisms for the introduction, Staphylococcus spp., Enterococcus spp, Listeria spp, but such as bacteria belonging to the genus Bacillus and the like, these, Bacillus bacteria, for example Bacillus subtilis or a mutant strain (e.g., JP 2006-174707 No. including protease 9 double deficient strain KA8AX described in Japanese) is preferred. 導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。 As the method of introduction, it is possible to use a method of protoplast method, in the art, such as electroporation are commonly used. 導入が適切に行われた株を薬剤耐性などを指標に選択することで、目的の形質転換体を得ることができる。 The strain introduced has been properly performed by selecting an index such as drug resistance, it is possible to obtain a transformant of interest.

斯くして得られた形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有するベクター上にコードされた遺伝子が発現して、本発明のキシラナーゼが合成される。 If cultured thus-obtained transformant in a suitable medium, the gene transformants were encoded on vectors containing the expressed xylanase of the present invention is synthesized. 培養に使用する培地は、形質転換体の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。 The medium used to culture those skilled in accordance with the type of transformant may be selected as appropriate. 生成された目的のキシラナーゼを該培養物から通常の方法により単離または精製することにより、本発明のタンパク質を取得することができる。 The xylanase of the generated object by isolated or purified by conventional methods from the culture, it is possible to obtain the protein of the present invention. このとき、当該ベクター上でキシラナーゼ遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたキシラナーゼは菌体外に分泌されるため、より容易に回収され得る。 At this time, if a secretory signal sequence and the xylanase gene on the vector is operably linked, it generated xylanase to be secreted extracellularly, may be more easily recovered. 回収されたキシラナーゼは、さらに公知の手段で精製されてもよい。 Recovered xylanase may be further purified by known means.

(3.バイオマス糖化用酵素製剤) (3. enzyme preparation for biomass saccharification)
上記本発明のキシラナーゼは、後述の実施例に示す通り、従来公知のキシラナーゼやキシラナーゼ製剤と比較して、バイオマスを糖化する活性が顕著に高い。 Xylanase of the present invention, as shown in the examples below, in comparison with conventional xylanase or xylanase preparation is significantly higher activity of saccharifying biomass. したがって、本発明のキシラナーゼは、バイオマス糖化のために好適に使用することができる。 Thus, xylanases of the invention can be suitably used for biomass saccharification.
すなわち、本発明はまた、上記本発明のキシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤、および上記本発明のキシラナーゼを含むバイオマス糖化用酵素製剤を提供する。 That is, the present invention is also the biomass saccharification agent comprising as an active ingredient the xylanase of the present invention, and provides an enzyme preparation for biomass saccharification containing xylanase of the present invention.

本発明の酵素製剤は、上述の本発明のキシラナーゼを含む。 Enzyme preparation of the present invention comprise a xylanase of the invention described above. また、糖化効率の向上の観点から、本発明の酵素製剤は、さらにセルラーゼを含むことが好ましい。 From the viewpoint of improving the saccharification efficiency, enzyme preparation of the present invention preferably further contains a cellulase. ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−1,4−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオハイドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。 Here, cellulase refers to enzymes that hydrolyze glycosidic bonds beta-1,4-glucan cellulose, endoglucanases, exo-glucanase or cellobiohydrolases and β- glucosidase such as generic term for enzymes termed it is. 本発明に使用されるセルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。 The cellulase to be used in the present invention, and commercially available cellulase preparations, animal, vegetable, mention may be cellulase derived from a microorganism. 本発明において、これらのセルラーゼは、単独で使用されても2種以上の組み合わせで使用されてもよい。 In the present invention, these cellulases may also be used in combination with two or more are used alone. 糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる1種以上を含むことが好ましい。 From the viewpoint of improving the saccharification efficiency, cellulase, preferably comprises at least one member selected from the group consisting of cellobiohydrolase and endoglucanase.

セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)由来のセルラーゼ;トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼ;バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−N145(FERM P−19727)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−N252(FERM P−17474)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−N115(FERM P−19726)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−N440(FERM P−19728)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−N659(FERM P−19730)などの各種バチルス株由来のセルラーゼ;パイロコッカス ホリコシ(Pyrococcus horikoshii)由来の耐熱性セルラーゼ;フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)由来のセルラーゼ、などが挙げ Specific examples of cellulases, Trichoderma reesei (Trichoderma reesei) from cellulase; Trichoderma viride (Trichoderma viride) from cellulase; (. Bacillus sp) Bacillus sp. KSM-N145 (FERM P-19727), Bacillus sp (Bacillus sp. ) KSM-N252 (FERM P-17474), Bacillus sp. (Bacillus sp.) KSM-N115 (FERM P-19726), Bacillus sp. (Bacillus sp.) KSM-N440 (FERM P-19728), Bacillus sp. (Bacillus sp .) KSM-N659 (FERM P-19730) cellulase derived from various Bacillus strains such as; Pyrococcus horikoshii (Pyrococcus horikoshii) derived from thermostable cellulase; Humicola insolens (Humicola insolens) derived cellulase, and the like られる。 It is. これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、またはフミコーラ インソレンス(Humicola insolens)由来のセルラーゼが好ましい。 Among these, from the viewpoint of improving the saccharification efficiency, Trichoderma reesei (Trichoderma reesei), Trichoderma viride (Trichoderma viride), or Humicola insolens (Humicola insolens) derived cellulase is preferred. 上記セルラーゼを含むセルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト(登録商標)1.5L(ノボザイムズ社製)、TP−60(明治製菓株式会社製)、Cellic(登録商標)CTec2(ノボザイムズ社製)、Accellerase TM DUET(ジェネンコア社製)、およびウルトラフロ(登録商標)L(ノボザイムズ社製)が挙げられる。 Specific examples of the cellulase preparation comprising the cellulase (manufactured by Novozymes) Celluclast (R) 1.5 L (manufactured by Meiji Seika Kaisha, Ltd.) TP-60, Cellic (TM) CTec2 (manufactured by Novozymes), Accellerase TM DUET (manufactured by Genencor), and ultra-flow (manufactured by Novozymes) (registered trademark) L, and the like. このうち、糖化効率の向上の観点、製造コスト低減の観点、入手性の観点などから、Cellic(登録商標)CTec2、Accellerase TM DUET(ジェネンコア社製)が好ましく、Cellic(登録商標)CTec2がより好ましい。 Among them, in view of improving the saccharification efficiency, in view of production cost reduction, etc. in view of availability, Cellic (registered trademark) CTec2, Accellerase TM DUET (manufactured by Genencor) are preferred, Cellic (registered trademark) CTec2 more preferably .

また、セルラーゼの1種であるβ−グルコシダーゼの具体例としては、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)由来のβ−グルコシダーゼ(例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム188やメガザイム社製β-グルコシダーゼ)、ならびにトリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)またはペニシリウム エメルソニイ(Penicillium emersonii)由来のβ−グルコシダーゼなどが挙げられる。 Specific examples of β- glucosidase which is one of cellulases, Aspergillus niger (Aspergillus niger) derived from β- glucosidase (e.g., manufactured by Novozymes Novozym 188 and Megazyme Co. β- glucosidase), and Trichoderma Liese (Trichoderma reesei) or Penicillium Emerusonii (Penicillium emersonii) derived from β- glucosidase, and the like. このうち、糖化効率向上の観点から、ノボザイム188、トリコデルマ リーゼ由来のβ−グルコシダーゼが好ましく、トリコデルマ リーゼ由来のβ−グルコシダーゼがより好ましい。 Of these, from the viewpoint of saccharification efficiency, Novozyme 188, preferably β- glucosidase from Trichoderma reesei, from Trichoderma reesei β- glucosidase is more preferable.

また、セルラーゼの1種であるエンドグルカナーゼの具体例としては、トリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)、アクレモニウム セルロリティカス(Acremonium celluloriticus)、フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)、クロストリジウム サーモセラム(Clostridium thermocellum)、バチルス(Bacillus)、サーモビフィダ(Thermobifida)、セルロモナス(Cellulomonas)由来の酵素などが挙げられる。 Specific examples of the endoglucanase is one cellulase, Trichoderma reesei (Trichoderma reesei), Acremonium cellulolyticus utility Kas (Acremonium celluloriticus), Humicola insolens (Humicola insolens), Clostridium thermocellum (Clostridium thermocellum), Bacillus (Bacillus ), Samobifida (Thermobifida), and the like Cellulomonas (Cellulomonas) enzymes derived from. このうち、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ リーゼ、フミコーラ インソレンス、バチルス 、セルロモナス由来のエンドグルカナーゼが好ましく、トリコデルマ リーゼ由来のエンドグルカナーゼがより好ましい。 Of these, from the viewpoint of saccharification efficiency, Trichoderma reesei, Humicola insolens, Bacillus, preferably endoglucanase derived Cellulomonas, more preferably endoglucanase from Trichoderma Liese.

また、本発明の酵素製剤は、上記本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼを含有していてもよい。 Further, the enzyme preparation of the present invention may contain a hemicellulase other than xylanase of the present invention. ここで、ヘミセルラーゼとは、へミセルロースを加水分解する酵素を指し、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼなどと称される酵素の総称である。 Here, the hemicellulase, refers to enzymes that hydrolyze hemicellulose, xylanase, xylosidase, is a generic term for enzymes called like galactanase. 本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの具体例としては、トリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)由来のヘミセルラーゼ;バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−N546(FERM P−19729)由来のキシナラーゼ;アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)、またはバチルス アルカロフィルス(Bacillus alcalophilus)由来のキシラナーゼ;サーモマイセス(Thermomyces)、オウレオバシジウム(Aureobasidium)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、クロストリジウム(Clostridium)、サーモトガ(Thermotoga)、サーモアスクス(Thermoascus)、カルドセラム(Caldocellum)、またはサーモモノスポラ(Thermomonospora)属由来のキシラナーゼ、バチルス プミルス(Bacill Examples of hemicellulase than xylanases of the present invention, Trichoderma reesei (Trichoderma reesei) from hemicellulase; (. Bacillus sp) Bacillus sp. KSM-N546 (FERM P-19729) from Kishinaraze; Aspergillus niger (Aspergillus niger ), Trichoderma viride (Trichoderma viride), Humicola insolens (Humicola insolens), or Bacillus alcalophilus (Bacillus alcalophilus) derived xylanase; Thermomyces (Thermomyces), Ou Leo Ba Shijiumu (Aureobasidium), Streptomyces (Streptomyces), Clostridium (Clostridium), Thermotoga (Thermotoga), Thermoascus (Thermoascus), Karudoseramu (Caldocellum), or thermo mono Supora (Thermomonospora) from the genus xylanase, Bacillus pumilus (Bacill us pumilus)由来のβ―キシロシダーゼ、セレノモナス ルミナンティウム(Selenomonas ruminantium)由来β―キシロシダーゼが挙げられる。 us pumilus) derived from β- xylosidase include Serenomonasu Ruminantiumu (Selenomonas ruminantium) from β- xylosidase. このうち、糖化効率向上の観点から、本発明の酵素製剤は、バチルス エスピー、アスペルギルス ニガー、トリコデルマ ビリデもしくはストレプトマイセス由来のキシラナーゼ、またはセレノモナス ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼを含有することが好ましく、バチルス エスピーもしくはトリコデルマ ビリデ由来のキシナラーゼ、またはセレノモナス ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼを含有することがより好ましい。 Of these, from the viewpoint of saccharification efficiency, enzyme preparation of the present invention, Bacillus sp., Aspergillus niger, to contain Trichoderma viride or Streptomyces origin of xylanase or Serenomonasu Ruminantiumu derived β- xylosidase, preferably Bacillus sp. or more preferably contains the Trichoderma viride-derived Kishinaraze or Serenomonasu Ruminantiumu derived β- xylosidase.

本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記本発明のキシラナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは0.5〜70質量%、より好ましくは1〜50質量%さらに好ましくは2〜40質量%、さらにより好ましくは2〜30質量%である。 In the total protein of the enzyme preparation of the present invention, the content of the xylanase of the present invention, from the viewpoint of saccharification efficiency, preferably 0.5 to 70 wt%, more preferably more preferably from 1 to 50 mass% 2-40 wt%, even more preferably from 2 to 30 mass%.
また、本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは10〜99質量%、より好ましくは30〜95質量%、さらに好ましくは50〜95質量%である。 Further, in the total protein in the enzyme preparation of the present invention, the content of the cellulase, in terms of saccharification efficiency, preferably 10 to 99 wt%, more preferably 30 to 95 wt%, more preferably 50 to 95 mass%.
また、本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記エンドグルカナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは1〜70質量%、より好ましくは5〜50質量%、さらに好ましくは10〜40質量%である。 Further, in the total protein of the enzyme preparation of the present invention, the content of the endoglucanases, in terms of saccharification efficiency, preferably 1 to 70 wt%, more preferably 5 to 50 mass%, more preferably 10 is 40 mass%. また、本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの含有量としては、糖化効率向上の観点から、好ましくは0.01〜30質量%、より好ましくは0.1〜20質量%、さらに好ましくは0.5〜20質量%である。 Further, in the total protein of the enzyme preparation of the present invention, the content of hemicellulase than xylanase of the present invention, from the viewpoint of saccharification efficiency, preferably 0.01 to 30 wt%, more preferably 0 .1~20 wt%, more preferably from 0.5 to 20 mass%.

本発明の酵素製剤における、本発明のキシラナーゼと上記セルラーゼのタンパク質量比(本発明のキシラナーゼ/セルラーゼ)は、糖化効率向上の観点から、好ましくは0.01〜100、より好ましくは0.05〜5、さらに好ましくは0.05〜1、よりさらに好ましくは0.05〜0.5である。 In the enzyme preparation of the present invention, the protein weight ratio of xylanase and the cellulase of the present invention (xylanase / cellulase of the present invention), from the viewpoint of saccharification efficiency, preferably 0.01 to 100, more preferably 0.05 to 5, more preferably 0.05 to 1, even more preferably from 0.05 to 0.5.

本発明の酵素製剤における、本発明のキシラナーゼと上記エンドグルカナーゼのタンパク質量比(本発明のキシラナーゼ/エンドグルカナーゼ)は、糖化効率向上の観点から、好ましくは0.05〜10、より好ましくは0.1〜5、さらに好ましくは0.1〜2、よりさらに好ましくは0.2〜1である。 In the enzyme preparation of the present invention, xylanase and protein mass ratio of the endoglucanase of the present invention (xylanase / endoglucanase of the present invention), from the viewpoint of saccharification efficiency, preferably 0.05 to 10, more preferably 0. 1-5, more preferably 0.1 to 2, even more preferably 0.2 to 1.

本発明のキシラナーゼおよび酵素製剤は、バイオマス糖化用として、後述する本発明の糖の製造方法に好適に用いられる。 Xylanase and enzyme preparation of the present invention, for the biomass saccharification is suitably used in the production method of the saccharide of the present invention described below. バイオマスについては、前述したとおりである。 For biomass, it is as described above. 本発明のキシラナーゼおよび酵素製剤の糖化効果をより効果的に発現させる観点から、バイオマスは、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)がより好ましく、バガスがさらに好ましい。 From the viewpoint of more effectively express glycation effect of xylanase and the enzyme preparation of the present invention, the biomass, wood, the workpiece or pulverized wood, plant stems, leaves, etc. bunch are preferred, bagasse, EFB, oil palm (executive), and still more preferably bagasse. 上記バイオマスは、単独でまたは2種以上を混合して使用してもよい。 The biomass, may be used alone or in combination of two or more. また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。 The may be the biomass is dried.

(4.糖の製造方法) (Method of Manufacturing 4. sugar)
本発明の糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明のキシラナーゼまたは酵素製剤で糖化する工程を含む。 The method of producing sugar of the present invention, including biomass, the process of saccharification by xylanase or enzyme preparation of the present invention. 本発明の糖の製造方法により、バイオマスの糖化効率が顕著に向上する。 The method for producing sugar of the present invention, the saccharification efficiency of biomass remarkably improved. 糖化効率が向上する理由は明らかではないが、本発明のキシラナーゼまたは酵素製剤を用いることにより、バイオマス中のヘミセルロースが効率的に分解されて、酵素がセルロースに接触しやすい状態となり、全体として糖化効率が向上するためであると推測される。 Although saccharification efficiency no reason clear to improve, by using xylanase or enzyme preparation of the present invention, hemicellulose in the biomass is decomposed efficiently, the enzyme is a state of easily contacting the cellulose saccharification efficiency of the entire There is presumed to be due to improved.

本発明の糖の製造方法におけるバイオマスについては、前述したとおりである。 The biomass in the production method of the saccharide of the present invention are as described above. 入手容易性および原料コストの観点、糖化効率向上の観点から、バイオマスは、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)がより好ましく、バガスがさらに好ましい。 Availability and cost of raw materials standpoint, in terms of saccharification efficiency, biomass, wood, the workpiece or pulverized wood, plant stems, leaves, is preferable, bunch, bagasse, EFB, oil palm (executive) is still more preferably from bagasse. 上記バイオマスは、単独でまたは2種以上を混合して使用してもよい。 The biomass, may be used alone or in combination of two or more. また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。 The may be the biomass is dried.

本発明の糖の製造方法は、粉砕効率向上、糖化効率向上、および生産効率向上(生産時間の短縮)の観点から、バイオマスを本発明のキシラナーゼまたは酵素製剤で糖化する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。 The method of producing sugar of the present invention, the milling efficiency, saccharification efficiency, and in terms of production efficiency (reduction of production time), before the step of saccharification xylanase or enzyme preparation of the present invention the biomass, the biomass preferably further comprising a pre-processing step.
前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる1種以上が挙げられる。 The pretreatment, for example, alkali treatment, one or more can be mentioned selected from the group consisting of milled and hydrothermally treated. 本発明のキシラナーゼはアルカリ領域においても高い酵素活性を有するため、当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行うことがより好ましい。 For xylanases of the invention have a high enzymatic activity in the alkaline range, as the pretreatment is carried out in terms of saccharification efficiency, alkali treatment is preferred, from the viewpoint of further improving the saccharification efficiency, the crushing treatment and alkali treatment it is preferable, it is more preferable to carry out the pulverization treatment and alkali treatment simultaneously.

本発明の糖の製造方法において、アルカリ処理とは、バイオマスを、後述する塩基性化合物と反応させることをいう。 In the method of the sugar of the present invention, the alkali treatment, the biomass refers to reacting with later-described basic compound. アルカリ処理の方法としては、バイオマスを、後述する塩基性化合物を含むアルカリ溶液に浸漬する方法(以下、「浸漬処理」ということがある)や、バイオマスと塩基性化合物とを混合して、後述する粉砕処理にかける方法(以下、「アルカリ混合粉砕処理」ということがある)などが挙げられる。 The method of alkali treatment, the biomass, a method of immersing in an alkaline solution containing a later-described basic compound (hereinafter sometimes referred to as "immersion") and, by mixing the biomass and the basic compound described later a method of applying a grinding treatment (hereinafter sometimes referred to as "alkali-mixing and pulverizing treatment"), and the like.

アルカリ処理に用いられる塩基性化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属水酸化物、酸化ナトリウム、酸化カリウムなどのアルカリ金属酸化物、酸化マグネシウム、酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属酸化物、硫化ナトリウム、硫化カリウムなどのアルカリ金属硫化物、硫化マグネシウム、硫化カルシウムなどのアルカリ土類金属硫化物などが挙げられる。 The basic compound used in the alkali treatment, sodium hydroxide, potassium hydroxide, alkali metal hydroxides such as lithium hydroxide, magnesium hydroxide, alkaline earth metal hydroxides such as calcium hydroxide, sodium oxide, alkali metal oxides such as potassium oxide, magnesium oxide, alkaline earth metal oxides such as calcium oxide, sodium sulfide, alkali metal sulfides such as potassium sulfide, magnesium sulfide, and alkaline earth metal sulfide such as calcium sulfide and the like. これらのうち、製造コストの低減、糖化効率向上の観点から、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物を用いることが好ましく、アルカリ金属水酸化物を用いることがより好ましく、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを用いることがさらに好ましい。 Of these, the reduction of manufacturing cost, in terms of saccharification efficiency, it is preferable to use an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide, it is more preferable to use an alkali metal hydroxide, sodium hydroxide or it is further preferable to use potassium hydroxide. これらの塩基性化合物は、単独でまたは2種以上を組み合わせて用いてもよい。 These basic compounds may be used alone or in combination of two or more.

浸漬処理におけるアルカリ溶液中の塩基性化合物の濃度は、糖化効率を高める観点、およびグルコースの生成量を高める観点から、好ましくは0.1〜60質量%、より好ましくは0.1〜50質量%、さらに好ましくは0.1〜40質量%である。 The concentration of the basic compound in the alkali solution in the immersion process, the viewpoint enhance saccharification efficiency, and in view of enhancing the production of glucose, preferably 0.1 to 60 wt%, more preferably 0.1 to 50 mass% , more preferably from 0.1 to 40 mass%. 浸漬処理におけるアルカリ溶液の使用量は、バイオマスの乾燥質量に対して、好ましくは50〜99質量%、より好ましくは60〜99質量%、さらに好ましくは80〜99質量%である。 The amount of the alkali solution in the immersion process, with respect to dry weight of biomass, preferably 50 to 99 wt%, more preferably 60 to 99 wt%, more preferably 80 to 99 wt%. 浸漬処理の処理時間としては、好ましくは0.5〜50時間、より好ましくは1〜24時間、さらに好ましくは1.5〜10時間である。 The processing time of immersion is preferably from 0.5 to 50 hours, more preferably 1 to 24 hours, more preferably 1.5 to 10 hours.

本発明の糖の製造方法において、粉砕処理とは、バイオマスを機械的に粉砕して小粒子化することをいう。 The method of manufacturing a sugar present invention, a grinding process, refers to small particles by being mechanically pulverized biomass. バイオマスを小粒子化することにより、糖化効率がより向上する。 By small particles of biomass, saccharification efficiency is further improved. また、粉砕処理により、バイオマスに含まれるセルロースの結晶構造が破壊されると、糖化効率がなお向上する。 Further, the pulverized, the crystal structure of the cellulose contained in the biomass is destroyed, saccharification efficiency is our improved such. 粉砕処理は公知の粉砕機を用いて行うことができる。 Pulverization treatment may be performed using a known pulverizer. 用いられる粉砕機に特に制限はなく、バイオマスを小粒子化することができる装置であればよい。 There is no particular restriction on the grinder used, may be any device capable of small particles of biomass.

粉砕機の具体例としては、高圧圧縮ロールミルや、ロール回転ミルなどのロールミル;リングローラーミル、ローラーレースミルまたはボールレースミルなどの竪型ローラーミル;転動ボールミル、振動ボールミル、振動ロッドミル、振動チューブミル、遊星ボールミルまたは遠心流動化ミルなどの容器駆動式媒体ミル;塔式粉砕機、攪拌槽式ミル、流通槽式ミルまたはアニュラー式ミルなどの媒体攪拌式ミル;高速遠心ローラーミルやオングミルなどの圧密せん断ミル;乳鉢;石臼;マスコロイダー;フレットミル;エッジランナーミル;ナイフミル;ピンミル;カッターミル、などが挙げられる。 Specific examples of the grinding machine, or a high-pressure compression roll mill, a roll mill, such as roll rotation mill; ring roller mill, vertical roller mill, such as a roller race mill or ball race mills; tumbling ball mill, a vibrating ball mill, a vibration rod mill, vibration tube mill, container-driven medium mill such as a planetary ball mill or centrifugal fluidization mill; such as high-speed centrifugal roller mill or angmill; tower mill, agitation tank type mills, flow tank type mill, or medium agitation mills such as annular mill compaction shearing mill; mortar; stone; Masscolloider; fret mill; edge runner mill; knife mill; pin mill; cutter mill, and the like. これらの中では、バイオマスの粉砕効率向上、セルロースの結晶化度低減および生産性の観点から、容器駆動式媒体ミルまたは媒体攪拌式ミルが好ましく、容器駆動式媒体ミルがより好ましく、振動ボールミル、振動ロッドミルまたは振動チューブミルなどの振動ミルがさらに好ましく、振動ロッドミルがさらにより好ましい。 Of these, pulverization efficiency of the biomass, from the viewpoint of crystallinity reduced and productivity of the cellulose, are preferred container-driven medium mill or a medium stirring mill, and more preferably the container-driven medium mill, vibrating ball mill, a vibrating more preferably a vibration mill, such as a rod mill or a vibration tube mill, even more preferred vibration rod mill. 粉砕方法としては、バッチ式および連続式のどちらでもよい。 As a grinding method may be either batchwise and a continuous type.

粉砕時間は、粉砕後のバイオマスが所望のサイズにサイズ低減されるよう適宜調整すればよい。 Milling time may be appropriately adjusted so that biomass after grinding is sized reduced to the desired size. 粉砕時間は、用いる粉砕機や使用するエネルギー量などによって変わり得るが、通常1分〜12時間であり、バイオマスの粒子径の低下の観点、セルロースの結晶化度低減の観点、およびエネルギーコストの観点から、2分間〜6時間が好ましく、5分間〜3時間がより好ましく、5分間〜2時間がさらに好ましい。 Milling time, may vary depending on the amount of energy grinder and used to be used, is usually 1 minute to 12 hours, in view of the reduction in the particle size of the biomass, the crystallinity decrease of the cellulose aspect, and the energy cost viewpoint from 6 hours preferably 2 minutes, more preferably from 3 hours 5 minutes, more preferably 2 hours 5 minutes.

粉砕処理は、上述した塩基性化合物によるアルカリ処理と組み合わせてもよい。 Grinding process may be combined with alkali treatment with a basic compound as described above. 粉砕処理は、アルカリ処理の前または後に行ってもよく、あるいは、粉砕処理と並行してアルカリ処理を行ってもよい。 Pulverization may be performed before or after the alkali treatment, or may be performed alkali treatment in parallel with the grinding process. 例えば、上述したアルカリ溶液に浸漬したバイオマスを粉砕処理にかけてもよく(湿式粉砕)、または固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけてもよいが(乾式粉砕)、このうち、乾式粉砕が好ましい。 For example, it may be multiplied by the biomass was immersed in the above-mentioned alkaline solution to pulverization treatment (wet grinding), or a solid alkali and a biomass may be subjected to grinding treatment together (dry grinding), of which the dry grinding is preferred. 粉砕処理において塩基性化合物を用いる場合、その量は、糖化効率を向上する観点、セルロースの結晶化度を低減する観点、およびバイオマス中のリグニンを除去する観点から、バイオマス中のホロセルロースをすべてセルロースとして仮定した場合に、該セルロースを構成するアンヒドログルコース単位(以下「AGU」と称する場合がある)1モルあたり0.01〜10倍モルであることが好ましく、0.05〜8倍モルであることがより好ましく、0.1〜5倍モルであることがさらに好ましく、0.1〜1.5倍モルであることがなお好ましい。 When a basic compound is used in the grinding process, the amount, in view of improving the saccharification efficiency, in terms of removing the viewpoint, and the lignin in the biomass to reduce the crystallinity of cellulose, all holo cellulose in biomass cellulose If it is assumed as, (sometimes hereinafter referred to as "AGU") anhydroglucose unit constituting the cellulose is preferably from 0.01 to 10 moles per mole, in 0.05-8 moles more preferably in, still more preferably 0.1 to 5 times by mole, it is still preferably 0.1 to 1.5 times mole.

粉砕処理後に得られるバイオマスの平均粒子径は、糖化効率向上、およびセルロースの結晶化度低減の観点から、好ましくは1〜150μm、より好ましくは5〜100μmである。 The average particle size of the biomass obtained after pulverization treatment, saccharification efficiency, and in terms of cellulose crystallinity reduction, preferably 1-150 [mu] m, more preferably 5 to 100 [mu] m. ここで、バイオマスの平均粒子径は、実施例に記載の方法により測定することができる。 Here, the average particle size of the biomass can be measured by the method described in Examples.

本発明の糖の製造方法において、水熱処理とは、バイオマスを、水分の存在下で加熱処理することをいう。 The method of manufacturing a sugar present invention, the hydrothermal treatment, the biomass refers to heat treatment in the presence of moisture. 水熱処理は、公知の反応装置を用いて行うことができ、用いられる反応装置に特に制限はない。 Hydrothermal treatment may be carried out using known reactors, and there is no particular limitation on the reaction apparatus used. 好ましくは、水熱処理では、バイオマスの粗粉砕物を、水に分散した水スラリーの状態とし、これを加熱処理する。 Preferably, in the hydrothermal treatment, the roughly pulverized product of the biomass, and the state of dispersed aqueous slurry of water, heat-treating it. 水スラリー中のバイオマスの含有量は、スラリーの流動性向上の観点から、好ましくは1〜500g/L、より好ましくは5〜400g/L、さらに好ましくは8〜300g/Lである。 The content of the biomass of water in the slurry, from the viewpoint of the slurry flow improvers, preferably 1 to 500 g / L, more preferably 5~400g / L, more preferably 8~300g / L.

水熱処理は、生産効率の向上および糖化効率の向上の観点から、酸性条件下で行うことが好ましい。 Hydrothermal treatment, from the viewpoint of improving the enhancement and saccharification efficiency in production efficiency, it is preferably carried out in acidic conditions. pH条件は、生産効率の向上、糖化効率の向上およびリグニンの変性抑制の観点から、pH3〜7が好ましく、pH4〜6がより好ましい。 pH conditions, improve production efficiency, in terms of improving and lignin inhibiting denaturation of glycated efficiency, preferably pH 3-7, pH 4-6 is more preferred. pH条件は、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸などの有機酸を用いることにより適宜調整することができる。 pH conditions can be appropriately adjusted by using hydrochloric acid, sulfuric, inorganic acids such as phosphoric acid, acetic acid, an organic acid such as citric acid. 水熱処理の条件としては、温度100〜400℃および圧力0.1〜4MPaが好ましく、温度140〜200℃および圧力0.5〜1MPaがより好ましい。 The conditions for hydrothermal treatment, preferably at a temperature 100 to 400 ° C. and a pressure 0.1~4MPa are temperature 140 to 200 ° C. and a pressure 0.5~1MPa is more preferable. 処理時間は、0.1〜3時間が好ましい。 The treatment time is preferably 0.1 to 3 hours. 水熱処理方法としては、バッチ式および連続式のどちらでもよい。 As the hydrothermal treatment method may be either batchwise and a continuous type. なお、水熱処理で得られたバイオマスは、湿潤状態のものでもよく、またはさらに乾燥処理にかけられてもよいが、糖化効率向上の観点から、湿潤状態のものが好ましい。 Incidentally, the biomass obtained in the hydrothermal treatment may be of wet, or further may be subjected to drying treatment, in terms of saccharification efficiency, those wet is preferable.

本発明の糖の製造方法は、バイオマス、好ましくは上記前処理されたバイオマスを、本発明のキシラナーゼまたは酵素製剤で糖化する工程(以下、「糖化処理」ということがある)を含む。 The method of producing sugar of the present invention include biomass, preferably the pretreated biomass, the process of saccharification by xylanase or enzyme preparation of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "saccharification"). 糖化処理に用いるキシラナーゼまたは酵素製剤については、前述したとおりである。 The xylanase or enzyme preparations used for the saccharification process, are as described above.

糖化処理の条件は、本発明のキシラナーゼおよび同時に配合するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。 Conditions of saccharification treatment is not particularly limited as long as other conditions that the enzyme is not inactivated formulated xylanase and simultaneously present invention. 適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が決定できる。 Suitable conditions, procedures biomass type and pretreatment steps, those skilled in the art depending on the type of enzyme used can be determined.
糖化処理においては、上記バイオマスを含む懸濁液に上記キシラナーゼまたは酵素製剤を添加することが好ましい。 In the saccharification process, it is preferable to add the xylanase or enzyme preparations to a suspension comprising said biomass. 懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率向上および生産性(生産時間の短縮)の観点から、好ましくは0.5〜20質量%、より好ましくは3〜15質量%、さらに好ましくは5〜10質量%である。 The content of the biomass in suspension, in terms of saccharification efficiency and productivity (shorter production time), preferably 0.5 to 20 wt%, more preferably 3 to 15 wt%, more preferably 5 a 10% by weight.
上記懸濁液に対するキシラナーゼまたは酵素製剤の使用量は、前処理条件、配合される酵素の種類および性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、好ましくは0.04〜600質量%、より好ましくは、より好ましくは0.1〜100質量%、さらに好ましくは0.1〜50質量%である。 The amount of xylanase or enzyme preparations for the suspension, pre-treatment conditions may be appropriately determined by the type and nature of the enzyme to be blended, with respect to the biomass weight, preferably from 0.04 to 600 wt%, more preferably, more preferably 0.1 to 100 wt%, more preferably from 0.1 to 50 mass%.
糖化処理時の反応pHとしては、糖化効率の向上、生産性(生産時間の短縮)向上、および生産コスト低減の観点から、好ましくはpH4〜9、より好ましくはpH5〜8、さらに好ましくはpH5〜7である。 The reaction pH at the time of saccharification, improve saccharification efficiency (reduction of production time) improved productivity, and in terms of production cost reduction, preferably pH 4-9, more preferably pH 5-8, more preferably pH5~ it is 7.
糖化処理時の反応温度は、糖化効率の向上、生産性(生産時間の短縮)向上、および生産コスト低減の観点から、20〜90℃が好ましく、より好ましくは25〜85℃、さらに好ましくは30〜80℃、さらにより好ましくは40〜75℃、なお好ましくは45〜65℃、さらになお好ましくは50〜65℃、よりさらになお好ましくは50〜60℃である。 The reaction temperature during saccharification process, improve the saccharification efficiency, productivity (shorter production time) improved, and in view of production cost reduction, preferably 20 to 90 ° C., more preferably 25 to 85 ° C., more preferably 30 to 80 ° C., even more preferably 40 to 75 ° C., still preferably 45 to 65 ° C., even more preferably 50-65 ° C., more even more preferably 50-60 ° C.. 糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類若しくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率の向上、生産性(生産時間の短縮)向上、および生産コスト低減の観点から、好ましくは1〜5日間、より好ましくは1〜4日間、さらに好ましくは1〜3日間である。 The reaction time of the saccharification process, the kind or amount of biomass, can be set as appropriate in accordance with such amount of enzyme, the improvement of saccharification efficiency (reduction of production time) improved productivity, and in terms of production cost reduction, preferably between 1-5 days, more preferably between 1-4 days, more preferably from 1 to 3 days.

本発明の例示的実施形態として、以下の組成物、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。 Exemplary embodiments of the present invention, the following compositions are disclosed manufacturing methods, applications or methods further herein. 但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 However, the present invention is not limited to these embodiments.

<1>下記(a)〜(c)から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有する、単離または精製されたタンパク質: <1> below (a) ~ consisting of an amino acid sequence selected from (c), and having a xylanase activity, isolated or purified protein:
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列; Amino acid sequence shown in (a) SEQ ID NO: 2;
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;および、 (B) SEQ ID NO: 2 amino acid sequences having 85% or more represented, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably an amino acid sequence having sequence identity of 98% or more; and,
(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1〜複数個、好ましくは1〜50個、より好ましくは1〜40個、さらに好ましくは1〜30個、さらにより好ましくは1〜20個、なお好ましくは1〜10個、さらになお好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 (C) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 1 a plurality, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, more preferably 1-30, even more preferably 1 to 20, Incidentally preferably 1-10, even more preferably 1 to 5 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence.

<2>上記キシラナーゼ活性が、pH7.0〜9.0の範囲において最大活性の70%以上、好ましくは74%以上であり、pH7.0〜8.5の範囲において最大活性の75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上である、上記<1>記載のタンパク質。 <2> The xylanase activity, more than 70% of the maximum activity in the range of PH7.0~9.0, preferably at least 74%, 75% or more of the maximum activity in the range of pH 7.0-8.5, more preferably 80% or more, further preferably 85% or more, the <1>, wherein the protein.

<3>最適反応pHが、pH5.5〜8.5の範囲、より好ましくはpH6.0〜8.0の範囲、さらに好ましくはpH6.0〜7.5の範囲、なお好ましくはpH6.0〜7.0の範囲である、上記<1>または<2>記載のタンパク質。 <3> Optimum reaction pH is in the range of PH5.5~8.5, more preferably in the range of pH 6.0 to 8.0, more preferably in the range of PH6.0~7.5, Note preferably pH6.0 in the range of 7.0, the <1> or <2>, wherein the protein.

<4>下記(d)〜(f)から選ばれる遺伝子にコードされる、上記<1>〜<3>のいずれか1項記載のタンパク質: <4> below (d) - encoded by a gene selected from (f), the <1> to <3> according to any one of the proteins:
(d)配列番号1で示される塩基配列からなる遺伝子; (D) a gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(e)配列番号1で示される塩基配列と85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、なお好ましくは98%以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子;および、 (E) SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence having 85% or more represented, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still preferably a gene consisting of a nucleotide sequence with a sequence identity of 98% or more; and,
(f)配列番号1で示される塩基配列において1〜複数個、好ましくは1〜150個、より好ましくは1〜120個、さらに好ましくは1〜90個、さらにより好ましくは1〜60個、なお好ましくは1〜30個、さらになお好ましくは1〜15個、さらによりなお好ましくは1〜10個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子。 (F). 1 to a plurality in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably from 1 to 150, more preferably 1 to 120, even more preferably 1 to 90, even more preferably 1 to 60, Note preferably 1-30, even more preferably 1-15, even more still preferably from 1 to 10 bases are deleted, the gene consisting of a substituted or added in the nucleotide sequence.

<5>上記遺伝子がXylanimonas属由来の遺伝子である、上記<4>記載のタンパク質。 <5> the gene is a gene derived from Xylanimonas genus, the <4>, wherein the protein.

<6>上記遺伝子を含むベクターを微生物に導入して得られた形質転換体により生産される、上記<4>または<5>記載のタンパク質。 <6> The vectors containing the gene are produced by transformants obtained by introducing into a microorganism, the <4> or <5>, wherein the protein.

<7>上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質を含む、バイオマス糖化用酵素製剤。 <7> above <1> to contain a protein according to any one of <6>, an enzyme preparation for biomass saccharification.

<8>上記酵素製剤の総タンパク質量中における、上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質の含有量が、好ましくは0.5〜70質量%、より好ましくは1〜50質量%、さらに好ましくは2〜40質量%、さらにより好ましくは2〜30質量%である、上記<7>記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <8> in the total protein of the enzyme preparation, the content of protein according to any one of the above <1> to <6>, preferably 0.5 to 70 wt%, more preferably from 1 to 50 wt%, more preferably from 2 to 40 wt%, even more preferably from 2 to 30 mass%, the <7> enzyme preparation for biomass saccharification according.

<9>セルラーゼをさらに含む、上記<7>または<8>記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <9> cellulase further comprising a said <7> or <8> Biomass saccharification enzyme preparation according.

<10>上記セルラーゼがエンドグルカナーゼを含む、上記<9>記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <10> the cellulase comprises endoglucanase, the <9> Biomass saccharification enzyme preparation according.

<11>上記酵素製剤の総タンパク質量中における、上記エンドグルカナーゼの含有量が、1〜70質量%、好ましくは5〜50質量%、より好ましくは10〜40質量%である、上記<10>記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <11> in the total protein of the enzyme preparation, the content of the endoglucanase, 1 to 70% by weight, preferably 5 to 50 mass%, more preferably 10 to 40 wt%, the <10> biomass saccharification enzyme formulations described.

<12>上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質と上記セルラーゼのタンパク質量比(該タンパク質/該セルラーゼ)が、0.01〜100、好ましくは0.05〜5、より好ましくは0.05〜1、さらに好ましくは0.05〜0.5である、上記<9>〜<11>のいずれか1に記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <12> above <1> to protein weight ratio of protein and the cellulase according to any one of <6> is (the protein / the cellulase), 0.01, preferably 0.05 to 5, more preferably 0.05 to 1, more preferably from 0.05 to 0.5, the <9> to <11> biomass saccharification enzyme preparation according to any one of the.

<13>上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質と上記エンドグルカナーゼのタンパク質量比(該タンパク質/該エンドグルカナーゼ)が、0.05〜10、好ましくは0.1〜5、より好ましくは0.1〜2、さらに好ましくは0.2〜1である、上記<10>〜<12>のいずれか1に記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <13> above <1> to protein and the endoglucanase protein content ratios according to any one of <6> (the protein / the endoglucanase) is from 0.05 to 10, preferably 0.1 to 5 , more preferably 0.1 to 2, more preferably from 0.2 to 1, the <10> ~ biomass saccharification enzyme preparation according to any one of <12>.

<14>上記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉、パーム空果房(EFB)、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる1種以上、好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる1種以上、より好ましくは、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)からなる群より選ばれる1種以上、さらに好ましくはバガスである、上記<7>〜<13>のいずれか1に記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 <14> the biomass, the workpiece or pulverized wood pulp, papers, bagasse, rice straw, corn Kukiwaka Shikuwa leaf, palm Sorahatebo (EFB), selected from the group consisting of plant shells such, and algae one or more members, preferably wood, the workpiece or pulverized wood, plant stems, leaves, and one or more selected from the group consisting of bunch, more preferably, comprised bagasse, EFB, from oil palm (stem) one or more members selected from the group, more preferably a bagasse, the above items <7> to <13> enzyme preparation for biomass saccharification according to any one of.

<15>バイオマスを、上記<7>〜<14>のいずれか1に記載の酵素製剤で糖化処理する工程を含む、糖の製造方法。 <15> biomass, comprising the step of saccharification treatment with the enzyme preparation according to any one of the above items <7> to <14> The production method of sugar.

<16>上記バイオマスを前処理する工程をさらに含み、該前処理がアルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる1種以上、好ましくは、アルカリ処理、および粉砕処理からなる群より選ばれる1種以上、より好ましくは、アルカリ処理および粉砕処理、さらに好ましくは、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行う処理である、上記<15>記載の方法。 <16> further comprising the step of pretreating the biomass, the pretreatment is alkaline treatment, one or more selected from the group consisting of milled and hydrothermally treated, preferably, alkali treatment, and selected from the group consisting of milled one or more members, more preferably, alkali treatment and pulverization treatment, more preferably simultaneously process the grinding process and the alkali treatment, the method of the <15> wherein.

<17>上記アルカリ処理に用いられる塩基性化合物が、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属酸化物、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ金属硫化物、およびアルカリ土類金属硫化物からなる群より選ばれる1種以上、好ましくはアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物、より好ましくはアルカリ金属水酸化物、さらに好ましくは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、上記<16>記載の方法。 <17> basic compound used in the alkali treatment, alkaline earth metal hydroxides, alkali metal oxides, alkaline earth metal oxides, alkali metal sulfide, and from the group consisting of alkaline earth metal sulfides one or more selected, preferably an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide, more preferably an alkali metal hydroxide, more preferably sodium hydroxide or potassium hydroxide, the <16> according Method.

<18>上記粉砕処理における粉砕時間が、1分〜12時間、好ましくは2分間〜6時間、より好ましくは5分間〜3時間、さらに好ましくは5分間〜2時間である、上記<16>または<17>記載の方法。 <18> milling time in the grinding process, 1 minute to 12 hours, preferably 6 hours 2 minutes, more preferably 5 minutes to 3 hours, further 2 hours preferably 5 minutes, the <16> or <17> the method described.

<19>上記粉砕処理後に得られるバイオマスの平均粒子径が、1〜150μm、好ましくは5〜100μmである、上記<16>〜<18>のいずれか1に記載の方法。 <19> The average particle size of the biomass obtained after the pulverization treatment, 1-150 [mu] m, preferably from 5 to 100 [mu] m, the <16> - The method according to any one of <18>.

<20>上記糖化処理において、上記バイオマスを含む懸濁液に上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質または上記<7>〜<14>のいずれか1に記載の酵素製剤を添加する、上記<15>〜<19>のいずれか1に記載の方法。 <20> In the above saccharification enzyme preparation according to the suspension in the above <1> to proteins or above according to any one of <6> <7> - any one of <14> comprising the biomass adding method according to any one of the above <15> - <19>.

<21>上記懸濁液中の上記バイオマスの含有量が、0.5〜20質量%、好ましくは3〜15質量%、好ましくは5〜10質量%である、上記<20>記載の方法。 <21> The content of the biomass of the suspension is 0.5 to 20 wt%, preferably 3 to 15 wt%, preferably from 5 to 10 wt%, the <20> The method according.

<22>上記懸濁液に対する上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質または上記<7>〜<14>のいずれか1に記載の酵素製剤の使用量が、上記バイオマスの質量に対して、好ましくは0.04〜600質量%、より好ましくは0.1〜100質量%、さらに好ましくは0.1〜50質量%である、上記<20>または<21>に記載の方法。 <22> The amount of the enzyme preparation according to any one of the above <1> to a protein or said <7> according to any one of <6> - <14> with respect to the suspension, the biomass with respect to the mass, preferably 0.04 to 600 wt%, more preferably from 0.1 to 100 wt%, more preferably from 0.1 to 50 mass%, according to the <20> or <21> Method.

<23>上記糖化処理時の反応pHが、pH4〜9、好ましくはpH5〜8、より好ましくはpH5〜7である、上記<15>〜<22>のいずれか1に記載の方法。 <23> The pH of the reaction during the saccharification process, pH 4-9, preferably pH 5-8, more preferably pH 5-7, the <15> - The method according to any one of <22>.

<24>上記糖化処理時の反応温度が、20〜90℃、好ましくは25〜85℃、より好ましくは30〜80℃、さらに好ましくは40〜75℃、さらにより好ましくは45〜65℃、なお好ましくは50〜65℃、さらになお好ましくは50〜60℃である、上記<15>〜<23>のいずれか1に記載の方法。 <24> The reaction temperature for the saccharification process, 20 to 90 ° C., preferably 25 to 85 ° C., more preferably 30 to 80 ° C., more preferably 40 to 75 ° C., even more preferably 45 to 65 ° C., Note preferably 50-65 ° C., even more preferably 50-60 ° C., the <15> - the method according to any one of <23>.

<25>上記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉、パーム空果房(EFB)、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる1種以上、好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる1種以上、より好ましくは、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)からなる群より選ばれる1種以上、さらに好ましくはバガスである、上記<15>〜<24>のいずれか1に記載の方法。 <25> the biomass, the workpiece or pulverized wood pulp, papers, bagasse, rice straw, corn Kukiwaka Shikuwa leaf, palm Sorahatebo (EFB), selected from the group consisting of plant shells such, and algae one or more members, preferably wood, the workpiece or pulverized wood, plant stems, leaves, and one or more selected from the group consisting of bunch, more preferably, comprised bagasse, EFB, from oil palm (stem) one or more members selected from the group, even more preferably from bagasse, the <15> - the method according to any one of <24>.

<26>バイオマス糖化剤の製造のための上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質の使用。 <26> Use of a protein according to any one of the above <1> to for the production of biomass saccharification agent <6>.

<27>バイオマス糖化用酵素製剤の製造のための上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質の使用。 <27> above for the preparation of biomass saccharification enzyme preparation <1> to use of a protein according to any one of <6>.

<28>バイオマス糖化のための上記<1>〜<6>のいずれか1に記載のタンパク質の使用。 <28> above for biomass saccharification <1> to use of a protein according to any one of <6>.

<29>上記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉、パーム空果房(EFB)、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる1種以上、好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる1種以上、より好ましくは、バガス、EFB、アブラヤシ(幹部)からなる群より選ばれる1種以上、さらに好ましくはバガスである、上記<26>〜<28>のいずれか1に記載の使用。 <29> the biomass, the workpiece or pulverized wood pulp, papers, bagasse, rice straw, corn Kukiwaka Shikuwa leaf, palm Sorahatebo (EFB), selected from the group consisting of plant shells such, and algae one or more members, preferably wood, the workpiece or pulverized wood, plant stems, leaves, and one or more selected from the group consisting of bunch, more preferably, comprised bagasse, EFB, from oil palm (stem) one or more members selected from the group, even more preferably from bagasse use according to any one of the above <26> - <28>.

以下の実施例において、「%」は特に断りのない場合、「質量%」を意味する。 In the following examples, "%" unless otherwise specified, means "% by mass".

<参考例1> PCR反応 以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においては、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ)を使用し、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。 In the polymerase chain reaction (PCR) for amplifying DNA fragments in the following Examples <Example 1> PCR reaction, using Applied Biosystems 2720 thermal cycler (Applied Biosystems), and accompanying PrimeSTAR Max Premix (Takara Bio) was DNA amplified using reagents. PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを各々20pmol、およびPrimeSTAR Max Premixを25μL添加して、反応液総量を50μLとした。 The reaction solution composition of the PCR, 1 [mu] L appropriately diluted template DNA, sense primer and antisense primer respectively 20 pmol, and PrimeSTAR Max Premix was added 25 [mu] L, the reaction solution amount was set to 50 [mu] L. PCRの反応条件は、98℃で10秒間、57℃で30秒間および72℃で10〜50秒間(目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり10秒)の3段階の温度変化を30回繰り返すことにより行った。 The reaction conditions for PCR, 10 seconds at 98 ° C., (adjustment. Guideline is 10 seconds per 1kb in accordance with the intended amplification product) 30 times the temperature change of the three stages 10-50 seconds for 30 seconds and 72 ° C. at 57 ° C. It was carried out by repeating.

<参考例2> タンパク質の定量 タンパク質の定量には、特に断りのない場合、プロテインアッセイキット(BioRad社製)を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線をもとに計算した。 The quantification of <Reference Example 2> Determination of Proteins, unless otherwise specified, using the protein assay kit (BioRad Co.) was calculated bovine serum albumin based on the calibration curve with the standard protein.

<参考例3> キシラナーゼ活性の測定(1)最適反応pH <Reference Example 3> Measurement of xylanase activity (1) optimum reaction pH
2.0%(w/v)キシラン(キシラン from beechwood、Sigma−Aldrich社製)50μLと、250mM酢酸バッファー(pH4.4、5.0、もしくは5.6)、250mMリン酸バッファー(pH6.2、6.6、7.0、もしくは7.4)、250mMトリス塩酸バッファー(pH7.8、8.2、8.6、もしくは9.0)、または250mMグリシンバッファー(pH9.4、9.8、もしくは10.0)40μLとを混合して、pHの異なる基質溶液90μLを調整した。 2.0% (w / v) xylan (xylan from beechwood, Sigma-Aldrich Corp.) and 50 [mu] L, 250 mM acetate buffer (PH4.4,5.0 or 5.6,), 250 mM phosphate buffer (pH 6.2 , 6.6,7.0, or 7.4), 250mM tris-HCl buffer (PH7.8,8.2,8.6 or 9.0), or 250mM glycine buffer, (PH9.4,9.8 or 10.0) were mixed and 40 [mu] L, to prepare a different substrate solution 90μL of pH. 適当な濃度に希釈したキシラナーゼ溶液を基質溶液に添加し、50℃で10分間反応させた。 Xylanase solution diluted to an appropriate concentration was added to the substrate solution, and reacted at 50 ° C. 10 min.
反応後、反応液にDNS溶液(水酸化ナトリウム(和光純薬工業)1.6%(w/v)、ジニトロサリチル酸(和光純薬工業)0.5%(w/v)、酒石酸ナトリウムカリウム(和光純薬工業)30.0%(w/v))を100μL添加して、100℃にて5分間反応させ酵素反応を停止させた。 After the reaction, DNS solution (sodium hydroxide to the reaction solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1.6% (w / v), dinitrosalicylic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5% (w / v), potassium sodium tartrate ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 30.0% of (w / v)) was 100μL added was stopped reacted enzymatic reaction for 5 minutes at 100 ° C.. 基質溶液90μLにDNS溶液を100μL添加後、上述のキシラナーゼ溶液10μLを加えて同様の操作を行ったものをブランクとした。 After 100μL added DNS solution to substrate solution 90 [mu] L, it was blank having been subjected to the same procedure by adding xylanase solution 10μL above. 反応液を冷却後、540nmの吸光度を吸光マイクロプレートリーダーVersaMax(モレキュラーデバイスジャパン)で測定した。 After cooling the reaction mixture, the absorbance was measured in 540nm by absorbance microplate reader VersaMax (Molecular Devices Japan).

(2)最適反応温度 2.0%(w/v)キシラン(キシラン from beechwood、Sigma−Aldrich社製)50μLと、pH6.0の250mMリン酸−クエン酸バッファー40μLとを混合して基質溶液90μLを調整した。 (2) optimum reaction temperature 2.0% (w / v) xylan (xylan from beechwood, Sigma-Aldrich Corp.) and 50 [mu] L, 250 mM phosphate pH 6.0 - substrate solution 90μL by mixing citrate buffer 40μL It was adjusted. 基質溶液に適当な濃度に希釈したキシラナーゼ溶液(10μL)を添加し、Veritiサーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて45〜70℃(5℃刻み)で10分間反応させた。 Was added xylanase was diluted to a suitable concentration in substrate solution solution (10 [mu] L), and allowed to react for 10 minutes at 45 to 70 ° C. (5 ° C. increments) with Veriti thermal cycler (Applied Biosystems). その後、DNS溶液を100μL添加し、100℃にて5分間反応させて酵素反応を停止させた。 Thereafter, the DNS solution 100μL added and allowed to react for 5 minutes at 100 ° C. The enzyme reaction was stopped. 反応液を冷却後、540nmの吸光度を吸光マイクロプレートリーダーにて測定した。 After cooling the reaction mixture, the absorbance was measured at 540nm at an absorbance microplate reader. なお、既知濃度のキシロース溶液で作成した検量線をもとに反応液中のキシロオリゴ糖量を算出した。 Note that to calculate the xylooligosaccharide content in the reaction solution based on a calibration curve prepared with xylose solutions of known concentration.

<参考例4> セルロース含有原料の調製(1)セルロース含有原料中のホロセルロース含有量の算出 粉砕したセルロース含有原料を、エタノール−ジクロロエタン混合溶剤(1:1)で6時間ソックスレー抽出を行い、抽出後のサンプルを60℃で真空乾燥した。 The <Reference Example 4> Preparation of the cellulose-containing raw material (1) cellulose-containing raw material calculated milled holo cellulose content of the cellulose-containing raw material, ethanol - dichloroethane mixed solvent (1: 1) for 6 hours Soxhlet extraction, extraction and vacuum dried at 60 ° C. the sample after. 得られた試料2.5gに水150mL、亜塩素酸ナトリウム1.0gおよび酢酸0.2mLを添加し、70〜80℃で1時間加温した。 The resulting sample 2.5g in water 150 mL, was added sodium chlorite 1.0g and acetic 0.2 mL, was 1 hour warmed at 70 to 80 ° C.. 引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を添加して加温する操作を、試料が白く脱色するまで3〜4回繰り返し行った。 Operations continue to warming by the addition of sodium chlorite and acetic acid, the sample was repeated 3-4 times until decolorized white. 白色の残渣をグラスフィルター(1G−3)でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、105℃で恒量になるまで乾燥し、残渣質量を求めた。 The white residue was filtered through a glass filter (1G-3), washed with cold water and acetone, dried to constant weight at 105 ° C., was determined residual 渣質 amount. 下記式によりホロセルロース含有量を算出し、これをセルロース含有量とした。 The following equation calculates the holocellulose content, which was used as a cellulose content.
セルロース含有量(質量%)=[残渣質量(g)/セルロース含有原料の採取量(g:塩基性化合物を除いた乾燥原料換算)]×100 Cellulose content (mass%) = [remaining 渣質 weight (g) / cellulose amount of collected containing raw material (g: dry feed converted excluding the basic compound)] × 100

(2)アンヒドログルコース単位(AGU)モル数の算出 AGUモル数は、セルロース含有原料中のホロセルロースをすべてセルロースと仮定して、以下の式に基づき算出した。 (2) calculating AGU moles of anhydroglucose units (AGU) moles, assuming all the holo cellulose in the cellulose-containing raw material and the cellulose was calculated based on the following equation.
AGUモル数=ホロセルロース質量(g)/162 AGU molar number = holocellulose Weight (g) / 162

(3)セルロース含有原料の水分量の測定 セルロース含有原料の水分量の測定には、赤外線水分計(株式会社ケット科学研究所製、製品名「FD−610」)を使用した。 (3) the measurement of the moisture content of the measurement cellulose-containing raw material of the water content of the cellulose-containing raw material, using an infrared moisture meter (Kett Electric Laboratory, product name "FD-610"). 150℃にて測定を行い、30秒間の質量変化率が0.1%以下となる点を測定の終点とした。 Was measured at 0.99 ° C., mass change ratio of the 30 seconds is the end point of the measurement points is 0.1% or less. 測定された水分量の値を、セルロース含有原料の乾燥質量に対する質量%に換算した。 The value of the measured water content, in terms of mass% relative to the dry weight of the cellulose-containing raw material.

(4)粉砕処理物の平均粒子径の測定 粉砕処理物の平均粒子径は、レーザー回折/散乱式粒度分布測定装置「LA−950」(株式会社堀場製作所製)を用いて測定した。 (4) Average particle diameter of the measuring pulverized product having an average particle diameter of the pulverized product were measured using a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring apparatus "LA-950" (manufactured by Horiba Ltd.). 測定試料として粉砕処理物0.1gを5mLの水に加え、超音波で1分間処理した試料分散液を用いた。 The pulverized product 0.1g was added to water 5mL as a measurement sample, using the sample dispersion liquid was treated for one minute with ultrasound. 体積基準のメジアン径を、温度25℃にて測定し、これを平均粒子径とした。 The median diameter on a volume basis, was determined at a temperature 25 ° C., and an average particle diameter of this.

<実施例1> キシラナーゼの調製(ゲノムDNAの抽出) Preparation of <Example 1> xylanase (Extraction of genomic DNA)
Xylanimonas cellulosilytica DSM15894株をTrypticase Soy Agar培地(3.0%Trypticase Soy、2.0%Agar)に植菌し、28℃にて1日間培養した。 Was inoculated Xylanimonas cellulosilytica DSM15894 share Trypticase Soy Agar medium (3.0% Trypticase Soy, 2.0% Agar) and cultured for 1 day at 28 ℃. 培養して得られた菌体から、UltraClean TM Microbial DNA Isolation Kit(Mo Bio Laboratories, Inc.製)を用いてゲノムDNAを取得した。 From the bacterial cells obtained by culturing, UltraClean TM Microbial DNA Isolation Kit ( Mo Bio Laboratories, Inc. , Ltd.) was obtained genomic DNA using.

(ベクターの作製) (Production of the vector)
得られたゲノムDNAを鋳型として、表1に示したフォワードプライマー1(配列番号5)とリバースプライマー1(配列番号6)を用いて、ゲノム上のキシラナーゼ遺伝子領域(配列番号1)約1.0kbp断片(A)を増幅した。 The obtained genomic DNA as a template, using forward primer shown in Table 1 1 (SEQ ID NO: 5) reverse primer 1 (SEQ ID NO: 6), xylanase on genomic gene region (SEQ ID NO: 1) about 1.0kbp fragment was amplified (a).
シャトルベクターpHY300PLK(タカラバイオ)のBamHI制限酵素切断点に、バチルス属細菌KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のS237アルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報参照)(配列番号3)をコードするDNA断片が挿入された組換えプラスミドpHY−S237を鋳型とし、表1に示したフォワードプライマー2(配列番号7)とリバースプライマー2(配列番号8)を用いてS237アルカリセルラーゼ構造遺伝子を除く約5.6kbp断片(B)を増幅した。 The BamHI restriction enzyme cleavage point of a shuttle vector pHY300PLK (Takara Bio), Bacillus bacterium KSM-S237 strain (FERM BP-7875) derived from S237 alkaline cellulase gene (see JP 2000-210081) (SEQ ID NO: 3) the recombinant plasmid pHY-S237 of encoding DNA fragment was inserted as a template, except S237 alkaline cellulase structural gene using the forward primer 2 shown in Table 1 (SEQ ID NO: 7) and reverse primer 2 (SEQ ID NO: 8) It was amplified about 5.6kbp fragment (B). 増幅した遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit(Roche製)にて精製した。 The amplified gene fragment was purified by High Pure PCR Product Purification kit (manufactured by Roche).

精製されたDNA断片(A)1μLとDNA断片(B)1μL、In−Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)に含まれる5×In−Fusion HD Enzyme Premi×2μL、DNaseフリーの水6μLを混合し、50℃で15分反応させ、キシラナーゼ遺伝子の断片をベクターにクローニングした。 Purified DNA fragment (A) 1 [mu] L DNA fragment (B) 1μL, In-Fusion HD Cloning Kit 5 × In-Fusion HD Enzyme Premi × 2μL contained in (Takara Bio), and mixed DNase free water 6 [mu] L, reacted for 15 minutes at 50 ° C., it was cloned fragments of xylanase genes in the vector. その後、反応液2μLを用いて、コンピテントセルE.coli HB101(タカラバイオ)20μLを形質転換した。 Then, by using the reaction solution 2 [mu] L, competent cells E. coli HB101 (Takara Bio) 20 [mu] L was transformed. 形質転換体の再生培地には、50ppmアンピシリンナトリウム(和光純薬工業)、2.0%アガー(和光純薬工業)を含むLB寒天培地を用いた。 The regeneration medium of transformant, 50 ppm ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was used LB agar medium containing 2.0% agar (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。 From the transformants obtained as an ampicillin resistant strain was selected a strain that retains a plasmid gene of interest was inserted by colony PCR. 選別した形質転換体は同様のLB寒天培地を用いて培養後(37℃、1日間)、得られた菌体からプラスミドをHigh Pure Plasmid Isolation kit(Roche)を用いて回収、精製した。 After selecting transformant is cultured using the same LB agar medium (37 ° C., 1 day), the plasmid from the obtained cells by using the High Pure Plasmid Isolation kit (Roche) recovered and purified.

(形質転換体の作製) (Preparation of transformants)
プラスミドの宿主菌への導入はプロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet., 1979, 168:111-115)に従って行った。 Introduction into the host bacterium plasmid protoplast transformation method (Mol Gen. Genet, 1979, 168:.. 111-115) and was performed according to. この際、宿主菌にはBacillus subtilis 168株プロテアーゼ9重欠損株(KA8AX)(特開2006−174707号公報)を用いた。 At this time, the host strain using Bacillus subtilis 168 strain protease 9 double deficient strain (KA8AX) (JP 2006-174707). 形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有DM3再生寒天培地(キシラン from beechwood(Sigma−Aldrich)1.0%(w/v)、バクトカザミノ酸(Difco)0.5%(w/v)、酵母エキス(Difco)0.5%(w/v)、L−トリプトファン(和光純薬工業)0.01%(w/v)、コハク酸二ナトリウム六水和物(和光純薬工業)8.1%(w/v)、リン酸一水素二カリウム(和光純薬工業)0.35%(w/v)、リン酸二水素一カリウム(和光純薬工業)0.15%(w/v)、グルコース(和光純薬工業)0.5%(w/v)、塩化マグネシウム(和光純薬工業)20mM、牛血清アルブミン(和光純薬工業)0.01%(w/v)、トリパンブルー0.01%(w/v)(A The regeneration medium transformants containing tetracycline DM3 regeneration agar medium (xylan from beechwood (Sigma-Aldrich) 1.0% (w / v), Bakutokazamino acid (Difco) 0.5% (w / v), Yeast extract (Difco) 0.5% (w / v), L- tryptophan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.01% (w / v), disodium succinate hexahydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 8.1 % (w / v), monohydrogen potassium phosphate (produced by Wako Pure Chemical Industries) 0.35% (w / v), dihydrogen potassium phosphate (produced by Wako Pure Chemical Industries) 0.15% (w / v) , glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5% (w / v), magnesium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM, bovine serum albumin (Wako Pure Chemical Industries) 0.01% (w / v), trypan blue 0 .01% (w / v) (A ROS ORGANICS)、テトラサイクリン塩酸塩(和光純薬工業)0.005%(w/v)、寒天1.0%(w/v))を用いた。 ROS ORGANICS), tetracycline hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries) 0.005% (w / v), were used 1.0% agar (w / v)).

(キシラナーゼ生産) (Xylanase production)
DM3再生寒天培地上に生育した形質転換体15ppmテトラサイクリン含有LB培地5mLを用いてシード培養後(30℃、250rpm、16時間)、シード培養液0.6mLを2×L Mal培地20mL(バクトトリプトン2%(w/v)、酵母エキス1.0%(w/v)、塩化ナトリウム1.0%(w/v)、硫酸マンガン五水和物(和光純薬工業)75ppm、マルトース一水和物(和光純薬工業)7.5%(w/v)、テトラサイクリン塩酸塩15ppm)に添加し、メイン培養を行った(30℃、230rpm、3日間)。 DM3 regeneration Transformants were grown on agar 15ppm with tetracycline-containing LB medium 5mL after seed culture (30 ° C., 250 rpm, 16 hours), the seed culture solution 0.6 mL 2 × L Mal medium 20 mL (Bacto tryptone 2% (w / v), 1.0% yeast extract (w / v), sodium chloride 1.0% (w / v), manganese sulfate pentahydrate (Wako Pure Chemical Industries) 75 ppm, maltose monohydrate things (Wako Pure Chemical Industries) 7.5% (w / v), was added to tetracycline hydrochloride 15 ppm), were the main culture (30 ℃, 230rpm, 3 days). 培養後、遠心分離(11,000rpm、15分間、4℃)により培養上清を得た。 After culture, centrifugation (11,000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to obtain a culture supernatant. 培養上清3mLを脱塩カラムEcono−Pac 10DG(BioRad)を用いて20mM Tris−HCl pH7.5へとバッファー交換を行うことで、組換えキシラナーゼ粗酵素液を調製した。 By performing the buffer exchanged into 20 mM Tris-HCl pH 7.5 using a desalting column Econo-Pac 10DG (BioRad) culture supernatant 3 mL, was prepared recombinant xylanase crude enzyme solution.

<試験例1> <Test Example 1>
(キシラナーゼ活性および最適反応pH) (Xylanase activity and optimum reaction pH)
適当な濃度に希釈した実施例1で調製したキシラナーゼ溶液(10μL)または対照キシラナーゼCellic(登録商標)HTec(Novozymes A/S)を基質溶液に添加し、前述の参考例3(1)の条件で反応させ、キシラナーゼ活性を測定した。 Xylanase prepared in Example 1 was diluted to a suitable concentration solution (10 [mu] L) or control xylanase Cellic (TM) HTec the (Novozymes A / S) was added to the substrate solution, the conditions of the aforementioned Reference Example 3 (1) It reacted, was measured xylanase activity.
既知濃度のキシロース溶液で作成した検量線をもとに、反応液中のキシロオリゴ糖量を算出し、その値から、基質液由来のバックグラウンドの値(ブランク)を差し引いた値を、酵素反応での生成糖量とした。 Based on the calibration curve prepared in xylose solutions of known concentration, calculates the xylooligosaccharide content in the reaction solution, from that value, the background from the substrate solution value a value obtained by subtracting the (blank), an enzyme reaction of the generated amount of sugar. その後、生成糖量から各希釈酵素溶液のキシラナーゼ活性(unit)を計算した。 It was then calculated xylanase activity (unit) of each dilution enzyme solution from generation amount of sugar. 1unit(U)は、1分間に1μmolのD−キシロース相当の還元糖を遊離する酵素の活性とした。 1unit (U) was the activity of the enzyme which liberates D- xylose equivalent reducing sugar 1μmol per minute. 結果を表2に示す。 The results are shown in Table 2. 表中、最大活性に対する相対活性(%)とは、最大活性を得たpH(pH6.6)での活性を100%としたときの相対活性を示し、Cellic(登録商標)HTecに対する相対活性(%)とは、各pHにおけるCellic(登録商標)HTecの比活性を100%としたときの相対活性を示す。 In the table, the relative activity (%) of the maximum activity, shows the relative activity when the activity at pH obtaining the maximum activity (pH 6.6) was 100%, Cellic (R) relative activity against HTec ( %) and indicates the relative activity is 100% of the specific activity of Cellic (registered trademark) HTec at each pH.

実施例1で調製した本発明のキシラナーゼは、pH6.6で最大活性を示し、その際の比活性は約1717U/mgであった。 Xylanase of the present invention prepared in Example 1 shows the maximum activity at pH 6.6, the specific activity at that time was about 1717U / mg. また、当該キシラナーゼは、pH5.0以上において市販キシラナーゼより高い比活性を示した。 Further, the xylanase showed higher specific activity than the commercial xylanase in the above pH 5.0. さらに、当該キシラナーゼは、pH7.0〜9.0の間で1200U/mg以上の比活性を有し、最大活性の70%以上の活性を維持していた。 Furthermore, the xylanase has a 1200 U / mg specific activity of more than among PH7.0~9.0, it maintained a 70% or more of maximum activity. これらの結果より、当該キシラナーゼが広い範囲のpHで高いキシラナーゼ活性を有し、特にアルカリ領域においても高い活性を有することが示された。 These results have a high xylanase activity at the pH of the xylanase wide range, it was especially shown to have high activity in an alkaline region.

<試験例2> <Test Example 2>
(最適反応温度) (Optimum reaction temperature)
基質溶液に適当な濃度に希釈した実施例1で調製したキシラナーゼ溶液(10μL)を添加し、前述の参考例3(2)の測定条件でキシラナーゼ活性を測定した。 Was added xylanase prepared in Example 1 was diluted to a suitable concentration in substrate solution solution (10 [mu] L), were measured xylanase activity under the measurement conditions of the aforementioned Reference Example 3 (2). 既知濃度のキシロース溶液で作成した検量線をもとに反応液中のキシロオリゴ糖量を算出した。 The calibration curve prepared in xylose solution of known concentration was calculated xylooligosaccharide content in the reaction solution based. 算出した値からブランクの値を差し引いて、酵素反応で生成されたキシロオリゴ糖量を算出した。 By subtracting the blank value from the calculated value was calculated xylooligosaccharide amount generated by the enzymatic reaction. 最大の生成糖量を示したサンプルを100%とした際の各温度での生成糖量を相対活性として求めた。 The production amount of sugar in each temperature at which the sample showed the maximum production amount of sugar as 100% was calculated as a relative activity. 結果を表3に示す。 The results are shown in Table 3. 本発明のキシラナーゼは、60℃付近で最もキシラン分解活性が高く、45〜65℃の範囲で60℃での活性の60%以上の活性を示した。 Xylanase of the present invention, the highest xylanolytic activity at around 60 ° C., showed more than 60% of the activity at 60 ° C. in the range of 45 to 65 ° C..

<実施例2> キシラナーゼによるバイオマスの糖化(バイオマスの調製) Saccharification of biomass by <Example 2> xylanase (Preparation of biomass)
基質として使用するバガス粉砕物は以下のように調製した。 Bagasse pulverized material used as a substrate was prepared as follows.
バガス(サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量71.3質量%、結晶化度29%、水分量7.0質量%)を減圧乾燥機VO−320(アドバンテック東洋)中に入れ、窒素流通下の条件で2時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量71.3wt%、結晶化度29%、水分量2.0wt%の乾燥バガスを得た。 Bagasse (pomace sugarcane, holocellulose content 71.3 wt%, crystallinity of 29%, water content 7.0 wt%) were placed in a vacuum dryer VO-320 (Advantec Toyo), under a nitrogen stream 2 hours and dried under reduced pressure at conditions holocellulose content 71.3Wt% crystallinity 29%, to obtain a water content 2.0 wt% of the dry bagasse.

(混合粉砕処理) (Mixing and pulverizing treatment)
得られた乾燥バガス100gと粒径0.7mmの粒状の水酸化ナトリウム「トーソーパール」(東ソー社製)8.8g(ホロセルロースを構成するAGU1モルに対し0.5モル相当量)を、バッチ式振動ミルMB−1(中央化工機:容器全容積3.5L、媒体としてφ30mm、長さ218mm、断面形状が円形のSUS304製ロッドを13本使用、ロッド充填率57%)に投入し、2時間粉砕処理することでバガス粉砕物(平均粒子径約16.6μm)を得た。 Sodium hydroxide particulate obtained dried bagasse 100g and particle size 0.7mm "Toso Pearl" (manufactured by Tosoh Corporation) 8.8 g (0.5 mol equivalent weight to AGU1 mol constituting the holocellulose), batch wherein the vibration mill MB-1 (middle Kakohki: container total volume 3.5 L, .phi.30 mm as a medium, the length 218 mm, sectional shape 13 present use a circular rod made of SUS304, rod filling rate 57%) was poured into 2 to obtain bagasse pulverized product (average particle size about 16.6Myuemu) by time grinding process.

(糖化処理) (Saccharification treatment)
2mL容マイクロチューブに、調製したバガス粉砕物50mgと0.4mLの水を添加し、1N−HClにて粉砕に使用した水酸化ナトリウムを中和した。 To 2mL volume microtube, water was added bagasse pulverized product 50mg and 0.4mL prepared to neutralize the sodium hydroxide used in the ground in 1N-HCl. 中和された溶液に0.4mLの250mM酢酸ナトリウムバッファー(pH4.0もしくは5.0)、250mMリン酸バッファー(pH6.0もしくは7.0)、または250mMトリス塩酸バッファー(pH8.0もしくは9.0)を添加して基質溶液を調製した。 250mM sodium acetate buffer at 0.4mL the neutralized solution (pH 4.0 or 5.0), 250mM phosphate buffer (pH 6.0 or 7.0), or 250mM Tris-HCl buffer (pH8.0 or 9. 0) was added to prepare a substrate solution. 基質溶液は、実施例1で調製したキシラナーゼ溶液または対照のキシラナーゼ溶液を1サンプルあたり50μg−タンパク質となるように添加後、水を加えて全量を1mLとした。 Substrate solution, after addition of xylanase solution or control xylanase solution prepared in Example 1 so that one sample per 50μg- protein, the total amount and mixed with water to prepare 1 mL. その後、50℃、150rpmで往復振とうしながら1日間糖化反応を行った。 Thereafter, 50 ° C., was 1 day saccharification reaction with shaking back and forth at 150 rpm. 対照のキシラナーゼとしては、Cellic(登録商標)HTec(Novozymes A/S)またはThermomyces lanuginosus由来キシラナーゼ(Sigma−Aldorich)を用いた。 As a control of xylanase was used Cellic (TM) HTec (Novozymes A / S) or Thermomyces lanuginosus xylanase (Sigma-Aldorich). Thermomyces lanuginosus由来キシラナーゼは、pH5.0の基質溶液のみに添加した。 Thermomyces lanuginosus xylanase was added only substrate solution pH 5.0.

反応終了後、遠心分離(15000rpm、5min、4℃)にて上清を回収し、DX500クロマトグラフィーシステム(日本ダイオネクス社製)にて上清中のキシロース、キシロビオースおよびキシロトリオースの濃度を測定した。 After the completion of the reaction, centrifuged supernatant was collected at (15000 rpm, 5min, 4 ° C.), xylose in the supernatant by DX500 Chromatography System (manufactured by Nippon Dionex) to determine the concentration of xylobiose and xylotriose . これら3つの遊離糖量の和をバガス由来の生成糖量とした。 The sum of these three free sugar amount was produced sugar content derived from bagasse. 結果を表4に示す。 The results are shown in Table 4. 表中の相対生成糖量は、各pHにおけるCellic(登録商標)HTecの生成糖量を100%とした場合の相対値である。 The relative production amount of sugar in the table are relative values ​​when the generation amount of sugar of Cellic (registered trademark) HTec at each pH as 100%.

表4に示したように、本発明のキシラナーゼは、測定した全てのpH範囲でCellic(登録商標)HTecよりも高い糖化活性を示し、特にアルカリ領域(pH7〜9)においても安定して高い糖化活性を維持していた。 As shown in Table 4, the xylanase of the present invention, Cellic (R) at all pH ranges measured HTec showed higher saccharification activity than, particularly stable even higher glycosylated in the alkaline region (pH 7-9) It had maintained the activity. なお、市販のThermomyces lanuginosus由来キシラナーゼは、pH5においてCellic(登録商標)HTecと同等の糖化活性(相対生成糖量101%)を示した。 Incidentally, commercially available Thermomyces lanuginosus xylanase showed Cellic (TM) HTec comparable saccharification activity (relative generation amount of sugar 101%) at pH 5. これらの結果より、本発明のキシラナーゼは幅広いpHにて汎用的な使用が可能であると考えられた。 These results, xylanase of the present invention is considered to be possible versatile use in a wide range of pH.

<実施例3> 酵素製剤によるバイオマスの糖化(バイオマスの調製) Saccharification of biomass by <Example 3> enzyme preparation (Preparation of biomass)
実施例2で調製したバガス粉砕物(平均粒子径約16.6μm)を用いた。 Bagasse ground product prepared in Example 2 (average particle diameter of about 16.6Myuemu) was used.
(セルラーゼの調製) (Preparation of cellulase)
Trichoderma reesei QM6a株由来エンドグルカナーゼI(配列番号10、以下TrEGIと略す)の調製は以下のように行った。 Trichoderma reesei QM6a line-derived endoglucanase I (SEQ ID NO: 10, hereinafter referred to as TrEGI) Preparation of was carried out as follows.
TrEGIをコードするDNA配列(配列番号9)をPCRにより増幅して、Aspergillus oryzae用発現ベクターであるpPTR I DNA(タカラバイオ)へとプロモーターと連結後導入した。 DNA sequences encoding TrEGI (SEQ ID NO: 9) was amplified by PCR, was introduced after linked to a promoter into pPTR I DNA is an expression vector for Aspergillus oryzae (Takara Bio). その後、A. oryzae RIB40株へと作製したベクターを導入し、形質転換体を取得した。 Then, A. And introducing the vector prepared to oryzae RIB40 strain to obtain a transformant. 得られた形質転換体を培養することで培養液中へとTrEGIを分泌生産させた。 The resulting TrEGI into culture medium by culturing the transformants were secreting produce. 発現させたTrichoderma reesei QM6a株由来エンドグルカナーゼI(以下TrEGI)のタンパク質量は、精製TrEGIのCMC分解活性とDCプロテインアッセイキット(BioRad社製)によるタンパク質量から比活性(211.5U/mg−タンパク質)を計算し、培養上清中のCMC分解活性から上清中のタンパク質量を逆算して求めた。 The amount of protein expressed was the Trichoderma reesei QM6a line-derived endoglucanase I (hereinafter TrEGI) is purified TrEGI the CMC degrading activity and DC protein assay kit (BioRad Co., Ltd.) by protein amounts from the specific activity (211.5U / mg- protein) It was calculated and calculates back the amount of protein in the supernatant from the CMC degrading activity in the culture supernatant.

(糖化処理) (Saccharification treatment)
2mL容マイクロチューブに、調製したバガス粉砕物50mgと0.4mLの水を添加し、1N−HClにて粉砕に使用した水酸化ナトリウムを中和した。 To 2mL volume microtube, water was added bagasse pulverized product 50mg and 0.4mL prepared to neutralize the sodium hydroxide used in the ground in 1N-HCl. 中和された溶液に0.4mLの250mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.5)を添加して基質溶液を調製した。 Was added 250mM sodium acetate buffer at 0.4mL the neutralized solution (pH 5.5) substrate solution was prepared. 基質溶液には、本発明のキシラナーゼを含む酵素製剤(試験品)を1サンプルあたり100μg−タンパク質となるように添加後、水を加えて全量を1mLとした。 The substrate solution, after addition of the enzyme preparation containing a xylanase of the invention (specimen) such that one sample per 100μg- protein, the total amount by adding water was 1 mL. 対象としては、Cellic(登録商標)CTec2を1サンプルあたり50μg、100μgまたは150μg−タンパク質を添加後、同様に水を加えて全量を1mLとした。 The target, Cellic (TM) CTec2 one sample per 50 [mu] g, after addition of 100μg or 150μg- protein, as well the total amount by adding water was 1 mL. その後、50℃、150rpmで往復振とうしながら3日間糖化反応を行った。 Thereafter, 50 ° C., was carried out for 3 days saccharification reaction with shaking back and forth at 150 rpm. 本発明のキシラナーゼを含む酵素製剤には、本発明のキシラナーゼ:TrEGI:exo-1,4-β-D-Xylosidase(メガザイム社):Cellic(登録商標)CTec2=10:20:1:31(タンパク質量比)で混合したものを用いた(タンパク質100μg中、Cellic(登録商標)CTec2を50μg含有)。 The enzyme preparation containing xylanase of the present invention, xylanases of the invention: TrEGI: exo-1,4-β-D-Xylosidase (Megazyme Co.): Cellic (TM) CTec2 = 10: 20: 1: 31 (protein It was a mixture in an amount ratio) (protein 100μg, Cellic (R) a CTec2 50 [mu] g-containing). なお、上記酵素製剤中の各タンパク質量及び比率計算には、DCプロテインアッセイキットにて測定したタンパク質量を使用した。 Incidentally, the amount of each protein and ratio calculation of the enzyme preparation used was the amount of protein was measured by DC protein assay kit.

反応終了後、遠心分離(15000rpm、5min、4℃)にて上清を回収し、DX500クロマトグラフィーシステム(日本ダイオネクス社製)にて上清中のグルコース、セロビオース、キシロース、キシロビオースおよびキシロトリオースの濃度を測定した。 After the completion of the reaction, centrifugation (15000 rpm, 5min, 4 ° C.) the supernatant was recovered by glucose in the supernatant by DX500 Chromatography System (manufactured by Nippon Dionex), cellobiose, xylose, of xylobiose and xylotriose concentration was measured. これら5つの遊離糖量の和をバガス由来の生成糖量とした。 The sum of these five free sugar amount was produced sugar content derived from bagasse. 結果を図1に示す。 The results are shown in Figure 1. 図中の相対糖化率は、Cellic(登録商標)CTec2を1サンプルあたり50μg−タンパク質を添加した際の生成糖量を100%とした場合の相対値である。 The relative glycation rate in the figure are relative values ​​when the generation amount of sugar upon addition of Cellic (TM) CTec2 one sample per 50μg- protein was 100%.

図1に示したように、本発明のキシラナーゼを含む酵素製剤を用いることで、同タンパク質量や1.5倍量のCellic(登録商標)CTec2よりも高い糖化活性を示し、本発明のキシラナーゼを含む酵素製剤がバイオマスの糖化に適していることが示された。 As shown in FIG. 1, by using the enzyme preparation containing xylanase of the present invention, it shows the same amount of protein and 1.5 times the amount of Cellic (TM) high saccharification activity than CTec2, the xylanase of the present invention enzyme preparation containing it was shown to be suitable for saccharification of biomass.

Claims (13)

  1. 下記(a)〜(c)から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有する、単離または精製されたタンパク質: Following (a) ~ consisting of an amino acid sequence selected from (c), and having a xylanase activity, isolated or purified protein:
    (a)配列番号2で示されるアミノ酸配列; Amino acid sequence shown in (a) SEQ ID NO: 2;
    (b)配列番号2で示されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;および、 (B) an amino acid sequence having the amino acid sequence 85% or more sequence identity to SEQ ID NO: 2; and,
    (c)配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 (C) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 1 plural amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence.
  2. pH7.0〜9.0の範囲における前記キシラナーゼ活性が、最大活性の70%以上である、請求項1記載のタンパク質。 The xylanase activity in the range of pH7.0~9.0 is 70% or more of the maximum activity, according to claim 1, wherein the protein.
  3. 最適反応pHが6.0〜7.0である、請求項1または2記載のタンパク質。 Optimum reaction pH is 6.0 to 7.0, according to claim 1 or 2 wherein the protein.
  4. 下記(d)〜(f)から選ばれる遺伝子にコードされる、請求項1〜3のいずれか1項記載のタンパク質: Following (d) ~ encoded by a gene selected from (f), of any one of claims 1 to 3 proteins:
    (d)配列番号1で示される塩基配列からなる遺伝子; (D) a gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
    (e)配列番号1で示される塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子;および、 (E) a gene consisting of a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1; and,
    (f)配列番号1で示される塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子。 (F). 1 to a plurality of nucleotides are deleted in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, gene consisting of a substituted or added in the nucleotide sequence.
  5. 前記遺伝子がXylanimonas属由来の遺伝子である、請求項4記載のタンパク質。 The gene is a gene derived from Xylanimonas genus claim 4 wherein the protein.
  6. 前記遺伝子を含むベクターを微生物に導入して得られた形質転換体により生産される、請求項4または5記載のタンパク質。 It said vector comprising a gene produced by transformants obtained by introducing into a microorganism, according to claim 4 or 5, wherein the protein.
  7. 請求項1〜6のいずれか1項記載のタンパク質を含む、バイオマス糖化用酵素製剤。 Including proteins according to any one of claims 1-6, the enzyme preparation for biomass saccharification.
  8. セルラーゼをさらに含む、請求項7記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 Further comprising a cellulase enzyme preparation for biomass saccharification of claim 7.
  9. 前記セルラーゼがエンドグルカナーゼを含む、請求項8記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 The cellulase comprises endoglucanase, an enzyme preparation for biomass saccharification of claim 8.
  10. 前記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉、パーム空果房(EFB)、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる1種以上である、請求項7〜9のいずれか1項記載のバイオマス糖化用酵素製剤。 The biomass, the workpiece or pulverized wood pulp, papers, bagasse, rice straw, corn Kukiwaka Shikuwa leaf, palm Sorahatebo (EFB), vegetable shells acids, and one selected from the group consisting of algae or more, biomass saccharification enzyme formulation according to any one of claims 7-9.
  11. バイオマスを、請求項7〜10のいずれか1項記載の酵素製剤で糖化処理する工程を含む、糖の製造方法。 Biomass, comprising the step of saccharification treatment with the enzyme preparation of any one of claims 7 to 10, a manufacturing method of the sugar.
  12. 前記バイオマスを前処理する工程をさらに含み、該前処理がアルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる1種以上である、請求項11記載の方法。 Further comprising, pretreatment alkali treatment, is at least one selected from the group consisting of milled and hydrothermally treated 12. The method of claim 11, wherein the step of preprocessing the biomass.
  13. 前記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉、パーム空果房(EFB)、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる1種以上である、請求項11または12記載の方法。 The biomass, the workpiece or pulverized wood pulp, papers, bagasse, rice straw, corn Kukiwaka Shikuwa leaf, palm Sorahatebo (EFB), vegetable shells acids, and one selected from the group consisting of algae in it, according to claim 11 or 12 a method according above.
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