JP6432896B2 - Japanese encephalitis virus vaccine and production method thereof - Google Patents
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Description
本発明は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルスに対するワクチン、及びその製造方法に関するものである。 The present invention relates to a vaccine against Japanese encephalitis virus classified into the genus Flavivirus, and a method for producing the same.
日本脳炎は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルスによって引き起こされる蚊媒介性のウイルス感染症であり、その患者は東アジアから東南アジア、南アジア地域等に広く分布している。日本においては、日本脳炎ワクチン接種の普及に従い、日本脳炎患者は減少し、1990年以降、当該患者は年間人口100,000人当たり10人以下となっている。しかし、依然として日本脳炎は健康上の重大な脅威となりうるものであり、東南アジアを中心に、近年でも症状を示す患者数は多く確認されている。さらに、効果的なワクチンを使用しても、日本脳炎ウイルスは蚊豚システムで積極的かつ静かに循環しており、アジアおよびその他の太平洋諸国の多くの地域では日本脳炎の発生率が増加している(非特許文献1及び2参照)。
日本脳炎ウイルスは、そのゲノム配列に基づいて遺伝子I型〜V型の5つの型(GI〜GV)に分類される。これまでに販売されてきた日本脳炎ワクチンの製造においては、日本脳炎ウイルス遺伝子III型(GIII)に属する、マウス脳由来の北京株ウイルス、又はマウス脳由来の中山株ウイルスが使用されている(非特許文献3及び4参照)。そして、従来、日本脳炎ワクチンは、ウイルス感染マウスの脳乳剤を原材料とするものであった。しかしながら、マウス脳由来の汚染物質によるアレルギー性中枢神経障害や病原微生物の混入の恐れがあることや、大量にマウスを必要とするためコストが高いことや動物愛護の点から動物細胞や昆虫細胞を用いたin vitro系での日本脳炎ワクチンの製造が試みられている(特許文献1及び2参照)。
このような状況下で、さらにより安価で安全で有効な新規ワクチンの開発が進められている。
ここで、近年の研究により、日本脳炎ウイルス遺伝子III型(GIII)に分類されるウイルス由来の日本脳炎ワクチンは、交叉反応等に基づいて同I〜IV型(GI〜GIV)に分類されるウイルスには効果を示すが、同V型(GV)に分類されるウイルスには効果を示さないことが明らかになっている(非特許文献3及び4参照)。具体的には、非特許文献3のTable 3(下記表1として、前記Table 3のデータを示す)に示されるように、北京株ワクチン(2倍希釈)においては、homo価が640より高い場合に、同じ遺伝子3型(GIII)に分類される中山株ウイルスに対しては320、GI型ウイルスに対しては160〜320、GIII型ウイルスに対しては80〜320のウイルス中和抗体価を示すが、GV型のMuarウイルスに対しては20という非常に低い中和抗体価を示すことが明らかになっている。
Japanese encephalitis is a mosquito-borne viral infection caused by the Japanese encephalitis virus classified into the genus Flavivirus, and its patients are widely distributed from East Asia to Southeast Asia and South Asia. In Japan, with the spread of Japanese encephalitis vaccination, the number of Japanese encephalitis patients has decreased, and since 1990, the number of such patients has been less than 10 per 100,000 population per year. However, Japanese encephalitis is still a serious health threat, and there are many confirmed cases of symptoms in recent years, especially in Southeast Asia. Moreover, even with effective vaccines, the Japanese encephalitis virus is actively and quietly circulating in the mosquito swine system, increasing the incidence of Japanese encephalitis in many parts of Asia and other Pacific countries. (See
Japanese encephalitis virus is classified into five types (GI to GV) of gene types I to V based on the genome sequence. In the production of Japanese encephalitis vaccines that have been sold so far, the Beijing strain virus derived from the mouse brain or the Nakayama strain virus derived from the mouse brain belonging to the Japanese encephalitis virus gene type III (GIII) is used. (See
Under such circumstances, development of a new vaccine that is even cheaper, safer and more effective is underway.
Here, according to recent research, Japanese encephalitis vaccines derived from viruses classified as Japanese encephalitis virus gene type III (GIII) are classified into types I to IV (GI to GIV) based on cross-reactions, etc. Is effective, but has not been shown to be effective against viruses classified into the same type V (GV) (see Non-Patent
同様のことは中山株ワクチンにも当てはまる。したがって、現在、特に広く使用される日本脳炎ワクチンである北京株ワクチンでは、GV型ウイルスに対する効果が非常に少ないことが懸念されている。
また、GV型のウイルスは他の型のウイルスと比較して異なる挙動を示すことも明らかになっている。さらに、最初はGV型のウイルスはインドネシア−マレーシア地域でのみ確認されていたが、2009年に中国において、2010年及び2012年に韓国においてGV型のウイルスが確認されており、流行の恐れも懸念されている。
The same applies to the Nakayama strain vaccine. Therefore, there is a concern that the Beijing vaccine, which is a Japanese encephalitis vaccine that is currently widely used, has very little effect on GV virus.
It has also been shown that GV type viruses behave differently than other types of viruses. In addition, GV virus was first confirmed only in Indonesia-Malaysia, but GV virus was confirmed in China in 2009 and in Korea in 2010 and 2012. Has been.
日本脳炎ウイルス遺伝子III型(GIII)に分類されるウイルスだけではなく、同V型(GV)に分類されるウイルスにも高い効果を示す新規のワクチンが必要とされている。 There is a need for new vaccines that are highly effective not only for viruses classified as Japanese encephalitis virus gene type III (GIII) but also for viruses classified as type V (GV).
本発明は、カイコ蛹に発現させた日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来の日本脳炎ウイルス様粒子が、予想外にGIII型のウイルスだけでなく、GV型のウイルスに対しても、予想外に高い効果を示すとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のMタンパク質及びEタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子及び(ii)日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルス由来のMタンパク質及びEタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含む、2種混合の日本脳炎ワクチンを提供する。
本発明において、前記日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価と等しいかそれ以上であることが好ましい。
また、本発明は、(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のMタンパク質及びEタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含み、日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価以上である、日本脳炎ワクチンを提供する。
The present invention is a Japanese encephalitis virus-like particle derived from a virus classified into Japanese encephalitis virus gene type III expressed in silkworm silkworms unexpectedly, not only for GIII type virus, but also for GV type virus, It was made based on the knowledge that the unexpectedly high effect was shown.
That is, the present invention relates to (i) a Japanese encephalitis virus-like particle containing M protein and E protein derived from a virus classified as Japanese encephalitis virus gene type III, and (ii) a virus classified as Japanese encephalitis virus gene V type. Provided is a Japanese encephalitis vaccine of a mixture of two types, comprising Japanese encephalitis virus-like particles containing the derived M protein and E protein.
In the present invention, the neutralizing antibody titer against the virus classified into the Japanese encephalitis virus gene type V of the antibody produced by immunizing an animal with the Japanese encephalitis virus-like particle (i) is the Japanese encephalitis virus gene type III of the antibody. It is preferable that it is equal to or more than the neutralizing antibody titer against the virus classified into the above.
The present invention also includes (i) a Japanese encephalitis virus-like particle containing M protein and E protein derived from a virus classified as Japanese encephalitis virus gene type III, and immunizes animals with the Japanese encephalitis virus-like particle (i). The Japanese encephalitis vaccine wherein the neutralizing antibody titer against the virus classified as Japanese encephalitis virus gene type V of the antibody prepared in the above is equal to or higher than the neutralizing antibody titer of the antibody classified as Japanese encephalitis virus gene type III I will provide a.
本発明において、前記日本脳炎ウイルス様粒子(i)及び/又は(ii)が、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によって産生されることが好ましく、日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスが中山株ウイルス又は北京株ウイルスであり、及び/又は、日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスがMuar株ウイルスであることが好ましい。
また、本発明は、上記の日本脳炎ワクチンの製造方法であって、カイコのタンパク質発現系を使用し、日本脳炎ウイルス遺伝子III型又はV型に分類される日本脳炎ウイルスにおけるpreMタンパク質をコードするpreM遺伝子とMタンパク質をコードするM遺伝子とEタンパク質をコードするE遺伝子とをこの順で包含するDNA断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記DNA断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化DNA断片を得る工程、得られたコドン最適化DNA断片をベクターに挿入する工程、得られたベクターと、線状化したバキュロウイルス由来DNAとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程を含む、日本脳炎ワクチンの製造方法を提供する。
本発明において、前記コドン最適化DNA断片の配列が、配列番号4及び/又は7の塩基配列であることが好ましい。
In the present invention, the Japanese encephalitis virus-like particles (i) and / or (ii) are preferably produced by silkworm-derived cells or silkworm silkworms, and viruses classified as Japanese encephalitis virus gene type III are Nakayama strain viruses. Alternatively, it is preferably a Beijing strain virus and / or a virus classified as Japanese encephalitis virus gene V type is a Muar strain virus.
The present invention also relates to a method for producing the above Japanese encephalitis vaccine, which encodes the pr e M protein in Japanese encephalitis virus classified into Japanese encephalitis virus gene type III or V type using a silkworm protein expression system. In the DNA fragment comprising the M gene encoding the pr e M gene, the M gene encoding the M protein, and the E gene encoding the E protein in this order, the encoded amino acid sequence is the corresponding amino acid sequence in the wild type Japanese encephalitis virus as does not occur mutation compared to the step of the modifying codons of the DNA fragment is inserted to obtain a codon optimized DNA fragment for the expression of silkworm, the resulting codon optimized DNA fragment in base compactors, a base compactors obtained, and baculovirus-derived DNA linearized, be co-transfected into Bombyx mori cells A step of obtaining a baculovirus recombinant containing a codon-optimized DNA fragment from the obtained silkworm cells, a step of infecting a silkworm cocoon with the baculovirus recombinant and breeding a silkworm cocoon, and the silkworm cocoon Provides a method for producing a Japanese encephalitis vaccine comprising the step of isolating Japanese encephalitis virus-like particles.
In the present invention, the sequence of the codon optimized DNA fragment is preferably the base sequence of SEQ ID NO: 4 and / or 7.
新規の日本脳炎ワクチン、特に、日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス及び同V型に分類されるウイルスの双方に対して高い効果をもたらす日本脳炎ワクチンを提供する。
また、安全で非常に高い収率を提供する日本脳炎ワクチンの製造方法を提供する。
Provided is a novel Japanese encephalitis vaccine, in particular, a Japanese encephalitis vaccine that has a high effect on both viruses classified into Japanese encephalitis virus gene type III and viruses classified into the same type V.
Also provided is a method for producing a Japanese encephalitis vaccine that is safe and provides a very high yield.
<ウイルス様粒子>
本発明のウイルス様粒子は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルス由来のMタンパク質及びEタンパク質を含むが、当該粒子内に日本脳炎ウイルスのCタンパク質及びその中のRNAを含まない、非病原性である粒子を意味する。当該ウイルス様粒子の構造は、30nm〜300nmであることが好ましく、より好ましくは50〜150nm、さらに好ましくは60nm〜120nmの直径を有する粒子の表面に明瞭なHAスパイクが密に配置した構造を有し、形態的にウイルス粒子に酷似している。
本発明のウイルス様粒子は、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によって発現されるものが好ましく、カイコ由来の脂質や糖鎖修飾を有していてもよい。
上記脂質としては、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、リン脂質等が挙げられる。
<Virus-like particles>
The virus-like particle of the present invention contains M protein and E protein derived from Japanese encephalitis virus classified into the genus Flavivirus, but does not contain Japanese encephalitis virus C protein and RNA therein. Means particles that are sexual. The structure of the virus-like particle is preferably 30 nm to 300 nm, more preferably 50 to 150 nm, and even more preferably 60 nm to 120 nm. The particle has a structure in which clear HA spikes are densely arranged on the surface of the particle. And it is very similar in shape to virus particles.
The virus-like particle of the present invention is preferably expressed by silkworm-derived cells or silkworm cocoons, and may have silkworm-derived lipids or sugar chain modifications.
Examples of the lipid include glyceroglycolipid, glycosphingolipid, cholesterol, phospholipid and the like.
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジクリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジクリセリド等が挙げられる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブシド、ガングリオシド等が挙げられる。
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
上記の脂質から、加水分解等によって誘導される脂肪酸等を含んでもよい。上記脂肪酸としては、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸等が挙げられる。
本発明のウイルス様粒子を含有するワクチンは、免疫原性を備える組換えウイルス膜タンパク質のスパイクを密に備える構造をしていることにより、アジュバントを用いなくても、従来にはない高い免疫原性を示すことが可能となる。アジュバントを用いないため、アレルギーやアナフィラキシショック等の副作用も低減することができる
Examples of the glyceroglycolipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like.
Examples of the glycosphingolipid include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside and the like.
Examples of the phospholipid include phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine, sphingomyelin and the like.
Fatty acids derived from the above lipids by hydrolysis or the like may be included. Examples of the fatty acid include myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linolenic acid, and the like.
The vaccine containing the virus-like particle of the present invention has a structure with densely-arranged spikes of recombinant virus membrane protein having immunogenicity, so that even if an adjuvant is not used, an unprecedented high immunogen is used. It becomes possible to show sex. Since no adjuvant is used, side effects such as allergies and anaphylactic shock can be reduced.
<中和抗体価>
本発明の中和力価は、プラーク中和試験法を利用して得られる。プラーク中和試験法では、まず、以下の要領で、細胞プレートを作製する。最初に細胞増殖用培地を用いて細胞数を2〜3×105 細胞/mLに調製し、6ウェルプレートに2mL/ウェルずつ分注し、均一な細胞シートになるようにプレートを前後左右によく振とうした後、35℃、湿度100%、5% CO2インキュベーター内で静置培養し、培養1日後に使用する。80〜90%程度の細胞シートが形成されていれば使用可能である。
次にプラーク中和試験法の具体的な手順について説明する。検査血清(すなわちVLPワクチン免疫血清や各免疫血清)を56℃で30分非働化した後、希釈液にて4倍階段希釈(40x、160x, 640x, 2560x)する。保存ウイルス(中山株、北京株、Muar株)を200PFU/100μLになるように希釈し、これを攻撃ウイルスとする(氷浴中)。40x〜2560x希釈血清300 μLに攻撃ウイルス300 μLを加える(氷浴中)。対照ウイルスは、希釈液1.8mLに攻撃ウイルス1.8mLを等量加える(氷浴中)。各試験管はよく振とう混和してから37℃の恒温水槽内で90分間中和反応を行ない、中和反応の終わった各試験管は、すみやかに氷浴中に移し、細胞プレートの培養上清を完全に除く。対照ウイルス、及び、血清とウイルス混和液のそれぞれを、ウェルあたり100μLを壁面より接種する。対照ウイルスは6〜12ウェル、血清とウイルス混和液の場合は3〜4ウェルを用い、接種直後に接種液が細胞全面に行き渡るようにプレートを軽く動かす。ウイルス吸着時間は、35℃, 5%CO2インキュベーター内で90分静置するが、15分毎にプレートを動かして接種液が細胞全面に潤うようにする。ウイルス吸着反応終了後、接種液を除かずに、重層培地2mLを各ウェルに加え、35℃、5%CO2下で4〜6日間培養する。その後、各ウェルの重層培地上へ3.7%中性緩衝ホルマリン液(ホルマリン原液(37%)をPBS (-)で10倍に希釈する)を1.5mL加えて軽く振とうし、室温で1時間以上放置する。ホルマリン固定終了後、流水道水下で培地とホルマリン液を洗い流し、メチレンプル-染色液を各ウェルに1.5mL加え1時間室温に放置し、染色終了後、水道水で染色液を洗い落とし、プラーク数を算定する。染色したプレートは最終合否判定日より1ヶ月間は保存する。
<Neutralizing antibody titer>
The neutralization titer of the present invention is obtained using the plaque neutralization test method. In the plaque neutralization test method, first, a cell plate is prepared as follows. First, use a cell growth medium to adjust the number of cells to 2 to 3 x 10 5 cells / mL, dispense 2 mL / well into a 6-well plate, and place the plate back and forth, left and right to form a uniform cell sheet. After shaking well, static culture is performed in a 35% C, 100% humidity, 5% CO 2 incubator and used after 1 day of culture. If a cell sheet of about 80 to 90% is formed, it can be used.
Next, a specific procedure of the plaque neutralization test method will be described. Test serum (ie, VLP vaccine immune serum and each immune serum) is inactivated at 56 ° C. for 30 minutes, and then diluted 4-fold in steps (40 ×, 160 ×, 640 ×, 2560 ×) with a diluent. A stock virus (Nakayama strain, Beijing strain, Muar strain) is diluted to 200 PFU / 100 μL and used as an attack virus (in an ice bath). Add 300 μL of challenge virus to 300 μL of 40x-2560x diluted serum (in ice bath). For the control virus, add 1.8 mL of the attack virus to an equal volume of 1.8 mL (in an ice bath). Mix each tube well and perform a neutralization reaction in a constant-temperature water bath at 37 ° C for 90 minutes. Immediately transfer each tube after completion of the neutralization reaction to an ice bath and place it on the cell plate. Qing is completely excluded.
ここで、発明において「中和抗体価」とは、対照ウイルス(非血清対照)と比較して50%のプラーク数減少をもたらす血清の最大の希釈倍率の逆数として定義される。
本発明の「ウイルス様粒子で動物に免疫して作った抗体」において、「動物」は、免疫系を有し、ワクチンを接種することによってウイルスに対する体液性免疫または細胞性免疫を獲得することができる動物であれば、特に限定されないが、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、トリ、ウマ、イヌ、ネコなどの動物でありうる。また、「ウイルス様粒子で動物に免疫して作った抗体」において、「免疫して作った抗体」とは、例えばウイルス様粒子をマウスの場合は腹腔に、ウサギの場合は頸部皮下又は臀部筋中に注射し、14日〜(28日(1ヶ月)2ヶ月、3ヶ月)〜4ヶ月後等に採血し、その血清に含まれ得るものである。
Here, the “neutralizing antibody titer” in the present invention is defined as the reciprocal of the maximum dilution factor of serum that results in a 50% plaque number reduction compared to the control virus (non-serum control).
In the “antibody produced by immunizing an animal with virus-like particles” of the present invention, the “animal” has an immune system and can acquire humoral immunity or cellular immunity against the virus by vaccination. Although it will not specifically limit if it is an animal which can be used, it can be animals, such as a human, a pig, a mouse, a rat, a rabbit, a bird, a horse, a dog, a cat. In addition, in “an antibody made by immunizing an animal with virus-like particles”, “an antibody made by immunization” means, for example, that virus-like particles are placed in the abdominal cavity in the case of mice, and subcutaneous or groin in the neck in the case of rabbits. It is injected into the muscle, blood is collected after 14 days to (28 days (1 month), 2 months, 3 months) to 4 months, etc., and can be contained in the serum.
<ウイルス様粒子の製造方法>
本発明においては、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によるタンパク質発現系を使用して、ウイルス様粒子を製造するのが好ましい。
本発明においてはカイコを用いたタンパク質発現の向上を目的として、コドン最適化を行う。かずさDNA研究所が提供するCodon Usage Databaseから得られるボンビュクス・モリのcodon usage (URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=7091)(図1)をもとに、作成されたアミノ酸配列と遺伝子配列の対応表(図2)を作成した。この対応表において、相補鎖に長いコーディングフレームが出来ることで思わぬ副産物が合成されるのを防ぐため、Serの配列は、UCA(最もボンビュクス・モリでの使用頻度も高い)を用い、相補鎖に多くのUGA(終止コドン)が生じるように設計した。
日本脳炎ウイルス等に関する、Genbank等に登録されているアミノ酸配列中のpreMタンパク質−Mタンパク質−Eタンパク質のアミノ酸配列にFLAGタグ等のタグ配列を付加して、核酸設計の基となるウイルスPreM−M−E融合タンパク質のアミノ酸配列を得る。このウイルスPreM−M−E融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、ウイルスの完全なpreMタンパク質をコードする完全なpreM遺伝子、Mタンパク質をコードする完全なM遺伝子および完全なEタンパク質をコードするウイルス様粒子遺伝子配列を決定し、カイコのコドン使用頻度の最適化を考慮し、当該ウイルス様粒子遺伝子配列を改変する。このような手順により、カイコの発現用のコドン最適化DNA断片を得る。
<Method for producing virus-like particles>
In the present invention, it is preferable to produce virus-like particles using a protein expression system using silkworm-derived cells or silkworm cocoons.
In the present invention, codon optimization is performed for the purpose of improving protein expression using silkworms. Bonbux Mori's codon usage (URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=7091) obtained from Codon Usage Database provided by Kazusa DNA Research Institute (Figure) Based on 1), a correspondence table (FIG. 2) between the prepared amino acid sequences and gene sequences was prepared. In this correspondence table, in order to prevent unexpected by-products from being synthesized due to the formation of a long coding frame in the complementary strand, the Ser sequence is UCA (most frequently used in Bombux Mori), and the complementary strand is used. Were designed to generate many UGAs (stop codons).
A virus PreM-M, which is a base for nucleic acid design, by adding a tag sequence such as FLAG tag to the amino acid sequence of preM protein-M protein-E protein in the amino acid sequence registered in Genbank et al. -Obtain the amino acid sequence of the E fusion protein. Code based on the amino acid sequence of this virus PreM-M-E fusion protein, full pr e M genes encoding the complete pr e M proteins of the virus, the complete M gene and a complete E protein encoding M protein The virus-like particle gene sequence is determined, and the virus-like particle gene sequence is modified in consideration of optimization of the codon usage frequency of silkworms. By such a procedure, a codon optimized DNA fragment for silkworm expression is obtained.
ここで、本発明においては、標的ウイルスにおけるpreMタンパク質をコードするpreM遺伝子とMタンパク質をコードするM遺伝子とEタンパク質をコードするE遺伝子とをこの順で包含するDNA断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の標的ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記DNA断片のコドンを改変する。「コードされるアミノ酸配列が、野生型の標的ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらない」というのは、標的ウイルスのコドン最適化DNA断片にコードされるPreM−M−E融合タンパク質のアミノ酸配列が、野生型の標的ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と実質的に同一であることを意味する。なお、実質的に同一とは、90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有することを意味する。 Here, in the present invention, in a DNA fragment including the pr e M gene encoding the pr e M protein in the target virus, the M gene encoding the M protein, and the E gene encoding the E protein in this order, The codons of the DNA fragments are modified so that the amino acid sequence to be generated does not mutate as compared with the corresponding amino acid sequence in the wild-type target virus. “The encoded amino acid sequence does not mutate compared to the corresponding amino acid sequence in the wild-type target virus” means that the PreM-ME fusion protein encoded by the codon-optimized DNA fragment of the target virus It means that the amino acid sequence is substantially identical to the corresponding amino acid sequence in the wild type target virus. Note that “substantially the same” means having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more, and more preferably 99% or more.
その後、得られたコドン最適化DNA断片を、周知の任意の方法を利用して、バキュロウイルスにおいて適した公知のベクターに挿入し、得られたベクターと、線状化したバキュロウイルス由来DNAとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を組換えたバキュロウイルス組換え体を得る工程、カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び前記カイコ蛹から、ウイルス様粒子を単離する工程を経て、ウイルス様粒子を得ることができる。 Thereafter, the resulting codon optimized DNA fragment, using any method known, inserted into a known base compactors suitable in baculovirus, a base compactors obtained, linearized baculovirus DNA from And a step of co-transfecting silkworm cells, a step of obtaining a baculovirus recombinant in which a codon-optimized DNA fragment is recombined from the obtained silkworm cells, and a silkworm silkworm infected with the baculovirus recombinant. Virus-like particles can be obtained through a step of breeding silkworm cocoons and a step of isolating virus-like particles from the silkworm cocoons.
組換え体バキュロウイルスのボンピュクス・モリのへの導入(接種)時期は蚕蛹期であれば特に限定されないが、蚕蛹期のうちの早期であることが好ましく、具体的には、蛹になった当日 (脱皮1日目)〜4日目 (脱皮5日目)が好ましく、翌日 (脱皮2日目) 〜翌々日 (脱皮3日目)がより好ましい。
上記組換え体バキュロウイルスをカイコ蛹に接種後、これらの蛹を所定の期間飼育するが、その際の温度条件は、20℃〜30℃が好ましく、22℃〜28℃がより好ましく、24℃〜27℃がさらに好ましく, 26℃が特に好ましい。上詑飼育の期間は、上記接種後から蛹が成虫(蛾)に変態する前までの時期であれば特に限定されないが、上記接種後2日間〜6日間が好ましく, 2日間〜4日間がより好ましく、3日間がさらに好ましい。
カイコ蛹からのウイルス様粒子の回収は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を用いることができる。例えば、カイコ蛹を等張緩衝溶液中にてホモゲナイズ後、固定化赤血球あるいはシアル酸カラム(フェツインカラム)を用いて回収することができる。また、ショ糖密度勾配遠心法等の分画方法を用いてウイルス様粒子の形状で含む分画を得ることもできる。
The time of introduction (inoculation) of the recombinant baculovirus into Bonpukus Mori is not particularly limited as long as it is in the leap period, but is preferably early in the leap period. (
After inoculating the silkworm silkworm pupae with the above recombinant baculovirus, these pupae are bred for a predetermined period. The temperature conditions at that time are preferably 20 ° C to 30 ° C, more preferably 22 ° C to 28 ° C, more preferably 24 ° C. ˜27 ° C. is more preferred, and 26 ° C. is particularly preferred. The period of raising the upper wing is not particularly limited as long as it is from the inoculation to before the pupae transform into adults (pupae), but preferably 2 to 6 days after the inoculation, more preferably 2 to 4 days. Preferably, 3 days is more preferable.
Recovery of virus-like particles from silkworm cocoons can use any method known to those skilled in the art. For example, silkworm cocoons can be homogenized in an isotonic buffer solution and then recovered using immobilized erythrocytes or a sialic acid column (fetuin column). In addition, a fraction containing virus-like particles can be obtained using a fractionation method such as sucrose density gradient centrifugation.
本発明のワクチンは、上記本発明のウイルス様粒子を含有する本発明のウイルス様粒子は高い免疫原性を備えるため、アジュバントを用いなくとも、従来にはない高い免疫原性を示すことが可能であるアジュバントを用いないため、アレルギーやアナフィラキシショック等の副作用も低減することができる。また、当然のことながら、本発明のウイルス様粒子の上記球状外殻の中空の内部にはウイルス由来の核酸は存在しないため、非病原性である。本発明のワクチンはヒトを含む動物のウイルス感染を、効果的に防ぐことができる。また、本発明のワクチンは、従来の鶏卵を用いた製造方法等に比較して、製造に必要な期間を著しく短縮することができる。そのため、インフルエンザ等のウイルス感染症の流行の際に、短期間でワクチンの調達をすることができ、人々を感染症から守り健康を維持させることに多大な貢献を果たすことができる。さらに、従来の鶏卵を用いるワクチンの製造においては、ワクチンに用いる種ウイルスを扱うため、P3施設等の高度安全施設を必要とすること、ワクチンの免疫原性が低いため大量のワクチンを製造する必要があること等の理由により莫大な製造コストが必要であるのに対し、本発明の製造方法によると製造コストを著しく低減することができる。 In the vaccine of the present invention, since the virus-like particle of the present invention containing the virus-like particle of the present invention has high immunogenicity, it is possible to exhibit high immunogenicity without using an adjuvant. Since no adjuvant is used, side effects such as allergies and anaphylactic shock can be reduced. Of course, the virus-like particles of the present invention are non-pathogenic because no virus-derived nucleic acid is present in the hollow interior of the spherical outer shell. The vaccine of the present invention can effectively prevent virus infection of animals including humans. Moreover, the vaccine of this invention can shorten the period required for manufacture remarkably compared with the manufacturing method etc. which used the conventional egg. As a result, vaccines can be procured in a short period of time during the epidemic of viral infections such as influenza, which can greatly contribute to protecting people from infections and maintaining their health. Furthermore, in the production of vaccines using conventional eggs, it is necessary to produce highly safe facilities such as P3 facilities to handle seed viruses used for vaccines, and to produce large quantities of vaccines because of the low immunogenicity of vaccines. Whereas a huge manufacturing cost is necessary due to the fact that the manufacturing method is present, the manufacturing method of the present invention can remarkably reduce the manufacturing cost.
<ワクチン組成物>
1つの実施態様において、本発明は、ウイルスの感染に対するワクチンを、動物に接種する方法であって、本発明に係るポリペプチドを含むかまたは本発明に係る生産方法に従って生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法である。
1つの実施態様において、本発明は、ウイルスに対する免疫応答を、動物に誘導する方法であって、本発明に係るポリペプチドを含むかまたは本発明に係る記載の生産方法により生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法である。別の態様において、本発明は、ウイルスワクチン組成物に関する。本ワクチン組成物は、前記ウイルス様粒子の他、追加成分、及び医薬的に許容される担体を含むことができる。追加成分としては、アジュバント、及び抗インフルエンザウイルス剤等の抗インフルエンザウイルス作用を増強させる成分を挙げることができる。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルション、水中油エマルション、水中油中エマルション、アクリルまたはメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸、アルケニル誘導体、カルボマー、ブロックコポリマーを挙げることができる。また、抗ウイルス剤としては、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、及びラニナミビル等のノイラミターゼ阻害剤、アマンタジン、リマンタジン、RNAポリメラーゼ阻害剤等を挙げることができる。本発明の組成物が含有する医薬的に許容される担体としては、医薬品として用いることが許可されている溶媒、分散剤、コーティング剤、安定剤(アルブミン、エチレンジアミン四酢酸アルカリ塩)、希釈剤(水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等)、保存剤、賦形剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤(塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等)、吸収遅延剤を含む。
<Vaccine composition>
In one embodiment, the present invention provides a method for inoculating an animal with a vaccine against viral infection, comprising an effective amount of a vaccine comprising a polypeptide according to the present invention or produced according to a production method according to the present invention. Is administered to said animal.
In one embodiment, the present invention provides a method for inducing an immune response against a virus in an animal, comprising a polypeptide according to the invention or produced by a production method according to the invention. A method comprising administering an amount to said animal. In another aspect, the present invention relates to a viral vaccine composition. In addition to the virus-like particles, the vaccine composition can include additional components and a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of the additional component include an adjuvant and a component that enhances an anti-influenza virus action such as an anti-influenza virus agent. Adjuvants can include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, saponin, water-in-oil emulsion, oil-in-water emulsion, oil-in-water emulsion, acrylic or methacrylic acid polymers, maleic anhydride, alkenyl derivatives, carbomers, block copolymers. . Examples of the antiviral agent include neuramitase inhibitors such as zanamivir, oseltamivir, peramivir, and laninamivir, amantadine, rimantadine, RNA polymerase inhibitors, and the like. The pharmaceutically acceptable carrier contained in the composition of the present invention includes a solvent, a dispersant, a coating agent, a stabilizer (albumin, ethylenediaminetetraacetic acid alkali salt), a diluent (allowed for use as a pharmaceutical product) Contains water, saline, dextrose, ethanol, glycerol, etc.), preservatives, excipients, antibacterial agents, antifungal agents, isotonic agents (sodium chloride, dextrose, mannitol, sorbitol, lactose, etc.), absorption delaying agents .
例えば、本発明の組成物は、非経口投与または経口に適する剤形とすることができる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤などが挙げられ、注射剤には、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形が含まれる。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗原タンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。また、非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製される。
ワクチンの有効量は、ウイルスに対する十分な体液性免疫または細胞性免疫を誘発するなどの生物学的効果を達成するのに十分な量をいう。また、投与方法は、吸入、鼻腔内、経口、非経口(例えば皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下投与)の投与が含まれる。有効量および投与方法は、投与されるヒトの年齢、性別、状態、体重に依存してよい。例えばインフルエンザワクチンの場合、一般には、1ml中に一株あたり15μg以上のHAタンパク質を含むワクチンを、6ヶ月以上3歳未満の者には0.25mlを皮下に、3歳以上13歳未満の者には0.5mlを皮下に、およそ2〜4週間の間隔をおいて2回注射する。13歳以上の者については、0.5mlを皮下に、1回、又は、およそ1〜4週間の間隔をおいて2回注射する。
次に、本発明を実施例により詳細に説明するが、これに限定されるものではない。
For example, the composition of the present invention can be in a dosage form suitable for parenteral administration or oral administration. Examples of compositions for parenteral administration include injections and nasal drops, and injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. The dosage form is included. Such an injection can be prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antigen protein in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection. The prepared injection solution is usually filled in appropriate ampules, vials, and syringes. In addition, parenteral pharmaceutical compositions are prepared in dosage unit form that is compatible with the dosage of the active ingredient.
An effective amount of vaccine refers to an amount sufficient to achieve a biological effect such as inducing sufficient humoral or cellular immunity against the virus. Administration methods also include inhalation, intranasal, oral, parenteral (eg, intradermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, and subcutaneous administration). The effective amount and method of administration may depend on the age, sex, condition, weight of the human being administered. For example, in the case of an influenza vaccine, generally, a vaccine containing 15 μg or more of HA protein per strain in 1 ml; Inject 0.5 ml subcutaneously twice, approximately 2-4 weeks apart. For those 13 years and older, 0.5 ml is injected subcutaneously once or twice at approximately 1 to 4 week intervals.
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, it is not limited to this.
[使用した細胞及びウイルス]
ベロ細胞(カタログ番号JCRB 9013、ロット番号11292002)は、Japanese Collection of Research Bioresources[JCRB]細胞バンクから購入した。
日本脳炎ウイルスである、中山株ウイルス、北京株ウイルス、及びMuar株ウイルスは、国立感染症研究所(東京、日本)から入手した。
カイコBm−N細胞は、株式会社 バキュロテクノロジーズ(香川県)から入手した。
バキュロウイルスBombyx mori核多角体ウイルス-BmNPVのP6E株は、株式会社 バキュロテクノロジーズ(香川県)から入手した。
[Used cells and viruses]
Vero cells (catalog number JCRB 9013, lot number 11292002) were purchased from the Japanese Collection of Research Bioresources [JCRB] cell bank.
The Japanese encephalitis viruses, Zhongshan strain virus, Beijing strain virus, and Muar strain virus, were obtained from National Institute of Infectious Diseases (Tokyo, Japan).
Silkworm Bm-N cells were obtained from Baculo Technologies, Inc. (Kagawa Prefecture).
The P6E strain of baculovirus Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus-BmNPV was obtained from Baculo Technologies, Inc. (Kagawa Prefecture).
[実施例1]日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類される日本脳炎ウイルス様粒子の製造方法
<日本脳炎-中山株ウイルス様粒子(JEV-NVLP)を発現する遺伝子を有するバキュロウイルス組換え体の構築>
Yamaji H等によるJ Biosci Bioeng 2012;114:657-62、Yun SI等によるHum Vaccin Immunother 2014;10:263-79及びLuca VC等によるJ Virol 2012;86:2337-46などの文献の内容に基づいて、日本脳炎ウイルス遺伝子III型由来のMタンパク質及びEタンパク質を含有するウイルス様粒子を発現するために使用する、バキュロウイルス組換え体を作製した。
まず、GenbankにAccession No.ABQ52691で登録されているアミノ酸配列中のpreMタンパク質から、Mタンパク質、Eタンパク質までのアミノ酸配列(配列番号1)にFLAGタグ配列(配列番号2)を付加して、核酸設計の基となる中山株ウイルスPreM−M−E融合タンパク質のアミノ酸配列を得た(配列番号3)。この中山株ウイルスPreM−M−E融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、中山株ウイルスの完全なpreMタンパク質をコードする完全なpreM遺伝子、Mタンパク質をコードする完全なM遺伝子および完全なEタンパク質をコードするJEV-NVLP遺伝子配列に関し、後の工程で使用するカイコ蛹において、該中山株ウイルス様粒子の発現を増強できるように当該JEV-NVLP遺伝子配列のコドン最適化を行ない、コドン最適化JEV-NVLP遺伝子配列を得た(配列番号4)。なお、コドン最適化JEV-NVLP遺伝子配列のDNA断片の合成には、Dragon Genomics(Shiga、Japan)を用いた。
[Example 1] Method for producing Japanese encephalitis virus-like particles classified into Japanese encephalitis virus gene type III <Construction of baculovirus recombinants having a gene expressing Japanese encephalitis-Nakayama strain virus-like particles (JEV-NVLP) >
Based on the literature content such as J Biosci Bioeng 2012; 114: 657-62 by Yamaji H et al., Hum Vaccin Immunother 2014 by Yun SI et al .; J Virol 2012 by Luca VC et al .; 86: 2337-46 Thus, a baculovirus recombinant used for expressing virus-like particles containing M protein and E protein derived from Japanese encephalitis virus gene type III was prepared.
First, the FLAG tag sequence (SEQ ID NO: 2) is added to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) from the preM protein in the amino acid sequence registered in Genbank under Accession No. ABQ52691 to the M protein and E protein. The amino acid sequence of the Nakayama strain virus PreM-ME fusion protein, which is the basis of the design, was obtained (SEQ ID NO: 3). Based on the amino acid sequence of the Nakayama strain virus PreM-M-E fusion protein, full pr e M genes encoding the complete pr e M protein of Nakayama strain viruses, a M gene and a complete full coding for M protein Regarding JEV-NVLP gene sequence encoding E protein, codon optimization of the JEV-NVLP gene sequence is performed so that expression of the Nakayama strain virus-like particle can be enhanced in the silkworm silkworm used in the subsequent step. The modified JEV-NVLP gene sequence was obtained (SEQ ID NO: 4). In addition, Dragon Genomics (Shiga, Japan) was used for the synthesis | combination of the DNA fragment of a codon optimization JEV-NVLP gene sequence.
合成したDNA断片をIn-Fusionキット(Clontech、Mountain View、CA、USA)を使用してベクターであるpPm-8プラスミドに挿入して、pBm-8-JEV-NVLPベクターを作製した。続いて、pBm-8-JEV-NVLPベクターおよびバキュロウイルスBombyx mori核多角体ウイルス-BmNPVのP6E株由来の線状化DNAを、血清を含まない培地中でカイコBm―N細胞にコトランスフェクションした。5時間のインキュベーションの後、前記無血清培地をTC-100培地および10%ウシ胎仔血清を含有する最小必須培地に交換し、当該細胞をさらに5〜7日間インキュベートした。その後、培地を回収し、3000rpmで5分間遠心分離して、沈降した細胞破片を分離した。同様の遠心分離を繰り返して、JEV-NVLPバキュロウイルス組換え体濃縮液を得た。 The synthesized DNA fragment In-Fusion Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA) was inserted into the ppm-8 plasmid is base restrictor was used to prepare a pBm-8-JEV-NVLP vector. Subsequently, linearized DNA derived from the pBm-8-JEV-NVLP vector and the baculovirus Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus-BmNPV strain P6E was cotransfected into silkworm Bm-N cells in serum-free medium. . After 5 hours of incubation, the serum-free medium was replaced with minimal essential medium containing TC-100 medium and 10% fetal calf serum, and the cells were further incubated for 5-7 days. Thereafter, the medium was collected and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to separate the precipitated cell debris. The same centrifugation was repeated to obtain a JEV-NVLP baculovirus recombinant concentrate.
ここで、顕微鏡観察による細胞の外観及び形態の変性に基づいてJEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染したカイコBm―N細胞を確認した。さらに、日本脳炎ウイルス(中山株ウイルス)に対するマウス抗血清又はウサギ抗血清と、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗マウスIgG抗体(米国ペンシルベニア州ウエストグローブ)とを用いた蛍光抗体法で、JEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染したカイコBm―N細胞を再確認した。また、JEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染したカイコBm―N細胞が日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のEタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を産生していることを、中山株ウイルスに対する前記マウス抗血清またはウサギ抗血清、ヤギポリクローナル抗JEVウサギ血清(NIID、Tokyo、Japanから入手した)、FITC結合ウサギ抗ヤギIgG-AP抗体(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA)及び、ECLプラス試薬(GE Healthcare、Port Washington、NY、USA)を使用したウエスタンブロット分析で確認した。 Here, silkworm Bm-N cells infected with JEV-NVLP baculovirus recombinants were confirmed based on microscopic observation of the appearance and morphology of the cells. Furthermore, a fluorescent antibody method using a mouse antiserum or rabbit antiserum against Japanese encephalitis virus (Nakayama strain virus) and a fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated anti-mouse IgG antibody (West Grove, PA, USA), JEV-NVLP Silkworm Bm-N cells infected with the baculovirus recombinant were reconfirmed. In addition, silkworm Bm-N cells infected with JEV-NVLP baculovirus recombinants are producing Japanese encephalitis virus-like particles containing E protein derived from viruses classified as Japanese encephalitis virus gene type III. Mouse antiserum or rabbit antiserum against Nakayama strain virus, goat polyclonal anti-JEV rabbit serum (obtained from NIID, Tokyo, Japan), FITC-conjugated rabbit anti-goat IgG-AP antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ) And Western blot analysis using ECL plus reagent (GE Healthcare, Port Washington, NY, USA).
<カイコ蛹における中山株ウイルス様粒子の生成と精製>
得られたJEV-NVLPバキュロウイルス組換え体濃縮液(1×1010pfu/ml)を1×106/蛹にPBSで調整(希釈)した20μlを、カイコ蛹に注射してJEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染させた。感染1〜5日後にそれぞれ、カイコ蛹を回収し、破砕し、破砕物に0.01%ホルマリンおよびフェニルチオウレアを添加した。そして、その混合物を3サイクルの超音波処理でホモジェナイズした。得られたホモジネートを、Beckman遠心分離機を備えたSW28ローターを用いて16,000rpmで30分間遠心分離し、続いて同じローターを用いて、さらに10〜50%(w / w)の線状スクロース勾配で遠心分離して、20個の画分を生成した。ウイルス様粒子抗原の存在を検出するために、すべての画分に対し、公知の手順でタンパク質含量定量、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびウエスタンブロット分析に供した。なお、これらのアッセイ等で使用した抗体等は、上記と同じである。その結果、感染後3日目のカイコ蛹から得られるEタンパク質収量が一番高いことが分かった。具体的には、感染後3日目の30匹のカイコ蛹のホモジネートから9,480μgのEタンパク質を回収できることを確認した。したがって、計算上、各カイコ蛹は、300μg以上のEタンパク質を産生することができた。
別途同様に行った実験では、30匹の蛹から15,840μgのEタンパク質が回収され、396μgのEタンパク質/蛹が産生された。また、得られたウイルス様粒子(VLP)抗原を電子顕微鏡で観察したところ、直径30〜200nmのサイズの粒子が確認された。
以上から、本発明におけるカイコ蛹の発現系では、予想外に高い収率で安全にウイルス様粒子抗原を得ることができることが分かった。
<Generation and purification of Nakayama strain virus-like particles in silkworm cocoons>
The obtained JEV-NVLP baculovirus recombinant concentrate (1 × 10 10 pfu / ml) was adjusted to 1 × 10 6 / 蛹 with PBS (diluted) and 20 μl was injected into silkworm cocoons to give JEV-NVLP baculo Infected with virus recombinants. Silkworm cocoons were collected and crushed 1 to 5 days after infection, and 0.01% formalin and phenylthiourea were added to the crushed material. The mixture was then homogenized by 3 cycles of sonication. The resulting homogenate is centrifuged at 16,000 rpm for 30 minutes using a SW28 rotor equipped with a Beckman centrifuge, followed by an additional 10-50% (w / w) linear sucrose gradient using the same rotor. Centrifugation yielded 20 fractions. In order to detect the presence of virus-like particle antigens, all fractions were subjected to protein content quantification, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot analysis by known procedures. The antibodies used in these assays are the same as described above. As a result, it was found that the E protein yield obtained from silkworm cocoons on the third day after infection was the highest. Specifically, it was confirmed that 9,480 μg of E protein could be recovered from the homogenate of 30 silkworm pupae on the third day after infection. Therefore, in calculation, each silkworm silkworm was able to produce more than 300 μg of E protein.
In a separate experiment, 15,840 μg E protein was recovered from 30 pupae, producing 396 μg E protein per cocoon. Further, when the obtained virus-like particle (VLP) antigen was observed with an electron microscope, particles having a diameter of 30 to 200 nm were confirmed.
From the above, it was found that the virus-like particle antigen can be safely obtained with an unexpectedly high yield in the silkworm cocoon expression system of the present invention.
[実施例2]日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類される日本脳炎ウイルス様粒子の製造方法
<日本脳炎-Muar株ウイルス様粒子(JEV-VLP)を発現する遺伝子を有するバキュロウイルス組換え体の構築>
GenbankにACCESSION ADX31663で登録されているアミノ酸配列中のpreMタンパク質から、Mタンパク質、Eタンパク質までのアミノ酸配列(配列番号5)にFLAGタグ配列(配列番号3)を付加して、核酸設計の基となるMuar株ウイルスPreM−M−E融合タンパク質のアミノ酸配列を得た(配列番号6)。この中山株ウイルスPreM/M−E融合タンパク質のアミノ酸配列に相当するMuar株のPreM/M-E融合タンパク質のアミノ酸配列のうち最初のValタンパクを中山株同様にMetに改変することで開始コドンとし、また、TAGアミノ酸配列を加え、該Muar株ウイルス様粒子の発現を増強できるように当該JEV-VLP遺伝子配列のコドン最適化を行ない、コドン最適化JEV-VLP遺伝子配列を得た(配列番号7)。
それ以外の手順は、全て実施例2と同様に行った。
[Example 2] Method for producing Japanese encephalitis virus-like particles classified into Japanese encephalitis virus gene type V <Construction of a baculovirus recombinant having a gene expressing Japanese encephalitis-Muar strain virus-like particles (JEV-VLP) >
The FLAG tag sequence (SEQ ID NO: 3) is added to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) from the preM protein to the M protein and E protein in the amino acid sequence registered in Genbank with ACCESSION ADX31663, The resulting amino acid sequence of the Muar strain virus PreM-ME fusion protein was obtained (SEQ ID NO: 6). Among the amino acid sequences of the Muar strain PreM / ME fusion protein corresponding to the amino acid sequence of the Nakayama strain PreM / ME fusion protein, the first Val protein is changed to Met in the same manner as the Nakayama strain, so that it becomes a start codon. The TAG amino acid sequence was added, and the JEV-VLP gene sequence was codon-optimized so that the expression of the Muar strain virus-like particles could be enhanced to obtain a codon-optimized JEV-VLP gene sequence (SEQ ID NO: 7).
All other procedures were the same as in Example 2.
[実施例3]2種混合ワクチンの製造方法
実施例1で得られたウイルス様粒子と、実施例2で得られたウイルス様粒子をそれぞれタンパク量(20μg/ml)で規定し、それぞれのVLPを等量混合して作製した。
[Example 3] Method for producing two-type mixed vaccine The virus-like particles obtained in Example 1 and the virus-like particles obtained in Example 2 are defined by the amount of protein (20 μg / ml), respectively. Were prepared by mixing equal amounts.
[実施例4]カイコで発現させた日本脳炎ウイルス様粒子の中和抗体価の確認(プラーク中和試験)
上述のプラーク中和試験法に基づいて、以下の実験を行った。
カイコ蛹で産生された中山株ウイルス様粒子(JEV-NVLP)をウサギに免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することで免疫原性を調べた。具体的には、ウサギに中山株ウイルス様粒子(JEV-NVLP)100〜200μg/mlの0.5〜1 mlを2週間間隔で7回注射(免疫)し、採血後の血液を1200rpmで10分間遠心して得られた抗血清を用いて中和抗体価を確認した。
JEV-NVLPに対する試験抗ウサギ血清を、10倍連続希釈後、さらに連続希釈し、同じ量の攻撃ウイルスと混合した。プラーク阻害アッセイのために、接種前に、攻撃ウイルスを10倍希釈した抗血清と混合した。 6ウェルプレートで6日間インキュベートした後、アガロース培地を除去し、生存プラークを計数した。
中山株に感染したVero細胞で産生されたプラークは非常に小さかったが、血清の濃度が増加するにつれてプラーク数は明らかに減少した。この傾向は、北京株ウイルスおよびMuar株ウイルスによって産生されたプラーク数でも観察された。この抗体試験抗ウサギ抗体-攻撃ウイルスの関係を、図3に示す。抗体の希釈倍数とプラーク数との間に相関関係が観察された。図3の曲線に基づいて、各ウェルの平均プラーク数を100%とし、プラーク数を50%に減少させるのに必要な最大の血清希釈倍率である中和抗体価を算出した(表2)。JEV-NVLPに対する抗血清は、III型に分類される中山株ウイルス及び北京株ウイルスに対してそれぞれ高い阻害効果をもたらした。特に、JEV-NVLPに対する抗血清は、V型に分類されるMuar株において、中山株よりも高い力価を有していた。
[Example 4] Confirmation of neutralizing antibody titer of Japanese encephalitis virus-like particles expressed in silkworm (plaque neutralization test)
Based on the plaque neutralization test method described above, the following experiment was conducted.
Immunogenicity was examined by measuring the neutralizing antibody titer of the antibody produced by immunizing rabbits with Nakayama strain virus-like particles (JEV-NVLP) produced in silkworm silkworms. Specifically, Rabbits were injected (immunized) with 0.5 to 1 ml of Nakayama strain virus-like particles (JEV-NVLP) 100 to 200 μg / ml seven times at 2-week intervals, and the collected blood was removed at 1200 rpm for 10 minutes. The neutralizing antibody titer was confirmed using the antiserum obtained with care.
Test anti-rabbit sera against JEV-NVLP was serially diluted 10-fold and then serially diluted and mixed with the same amount of challenge virus. For plaque inhibition assay, challenge virus was mixed with 10-fold diluted antisera prior to inoculation. After 6 days incubation in 6 well plates, the agarose medium was removed and viable plaques were counted.
The plaques produced by Vero cells infected with Zhongshan strain were very small, but the number of plaques obviously decreased as the serum concentration increased. This trend was also observed for the number of plaques produced by Beijing and Muar strain viruses. This antibody test anti-rabbit antibody-attack virus relationship is shown in FIG. A correlation was observed between antibody dilution and plaque number. Based on the curve in FIG. 3, the neutralization antibody titer, which is the maximum serum dilution factor required to reduce the number of plaques to 50%, was calculated (Table 2). The antiserum against JEV-NVLP has a high inhibitory effect on the Zhongshan strain virus and Beijing strain virus classified as type III, respectively. In particular, the antiserum against JEV-NVLP had a higher titer in the Muar strain classified as type V than in the Nakayama strain.
[実施例5]カイコで発現させた日本脳炎ウイルス様粒子の中和抗体価の確認
カイコ蛹で産生されたMuar株ウイルス様粒子(JEV-VLP)でウサギに免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することで免疫原性を調べた。手順は実施例4と同様に行った。この抗体試験抗ウサギ抗体-攻撃ウイルスの関係を、図4に示す。抗体の希釈倍数とプラーク数との間に相関関係が観察された。図4の曲線に基づいて、各ウェルの平均プラーク数を100%とし、プラーク数を50%に減少させるのに必要な最大の血清希釈倍率である中和抗体価を算出した(表3)。JEV-VLPに対する抗血清は、V型に分類されるMuar株ウイルスに対して高い阻害効果をもたらした。また、当該抗血清は、中山株ウイルスに対しても高い阻害効果をもたらした。これは、従来のワクチンでは得られなかった予想外の効果であった。
[Example 5] Confirmation of neutralizing antibody titer of Japanese encephalitis virus-like particles expressed in silkworms Japanese encephalitis of antibodies made by immunizing rabbits with Muar strain virus-like particles (JEV-VLP) produced in silkworm silkworms The immunogenicity was examined by measuring the neutralizing antibody titer against the virus. The procedure was the same as in Example 4. This antibody test anti-rabbit antibody-attack virus relationship is shown in FIG. A correlation was observed between antibody dilution and plaque number. Based on the curve of FIG. 4, the average number of plaques in each well was set to 100%, and the neutralizing antibody titer that was the maximum serum dilution factor required to reduce the number of plaques to 50% was calculated (Table 3). Antisera against JEV-VLP had a high inhibitory effect on Muar strain viruses classified as type V. The antiserum also exerted a high inhibitory effect against the Nakayama strain virus. This was an unexpected effect that was not obtained with conventional vaccines.
[実施例6]カイコで発現させた日本脳炎ウイルス様粒子の中和抗体価の確認(2種混合ワクチン)
実施例3で作製した2種混合ワクチンでウサギに免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することで免疫原性を調べた。中和抗体価を確認する手順は実施例4と同様に行った。そして、2種混合ワクチンによって得られる中和抗体価を算出した(表4)。なお、表4には、表2及び表3の結果、及び、表1で示した従来技術が反映されている。
[Example 6] Confirmation of neutralizing antibody titer of Japanese encephalitis virus-like particles expressed in silkworms (2 types of mixed vaccine)
Immunogenicity was examined by measuring the neutralizing antibody titer of the antibody produced by immunizing rabbits with the two-mixed vaccine prepared in Example 3 against Japanese encephalitis virus. The procedure for confirming the neutralizing antibody titer was the same as in Example 4. And the neutralizing antibody titer obtained by 2 types of mixed vaccine was computed (Table 4). Table 4 reflects the results of Tables 2 and 3 and the prior art shown in Table 1.
現在、広く市販されている中山株と北京株ワクチンの免疫血清に対し、JEV GV型のMuar株の中和抗体価は、20と低く反応し、その予防効果は期待できない。これに対し、中山株ウイルス様粒子を含むワクチンは、中山株、Muar株に高く反応するが、北京株にはやや低く反応している。一方、Muar株ウイルス様粒子を含むワクチンは、ホモのMuar株ウイルスに非常に高く反応し、中山株にも高く反応するが、北京株には極端に低い反応を示し、中和抗体価は僅か76となっている。以上から、中山株ウイルス様粒子とMuar株ウイルス様粒子とを含む2種混合ワクチンは、9,600、8,000、8,000と、ほぼ同程度の抗体価を有していることから、本日本脳炎2種混合ワクチンは、現在世界で流行しているGI、GIII、GV型の日本脳炎ウイルスを制圧することが可能になると考えられる。本発明により、中山株とMuar株、あるいは北京株とMuar株ウイルスの2種混合ワクチンの登場が期待される。 Currently, the neutralizing antibody titer of JEV GV type Muar strain reacts as low as 20 against the immune sera of Nakayama strain and Beijing strain vaccine, which are widely marketed, and its preventive effect cannot be expected. In contrast, vaccines containing Nakayama strain virus-like particles are highly reactive with Nakayama and Muar strains, but are slightly less reactive with Beijing strains. On the other hand, vaccines containing Muar strain virus-like particles react very high with homo muar strain virus and also with Zhongshan strain, but show extremely low response with Beijing strain, and neutralizing antibody titer is slightly 76. From the above, two types of mixed vaccines containing Nakayama strain virus-like particles and Muar strain virus-like particles have 9,600, 8,000, 8,000 and almost the same antibody titer. Vaccines will be able to control GI, GIII, and GV Japanese encephalitis viruses that are currently prevalent in the world. According to the present invention, two mixed vaccines of Nakayama strain and Muar strain, or Beijing strain and Muar strain virus are expected to appear.
[実施例7]JEV-NVLPワクチンによる予防接種
部分的に精製したJEV-NVLPをマウスでの免疫化に使用した。最初に、JEV-NVLPを完全アジュバントと混合した。得られたアジュバントワクチンを最初の免疫化(初回投与)に使用し、不完全アジュバントワクチンを2週間後の2回目の免疫化(2回目の投与)に使用した。さらにアジュバントを含まない第3の免疫化(第3の用量)を4週間後に与え、血液サンプルを2週間後に収集した。結果を図5に示す。なお、動物実験の基本的なルールは、動物実験の基本規則(沖縄生物資源研究所)と実験動物の管理と使用に関するガイドライン(日本科学会)に従った。
図5に示すように、一連の3回の用量で免疫したマウスでは、より高い中和力価がJEV-Muar株について観察された。引き続く高いプラーク中和力価が相同な中山株において確認された。対照的に、JEV-NVLPに対する上記の強力な抗血清は、北京株によるプラーク形成の阻害には他の2種ほどは影響を及ぼさなかった。
[Example 7] Vaccination with JEV-NVLP vaccine Partially purified JEV-NVLP was used for immunization in mice. First, JEV-NVLP was mixed with complete adjuvant. The resulting adjuvant vaccine was used for the first immunization (first dose) and the incomplete adjuvant vaccine was used for the second immunization (second dose) after 2 weeks. In addition, a third immunization (third dose) without adjuvant was given after 4 weeks and blood samples were collected after 2 weeks. The results are shown in FIG. The basic rules for animal experiments were in accordance with the basic rules for animal experiments (Okinawa Institute for Bioresources) and guidelines for the management and use of laboratory animals (Japan Science Society).
As shown in FIG. 5, higher neutralization titers were observed for the JEV-Muar strain in mice immunized with a series of three doses. Subsequent high plaque neutralization titers were confirmed in the homologous Nakayama strain. In contrast, the powerful antisera described above against JEV-NVLP did not affect the inhibition of plaque formation by Beijing strains as much as the other two.
Claims (9)
(i)カイコ由来細胞又はカイコ蛹によって産生される、中山株ウイルス由来のMタンパク質及びEタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子、及び、(ii)Muar株ウイルス由来のMタンパク質及びEタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含む、
2種混合の日本脳炎ワクチン。 Japanese encephalitis vaccine against Nakayama strain virus and Beijing strain virus, viruses classified as Japanese encephalitis virus gene type III, and Muar strain virus, a virus classified as Japanese encephalitis virus gene type V,
(i) Japanese encephalitis virus-like particles containing M protein and E protein derived from Nakayama strain virus, produced by silkworm-derived cells or silkworm cocoons, and (ii) containing M protein and E protein derived from Muar strain virus Including Japanese encephalitis virus-like particles
Two types of Japanese encephalitis vaccine.
カイコ由来細胞又はカイコ蛹において、配列番号4で示される中山株ウイルスコドン最適化PreM−M−E融合タンパク質遺伝子DNA配列で発現されるアミノ酸配列を含むコドン最適化PreM−M−E融合タンパク質を含む、日本脳炎ウイルス様粒子(i)を含み、
日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスであるMuar株ウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスである中山株ウイルス或いは北京株ウイルスに対する中和抗体価より高い、
日本脳炎ワクチン。 Japanese encephalitis vaccine against Muar strain virus, a virus classified as Japanese encephalitis virus gene V type,
A codon-optimized PreM-ME fusion protein comprising an amino acid sequence expressed in the DNA sequence of Nakayama strain virus codon optimized PreM-ME fusion protein shown in SEQ ID NO: 4 in a silkworm-derived cell or silkworm silkworm , Including Japanese encephalitis virus-like particles (i),
Neutralizing antibody titer against Muar strain virus, which is a virus classified into Japanese encephalitis virus gene V type of antibody made by immunizing animals with Japanese encephalitis virus-like particles (i), Higher than neutralizing antibody titer against Zhongshan strain virus or Beijing strain virus, which is a virus classified as
Japanese encephalitis vaccine.
カイコのタンパク質発現系を使用し、
日本脳炎ウイルス遺伝子III型及びV型に分類される日本脳炎ウイルスそれぞれにおけるpreMタンパク質をコードするpreM遺伝子とMタンパク質をコードするM遺伝子とEタンパク質をコードするE遺伝子とをこの順で包含するDNA断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記DNA断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化DNA断片を得る工程、
得られたコドン最適化DNA断片をベクターに挿入する工程、
得られたベクターと、線状化したバキュロウイルス由来DNAとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、
得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、
カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び
前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程、
を含み、前記コドン最適化DNA断片の配列が、配列番号4及び7の塩基配列である、日本脳炎ワクチンの製造方法。 (i) Japanese encephalitis virus-like particles containing M protein and E protein derived from a virus classified as Japanese encephalitis virus gene type III; and (ii) a virus derived M protein and E classified as Japanese encephalitis virus gene V type. A method for producing a mixed Japanese encephalitis vaccine comprising Japanese encephalitis virus-like particles containing protein,
Using silkworm protein expression system,
A DNA fragment comprising, in this order, a preM gene encoding a preM protein, an M gene encoding an M protein, and an E gene encoding an E protein in each of Japanese encephalitis viruses classified into Japanese encephalitis virus genes type III and V A codon-optimized DNA fragment for expression of silkworms by modifying the codon of the DNA fragment so that the encoded amino acid sequence does not mutate compared to the corresponding amino acid sequence in wild-type Japanese encephalitis virus Obtaining a step,
Inserting the obtained codon optimized DNA fragment into a vector;
Co-transfecting the obtained vector and linearized baculovirus-derived DNA into silkworm cells,
Obtaining a baculovirus recombinant containing a codon-optimized DNA fragment from the obtained silkworm cell,
Infecting silkworm cocoons with the baculovirus recombinant, and breeding silkworm cocoons, and isolating Japanese encephalitis virus-like particles from the silkworm cocoons,
A method for producing a Japanese encephalitis vaccine, wherein the sequence of the codon optimized DNA fragment is the base sequence of SEQ ID NOs: 4 and 7 .
日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価以上である、
日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスであるMuar株ウイルスに対する日本脳炎ワクチンの製造方法であって、
カイコのタンパク質発現系を使用し、
日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類される日本脳炎ウイルスにおけるpreMタンパク質をコードするpreM遺伝子とMタンパク質をコードするM遺伝子とEタンパク質をコードするE遺伝子とをこの順で包含するDNA断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記DNA断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化DNA断片を得る工程、
得られたコドン最適化DNA断片をベクターに挿入する工程、
得られたベクターと、線状化したバキュロウイルス由来DNAとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、
得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、
カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び
前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程、
を含み、前記コドン最適化DNA断片の配列が、配列番号4の塩基配列である、日本脳炎ワクチンの製造方法。 (i) Japanese encephalitis virus-like particles containing M protein and E protein derived from a virus classified into Japanese encephalitis virus gene type III,
A virus whose neutralizing antibody titer against a virus classified as Japanese encephalitis virus gene type V of an antibody made by immunizing an animal with Japanese encephalitis virus-like particle (i) is classified as Japanese encephalitis virus gene type III of the antibody More than neutralizing antibody titer against
A method for producing a Japanese encephalitis vaccine against Muar strain virus, which is a virus classified as Japanese encephalitis virus gene V type ,
Using silkworm protein expression system,
In a Japanese encephalitis virus gene type III classified into the Japanese encephalitis virus gene III, the preM gene encoding the preM protein, the M gene encoding the M protein, and the E gene encoding the E protein are encoded in this order. Modifying the codons of the DNA fragment so that the amino acid sequence is not mutated compared to the corresponding amino acid sequence in wild-type Japanese encephalitis virus, obtaining a codon-optimized DNA fragment for silkworm expression,
Inserting the obtained codon optimized DNA fragment into a vector;
Co-transfecting the obtained vector and linearized baculovirus-derived DNA into silkworm cells,
Obtaining a baculovirus recombinant containing a codon-optimized DNA fragment from the obtained silkworm cell,
Infecting silkworm cocoons with the baculovirus recombinant, and breeding silkworm cocoons, and isolating Japanese encephalitis virus-like particles from the silkworm cocoons,
A method for producing a Japanese encephalitis vaccine, wherein the sequence of the codon optimized DNA fragment is the base sequence of SEQ ID NO: 4.
カイコのタンパク質発現系を使用し、
日本脳炎ウイルス遺伝子III型及びV型に分類される日本脳炎ウイルスそれぞれにおけるpreMタンパク質をコードするpreM遺伝子とMタンパク質をコードするM遺伝子とEタンパク質をコードするE遺伝子とをこの順で包含するDNA断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記DNA断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化DNA断片を得る工程、
得られたコドン最適化DNA断片をベクターに挿入する工程、
得られたベクターと、線状化したバキュロウイルス由来DNAとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、
得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、
カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び
前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程、
を含む、日本脳炎ワクチンの製造方法。 A method for producing the Japanese encephalitis vaccine according to claim 1 or 2 ,
Using silkworm protein expression system,
A DNA fragment comprising, in this order, a preM gene encoding a preM protein, an M gene encoding an M protein, and an E gene encoding an E protein in each of Japanese encephalitis viruses classified into Japanese encephalitis virus genes type III and V A codon-optimized DNA fragment for expression of silkworms by modifying the codon of the DNA fragment so that the encoded amino acid sequence does not mutate compared to the corresponding amino acid sequence in wild-type Japanese encephalitis virus Obtaining a step,
Inserting the obtained codon optimized DNA fragment into a vector;
Co-transfecting the obtained vector and linearized baculovirus-derived DNA into silkworm cells,
Obtaining a baculovirus recombinant containing a codon-optimized DNA fragment from the obtained silkworm cell,
Infecting silkworm cocoons with the baculovirus recombinant, and breeding silkworm cocoons, and isolating Japanese encephalitis virus-like particles from the silkworm cocoons,
A method for producing a Japanese encephalitis vaccine, comprising:
カイコのタンパク質発現系を使用し、 Using silkworm protein expression system,
日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類される日本脳炎ウイルスにおけるpreMタンパク質をコードするpreM遺伝子とMタンパク質をコードするM遺伝子とEタンパク質をコードするE遺伝子とをこの順で包含するDNA断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記DNA断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化DNA断片を得る工程、 In the Japanese encephalitis virus gene type III classified into the Japanese encephalitis virus gene III, the preM gene encoding the preM protein, the M gene encoding the M protein and the E gene encoding the E protein are encoded in this order Modifying the codons of the DNA fragment so that the amino acid sequence is not mutated compared to the corresponding amino acid sequence in wild-type Japanese encephalitis virus, obtaining a codon-optimized DNA fragment for silkworm expression,
得られたコドン最適化DNA断片をベクターに挿入する工程、 Inserting the obtained codon optimized DNA fragment into a vector;
得られたベクターと、線状化したバキュロウイルス由来DNAとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、 Co-transfecting the obtained vector and linearized baculovirus-derived DNA into silkworm cells,
得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、 Obtaining a baculovirus recombinant containing a codon-optimized DNA fragment from the obtained silkworm cell,
カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び Infecting silkworm cocoons with the baculovirus recombinant, and breeding silkworm cocoons, and
前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程、 Isolating Japanese encephalitis virus-like particles from the silkworm cocoon,
を含む、日本脳炎ワクチンの製造方法。A method for producing a Japanese encephalitis vaccine, comprising:
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