JP6460945B2 - Method for detecting Geobacillus stearothermophilus and primer pair for detecting Geobacillus stearothermophilus - Google Patents
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Description
本発明は、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスを特異的に検出する方法およびジオバチルス・ステアロサーモフィルス検出用プライマー対に関する。 The present invention relates to a method for specifically detecting Geobacillus stearothermophilus and a primer pair for detecting Geobacillus stearothermophilus.
微生物の中には、芽胞を形成する細菌が存在する。芽胞形成細菌は、生存に良好な環境では活発に分裂し増殖するが、環境の栄養分が減少したり、乾燥するなど、増殖に不利な環境になると芽胞を形成する。芽胞は極めて高い耐久性を持っており、さらに環境が悪化して通常の細菌が死滅する状況に陥っても生き残ることが可能である。しかし、芽胞の状態では細菌は新たに分裂することはできず、その代謝も限られている。 Among microorganisms, there are bacteria that form spores. Spore-forming bacteria actively divide and proliferate in an environment that is good for survival, but form spores when the environment becomes disadvantageous for growth, such as when the nutrients in the environment decrease or dry. Spores have extremely high durability, and can survive even if the environment deteriorates and normal bacteria die. However, bacteria cannot newly divide in the spore state, and their metabolism is limited.
芽胞は栄養細胞の中に形成される耐久型細胞であり、水分が非常に低く、殆ど代謝せず、いわば休眠状態にある。この状態のときは種々のストレスに強い耐性を示し、加熱に対する抵抗性も強く、殺滅には１００℃以上で所定時間以上の加熱が必要である。休眠状態にある芽胞は、生き残った芽胞が再びその細菌の増殖に適した環境に置かれると、当該芽胞が発芽して、通常の増殖・代謝能を有する菌体が作られる。 Spores are durable cells formed in vegetative cells, have very low water content, hardly metabolize, and are in a dormant state. In this state, it shows a strong resistance to various stresses and has a high resistance to heating. To kill it, heating at 100 ° C. or higher for a predetermined time or longer is required. When the surviving spores are placed again in an environment suitable for the growth of the bacteria, the spores germinate to produce cells having normal growth / metabolism ability.
芽胞は耐熱性が強いために、加熱殺菌によって微生物の制御をしている容器詰め食品では、その存在が問題となる。芽胞は、容器詰め食品にとって最も重要な生物学的危害要因で、加熱殺菌の指標となっている。 Since spores have high heat resistance, their presence is a problem in packaged foods in which microorganisms are controlled by heat sterilization. Spores are the most important biological hazard for packaged foods and are an indicator of heat sterilization.
食品材料の炭水化物や脂肪等が分解されて風味が悪くなり食用に適さなくなることを変敗というが、高温下に放置された容器詰め食品（例えば飲料缶詰）の中には、フラットサワー様の変敗を引き起こす事例が認められることがあった。この変敗の原因菌として、モーレラ属菌、ジオバチルス属菌、サーモアナエロバクテリウム属菌などの高温芽胞菌による汚染であるとの報告がある（非特許文献１〜４）。 Degradation is caused when carbohydrates and fats in food materials are decomposed and become unusable due to a bad taste. However, some foods that are left in high temperatures (for example, canned beverages) are flat sour-like changes. In some cases, defeat was observed. As a causative bacterium of this deterioration, there is a report that it is contamination by high-temperature spore bacteria such as Morella, Geobacillus, and Thermoanaerobacterium (Non-Patent Documents 1 to 4).
これら細菌は、何れも形成する芽胞の耐熱性が極めて高く、制御の難しい微生物とされており、低酸性飲料や缶詰などの変敗サンプルから高頻度で検出されている。 These bacteria are considered to be microorganisms that are extremely difficult to control because of the extremely high heat resistance of the spores that form, and are frequently detected from degraded samples such as low-acid beverages and canned foods.
容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。乳成分含有飲料が自動販売機などにおいて低温保存状態で販売ないし貯蔵される場合には、残存した耐熱性芽胞形成細菌の芽胞は発芽・増殖し難く、品質上の問題が生じることは殆どない。しかし、例えば５５℃の加温状態に置かれた場合には、残存した高温耐熱性芽胞形成菌の芽胞が発芽・増殖して、飲料内容物に変敗を生じさせる結果、飲食適性（商品性）が失われる虞がある。 In beverage production among container-packed foods, for example, dairy ingredient-containing beverages are usually subjected to retort heat sterilization treatment. Under normal conditions of this heat sterilization treatment, there is a risk that spores of heat-resistant spore-forming bacteria remain. When a milk component-containing beverage is sold or stored in a low temperature storage state in a vending machine or the like, the remaining heat-resistant spore-forming spore hardly germinates and proliferates, and hardly causes quality problems. However, when placed in a heated state of, for example, 55 ° C., the remaining high-temperature heat-resistant spore-forming spore germinates and grows, resulting in deterioration of the beverage content, resulting in food suitability (commercial properties). ) May be lost.
従って、上述した高温芽胞菌の制御については、食品業界において非常に重要な菌種であると考えられる。 Therefore, it is considered that the above-mentioned control of thermospore bacteria is a very important bacterial species in the food industry.
微生物学の分野においても分子生物学的手法が盛んに用いられるようになり、細菌の検出に核酸増幅法による検出のためのプライマーが提案されている。リアルタイムＰＣＲ法は、高感度で定性・定量が可能となる方法である。しかし、これまでに上述した高温芽胞菌、特にジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）を対象とした核酸増幅法による検出は知られていなかった。 In the field of microbiology, molecular biological techniques are actively used, and primers for detection by a nucleic acid amplification method have been proposed for detection of bacteria. The real-time PCR method is a method that enables qualitative and quantitative measurement with high sensitivity. However, detection by the nucleic acid amplification method targeting the above-mentioned thermospore bacteria, in particular, Geobacillus stearothermophilus , has not been known so far.
従って、本発明の目的は、核酸増幅法を使用したジオバチルス・ステアロサーモフィルスの検出方法、および、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス検出用プライマー対を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for detecting Geobacillus stearothermophilus using a nucleic acid amplification method and a primer pair for detecting Geobacillus stearothermophilus.
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［２］に示す発明を提供する。
［１］ジオバチルス・ステアロサーモフィルスの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子に由来する配列番号１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるプライマー対を使用して、被検体試料中に含まれる細菌から抽出した核酸を鋳型として前記プライマー対を使用して前記核酸の増幅をリアルタイムＰＣＲ法により行なう核酸増幅工程を含むジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出する方法。
［２］配列番号１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、リアルタイムＰＣＲ法で使用するジオバチルス・ステアロサーモフィルス検出用プライマー対。
That is, in order to achieve the above object, the following inventions [1] to [2] are provided.
[1] A combination of a forward primer consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 derived from a gene encoding 16S rRNA of Geobacillus stearothermophilus and a reverse primer consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Geobacillus stearothermophilus comprising a nucleic acid amplification step using a primer pair to amplify the nucleic acid by a real-time PCR method using the primer pair as a template with a nucleic acid extracted from bacteria contained in a sample. How to detect.
[2] Primer for detecting Geobacillus stearothermophilus used in real-time PCR method, comprising a combination of a forward primer consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 2 versus.
上記［１］によれば、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスの検出を核酸増幅法（リアルタイムＰＣＲ法）で簡便に行なうことができる。特に、プライマー対を、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子においてジオバチルス・ステアロサーモフィルスに特徴的な配列に基づいて設計したため、当該プライマー対を使用して増幅した増幅産物は、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のものとなる。従って、本構成の核酸増幅工程を行なって得られた増幅産物を検出することで、確実にジオバチルス・ステアロサーモフィルスの検出を行なうことができる。 According to the above [1 ] , Geobacillus stearothermophilus can be easily detected by a nucleic acid amplification method (real-time PCR method) . In particular, since the primer pair was designed based on a sequence characteristic of Geobacillus stearothermophilus in the gene encoding 16S rRNA of Geobacillus stearothermophilus, the amplification product amplified using the primer pair was It is derived from Geobacillus stearothermophilus. Therefore, by detecting the amplification product obtained by performing the nucleic acid amplification step of this configuration, it is possible to reliably detect Geobacillus stearothermophilus.
また、本構成によれば、高感度で定性・定量が可能となる核酸増幅方法（リアルタイムＰＣＲ法）によってジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出することができる。 Further, according to this configuration, Geobacillus stearothermophilus can be detected by a nucleic acid amplification method (real-time PCR method) that enables qualitative and quantitative measurement with high sensitivity.
上記［２］のプライマー対は、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子においてジオバチルス・ステアロサーモフィルスに特徴的な配列である配列番号１，２に記載された核酸配列を有する。そのため、本構成のプライマー対は、特異的にジオバチルス・ステアロサーモフィルスをリアルタイムＰＣＲ法で検出できるプライマーと成り得る。 The primer pair of [2] above has the nucleic acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2, which is a sequence characteristic of Geobacillus stearothermophilus in a gene encoding 16S rRNA. Therefore, the primer pair of this configuration can be a primer that can specifically detect Geobacillus stearothermophilus by a real-time PCR method .
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明のジオバチルス・ステアロサーモフィルスの検出方法では、容器入り食品中から採取した食品サンプルを被検体試料とし、当該被検体試料にジオバチルス・ステアロサーモフィルスが含まれるか否かを判断する。本方法は、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子に由来する配列番号１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるプライマー対を使用して、被検体試料中に含まれる細菌から抽出した核酸を鋳型として前記プライマー対を使用して前記核酸の増幅を行なう核酸増幅工程を含むジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出する方法である。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
In the method for detecting Geobacillus stearothermophilus according to the present invention, a food sample collected from a food in a container is used as an object sample, and it is determined whether or not the object sample contains Geobacillus stearothermophilus. This method comprises a combination of a forward primer consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 1 derived from a gene encoding 16S rRNA of Geobacillus stearothermophilus and a reverse primer consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 2. Detecting Geobacillus stearothermophilus including a nucleic acid amplification step using a primer pair to amplify the nucleic acid using the primer pair using a nucleic acid extracted from bacteria contained in a sample as a template Is the method.
「被検体試料」は、食品・飲料などの対象物を収容容器に収容したレトルト食品・缶詰・ＰＥＴボトル飲料等の容器入り食品からその一部又は全部を採取した食品サンプルである。しかし、これに限定されるものではなく、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスを含有する可能性のあるサンプルであればよい。 The “specimen sample” is a food sample obtained by collecting part or all of a food in a container such as a retort food, canned food, or PET bottle drink in which an object such as food or drink is contained in a container. However, the present invention is not limited to this, and any sample that may contain Geobacillus stearothermophilus may be used.
本方法では、被検体試料中に含まれる細菌（ジオバチルス・ステアロサーモフィルス）の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子に存在する特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、被検体試料中に含まれる細菌から抽出した核酸を鋳型としてＰＣＲ法を適用し、特定のサイズのＰＣＲ増幅産物が得られたことを指標として細菌の同定を行う。 In this method, a bacterium contained in a sample by using an oligonucleotide having a specific sequence present in a gene encoding 16S rRNA of a bacterium (Giobacillus stearothermophilus) contained in the sample as a primer. The PCR method is applied using the nucleic acid extracted from the template as a template, and the bacteria are identified using as an index that a PCR amplification product of a specific size has been obtained.
「オリゴヌクレオチド」は、数塩基〜数十塩基からなる核酸断片をいい、天然の核酸分子、遺伝子組換えによって得られた核酸分子、化学合成によって得られた核酸分子などが該当する。「プライマー」は、例えばＰＣＲなどの核酸増幅法などにおける酵素的重合の開始のための決められた条件下で、１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし、重合酵素であるポリメラーゼによる塩基伸長反応を誘導し得る数塩基〜数十塩基のオリゴヌクレオチドである。 “Oligonucleotide” refers to a nucleic acid fragment consisting of several bases to several tens of bases, and includes natural nucleic acid molecules, nucleic acid molecules obtained by genetic recombination, nucleic acid molecules obtained by chemical synthesis, and the like. A “primer” is a base extension by a polymerase that is a polymerization enzyme that hybridizes with a single-stranded nucleic acid or nucleic acid fragment under a predetermined condition for initiation of enzymatic polymerization in a nucleic acid amplification method such as PCR. It is an oligonucleotide of several bases to several tens of bases that can induce a reaction.
ＰＣＲ法はリアルタイムＰＣＲとする。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れている。リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置で行うことができる。リアルタイムＰＣＲのモニターは蛍光試薬を用いて行う。このような蛍光モニター法として、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）をＰＣＲ反応系に加えるインターカレーター法などを適用することができるが、これに限定されるものではない。 The PCR method is real-time PCR. Real-time PCR is a method for monitoring and analyzing the amount of PCR amplification in real time, and does not require electrophoresis and is excellent in rapidity and quantitativeness. Real-time PCR can be performed with an apparatus dedicated to real-time PCR, in which a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated. Real-time PCR is monitored using a fluorescent reagent. As such a fluorescence monitoring method, an intercalator method in which a reagent (intercalator) that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA is added to the PCR reaction system can be applied, but the method is not limited to this. Absent.
インターカレーターは、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターでき、また、増幅ＤＮＡの融解温度を測定することができる。 The intercalator binds to double-stranded DNA synthesized by the PCR reaction and emits fluorescence when irradiated with excitation light. By detecting this fluorescence intensity, the amount of amplification product produced can be monitored, and the melting temperature of the amplified DNA can be measured.
使用できる蛍光色素としては、例えばサイバーグリーン（SYBR GREEN）Ｉ（２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム）、エチジウムブロマイド、ヘキスト３３２５８等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。 Examples of fluorescent dyes that can be used include SYBR GREEN I (2- [N- (3-dimethylaminopropyl) -N-propylamino] -4- [2,3-dihydro-3-methyl- (benzo -1,3-thiazol-2-yl) -methylidene] -1-phenyl-quinolinium), ethidium bromide, Hoechst 33258 and the like can be used, but are not limited thereto.
ＰＣＲ法等の分子生物学的手法は細菌の遺伝的多様性を分析する手法として用いられる。例えばｒＤＮＡは保存性が高い遺伝子と多様性が高い遺伝子領域を含むため、生物の系統・分類に利用される。以下に、核酸増幅法を利用したジオバチルス・ステアロサーモフィルスの検出方法について詳述する。 Molecular biological techniques such as PCR are used as techniques for analyzing the genetic diversity of bacteria. For example, rDNA contains a highly conserved gene and a highly diverse gene region, and is therefore used for organism lineage and classification. Below, the detection method of Geobacillus stearothermophilus using the nucleic acid amplification method is explained in full detail.
即ち、図１に示したジオバチルス・ステアロサーモフィルスの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子領域を特定のプライマーを使用してＰＣＲ法により増幅し、特定のサイズのＰＣＲ増幅産物が得られたことを指標としてジオバチルス・ステアロサーモフィルスの同定を行う。 That is, the gene region encoding 16S rRNA of Geobacillus stearothermophilus shown in FIG. 1 was amplified by a PCR method using a specific primer, and a PCR amplification product having a specific size was obtained as an index. To identify Geobacillus stearothermophilus.
プライマーは、重合酵素であるポリメラーゼ存在下で核酸増幅のために使用される。
本発明で適用するリアルタイムＰＣＲでは、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子の所望領域を特異的に増幅するため、配列番号１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるプライマー対を使用する。１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子を鋳型としてこれらプライマー対を使用することにより、１６３ ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。
The primer is used for nucleic acid amplification in the presence of a polymerase, a polymerase.
In the real-time PCR applied in the present invention, in order to specifically amplify a desired region of a gene encoding 16S rRNA, it comprises a forward primer comprising the sequence described in SEQ ID NO: 1 and a sequence described in SEQ ID NO: Use primer pairs that are in combination with reverse primers. By using these primer pairs using the gene encoding 16S rRNA as a template, a 163 bp PCR product is amplified.
使用したプライマーは、以下の通りである。
5′-GAT TGG GGC TTG CCT TGA-3′（Ｇｖ１Ｆ：配列番号１）
5′-GCA AGT GAC AGC CCA AAG G-3′（Ｇｖ３Ｒ：配列番号２）
The used primers are as follows.
5′-GAT TGG GGC TTG CCT TGA-3 ′ (Gv1F: SEQ ID NO: 1)
5′-GCA AGT GAC AGC CCA AAG G-3 ′ (Gv3R: SEQ ID NO: 2)
これらプライマー対は、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の所望領域の核酸配列に基づき、当該所望領域が増幅できるように、プライマー３プラス（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）等、公知のプライマー設計プログラム等により設計するとよい（プライマー設計工程）。 These primer pairs are based on the nucleic acid sequence of the desired region of the gene encoding 16S rRNA, so that the desired region can be amplified (primary 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus. cgi), etc., and a known primer design program or the like (primer design process).
尚、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子の所望領域の核酸配列は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）が提供しているＧｅｎＢａｎｋ（ジェンバンク）、および、NITE Biological Resource Center（ＮＢＲＣ）から得たものを使用すればよい。これらより得た配列はClustalX（Thompson et al.,1997）を使用してアライメントを行い、このアライメントの結果に基づいてプライマーを設計するのがよい。 The nucleic acid sequence of the desired region of the gene encoding 16S rRNA is obtained from GenBank provided by NCBI (National Center for Biotechnology Information) and NITE Biological Resource Center (NBRC). do it. The sequences obtained from these should be aligned using ClustalX (Thompson et al., 1997), and primers should be designed based on the results of this alignment.
一対のプライマーは、数塩基〜数十塩基の断片長を有するように設計し、好ましくはターゲットとなるＰＣＲ増幅産物のＴｍ値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにプライマーを設計し、化学合成等の手法により合成する。当該化学合成は、公知のＤＮＡ合成手法により行なうことができる。尚、配列番号１のフォワードプライマーの断片長は１８塩基、Ｔｍ値は６６．１であり、配列番号２のリバースプライマーの断片長は１９塩基、Ｔｍ値は６５．８である。Ｔｍ値は最近接塩基対法（Nearest Neighbor method）を使用して計算している。 A pair of primers is designed to have a fragment length of several bases to several tens of bases, and preferably the primer is designed so that the Tm value of the target PCR amplification product is higher than that of the primer dimer itself. It synthesize | combines by methods, such as. The chemical synthesis can be performed by a known DNA synthesis method. The fragment length of the forward primer of SEQ ID NO: 1 is 18 bases and the Tm value is 66.1, the fragment length of the reverse primer of SEQ ID NO: 2 is 19 bases, and the Tm value is 65.8. Tm values are calculated using the Nearest Neighbor method.
このようにして抽出した核酸を鋳型として前記プライマー対を使用して前記核酸の増幅を行なう（核酸増幅工程）。
核酸増幅の条件（変性温度、アニール温度およびアニール時間、サイクル数、伸延温度および伸延時間）は、設計したプライマーの長さやＧＣ含有量等によって適宜決定する。ＰＣＲに使用するポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラ−ゼ・Ｔａｑポリメラ−ゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラ−ゼ等、公知の重合酵素を使用すればよい。
The nucleic acid thus extracted is amplified using the primer pair as a template (nucleic acid amplification step).
Nucleic acid amplification conditions (denaturation temperature, annealing temperature and annealing time, cycle number, extension temperature and extension time) are appropriately determined depending on the designed primer length, GC content, and the like. The polymerase used for PCR may be a known polymerizing enzyme such as a DNA-dependent DNA polymerase such as DNA polymerase or Taq polymerase.
ＰＣＲ反応が終了した後、増幅したＰＣＲ増幅産物を確認するため、反応液を採取して電気泳動を行なう（電気泳動工程）。電気泳動工程では、適切な緩衝液およびゲルを使用して行なう。電気泳動時間・電圧は適宜設定する。電気泳動工程の後、所定濃度のエチジウムブロマイド等の染色剤によりＰＣＲ増幅産物を所定時間染色して紫外線の照射等によって可視化することでＰＣＲ増幅産物を検出する（ＰＣＲ検出工程）。 After the PCR reaction is completed, the reaction solution is collected and subjected to electrophoresis in order to confirm the amplified PCR amplification product (electrophoresis step). The electrophoresis step is performed using an appropriate buffer and gel. The electrophoresis time and voltage are set appropriately. After the electrophoresis step, the PCR amplification product is detected by staining the PCR amplification product with a staining agent such as ethidium bromide at a predetermined concentration for a predetermined time and visualizing it by irradiation with ultraviolet rays (PCR detection step).
〔実施例１〕
以下に、ＰＣＲ法を利用したジオバチルス・ステアロサーモフィルスの検出方法の実施例について説明する。ジオバチルス・ステアロサーモフィルスおよびコントロールに使用した細菌についての一覧を表１に示した。
[Example 1]
Below, the Example of the detection method of Geobacillus stearothermophilus using PCR method is described. A list of Geobacillus stearothermophilus and bacteria used for control is shown in Table 1.
表１で示した菌株において、ＡＴＣＣと付してある菌株については、国際寄託機関であるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手でき、ＮＢＲＣと付してある菌株については、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手でき、ＤＳＭと付してある菌株については、国際寄託機関であるDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）より入手でき、ＪＣＭと付してある菌株については、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター （Japan Collection of Microorganisms）より入手できる。 In the strains shown in Table 1, the strains attached with ATCC can be obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) which is an international depositary agency. The strains that can be obtained from the National Institute for Biological and Genetic Resources (NBRC) and are labeled DSM are those that are available from the international depository Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) and those that are labeled JCM Can be obtained from the Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center.
ジオバチルス・ステアロサーモフィルスおよびコントロールに使用した細菌についてゲノムＤＮＡを調製した。 Genomic DNA was prepared for Geobacillus stearothermophilus and bacteria used for controls.
ジオバチルス・ステアロサーモフィルス ＮＢＲＣ １２５５０ＴをスタンダードサンプルとしてゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出は、Ultra clean DNA isolation kit（MO Bio Laboratories社）を使用した。 Genomic DNA was extracted using Geobacillus stearothermophilus NBRC 12550 T as a standard sample. For the extraction of genomic DNA, an Ultra clean DNA isolation kit (MO Bio Laboratories) was used.
個々の缶詰のサンプルは、５分の間超音波処理を行い、微生物ペレットを、４０分の間７８００ｇの遠心分離によって集めた。上澄みを除去し、ペレットは１ｍＬのＰＢＳによって３回洗浄した。次に、３００μＬのマイクロビーズ溶液と、５０μＬのＭＤ１溶液を添加してペレットを懸濁し、２０分間９５℃で加温した後、１００００ｇで２分間の遠心分離を行った。上清の３００μＬに１００μＬのＭＤ２溶液を添加し、数回の転倒混和を行った後、４℃で１０分間インキュベートし、１００００ｇで２分間の遠心分離を行った。上清の３００μＬに９００μＬのＭＤ３溶液を添加し、スピンカラムにて１００００ｇで３０秒間の遠心分離を行った。フロースルー液を捨てた後、３００μＬのＭＤ４溶液をスピンカラムに添加して同様の遠心分離を行ってフロースルー液を捨てた。その後、１００μＬのＭＤ５溶液をスピンカラムに添加して１００００ｇで１分間の遠心分離を行い、フロースルー液を回収してＰＣＲ分析に使用した。 Individual canned samples were sonicated for 5 minutes and microbial pellets were collected by centrifugation at 7800 g for 40 minutes. The supernatant was removed and the pellet was washed 3 times with 1 mL PBS. Next, 300 μL of the microbead solution and 50 μL of the MD1 solution were added to suspend the pellet, heated at 95 ° C. for 20 minutes, and then centrifuged at 10,000 g for 2 minutes. 100 μL of MD2 solution was added to 300 μL of the supernatant, mixed several times by inversion, incubated at 4 ° C. for 10 minutes, and centrifuged at 10,000 g for 2 minutes. 900 μL of MD3 solution was added to 300 μL of the supernatant, and centrifuged at 10,000 g for 30 seconds using a spin column. After discarding the flow-through solution, 300 μL of MD4 solution was added to the spin column and the same centrifugation was performed to discard the flow-through solution. Thereafter, 100 μL of MD5 solution was added to the spin column and centrifuged at 10,000 g for 1 minute, and the flow-through solution was recovered and used for PCR analysis.
〔実施例２〕
抽出したゲノムＤＮＡは濃度を測定して段階希釈（１２．５ｎｇ/μＬ〜１．２５ｆｇ/μＬ）を行い、リアルタイムＰＣＲの鋳型に供した。本実施例ではジオバチルス・ステアロサーモフィルス ＮＢＲＣ １２５５０ＴのゲノムＤＮＡを使用してリアルタイムＰＣＲを行った。
[Example 2]
The extracted genomic DNA was subjected to serial dilution by measuring the concentration (12.5 ng / μL to 1.25 fg / μL) and used as a template for real-time PCR. In this example, real-time PCR was performed using Geobacillus stearothermophilus NBRC 12550 T genomic DNA.
ジオバチルス・ステアロサーモフィルスの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子に由来する配列番号１に記載された配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に記載された配列からなるリバースプライマーとの組み合わせであるプライマー対を使用して、増幅される１６３ ｂｐのＰＣＲ産物を検出した。 A primer pair which is a combination of a forward primer consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 derived from the gene encoding 16S rRNA of Geobacillus stearothermophilus and a reverse primer consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Used to detect the amplified 163 bp PCR product.
ＰＣＲ反応は、サイバーグリーン（SYBR GREEN）を使用して行った。即ち、２５μＬの２×SYBRプレミックスExTaq（Tli RNaseH）（タカラバイオ株式会社製）、０．２μＭの各プライマー、１μＬのゲノムＤＮＡを反応液組成とし、リアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System（タカラバイオ株式会社製）を用いて反応を行った。反応サイクルは、９４℃で３０秒間の変性を行なった後、９５℃１０秒−６２℃３０秒−７２℃１分の反応サイクルを３６サイクル繰り返した。最後の増幅サイクル（温度域５４〜９５℃）の後に融解曲線が生成された。ＰＣＲ産物の電気泳動を常法に従って行い、増幅産物のバンドおよびサイズの確認を行った。融解曲線の結果を図２、電気泳動の結果を図３に示した。図３の左端のレーンにおけるマーカーは１００ ｂｐラダーサイズマーカーを使用した。レーン１〜８は鋳型となるゲノムＤＮＡを順に１２．５ｎｇ/μＬ〜１．２５ｆｇ/μＬまで１０倍の段階希釈をしたものである。 PCR reaction was performed using SYBR GREEN. That is, 25 μL of 2 × SYBR premix ExTaq (Tli RNaseH) (manufactured by Takara Bio Inc.), 0.2 μM of each primer, and 1 μL of genomic DNA as a reaction solution composition, a real-time PCR device Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara) The reaction was carried out using Bio Inc.). In the reaction cycle, after denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, a reaction cycle of 95 ° C. for 10 seconds-62 ° C. for 30 seconds-72 ° C. for 1 minute was repeated 36 cycles. A melting curve was generated after the last amplification cycle (temperature range 54-95 ° C.). Electrophoresis of the PCR product was performed according to a conventional method, and the band and size of the amplified product were confirmed. The result of the melting curve is shown in FIG. 2, and the result of electrophoresis is shown in FIG. The marker in the leftmost lane of FIG. 3 was a 100 bp ladder size marker. Lanes 1-8 are 10-fold serial dilutions of the template genomic DNA in order from 12.5 ng / μL to 1.25 fg / μL.
融解曲線を確認した結果、８７．３℃でピークを示したことが認められた。また、電気泳動による確認では、増幅されたバンドのサイズは１６３ ｂｐであると認められた。また、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスのゲノムＤＮＡの濃度が１２．５ｆｇ/μＬの場合（レーン７）であってもバンドが確認できたことから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとする特異的プライマー（配列番号１、配列番号２）の検出限界は１２．５ｆｇ/μＬであると認められた。 As a result of confirming the melting curve, it was confirmed that a peak was exhibited at 87.3 ° C. Moreover, in the confirmation by electrophoresis, it was recognized that the size of the amplified band was 163 bp. In addition, since the band was confirmed even when the concentration of Geobacillus stearothermophilus genomic DNA was 12.5 fg / μL (lane 7), a specific primer targeting the 16S rRNA gene (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, the detection limit of SEQ ID NO: 2) was found to be 12.5 fg / μL.
〔実施例３〕
本発明のプライマー対（配列番号１、配列番号２）がジオバチルス・ステアロサーモフィルスを特異的に検出できるプライマーであることを確認するため、実施例２で使用したジオバチルス・ステアロサーモフィルス ＮＢＲＣ １２５５０Ｔ以外の３株（ＮＢＲＣ １２９８３、ＮＢＲＣ １３７３７、ＮＢＲＣ １００８６２）、および、同属菌株・近縁株・非近縁株を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲで用いた菌株は表１に示した３４菌株とした。リアルタイムＰＣＲの条件は実施例２の条件に準じて行った。
Example 3
In order to confirm that the primer pair of the present invention (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) is a primer capable of specifically detecting Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus stearothermophilus NBRC 12550 used in Example 2 Real-time PCR was performed using 3 strains other than T (NBRC 12983, NBRC 13737, NBRC 10082), and related strains, related strains, and unrelated strains. The strains used in real-time PCR were 34 strains shown in Table 1. The conditions for real-time PCR were the same as those in Example 2.
これら３４菌株のリアルタイムＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物の電気泳動を常法に従って行い、増幅産物のバンドおよびサイズの確認を行った。結果を図４に示した。マーカーは１００ ｂｐラダーサイズマーカーを使用した。レーン３６，３７はネガティブコントロールである。 After performing real-time PCR of these 34 strains, electrophoresis of the PCR product was performed according to a conventional method, and the band and size of the amplified product were confirmed. The results are shown in FIG. The marker used was a 100 bp ladder size marker. Lanes 36 and 37 are negative controls.
この結果、レーン１のジオバチルス・ステアロサーモフィルス ＮＢＲＣ １２５５０Ｔ、および、レーン２〜４の同種菌株の３株（ＮＢＲＣ １２９８３、ＮＢＲＣ １３７３７、ＮＢＲＣ １００８６２）において、増幅されたバンドのサイズは１６３ ｂｐであると認められ、これら菌株は陽性であると認められた。一方、他の近縁株、非近縁株では増幅されたバンドは確認できなかったため、これら菌株は陰性であると認められた。従って、本発明のプライマー対（配列番号１、配列番号２）を用いることで、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスのみを特異的に検出できると認められた。 As a result, in Geobacillus stearothermophilus NBRC 12550 T in lane 1 and three strains of the same strains in lanes 2 to 4 (NBRC 12983, NBRC 13737, and NBRC 100862), the size of the amplified band was 163 bp. These strains were found to be positive. On the other hand, since no amplified band could be confirmed in other related strains and non-related strains, these strains were confirmed to be negative. Therefore, it was recognized that only Geobacillus stearothermophilus can be specifically detected by using the primer pair of the present invention (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2).
〔実施例４〕
容器詰め食品からジオバチルス・ステアロサーモフィルスのみを特異的に検出できることを確認するため、容器詰め食品からゲノムＤＮＡの抽出、リアルタイムＰＣＲ法を用いてスパイク試験を行った。容器詰め食品として、コーンの缶詰（殺菌温度１１６℃、７５分）および小豆の水煮（殺菌温度１１５℃、７０分）を使用した。これら容器詰め食品には、フラットサワー様の変敗を引き起こす原因菌として、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス以外の菌株も含まれると考えられる。従って、本実施例のスパイク試験は、複数種類の前記原因菌を含む細菌ゲノムＤＮＡが混在したゲノムＤＮＡを使用した。ゲノムＤＮＡの抽出、リアルタイムＰＣＲは上述した実施例に準じて行った。
Example 4
In order to confirm that only Geobacillus stearothermophilus can be specifically detected from the packaged food, a genomic DNA was extracted from the packaged food, and a spike test was performed using a real-time PCR method. Canned corn (sterilization temperature 116 ° C., 75 minutes) and boiled red beans (sterilization temperature 115 ° C., 70 minutes) were used as the container-packed food. These packaged foods are thought to contain strains other than Geobacillus stearothermophilus as causative bacteria that cause flat sour-like deterioration. Therefore, the spike test of the present example used genomic DNA in which bacterial genomic DNA containing a plurality of types of the causative bacteria was mixed. Genomic DNA extraction and real-time PCR were performed according to the above-described Examples.
リアルタイムＰＣＲを行って得られたＣｔ値（ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数）をプロットして得られた検量線の結果を図５（コーンの缶詰）、図６（小豆の水煮の缶詰）に示した。図５,６における黒丸のデータは、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス ＮＢＲＣ １２５５０ＴのみのゲノムＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで増幅したときに得られた検量線である。このときの回帰方程式はｙ＝−１．４８（±０．１）Ｉｎ（ｘ）＋３３．３５６（±０．３０２）であった。 FIG. 5 (canned corn) and FIG. 6 (red bean) show the results of calibration curves obtained by plotting Ct values (number of cycles when the PCR amplification product reaches a certain amount) obtained by performing real-time PCR. Canned in boiled water). The data of the black circles in FIGS. 5 and 6 are calibration curves obtained when the genomic DNA of Geobacillus stearothermophilus NBRC 12550 T alone is amplified by real-time PCR. The regression equation at this time was y = −1.48 (± 0.1) In (x) +33.356 (± 0.302).
この結果、図５（コーンの缶詰）より得られた回帰方程式はｙ＝−１．３０９（±０．０５７）Ｉｎ（ｘ）＋３４．１７６（±０．５０５）であり、図６（小豆の水煮の缶詰）より得られた回帰方程式はｙ＝−０．８９３（±０．０１１）Ｉｎ（ｘ）＋２８．８５（±０．０４９）であった。これらの結果より、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスの菌数が１０６〜１０１ＣＦＵ/ｍＬの範囲で高い直線性が得られた。従って、本発明のジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出する方法は、容器詰め食品において共存する他の菌株が存在した場合であっても、感度よく、特異的にジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出することができると認められた。 As a result, the regression equation obtained from FIG. 5 (canned corn) is y = −1.309 (± 0.057) In (x) +34.176 (± 0.505), and FIG. The regression equation obtained from canned water) was y = −0.893 (± 0.011) In (x) +28.85 (± 0.049). From these results, high linearity was obtained when the number of Geobacillus stearothermophilus bacteria was in the range of 10 6 to 10 1 CFU / mL. Therefore, the method for detecting Geobacillus stearothermophilus according to the present invention is sensitive and specifically detects Geobacillus stearothermophilus even when other strains coexist in the packaged food. It was recognized that it was possible.
本発明のジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出する方法およびジオバチルス・ステアロサーモフィルス検出用プライマー対は、容器詰め食品からジオバチルス・ステアロサーモフィルスを特異的に検出するために利用することができる。 The method for detecting Geobacillus stearothermophilus and the primer pair for detecting Geobacillus stearothermophilus of the present invention can be used for specifically detecting Geobacillus stearothermophilus from a packaged food.
Claims (2)
被検体試料中に含まれる細菌から抽出した核酸を鋳型として前記プライマー対を使用して前記核酸の増幅をリアルタイムＰＣＲ法により行なう核酸増幅工程を含むジオバチルス・ステアロサーモフィルスを検出する方法。 A primer pair which is a combination of a forward primer consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 derived from the gene encoding 16S rRNA of Geobacillus stearothermophilus and a reverse primer consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Use,
A method for detecting Geobacillus stearothermophilus comprising a nucleic acid amplification step in which amplification of the nucleic acid is performed by a real-time PCR method using the primer pair using a nucleic acid extracted from bacteria contained in a sample as a template.
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