JP6428763B2 - アミド化合物 - Google Patents
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Description
PGE2の受容体には、EP1、EP2、EP3及びEP4の4種類のサブタイプが存在し、これらは種々の組織に広く分布している。EP1受容体の活性化は細胞内Ca2+の増加を引き起こす。EP3受容体の活性化は細胞内Ca2+の増加を引き起こすと共に、アデニル酸シクラーゼの抑制を引き起こし細胞内のcAMPレベルを減少させる。EP2及びEP4受容体の活性化はアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こし、細胞内のcAMPレベルを増加させる。特にEP4受容体は平滑筋の弛緩、炎症反応の促進又は抑制、リンパ球分化、メサンギウム細胞の肥大又は増殖、胃腸からの粘液分泌等に関わっているとされている(Pharmacology & Therapeutics 2013、138:485−502;Pharmacological Reviews 2013、65:1010−1052;American Journal of Physiology Renal Physiology 2004、287、F673−F681)。
PGE2受容体の阻害剤、つまりEP受容体アンタゴニストはEP受容体に対する結合活性を有し、PGE2のEP受容体を介した作用を阻害する。したがって、EP受容体アンタゴニストはPGE2に起因する疾患を治療する薬剤として期待されている。中でも、EP4受容体アンタゴニストはEP4に関連した疾患、たとえば腎臓病、炎症性疾患、種々の疼痛等に対するヒト及び動物での治療薬として期待されている(Journal of American Society Nephrology 2010、21:1678−1690;Proceedings of the National Academy of Sciences、2010、107:12233−12238;The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2008、325:425−434)。さらに、EP4受容体選択的アンタゴニストは、他のEP1、EP2及びEP3の拮抗に基づく副作用を回避できる点から望ましい(Physiological Reviews 1999、79:1193−1226;Annual Reviews Physiology 2001、63:579−605)。
(式中、環Dは次式(III)の基等であり、次式中、環D1はフェニルで置換されてもよい単環又は二環式の含窒素ヘテロ環を、R41は−X2−B4を、X2はC1-6アルキレン等を、B4はR4から選択される同一又は異なる1〜5個の基でそれぞれ置換されてもよいアリール、ヘテロ環等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。)
(式中、R2はメチル、フルオロメチル等を、R4はフルオロメチル、メトキシ等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。)
(式中、R2はメチル、フルオロメチル(例えば、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル)等を、R4はフルオロメチル、メトキシ等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。)
(式中、環B及び環Dは、同一又は互いに異なって、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロ環を、Xは単結合、−R00−等を、R00は低級アルキレンを、R1はH等を表す。Aは次式(II)の基等であり、次式中、YはCH等を、R2はR0等を、R0は低級アルキルを、Zは単結合等を、R3は−COOH等を表す。他の記号は当該特許文献を参照。)
当該特許文献において、環Dがピラゾールである具体的な化合物の開示はない。
即ち、本発明は、化合物A又はその塩、並びに、化合物A又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
また、本発明は、慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための化合物A又はその塩の使用、慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための化合物A又はその塩の使用、慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための化合物A又はその塩、並びに、化合物A又はその塩の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法に関する。なお、「対象」とは、その予防又は治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様としては、その予防又は治療を必要とするヒトである。
(1) 化合物A又はその塩。
(1−1)化合物A。
(1−2)化合物Aのメタンスルホン酸塩。
(2) (1)に記載された化合物A又はその塩の結晶。
(3) (1−1)に記載された化合物Aの結晶。
(3−1)示差走査熱量計分析(DSC分析)における吸熱ピークのオンセット温度が253℃付近である(3)に記載の化合物Aの結晶。
(3−2)管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=5.7付近、7.9付近、11.5付近、13.1付近、及び17.9付近にピークを示すことを特徴とする(3)に記載の化合物Aの結晶。
(3−3)管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=5.7付近、7.9付近、8.3付近、8.9付近、9.2付近、11.5付近、12.5付近、13.1付近、15.8付近、16.3付近、16.7付近、17.2付近、17.9付近、18.5付近、及び19.5付近にピークを示すことを特徴とする(3)に記載の化合物Aの結晶。
(3−4)DSC分析における吸熱ピークのオンセット温度が253℃付近であり、管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=5.7付近、7.9付近、11.5付近、13.1付近、及び17.9付近にピークを示すことを特徴とする(3)に記載の化合物Aの結晶。
(3−5)DSC分析における吸熱ピークのオンセット温度が253℃付近であり、管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=5.7付近、7.9付近、8.3付近、8.9付近、9.2付近、11.5付近、12.5付近、13.1付近、15.8付近、16.3付近、16.7付近、17.2付近、17.9付近、18.5付近、及び19.5付近にピークを示すことを特徴とする(3)に記載の化合物Aの結晶。
(4) (1−2)に記載された化合物Aのメタンスルホン酸塩の結晶。
(4−1)DSC分析における吸熱ピークのオンセット温度が192℃付近である(4)に記載の化合物Aのメタンスルホン酸塩の結晶。
(4−2)管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=4.7付近、9.5付近、12.0付近、13.2付近、13.7付近、15.3付近、18.8付近、20.3付近、20.9付近、及び22.8付近にピークを示すことを特徴とする(4)に記載の化合物Aのメタンスルホン酸塩の結晶。
(4−3)DSC分析における吸熱ピークのオンセット温度が192℃付近であり、管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=4.7付近、9.5付近、12.0付近、13.2付近、13.7付近、15.3付近、18.8付近、20.3付近、20.9付近、及び22.8付近にピークを示すことを特徴とする(4)に記載の化合物Aのメタンスルホン酸塩の結晶。
(5−1)(1)〜(1−2)のいずれかに記載の化合物、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
(5−2)(2)〜(4−3)のいずれかに記載の結晶、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
(5−3)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用である(1)〜(1−2)のいずれかに記載の化合物、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
(5−4)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用である(2)〜(4−3)のいずれかに記載の結晶、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
(6−1)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための(1)〜(1−2)のいずれかに記載の化合物の使用。
(6−2)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための(2)〜(4−3)のいずれかに記載の結晶の使用。
(7−1)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための(1)〜(1−2)のいずれかに記載の化合物。
(7−2)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための(2)〜(4−3)のいずれかに記載の結晶。
(8−1)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための(1)〜(1−2)のいずれかに記載の化合物の使用。
(8−2)慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療のための(2)〜(4−3)のいずれかに記載の結晶の使用。
(9−1)(1)〜(1−2)のいずれかに記載の化合物の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法。
(9−2)(2)〜(4−3)のいずれかに記載の結晶の有効量を対象に投与することからなる慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療方法。
なお、粉末X線回折パターンはデータの性質上、結晶の同一性認定においては、結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、回折角及び回折強度は結晶成長の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少変わりうるものである。
化合物A又はその塩は、その基本構造あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成法を適用して製造することができる。その際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で適当な保護基(容易に当該官能基に転化可能な基)に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、ウッツ(P. G. M. Wuts)及びグリーン(T. W. Greene)著、「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)」に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。
また、化合物Aのプロドラッグは、上記保護基と同様、原料から中間体へ至る段階で特定の基を導入、あるいは得られた化合物Aを用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。
以下、化合物Aの代表的な製造法を説明する。各製法は、当該説明に付した参考文献を参照して行うこともできる。なお、本発明の製造法は以下に示した例には限定されない。また、特に記載がない限り、当該製造法の構造式中に示される記号において、同一の記号は同一の意味を表す。
反応は、化合物(3)と化合物(4)とを等量若しくは一方を過剰量用い、縮合剤の存在下、反応に不活性な溶媒中、冷却下から加熱下、好ましくは−20℃〜60℃において、通常0.1時間〜5日間撹拌することによって行われる。ここに、溶媒としては特に限定はされないが、例えば、ベンゼン、トルエン若しくはキシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン(DCM)、1,2−ジクロロエタン(DCE)若しくはクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン(THF)、ジオキサン、ジメトキシエタン(DME)等のエーテル類、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、酢酸エチル、アセトニトリル又は水、あるいはこれらの混合物が挙げられる。縮合剤としては、1−[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]−1H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−1−イウム−3−オキシド ヘキサフルオロホスファート(HATU)、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド 塩酸塩、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)、ジフェニルリン酸アジド、オキシ塩化リン、または縮合剤を担持したポリスチレン樹脂、例えばPS−カルボジイミド(PS−Carbodiimide)(アルゴノートテクノロジー(Argonaut Technologies)、米国)等を用いることが好ましい場合があるが、これらに限定されるものではない。また、例えば1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)等の添加剤を用いることが反応に好ましい場合があり、また、例えばトリエチルアミン(TEA)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)若しくはN−メチルモルホリン(NMM)等の有機塩基、又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウム等の無機塩基の存在下に反応させるのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。さらに反応終了後の過剰なアミンを除去する目的でイソシアナートを担持したポリスチレン樹脂、例えばPS−イソシアナート(PS−Isocyanate)(アルゴノートテクノロジー、米国)等を用いることができる。さらに反応終了後の過剰なカルボン酸及び前述の添加剤等を除去する目的で四級アンモニウム塩を担持したポリスチレン樹脂、例えばMP−カルボナート(MP−Carbonate)(アルゴノートテクノロジー、米国)等を用いることができる。
また、化合物(3)を反応性誘導体へ導いた後に化合物(4)と反応させる方法も用いることができる。ここに化合物(3)の反応性誘導体としては、オキシ塩化リン、塩化チオニル等のハロゲン化剤と反応して得られる酸ハロゲン化物、クロロギ酸イソブチル等と反応して得られる混合酸無水物、HOBt等と縮合して得られる活性エステル等が挙げられる。これらの反応性誘導体と化合物(4)との反応は、前記ハロゲン化炭化水素類、芳香族炭化水素類、エーテル類等の反応に不活性な溶媒中、冷却下〜加熱下、好ましくは、−20℃〜60℃で行うことができる。
Xで示される脱離基の具体例としては、ハロゲン、メタンスルホニルオキシ、p−トルエンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基等が含まれる。
この反応では、化合物(5)と化合物(6)を等量若しくは一方を過剰量用い、これらの混合物を、反応に不活性な溶媒中、又は無溶媒下、冷却下から加熱還流下、好ましくは0℃から80℃において、通常0.1時間〜10日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、THF、ジオキサン、DME等のエーテル類、DCM、DCE、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、DMF、DMSO、1−メチル−2−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル及びこれらの混合物が挙げられる。TEA、DIPEA若しくはNMM等の有機塩基、又はカリウムtert−ブトキシド、炭酸セシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウム等の無機塩基の存在下で反応を行うのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
光学異性体は、ラセミ体の一般的な光学分割法(例えば、光学活性な塩基又は酸とのジアステレオマー塩に導く分別結晶化や、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィー等)により得られ、また、適当な光学活性な原料化合物から製造することもできる。
ラットEP4受容体発現ベクターの構築:
ラットEP4受容体遺伝子(GenBank登録番号:NM_032076.1)を、発現ベクターpcDNA3.1−V5−His−TOPO(Invitrogen)に導入した。
ラットEP4受容体の一過性発現:
ラットEP4受容体の発現ベクターを、HEK−293細胞(ATCC番号:CRL−1573)に導入した。導入には、Lipofectoamine(登録商標)2000試薬(Invitrogen)を用いて、添付説明書に準じて行った。導入後α−MEM培地にて20−24時間培養した。
膜画分の調製:
培地を吸引除去し、15 cm dishあたり10 mLの冷却リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline(PBS))を加えてセルスクレーパー(Sumitomo Bakelite)を用いて細胞を掻きとった。細胞を回収し遠心(250 x g、4℃、5 min)した後、dishあたり6 mLの冷却20 mmol/L Tris−HCl(pH7.4;ナカライテスク、5 mmol/L エチレンジアミン四酢酸(EDTA、ナカライテスク)を含む)に懸濁し、ポリトロン(登録商標)を用いてホモジナイズし、そのホモジネートを遠心(69,000 x g、20 min、4℃)した。得られた沈殿を冷却20 mmol/L Tris−HClに再懸濁させ、再びホモジナイズし、そのホモジネートを遠心(69,000 x g、20 min、4℃)した。得られた沈殿をdishあたり1 mLの50 mmol/L HEPES −NaOH(Dojindo Laboratories)(pH7.5)に懸濁させたのちホモジナイズし、膜画分として−80℃凍結保存した。この時、一部をタンパク濃度の測定に用いた。タンパク濃度の測定はBio−Rad Protein assay kit(Bio−Rad Laboratories)を用い、添付の標準プロトコールに従ってデュプリケイト(duplicate)で行った。
Binding Assay:
[3H]PGE2、及び膜画分はアッセイバッファー(50 mmol/L HEPES−NaOH、10 mmol/L MgCl2、pH7.5)にて、被験化合物、及びunlabeled PGE2(Cayman)はDMSO及びアッセイバッファーにて希釈した。反応液(200 μL)の組成は、50 mmol/L HEPES−NaOH(pH7.5)、10 mmol/L MgCl2、0.3 nmol/L [3H]PGE2 (Perkin Elmer)50 μL、ラットEP4細胞膜画分(200 μg protein/mL)100 μL及び試験化合物(最終濃度0.1,0.3,1,3,10,30および100 nmol/L)50 μLとした。非特異的結合の測定には最終濃度が1 μmol/Lとなるようにunlabeled PGE2(Cayman)を添加した。DMSOの最終濃度は1%とした。反応液を96 wellマイクロプレート(Sumitomo Bakelite)で室温にて1時間インキュベートした。反応液はFilterMateハーベスター(Perkin Elmer)を用いて濾紙UniFilter−96 GF/B(Perkin Elmer)で濾過した。濾過後の濾紙は冷却アッセイバッファー300 μL/wellで3回洗浄した後、乾燥機にて一晩乾燥させ、液体シンチレーターMicroScint20(Perkin Elmer)50 μL/wellを加えた。放射活性はTopCount(Perkin Elmer)を用いて測定した。測定はすべてデュプリケイト(duplicate)で1回実施した。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を差し引いて求めた。Ki値は定法に従い算出した。
評価の結果、化合物AのラットEP4受容体に対するKi値は0.874 nmol/Lであった。なお、特許文献1の実施例205の化合物のラットEP4受容体に対するKi値は140 nmol/Lであった。
Binding Assay:
[3H]PGE2、及びヒトEP4細胞膜画分(Chemicon)はアッセイバッファー(50 mmol/L HEPES−NaOH、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2(pH7.4)、0.5% ウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin(BSA)))にて、被験化合物、及びunlabeled PGE2(Sigma)はDMSO及びアッセイバッファーにて希釈した。反応液(250 μL)の組成は、[3H]PGE2(最終濃度2.9 nmol/L)を含むアッセイバッファー175 μL、膜画分(Chemicon、40 μg protein/mL)50 μL、及び被験化合物(最終濃度0.1,1,10,100および1000 nmol/L)25 μLとした。非特異的結合の測定には最終濃度が10 μmol/Lとなるようにunlabeled PGE2を添加した。DMSOの最終濃度は1%とした。反応液を25℃で60分間インキュベートした。その反応液をセルハーベスター(ブランデル)を用いて濾紙GF/C(Whatman)で濾過した。濾過後の濾紙は50 mmol/L HEPES−NaOH(pH7.4)、500 mmol/L NaCl、0.1% BSAを含む溶液 1 mLで3回洗浄した。濾紙GF/Cをアッセイバイアルに入れ、液体シンチレーターAtomlightを5 mL加えた。放射活性は液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)を用いて測定した。測定はすべてデュプリケイト(duplicate)で1回実施した。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を差し引いて求めた。Ki値は定法に従い算出した。
評価の結果、化合物AのヒトEP4受容体に対するKi値は1.46 nmol/Lであった。
細胞培養:
Jurkat細胞(ヒト白血病Tリンパ腫由来)を、10% ウシ胎児血清(fetal bovine serum(FBS))添加のRPMI1640培地(品番11879020、Invitrogen)を用いて37℃、5% CO2の条件下で培養した。コンフルエント(Confluent)前まで増殖させた後、最終濃度5 μmol/Lのインドメタシンを添加しさらに18時間培養した。この細胞を15 mLスピッツ管に回収し、セルバンカー(三菱化学ヤトロン)にて1x106 個/mLに調製し、−80℃にて保存した。
化合物処理:
被験化合物は0.5% BSAを含むアッセイバッファー(1xHBSS(Hanks buffered salt solution、日水製薬)、20 mmol/L HEPES−NaOH(ナカライ)(pH 7.4)、0.5 mmol/L IBMX(3−イソブチル−1−メチルキサンチン、WAKO)、0.02% CHAPS(Sigma)、0.5% BSA(Sigma)、2 μmol/L インドメタシン(Sigma))にて最終濃度の3倍の濃度になるように希釈調整した。PGE2は0.5% BSAを含むアッセイバッファーにて300 nmol/Lに調整した。冷凍保存されたJurkat細胞は37℃にて解凍し0.5% BSAを含むアッセイバッファーを用い1x106個/mLに調製した。384ウェルU底型黒色マイクロプレート(コーニング)に試験化合物(最終濃度0.01,0.03,0.1,0.3,1,3および10 nmol/L)、細胞、PGE2の順で各5 μLずつ添加し、プレートシェイカーにて攪拌後、室温にて30分インキュベートした。PGE2非刺激状態のcAMP量を求めるため、PGE2非添加群を設けた。
cAMP量の測定および解析:
cAMP測定にはcAMP HiRangeキット(Cisbio international)を使用した。インキュベート後、Lysisバッファー(50 mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)、0.8 mol/L KF、1% TritonX−100、0.2% BSA)にて0.6倍に希釈したキットのd2試薬を各wellに5 μLずつ添加し、プレートシェイカーにて攪拌した。続いてLysisバッファーにて0.6倍に希釈したキットのユーロピウムクリプテート試薬を各wellに5 μLずつ添加し、プレートシェイカーにて攪拌後、遮光下室温にて60分インキュベートした。インキュベート後、ARVO1420(Perkin Elmer)を用いてクリプテートの蛍光強度を620 nm、d2の蛍光強度を665 nmにて測定した。標準曲線作成用に280、70、17.5、4.38、1.09、0.27、0.068 nmol/LのcAMPをそれぞれwellに入れ、上記と同様に蛍光強度を測定した。測定はすべてトリプリケイト(triplicate)にて行った。PGE2添加時のcAMP量を100%、PGE2非添加時のcAMP量を0%とし、化合物処理時のcAMP量から、化合物によるIC50値をLogistic回帰法により算出した。3回の実験結果から平均値を算出した。
評価の結果、ヒトJurkat細胞において、化合物AのPGE2(100nmol/L)によるcAMP産生作用に対するIC50値は0.16 nmol/Lであった。
ラットEP4受容体発現ベクターの構築:
試験例1と同様に行った。
ラットEP4受容体安定発現細胞の構築:
ラットEP4受容体の発現ベクターを、CHO−K1細胞(ATCC番号:CCL−61)に導入した。導入には、Lipofectoamine(登録商標)2000試薬(Invitrogen)を用いて、添付説明書に準じて行った。導入後G418(ナカライテスク)含有α−MEM培地(品番12571063、Invitrogen)にて培養し、薬剤耐性クローンを取得した。
細胞培養および化合物処理:
ラットEP4を安定的に発現させたCHO−K1細胞を96 well プレートに0.5x104 個/100μLで蒔き、終夜培養した。培地を2 μmol/L インドメタシン/ 0.5% BSA/ α−MEM培地に交換し、さらに60分後、1 mmol/L IBMX/ 2 μmol/L インドメタシン/ 0.5% BSA/ α−MEM培地に交換した。10分後、被験化合物(最終濃度0.1,0.3,1,3および10 nmol/L)を添加し、さらに10分後、最終濃度100 nmol/LになるようにPGE2を添加した(最終DMSO濃度0.1%)。PGE2添加によるcAMP産生量を算出するため、PGE2非添加群を設けた。細胞はCO2インキュベーター(37℃、5% CO2)内にて培養、反応させた。30分後に培地を除き、0.2% TritonX−PBS 100 μL/wellを添加し細胞を溶解した。試験はデュプリケイト(duplicate)にて2回実施した。
cAMP量の測定および解析:
細胞溶解液に含まれるcAMP量をcAMP HiRangeキットを用いて測定した。各wellの細胞溶解液を384well U底型黒色マイクロプレートに10 μLずつ分注し、d2試薬、ユーロピウムクリプテート試薬の順に各5 μLずつ添加後、遮光下室温にて60分インキュベートした。インキュベート後、ARVO1420を用いてクリプテートの蛍光強度を620 nm、d2の蛍光強度を665 nmにて測定した。標準曲線作成用に280、70、17.5、4.38、1.09、0.27及び0.068 nmol/LのcAMPをそれぞれwellに入れ、上記と同様に蛍光強度を測定した。最終濃度100 nmol/LのPGE2添加時のcAMP量を100%、PGE2非添加時のcAMP量を0%とし、被験化合物処理時のcAMP量から、被験化合物のIC50値をLogistic回帰法により算出した。2回の実験結果から平均値を算出した。
評価の結果、ラットEP4受容体発現CHO−K1細胞において、化合物AのPGE2(100 nmol/L)によるcAMP産生作用に対するIC50値は1.04 nmol/Lであった。
非絶食下SDラット(雄、6週齢)を試験に使用した。PEG400:20% Tween80:1 mol/L NaHCO3水溶液=1:4:5の混合液に溶解させた被験化合物を0.03 mg/kgで経口投与(po)した(5 mL/kg)。1時間後、生理食塩水に溶解したEP4アゴニストONO−4819の活性代謝物(ONO−AE1−437(CAS No. 256382−23−7))を0.01 mg/kgで背部に皮下投与(sc)した(5 mL/kg)。30分後にLipopolysaccharide(LPS、0.01 mg/kg)を尾静脈内投与し(2 mL/kg)、その60分後に麻酔下にてヘパリンを含むチューブに血液を約0.5mL採取した。遠心操作(1000 x g、10分、4℃)により血液サンプルから血漿を分離した。ELISAキット(DuoSet ELISA、R&D Systems)にて血漿中のラットTNF−α濃度を測定した。ONO−AE1−437非処置群(n=5)のTNF−αの濃度を阻害率100%、ONO−AE1−437処置群(n=5)のそれを阻害率0%として、EP4アゴニストによるTNF−α産生阻害作用に対する被験化合物群(n=5)の抑制率を算出した。
評価の結果、化合物A(0.03 mg/kg,po)はEP4アゴニストONO−AE1−437(0.01 mg/kg,sc)のTNF−α産生阻害作用を38%抑制した。
非絶食下SDラット(雄、7週齢)を試験に使用した。PEG400:20% Tween80:1mol/L NaHCO3水溶液=1:4:5の混合液に溶解させた被験化合物を0.3 mg/kgで経口投与した(5 mL/kg)。1時間後、生理食塩水に溶解したEP4アゴニストONO−4819 の活性代謝物(ONO−AE1−437)を0.01 mg/kgで背部に皮下投与した(5 mL/kg)。その10分後に無麻酔下で断頭しEDTA・2Na 3 mgを含むチューブに血液を約2 mL採取した。遠心操作(1000 x g、10分、4℃)により血液サンプルから血漿を分離した。血漿100 μLにアッセイバッファー(2 mol/L NaH2PO4 20.4 mL、1 mol/L Na2HPO4 9.3 mL、0.5 mol/L EDTA・2Na 15 mL、CHAPS 0.1gを混合し蒸留水で合わせて50 mLに希釈、pH5.55)10 μLおよび100 mmol/L 4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩 1 μLを添加した。半量を分取し37℃にて90分間インキュベートした。残りの半量は4℃に保存しブランク反応用とした。両サンプル中のAngiotensin I濃度をELISA法にて測定し、37℃インキュベーションサンプルの値からブランク反応の値を減算した濃度を血漿中レニン活性(plasma renin activity(PRA))とした。ONO−AE1−437非処置群(n=5)のPRAを阻害率100%、ONO−AE1−437処置群(n=4)のそれを阻害率0%として、被験化合物群(n=5)の阻害率を算出した。
評価の結果、化合物A(0.3 mg/kg,po)はEP4アゴニストONO−AE1−437(0.01 mg/kg,sc)によるPRA上昇を102%抑制した。
2型糖尿病db/dbマウス(雄、8週齢)を試験に使用した。24時間採尿により得られた尿サンプルのアルブミン濃度を抗マウスアルブミン抗体(RAM/Alb/7S、Nordic Immunology)を用いたELISA法にて、尿中クレアチニン濃度をCRE−ENカイノス(カイノス)を用いて測定した。尿中アルブミン−クレアチニン比(ACR)を算出し、ACRに偏りのないよう被験化合物非処置群(n=12)と被験化合物処置群(n=12)に群分けを行った。被験化合物処置群には0.5%メチルセルロース(MC)溶液に懸濁した被験化合物を0.3 mg/kgで1日1回1週間経口投与した(10 mL/kg)。被験化合物非処置群には0.5%MC溶液を10 mL/kgの投与容量で1日1回1週間経口投与した。最終投与終了後より24時間採尿を実施し、算出したACRを指標にして2型糖尿病マウスの早期腎症に対する被験化合物の改善効果を検討した。被験化合物非処置群のACR値を100%としたときの被験化合物処置群のACRの抑制率を求めた。
評価の結果、化合物A(0.3 mg/kg,po)は1週間の経口投与により2型糖尿病db/dbマウスのACRを44%抑制した。
Wistarラット(雄、8週齢)を試験に使用した。ペントバルビタール麻酔下で左腎の3分の2を切除し、その1週間後に右腎を全摘出した(5/6Nx)。5/6Nxの2週間後に、24時間採尿により得られた尿サンプルの尿タンパク濃度をBio−Rad Protein assay kitを用いて、尿中クレアチニン濃度をデタミナーL CRE(協和メデックス)を用いて測定した。尿中タンパク−クレアチニン比(UPCR)を算出し、UPCRに偏りがないように被験化合物非処置群(n=12)と被験化合物処置群(n=12)に群分けを行った。その後、被験化合物処置群には0.5%MC溶液に懸濁した被験化合物を0.2 mg/kgで1日1回6週間経口投与した(5 mL/kg)。被験化合物非処置群には0.5% MC溶液を5 mL/kgの投与容量で1日1回6週間経口投与した。最終投与終了後より24時間採尿を実施し、算出したUPCRを指標にして慢性腎不全ラットの腎機能に対する被験化合物の改善効果を検討した。被験化合物非処置群のUPCRを100%としたときの被験化合物処置群のUPCRの抑制率を求めた。
評価の結果、化合物A(0.2 mg/kg,po)は、6週間の経口投与により5/6腎臓摘出慢性腎不全ラットのUPCRを47%抑制した。
化合物Aのラット由来PGE2受容体の他のサブタイプ(EP1、EP2、EP3)に対する拮抗作用を評価した。EP1およびEP3については細胞内Ca2+量、EP2については細胞内cAMP量を指標に、被験化合物の作用を検討した。
ラットEP1、EP2またはEP3受容体発現ベクターの構築:
ラットEP1受容体遺伝子(GenBank登録番号:D88751.1)、ラットEP2受容体遺伝子(GenBank登録番号:NM_031088.1)、またはラットEP3受容体遺伝子(GenBank登録番号:NM_012704.1)を、発現ベクターpcDNA3.1−V5−His−TOPO(Invitrogen)にそれぞれ導入した。
ラットEP1、EP2またはEP3受容体安定発現細胞の構築:
ラットEP1、EP2またはEP3受容体の発現ベクターを、HEK−293細胞(ラットEP1またはEP3受容体安定発現用、ATCC番号:CRL−1573)またはCHO−K1細胞(ラットEP2受容体安定発現用、ATCC番号:CCL−61)に導入した。導入には、Lipofectoamine(登録商標)2000試薬(Invitrogen)を用いて、添付説明書に準じて行った。導入後G418(ナカライテスク)含有D−MEM培地(ラットEP1またはEP3受容体安定発現用)(品番11885084、Invitrogen)またはG418含有α−MEM培地(ラットEP2受容体安定発現用)にて細胞を培養し、薬剤耐性クローンを取得した。
EP2受容体安定発現細胞の培養および化合物処理:
ラットEP2を安定的に発現させたCHO−K1細胞を96 well プレートに1x104 個/100 μLで蒔き、10% FBS添加のα−MEM培地を用いて37℃、5% CO2の条件下で終夜培養した。培地を2 μmol/L インドメタシン/0.1% BSA/α−MEM培地に交換し、さらに60分後、1 mmol/L IBMX/ 2 μmol/L インドメタシン/0.1% BSA/α−MEM培地(品番12571063、Invitrogen)に交換した。10分後、被験化合物(最終濃度0.01,0.1,1および10 μmol/ L )を添加し、さらに10分後、最終濃度100 nmol/LになるようにPGE2を添加した(最終DMSO濃度0.1%)。PGE2添加によるcAMP産生量を算出するため、PGE2非添加群を設けた。細胞はCO2インキュベーター(37℃、5% CO2)内にて培養、反応させた。30分後に培地を除き、0.2% TritonX−PBS 100 μL/wellを添加し細胞を溶解した。試験はデュプリケイト(duplicate)にて1回実施した。
EP2受容体安定発現細胞内のcAMP量の測定および解析:
細胞溶解液に含まれるcAMP量を、cAMP HiRangeキットにて試験例4と同様に測定した。最終濃度100 nmol/LのPGE2添加時のcAMP量を100%、PGE2非添加時のcAMP量を0%とし、被験化合物処理時のcAMP量の割合を算出した。
評価の結果、化合物AはラットのEP2受容体を介したPGE2による細胞内cAMP量の増加に対して10,000 nmol/Lまで50%以上の阻害作用を示さなかった。
EP1およびEP3受容体安定発現細胞の培養および化合物処理:
ラットEP1またはラットEP3を安定的に発現させたHEK−293細胞を96 well プレートに1x104 個/100 μLで蒔き、10% FBS添加のD−MEM培地を用いて37℃、5% CO2の条件下で終夜培養した。アッセイバッファー(1xHBSS、20 mmol/L HEPES−NaOH(pH7.4)、0.6 mg/mL probenecid、0.1% BSA)にCa3アッセイキット(モレキュラーデバイス)の蛍光試薬Dyeを70:1の割合で加えた。培地をこの希釈したDye溶液に交換し、3時間インキュベートした。DMSOおよび上記アッセイバッファーに溶解した化合物(最終濃度1および10 μmol/L)をそこに加えた。5分後に最終濃度100 nmol/LになるようにPGE2を添加した(最終DMSO濃度1%)。ラットEP1またはラットEP3受容体安定発現細胞を用いた試験は、それぞれデュプリケイト(duplicate)にて1回実施した。
EP1またはEP3受容体安定発現細胞内Ca2+濃度の測定および解析:
細胞内Ca2+濃度はDyeの蛍光強度を指標としてFLIPR tetra(モレキュラーデバイス)を用いて測定した。PGE2添加による細胞内Ca2+濃度を測定するため、PGE2非添加群を設けた。最終濃度100 nmol/L PGE2添加時のCa2+濃度を100%、PGE2非添加時のCa2+濃度を0%とし、化合物処理時のCa2+濃度の割合を算出した。
評価の結果、化合物AはラットのEP1またはEP3受容体を介したPGE2による細胞内Ca2+濃度の上昇に対して10,000 nmol/Lまで50%以上の阻害作用を示さなかった。
SDラット(雄、7週齢)を使用した。PEG400:20% Tween80:1 mol/L NaHCO3水溶液=1:4:5の混合液に溶解した被験化合物を3 mg/kgで7日間経口投与した(n=5,5 mL/kg)。被験薬非処置群(n=5)には上述の混合液を5 mL/kgの投与容量で7日間経口投与した。最終投与の翌日に終夜絶食下で血液学・血液化学的検査用に採血した。採血後に、放血により安楽死させた動物を直ちに剖検し、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肝臓を摘出した。摘出臓器は10%中性緩衝ホルマリン液に固定し、病理組織評価に使用した。
評価の結果、化合物Aは異常を示す所見は認められなかった。
したがって、化合物A又はその塩は、慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防若しくは治療等に使用できる。
また、化合物A又はその塩は、種々の浮腫(例えば、心臓性浮腫、脳浮腫等)、悪性高血圧症などのような高血圧症、月経前緊張症、尿路結石、急性又は慢性疾患によって引き起こされるような尿乏症、高リン血症等の治療及び/又は予防する薬剤として使用できる。
さらに、化合物A又はその塩は、種々の多尿症(例えば、中枢性尿崩症、腎性尿崩症、心因性尿崩症、糖尿病、塩化ナトリウム吸収障害、多飲症等)の治療及び/又は予防する薬剤として使用できる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
なお、DSC分析及び粉末X線回折は以下の方法により行った。
DSC分析は、TA Instruments製 Q1000およびQ2000を用いて行った。試料およそ2mgを専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、サンプルパンに蓋をしない状態で、窒素雰囲気下(50mL/分)において、測定範囲を室温〜300℃とし、昇温速度10℃/分で試料とリファレンス(空のアルミニウム製サンプルパン)との間に発生する熱量変化を連続的に測定し記録した。なお、データ処理を含む装置の取り扱いは、各装置で指示された方法及び手順に従った。
(2)粉末X線回折
粉末X線回折の測定は、RINT−TTRIIを用い、管球:Cu、管電流:300 mA、管電圧:50 kV、サンプリング幅:0.020°、走査速度:4°/min、波長:1.54056Å、測定回折角範囲(2θ):2.5〜40°の条件で測定した。なお、データ処理を含む装置の取り扱いは、各装置で指示された方法及び手順に従った。
なお便宜上、濃度mol/LをMとして表す。例えば、1M水酸化ナトリウム水溶液は1mol/Lの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。
4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸 (I)の合成
4−[(1S)−1−{[(4−ブロモ−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)カルボニル]アミノ}エチル]安息香酸メチル (5a)の合成
4−ブロモ−3−メチル−1H−ピラゾール−5−カルボン酸(3) (1.00 g)、DMF (20 mL)、4−[(1S)−1−アミノエチル]安息香酸メチル 塩酸塩 (1.26 g)、HOBt (0.99 g)の混合物に、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド (1.2 mL)を加え、室温下終夜撹拌した。混合物に酢酸エチルを加え、氷冷下撹拌した。混合物に10%クエン酸水溶液を加え、有機層及び水層に分離し、水層を酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層を合わせて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、4−[(1S)−1−{[(4−ブロモ−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)カルボニル]アミノ}エチル]安息香酸メチル(5a) (1.75 g)を得た。
ESI+: 366, 368
4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メチル (2a)の合成
4−[(1S)−1−{[(4−ブロモ−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)カルボニル]アミノ}エチル]安息香酸メチル(5a) (1.72 g)、DMF (20.0 mL)の混合物を氷冷下撹拌した。混合物にカリウムtert−ブトキシド (580 mg)を加え、0.5時間撹拌した。混合物に3−(ブロモメチル)イソキノリン (1.10 g)とDMF (14 mL)の混合物を加え、室温に昇温して10日間撹拌した。得られた混合物を氷冷下撹拌し、酢酸エチル、10%クエン酸水溶液を加え、しばらく撹拌し、酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ノルマルヘキサン:酢酸エチル=6:4)にて精製し、4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メチル (2a) (518 mg)を得た。
NMR−DMSO−d6: 9.28 (1H, d, J = 7.8 Hz), 9.23 (1H, s), 8.13 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.89 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.81−7.76 (1H, m), 7.72−7.64 (3H, m), 7.50 (1H, s), 7.38 (2H, d, J = 8.3 Hz), 5.65−5.54 (2H, m), 5.12−5.04 (1H, m), 3.83 (3H, s), 2.17 (3H, s), 1.37 (3H, d, J = 7.0 Hz)
4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸 (I)の合成
4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メチル(2a) (486 mg)、THF (10.0 mL)、メタノール (10.0 mL)の混合物に、氷冷下2M水酸化ナトリウム水溶液 (5.0 mL)を加え、室温下17時間攪拌した。混合物に氷冷下1M塩酸 (10.0 mL)を加え、室温に昇温し、2時間攪拌した。析出した固体を濾取し、水で洗浄して4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸(I) (411 mg)を結晶として得た。
ESI+: 493, 495
NMR−DMSO−d6: 12.9−12.7 (1H, m), 9.30 (1H, d, J = 7.8 Hz), 9.24 (1H, s), 8.13 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.91 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.81−7.76 (1H, m), 7.74−7.66 (3H, m), 7.53 (1H, s), 7.40 (2H, d, J = 8.2 Hz), 5.60 (2H, s), 5.14−5.03 (1H, m), 2.16 (3H, s), 1.37 (3H, d, J = 7.0 Hz)
元素分析:calcd for C24H21BrN4O3 :C,58.43; H,4.29; N,11.36; Br,16.20.
Found:C,58.33; H,4.38; N,11.24; Br,16.07.
実施例1の工程3で得られた結晶のDSC分析の結果、吸熱ピークのオンセット温度は253℃であった。
4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メタンスルホン酸塩 (Ia)の合成
4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸(I) (1000.0 mg)、ジオキサン (30 mL)の混合物に、氷冷下メタンスルホン酸 (140 μL)を加えた。得られた混合物を90℃に昇温し、1時間撹拌した。室温まで放冷後、析出した固体を濾取し、4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メタンスルホン酸塩 (Ia)を結晶 (1030 mg)として得た。
ESI+: 493、 495
NMR−DMSO−d6: 9.32 (1H, s), 9.27 (1H, d,J = 7.7 Hz), 8.17 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.95 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.90−7.79 (1H, m), 7.77−7.66 (3H, m), 7.59 (1H, s), 7.40 (2H, d, J = 7.8 Hz), 5.71−5.54 (2H, m), 5.16−5.00 (1H, m), 2.33 (3H, s), 2.17 (3H, s), 1.37 (3H, d, J = 7.1 Hz)
元素分析:calcd for C24H21BrN4O3.CH4O3S :C,50.94; H,4.27; N,9.50; S,5.44; Br,13.56.
Found :C,50.65; H,4.25; N,9.36; S,5.41; Br,13.42.
実施例2で得られた結晶のDSC分析の結果、吸熱ピークのオンセット温度は192℃であった。
Claims (8)
- 4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸又はその塩。
- 4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メタンスルホン酸塩である、請求項1に記載の化合物。
- 4−[(1S)−1−({[4−ブロモ−1−(イソキノリン−3−イルメチル)−3−メチル−1H−ピラゾール−5−イル]カルボニル}アミノ)エチル]安息香酸メタンスルホン酸塩の結晶である、請求項2に記載の化合物。
- DSC分析における吸熱ピークのオンセット温度が192℃であり、管球としてCuを用いた粉末X線回折において、2θ(°)=4.7、9.5、12.0、13.2、13.7、15.3、18.8、20.3、20.9、及び22.8にピークを有する結晶である、請求項3に記載の化合物。
- 請求項1に記載の化合物又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
- 慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用である請求項5に記載の化合物又はその塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
- 慢性腎不全及び/又は糖尿病性腎症の予防又は治療用医薬組成物の製造のための請求項1に記載の化合物又はその塩の使用。
- 請求項3に記載の結晶、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
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