JP6406759B6 - ナノカプセル、組成物、ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体 - Google Patents

Description

本発明は、ナノカプセル、組成物、ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体に関する。

薬物輸送システム（ＤＤＳ）として、ポリ乳酸及びキトサン等の生体親和性の高分子材料が用いられている。高分子材料は、工業的な大量生産が可能であり、ＤＤＳの材料として期待されているが、内包する薬物の送達部位における薬効及び送達部位の特異性を向上させることは難しい。一方、遺伝子を送達する方法として、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを用いる方法が検討されているが、染色体異常、遺伝子の発現効率の低さ等の問題が指摘されている。

新たなＤＤＳの材料として、タンパク質をベースにしたナノカプセルが検討されている。例えば、特許文献１には、表面に外来ペプチドを挿入したパホバウイルスのカプシドタンパク質が開示されている。外来ペプチドをカプシドタンパク質に導入することで、当該ウイルスカプシドタンパク質で形成されるウイルス様粒子の細胞指向性を制御できるので、送達部位の特異性を向上させることができる。

非特許文献１には、所定の細胞に特異的に送達されるように改変された古細菌メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）で形成された構造体が開示されている。ＨＳＰの表面には、ターゲッティングペプチド又は抗体が組み込まれている。ターゲッティングペプチド又は抗体と所定の細胞に発現している標的分子との結合を介して、ＨＳＰで形成された構造体は所定の細胞に特異的に送達される。

国際公開第２００６／０８８２２９号

Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｌ． Ｆｌｅｎｎｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｇｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，１６１−１７０，２００６

しかし、上記特許文献１に記載のウイルス様粒子及び上記非特許文献１に記載のＨＳＰで形成された構造体では、送達部位の特異性に関しては改良されているが、送達部位において内包する薬物の薬効が十分に発揮されているとは言い難い。

本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができるナノカプセル、組成物、ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係るナノカプセルは、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、
該タンパク質の自己組織化によって形成された構造体である。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、前記アミノ酸配列のＮ末端から３２残基又は３３残基までのアミノ酸配列から構成される疎水性ヘリックス領域が１個以上付加されたアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列に、ユビキチン化されうる部位を構成するアミノ酸配列が前記構造体において外部に提示される位置にさらに付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＣ末端に、ｉＲＧＤペプチドに対応するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列、及び
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列に、１０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられたアミノ酸配列

また、前記ユビキチン化されうる部位を構成するアミノ酸配列は、
低酸素誘導因子−１のアミノ酸配列に含まれる配列番号８に示すアミノ酸配列である、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る組成物は、
上記本発明の第１の観点に係るナノカプセルと、
前記ナノカプセルに内包される薬物と、
を含む。

この場合、前記薬物は、
造影剤である、
こととしてもよい。

また、前記薬物は、
抗がん剤である、
こととしてもよい。

本発明の第３の観点に係るポリヌクレオチドは、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、
該アミノ酸配列からなるタンパク質は、自己組織化によって構造体を形成する。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、前記アミノ酸配列のＮ末端から３２残基又は３３残基までのアミノ酸配列から構成される疎水性ヘリックス領域が１個以上付加されたアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列に、ユビキチン化されうる部位を構成するアミノ酸配列が前記構造体において外部に提示される位置にさらに付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＣ末端に、ｉＲＧＤペプチドに対応するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列、及び
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列に、１０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられたアミノ酸配列

本発明の第４の観点に係る組換えベクターは、
上記本発明の第３の観点に係るポリヌクレオチドを含む。

本発明の第５の観点に係る形質転換体は、
上記本発明の第４の観点に係る組換えベクターを含む。

本発明によれば、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができる。

動的光散乱法で測定したナノカプセルの粒径を示す図である。 ナノカプセルに内包された蛍光標識したｓｉＲＮＡの蛍光強度を示す図である。 ナノカプセル内に固定化されたガドリウム（Ｇｄ）の割合を示す図である。 核磁気共鳴画像装置で撮像したナノカプセルに内包された造影剤のＴ１強調画像を示す図である。 ナノカプセルに内包された造影剤の投与前及び投与後における担癌マウスの癌部付近のＴ１強調画像を示す図である。 細胞内でのナノカプセルのユビキチン化を示す図である。 ナノカプセルの細胞内での分解を示す図である。 ナノカプセルを作用させた細胞の生存率を示す図である。

本発明の実施の形態について詳細に説明する。

（実施の形態１）
まず、本発明の実施の形態１について説明する。本実施の形態に係るナノカプセルは、古細菌メタノコッカス・ジャナシに由来するスモール熱ショックタンパク質Ｈｓｐ１６．５（以下、単に「ＨＳＰ」とする）を改変したタンパク質で形成される。ＨＳＰは、種を超えて普遍的に存在するタンパク質である。野生型のＨＳＰのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＨＳＰは、自己組織化による構造形成が可能であり、通常は、オリゴマー構造で存在する。熱ストレス等の環境変化に応じてＨＳＰのオリゴマー構造が解離し、分子シャペロン機能を発現する。

ＨＳＰは、２４量体からなるナノサイズの球状構造体であるナノカプセルを形成する。ナノカプセルは、熱的及び化学的に極めて安定である。ナノカプセルの内部には空洞がある。内部の空洞は、中空であってもよく、水、脂質、イオン等を含んでもよい。内部の空洞には、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から始まる疎水性ヘリックス領域（以下、単に「Ｎヘリックス領域」とする）が配向する。当該Ｎヘリックス領域は、Ｎ末端から３２番目又は３３番目までのアミノ酸配列に対応し、ナノカプセルの形成と安定化に寄与する。

本実施の形態に係るナノカプセルは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に、Ｎヘリックス領域を改変するアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列）が付加されたアミノ酸配列からなる改変型のＨＳＰを含む。

Ｎヘリックス領域を改変するアミノ酸配列は、例えば複数個のアミノ酸からなるリンカー配列である。ここで、アミノ酸配列が付加されるとは、１個又は複数個のアミノ酸に対応するアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列の任意の部位に挿入されることを含む。リンカー配列は、Ｎヘリックス領域の終端付近に挿入されることで配列番号１に示されるアミノ酸配列に付加されてもよい。特に、リンカー配列は、Ｎヘリックス領域の終端、すなわちＮ末端から３３番目のスレオニンと３４番目のグリシンとの間に付加されるのが好ましい。リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は、リンカー配列を付加した改変型のＨＳＰが自己組織化による構造形成が可能な範囲であれば特に限定されない。リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は、例えば、１個以上５０個以下、好ましくは５個以上４０個以下、より好ましくは１１個以上３０個以下である。

リンカー配列は、例えば１１個のアミノ酸から構成され、リンカー配列が付加された改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列である。また、改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、２０個のアミノ酸から構成されるリンカー配列を付加した配列番号３に示すアミノ酸配列であってもよい。この他、３０個のアミノ酸から構成されるリンカー配列を付加してもよい。この場合の改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、例えば配列番号４に示すアミノ酸配列である。

配列番号２乃至４に示すアミノ酸配列からなる改変型のＨＳＰは、自己組織化による構造形成が可能であり、２４量体となってナノカプセルを形成する。リンカー配列は、ナノカプセル形成時に内部の空洞に配向するＮヘリックス領域の内側に付加されることで、Ｎヘリックス領域の柔軟性を向上させる。Ｎヘリックス領域は、カプセルの形成に寄与する領域であるため、柔軟性の向上によりナノカプセルの粒径が増大する。

当該ナノカプセルは、内部の空洞に種々の薬物を内包できる。薬物は、例えば、抗がん剤、免疫抑制剤及び抗炎症剤等の治療薬、蛍光物質、放射性物質及び磁性物質等の標識物質、造影剤等の診断薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等の核酸、インスリン等のペプチド、アミノ酸、ビタミン類等である。なお、ここでいう内包とは、ナノカプセルの内部に薬物分子の全体が完全に包み込まれている必要はなく、薬物分子の一部がナノカプセルの外部に突出していてもよい。

野生型のＨＳＰで形成されるナノカプセルの粒径は、約１２ｎｍである。これに対し、本実施の形態に係る改変型のＨＳＰで形成されるナノカプセルの粒径は、配列番号２に示すアミノ酸配列の場合は１４〜１５ｎｍである。配列番号３に示すアミノ酸配列の場合、ナノカプセルの粒径は２２〜２３ｎｍである。また、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合、ナノカプセルの粒径は３２〜３３ｎｍである。

次に、本実施の形態に係るナノカプセルの製造方法について説明する。改変型のＨＳＰで形成されるナノカプセルは、遺伝子工学及び分子生物学を利用した公知の方法により製造できる。

まず、配列番号２乃至４に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する。塩基配列は、アミノ酸に対応するコドンによって決定される。アミノ酸とコドンとの対応関係に基づいて、１つのアミノ酸配列から、そのアミノ酸配列をコードする多数の塩基配列が決定される。塩基配列の決定ではコンピュータを用いてもよい。当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させる際に用いる宿主に応じてコドン頻度を考慮すれば、配列番号２乃至４に示すアミノ酸配列をコードする好適な塩基配列を決定することができる。

次に、配列番号２乃至４に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを調製する。組換えベクターは、配列番号１に示す野生型のＨＳＰ又は所定の変異の入ったＨＳＰをコードするベクターをテンプレートとして、インバースＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等により調製できる。ＰＣＲ反応では、下記実施例のように、目的とするアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが得られるプライマーを用いればよい。

組換えベクターを宿主に導入することによって、配列番号２乃至４に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主において発現させることができる。宿主は、特に限定はされないが、原核細胞であることが好ましい。具体的には、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等が挙げられるが上述のポリヌクレオチドを効率的に発現させることを勘案すれば、大腸菌であることが好ましい。

宿主として用いる大腸菌は、公知のものを採用すればよく、特に限定はされない。組換えベクターは、ＩＰＴＧ、ラムノース等の存在下において、上述のポリヌクレオチドの発現を誘導することができるのが好ましい。組換えベクターは、例えば、ｐＥＴベクター及びｐＧＥＸベクター等である。

続いて、上記で調製した組換えベクターを宿主に導入した形質転換体を調製する。組換えベクターを宿主に導入する方法は特には限定されず、塩化カルシウム法及び塩化ルビジウム法で調製したコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポーレーション法、ならびにプロトプラスト法等がある。

なお、上述の組換えベクターがｐＥＴ２１の場合、大腸菌株ＸＬ１０又はＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換体として用いるのが好ましい。形質転換体のコロニーを、ダイレクトＰＣＲにより、又はそのＤＮＡの塩基配列を決定して確認することで目的とする形質転換体を得ることができる。

次に、上記で調製した形質転換体を培養する。形質転換体の培養方法は、形質転換体に適合した公知の培養方法を採用すればよい。形質転換体として大腸菌を用いる場合、例えば、２×ＹＴ培地等において、３７℃で振とう培養すればよい。

続いて、得られた形質転換体から改変型のＨＳＰを回収する。回収の方法は特に限定されず、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ４０等の公知の界面活性剤を用いる方法、超音波処理によって破砕する方法、液体窒素等の冷媒及び特定の機器を用いて細胞膜、細胞壁等を破砕する凍結融解法、ガラスビーズ法、ザイモリエース等のような細胞壁を消化する酵素を用いたスフェロプラスト法、高圧化にて処理を行うフレンチプレス法等の公知の方法を採用した後に、遠心分離処理で得られる液相分画を回収すればよい。なお、これらの回収の方法は、単独であっても、２種類以上を組み合わせてもよい。

回収した液相分画から改変型のＨＳＰを精製する方法は、特に限定されることはなく、公知のタンパク質の精製法を用いればよい。タンパク質の精製法は、例えば、塩化セシウム、スクロース、グリセロール、ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｐｅｒｃｏｌ等の成分を各種濃度又は線形グラジエント濃度勾配にて含有する緩衝液に上述の液相分画を加え、超遠心分離処理を行う密度勾配遠心分離法、上述の液相分画に熱処理を与えて、夾雑タンパク質等を変性させて改変型のＨＳＰ以外の成分を除去する方法等である。また、タンパク質の精製法は、上述の液相分画に硫酸アンモニウム、エタノール酢酸、アセトン等を作用させて、夾雑タンパク質等を変性させることにより、改変型のＨＳＰ以外の成分を除去する方法、上述の液相分画に対して硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールを加えて沈殿させることで、改変型のＨＳＰ以外の成分を除去する方法がある。また、上述の液相分画に対してクロマトグラフィー用いて、改変型のＨＳＰ以外の成分を除去することで改変型のＨＳＰを精製してもよい。これら精製方法は、単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

上記のクロマトグラフィーの種類は、特に限定されないが、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等である。これらクロマトグラフィーは単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

上述のように、改変型のＨＳＰは、自己組織化によるナノカプセルを形成する。ナノカプセルを形成するのは、宿主内、試験管内、培養容器内等の当該改変型のＨＳＰの合成の際か、ＨＳＰの合成の終了後における精製、回収、保存等のときであり、特に限定はされない。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るナノカプセルは、ＨＳＰのＮヘリックス領域にリンカー配列を付加したアミノ酸配列からなる改変型のＨＳＰで形成される。リンカー配列は、ナノカプセル形成時に内部の空洞に配向するＮヘリックス領域の柔軟性を高めるため、ナノカプセルの粒径が増大する。これにより、当該ナノカプセルが内包できる薬物の量を増加させることができるため、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができる。

また、ナノカプセルの粒径が増大することで、分子量の比較的大きい核酸医薬等を効率よく、ナノカプセルに内包させることができる。

なお、上記のようなリンカー配列を付加したアミノ酸配列に、１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられてもよい。置換、欠失及び付加されるアミノ酸の数は、改変型のＨＳＰが、自己組織化による構造形成が可能な範囲とすればよく、特には限定されないが、通常は２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下であり、最も好ましくは３個以下である。例えば、このような改変として、配列番号２乃至４にアミノ酸配列を示す改変型のＨＳＰのように、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から４１番目のグリシン残基をシステイン残基に置換してもよい。こうすることで、マレイミド化した薬物とシステイン残基とを結合させることができるので、ナノカプセル内部に薬物を固定できる。これにより、送達部位に薬物をより確実に送達することができる。

なお、リンカー配列は、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列の終端に限らず、終端からＮ末端側に１〜数残基の位置に付加されてもよい。

また、改変型のＨＳＰには、各種タグポリペプチドが付加されてもよい。具体的なタグポリペプチドとして、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、Ｚタグ、ストレプタグ等が挙げられる。これらのタグポリペプチドは、単独で付加されていても、２種以上を組み合わせて付加されていてもよい。改変型のＨＳＰにタグポリペプチドが付加された場合、当該タグポリペプチドとの相互作用に基づいたアフィニティクロマトグラフィーによって改変型のＨＳＰを精製することが好ましい。

本実施の形態で用いる様々な技術は、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ等の文献を参照すればよい。

（実施の形態２）
本発明の実施の形態２について説明する。

本実施の形態に係るナノカプセルでは、付加される第１のアミノ酸配列が上記実施の形態１と異なる。以下では、本実施の形態に係るナノカプセルについて上記実施の形態１と異なる点を中心に説明する。

本実施の形態におけるＮヘリックス領域を改変するアミノ酸配列は、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を少なくとも１つ含むアミノ酸配列である。Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列１つを含むアミノ酸配列を付加することで、改変型のＨＳＰは、本来有しているＮヘリックス領域と合わせて２箇所のＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を有することになる。当該改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、例えば配列番号５に示すアミノ酸配列である。

Ｎヘリックス領域を改変するアミノ酸配列は、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を複数含むアミノ酸配列であってもよい。Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列の数は、改変型のＨＳＰが、自己組織化による構造形成が可能な範囲とすればよい。Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列の数は、例えば２つ以上１０つ以下で、好ましくは２つ以上５つ以下、より好ましくは２つ以上３つ以下である。配列番号６に示すアミノ酸配列は、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を２つ含むアミノ酸配列を付加した改変型のＨＳＰのアミノ酸配列を示す。すなわち、配列番号６に示す改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、３箇所のＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を有する。

より好ましくは、配列番号７に示すように、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を３つ含むアミノ酸配列を付加してもよい。この場合、配列番号７に示す改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、４箇所のＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を有する。

なお、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を少なくとも１つ含むアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から３３番目のスレオニンと３４番目のグリシンとの間に挿入されることによって付加されてもよいし、当該Ｎ末端に付加されてもよい。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るナノカプセルは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を少なくとも１つ含むアミノ酸配列が付加された改変型のＨＳＰで形成される。付加されたＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列はナノカプセル形成時に内部の空洞の疎水性を高め、複数のＮヘリックス領域の相互作用によってナノカプセルの構造的な剛直さと安定性とが向上する。これにより、当該ナノカプセルは内包する薬物をより安定に保持し、より確実に送達部位に送達することができる。このため、当該ナノカプセルによれば、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができる。

また、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を付加することで、ナノカプセルの粒径が増大する。このため、分子量の比較的大きい核酸医薬等を効率よく、ナノカプセルに内包させることができる。

また、上記のようなＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列に、１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられてもよい。なお、配列番号５乃至７に示したアミノ酸配列は、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を付加したのに加えて、ｉＲＧＤ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ ＲＧＤ）ペプチドに対応するアミノ酸配列がＣ末端に付加されている。ナノカプセルを形成した際に、ＨＳＰのＣ末端側は、ナノカプセルの外殻を構成する。このため、ＨＳＰのＣ末端にアミノ酸配列を付加することで、所定の分子と相互作用するペプチド及び抗体等をナノカプセルの表面に付加することができる。これにより、ナノカプセルの種々の機能をもたせることができる。ｉＲＧＤペプチドは、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ＮＲＰ−１）受容体に親和性が高いため、Ｃ末端にｉＲＧＤペプチドに対応するアミノ酸配列を付加することで、ナノカプセルの外殻にｉＲＧＤペプチドを呈示させることができる。これにより、腫瘍内の細胞等、ＮＲＰ−１を発現している細胞にナノカプセルをさらに効率よく送達することができる。

（実施の形態３）
本発明の実施の形態３について説明する。

本実施の形態に係るナノカプセルでは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に付加されるアミノ酸配列が上記各実施の形態と異なる。以下では、本実施の形態に係るナノカプセルについて上記実施の形態１と異なる点を中心に説明する。

本実施の形態に係るナノカプセルは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に、ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列（第２のアミノ酸配列）が付加されたアミノ酸配列からなる改変型のＨＳＰを含む。

一般に、タンパク質は、ユビキチン化されて、細胞内に普遍的に存在するユビキチン−プロテアソーム系で分解される。タンパク質のユビキチン化されうる部位がユビキチン転移酵素に認識され、タンパク質のリシン残基の側鎖のアミノ基とユビキチンのＣ末端のグリシンがアミド結合することでユビキチンがタンパク質に結合する。さらにタンパク質に結合したユビキチンのリシン残基の側鎖に次のユビキチンが結合し、複数のユビキチンが結合していく（ポリユビキチン化）。ポリユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームによって分解される。

ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列は、例えば、低酸素誘導因子−１（「Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒ−１」又は「ＨＩＦ−１」ともいう）のアミノ酸配列に含まれる配列番号８に示すアミノ酸配列である。低酸素誘導因子−１は、ユビキチン−プロテアソーム系による分解によって機能が負に制御されている。ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列は、改変型のＨＳＰがナノカプセルを形成した際、外部に提示されうる位置に付加すればよいが、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端に付加される。この場合、ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列は、複数個のアミノ酸を介してＣ末端に付加されてもよいし、ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列のＣ末端にさらに複数個のアミノ酸が付加されてもよい。配列番号８に示すアミノ酸配列を付加した改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列である。

Ｃ末端に第２のアミノ酸配列を付加することで、改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルは、ユビキチン化されうる部位を外部に提示するため、ユビキチン転移酵素に認識さる。これにより、細胞内でのナノカプセルのプロテアソームによる分解が促進される。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るナノカプセルは、送達部位での分解がより促進される。このため、内包する薬物を効率よく放出することができる。こうすることで、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができる。

なお、本実施の形態では、ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列を、低酸素誘導因子−１由来のアミノ酸配列としたがこれに限らない。例えば、ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列は、分解促進シグナルとして知られているＰＥＳＴ配列（配列番号１０）等でもよい。配列番号１０に示すアミノ酸配列を付加した改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、例えば、配列番号１１に示すアミノ酸配列である。

なお、上記ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列に、１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられてもよい。また、第２のアミノ酸配列に、リンカー配列等その他のアミノ酸配列が含まれるようにしてもよい。

なお、本実施の形態に係る改変型のＨＳＰは、上記実施の形態１のリンカー配列及び実施の形態２のＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列の少なくとも一方がさらに付加されてもよい。

（実施の形態４）
本発明の実施の形態４について説明する。本実施の形態に係る組成物は、上記各実施の形態に記載されたナノカプセルと、ナノカプセルに内包される薬物とを含む。ナノカプセルに内包される薬物は、例えば造影剤である。造影剤は、例えば、Ｇｄイオンとジエチレントリアミン５酢酸（以下、単に「ＤＴＰＡ」とする）とを錯化させたＧｄ−ＤＴＰＡ及び酸化鉄等である。

ナノカプセルに内包される薬物は、抗がん剤であってもよい。抗がん剤は、特に限定されないが、ゲムシタビン、ドキソルビシン等である。

ナノカプセル内部の空洞に薬物を内包させるには、ナノカプセルと薬物とを混在させ、所定の温度、例えば３５〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃で１〜２時間程度加熱しながら撹拌し、放冷させればよい。ナノカプセルに内包されなかった薬物は、放冷後、限外濾過等により除去するのが好ましい。

また、ナノカプセルに内包させる薬物としてＧｄ−ＤＴＰＡを用いる場合、マレイミド化したＤＴＰＡとＧｄイオンとを錯化させて得られたマレイミド化Ｇｄ−ＤＴＰＡをナノカプセル内部の空洞のシステイン残基に固定化するようにしてもよい。ＤＴＰＡに限らず、抗がん剤等をマレイミド化することで、抗がん剤等をナノカプセル内部の空洞に同様に固定化できる。

この他、ナノカプセル内部の空洞に薬物を内包させる方法には、界面活性剤やその他の方法でナノカプセルの構造を破壊し、内包させる薬物と混和した後に、再度、ナノカプセルを形成させて薬物を内包させる方法がある。

本実施の形態に係る組成物は、有効成分として約０．１％〜９９％、約１％〜約５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）のナノカプセルを含む。

本実施の形態に係る組成物は、医薬用途においては、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤及び口腔内吸収剤等として用いることができる。当該組成物は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤材料として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。

本実施の形態に係る組成物は、下記実施例４、５及び９に示すように、造影剤又は抗がん剤に使用されるのが好適である。また、当該組成物は、蛍光物質を内包させて、スクリーニング用試薬、診断薬等としても使用できる。

本実施の形態に係る組成物の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。当該組成物は、内包する薬物が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な薬物の量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量、あるいは、診断に必要な量である。当該組成物の投与量は、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。当該組成物を分割して投与する場合、当該組成物は、好ましくは１日に１〜４回投与される。また、当該組成物は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る製剤によれば、上記実施の形態１乃至３に記載されたナノカプセルに薬剤が内包されているので、薬剤がより確実に送達部位に送達される。また、送達部位での当該カプセルの分解をより促進させ、薬物を効率よく放出させることもできる。こうすることで、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができる。

（実施の形態５）
本発明の実施の形態５について説明する。本実施の形態に係るポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に、Ｎヘリックス領域を改変するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号２乃至７のいずれか１つの改変型のＨＳＰのアミノ酸配列をコードする。

また、本実施の形態に係るポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に、ユビキチン化されうる部位に対応するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号９又は１１の改変型のＨＳＰのアミノ酸配列をコードする。

当該塩基配列は、コードするアミノ酸配列を基にコンピュータを利用して決定することができる。ポリヌクレオチドは、決定した塩基配列に基づいて、ＨＳＰを組み込んだ公知のベクターを利用したＰＣＲ等の方法で合成できる。配列番号２乃至７、９、１１の改変型のＨＳＰのアミノ酸配列それぞれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、配列番号１２乃至１７、１８、１９に示す塩基配列である。

また、本実施の形態に係る組換えベクターは、上述したポリヌクレオチドを含む。組換えベクターとは生物宿主に導入することによって、特定の遺伝子を発現するものである。本実施の形態に係る組換えベクターは、上記ポリヌクレオチドを発現する。目的のポリヌクレオチドの塩基配列は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼ等を用いて各種ベクターに導入することができる。

また、本実施の形態に係る形質転換体は、上述した組換えベクターを含む。当該形質転換体は、上述した組換えベクターによって生物宿主が形質転換されたものである。形質転換する方法は特には限定されず、上記のように公知の塩化カルシウム法等が挙げられる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るポリヌクレオチド、組換えベクター又は形質転換体は、上記実施の形態１乃至４に記載されたナノカプセルを形成する改変型のＨＳＰを安定して供給できるため、当該ナノカプゼルの製造に好適である。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

（実施例１：リンカー配列を付加したＨＳＰの遺伝子クローニング、発現及び精製）
１１残基、２０残基又は３０残基のアミノ酸からなるリンカー配列を付加した改変型のＨＳＰを発現するクローンを作製した。
配列番号１に示す野生型のＨＳＰのＮ末端から４１残基目のグリシンをシステインに置換したＨＳＰ−Ｇ４１Ｃをコードするベクター（ｐＥＴ２１−ＨＳＰ１６．５−Ｇ４１Ｃ；Ｓａｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１７，８５−９３，２００９）をテンプレートとして、インバースＰＣＲを行った。インバースＰＣＲは、配列番号２０に示すフォワードプライマー及び配列番号２１に示すリバースプライマーを用いて、標準的なプロトコールで行った。ＰＣＲ反応では、ＤＮＡポリメラーゼとして、極めて正確性の高いＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼを使用した。反応終了後、テンプレートとして使用したｐＥＴ２１−ＨＳＰ１６．５−Ｇ４１ＣをＤｐｎＩで分解した後、反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、約６０００ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから回収した。ＤＮＡリガーゼを用いて、回収したＰＣＲ産物をセルフライゲーションし、大腸菌株ＸＬ１０に形質転換後、ＬＢアガープレートに播種した。プレートを３７℃で一晩培養した後、ダイレクトＰＣＲ及びＤＮＡ配列を決定することでコロニーをチェックし、１１残基のアミノ酸からなるリンカー配列が付加された改変型のＨＳＰを発現するクローン（ｐＥＴ２１−Ｌ１１−Ｇ４１Ｃ）を得た。

ｐＥＴ２１−Ｌ１１−Ｇ４１Ｃと同様に、２０残基のアミノ酸からなるリンカー配列が付加された改変型のＨＳＰを発現するクローン（ｐＥＴ２１−Ｌ２０−Ｇ４１Ｃ）を得た。インバースＰＣＲでは、配列番号２２に示すフォワードプライマー及び配列番号２３に示すリバースプライマーを用いた。

ｐＥＴ２１−Ｌ１１−Ｇ４１Ｃと同様に、３０残基のアミノ酸からなるリンカー配列が付加された改変型のＨＳＰを発現するクローン（ｐＥＴ２１−Ｌ３０−Ｇ４１Ｃ）を得た。インバースＰＣＲでは、上記で得られたｐＥＴ２１−Ｌ２０−Ｇ４１Ｃをテンプレートとして、配列番号２４に示すフォワードプライマー及び配列番号２５に示すリバースプライマーを用いた。

ｐＥＴ２１−Ｌ１１−Ｇ４１Ｃ、ｐＥＴ２１−Ｌ２０−Ｇ４１Ｃ及びｐＥＴ２１−Ｌ３０−Ｇ４１Ｃが発現する改変型のＨＳＰのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示される。

改変型のＨＳＰの発現及び精製は、次のように行った。ｐＥＴ２１−Ｌ１１−Ｇ４１Ｃ、ｐＥＴ２１−Ｌ２０−Ｇ４１Ｃ及びｐＥＴ２１−Ｌ３０−Ｇ４１Ｃを、それぞれ１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００の値が０．５に達した際に、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて改変型のＨＳＰの発現を誘導し、そのまま４時間培養を続けた。

培養終了後、培地を遠心分離し、得られたペレットに１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて十分に懸濁した。これを氷冷下において密閉式超音波細胞破砕装置ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ（登録商標）（コスモバイオ社製）で破砕した（２００Ｗ、２０秒破砕、２０秒休止を１２回繰り返した）。続いて、４℃で遠心分離（２００００ｇ、２０分間）した後、不溶性分画を除去した。

改変型のＨＳＰの精製は、ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（登録商標）アニオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで行った。次に、塩濃度グラジェントによってタンパク質を溶解し、分取した各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、十分な量のタンパク質が可溶性タンパク質として得られたことを確認した。さらに、目的の改変型のＨＳＰを含むフラクションは、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー社製）を用いてゲル濾過精製した。なお、ヒスチジンタグを改変型ＨＳＰの場合は、上記のアニオン交換カラムの代わりにＨｉｓＴＡＬＯＮ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）５ｍｌ金属キレートカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーで粗精製を行った。なお、以下では、ｐＥＴ２１−Ｌ１１−Ｇ４１Ｃ、ｐＥＴ２１−Ｌ２０−Ｇ４１Ｃ及びｐＥＴ２１−Ｌ３０−Ｇ４１Ｃが発現する改変型のＨＳＰを、それぞれ「Ｌ１１」、「Ｌ２０」及び「Ｌ３０」とする。また、Ｌ１１、Ｌ２０及びＬ３０で形成されるナノカプセルを、それぞれ「Ｌ１１ナノカプセル」、「Ｌ２０ナノカプセル」及び「Ｌ３０ナノカプセル」とする。また、リンカー配列を付加していないＨＳＰ−Ｇ４１Ｃで形成されるナノカプセルを、「Ｇ４１Ｃナノカプセル」とする。

Ｌ１１、Ｌ２０及びＬ３０がカプセル構造をとっているかを確認するため、動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）で粒径を測定した。１．０ｍｇ／ｍｌに調製したＬ１１ナノカプセル、Ｌ２０ナノカプセル及びＬ３０ナノカプセルの各溶液を、０．２２ｍｍスピンフィルターに通し、その溶液をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（ｍｏｄｅｌ：ｚｅｎ３６００）にて測定した。比較のため、Ｇ４１Ｃナノカプセルも同様に測定した。

（結果）
図１は、ＤＬＳで求めた粒径の個数分布を示す。Ｇ４１Ｃナノカプセル、Ｌ１１ナノカプセル、Ｌ２０ナノカプセル及びＬ３０ナノカプセルの平均粒径は、それぞれ１２．５ｎｍ、１４．４ｎｍ、２２．７ｎｍ及び３２．６ｎｍであった。

上記のように、ナノカプセル形成と安定化に寄与しているＨＳＰのＮ末端から始まるＮヘリックス領域のＣ末端にリンカー配列を付加することによって、改変型のＨＳＰで形成されるナノカプセルの粒径を拡大することができた。

（実施例２：Ｌ２０ナノカプセルへのｓｉＲＮＡの内包及びＬ２０ナノカプセルの細胞への導入）
上記実施例１で調製したＬ２０ナノカプセルにｓｉＲＮＡを内包させ、細胞に導入できることを確認した。
まず、５’末端をマレイミドで修飾した配列番号２６に示すセンス鎖と５’末端をＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８で修飾した配列番号２７に示すアンチセンス鎖とを含む蛍光標識したｓｉＲＮＡ溶液を調製した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２５μＭのＬ２０ナノカプセル溶液に、当該ｓｉＲＮＡ溶液を終濃度１０μＭとなるように加え、６０℃で２時間加熱した後、そのまま室温まで放冷した。Ｌ２０ナノカプセルに内包されなかった残余のｓｉＲＮＡを限外濾過により除去した（カットオフ：１００ＫＤａ）。

次に、ｓｉＲＮＡを内包したＬ２０ナノカプセルを１０μＭの濃度でＰＢＳ緩衝液中に溶解した。あらかじめ２４穴プレートにＭＣＦ７−ｌｕｃ細胞を、５×１０^４個／ウェルとなるように播種し、陽イオン性脂質ベースの細胞導入試薬ＢＩＯＰＯＲＴＥＲ（登録商標）を用いて、ＭＣＦ７−ｌｕｃ細胞にＬ２０ナノカプセルを形質転換した。添付のプロトコールにしたがって処理した後、細胞内に取り込まれたｓｉＲＮＡ由来の蛍光をプレートリーダーにより定量した。Ｌ２０ナノカプセルに内包させたものと同一のｓｉＲＮＡを対照として用いた。

（結果）
図２は、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを内包したＬ２０ナノカプセルを導入したＭＣＦ７−ｌｕｃ細胞の蛍光強度を示す。Ｌ２０ナノカプセルにｓｉＲＮＡを内包させることで、細胞内へのｓｉＲＮＡの導入効率が約１０倍に増加した。

このようにリンカー配列を付加して粒径を大きくすることで、改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルは薬物ペイロードを増加させることができる。改変型のＨＳＰは、粒径が大きくなっても細胞内に導入可能である。また、改変型のＨＳＰは、ｓｉＲＮＡのような比較的大きな分子も内包させることができ、内包させる薬物の選択の幅を広げることができる。

（実施例３：Ｎヘリックス領域を付加したＨＳＰの遺伝子クローニング、発現及び精製）
Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列を１つ、２つ又は３つ含むアミノ酸配列を付加した改変型のＨＳＰを発現するクローンを作製した。
ＨＳＰ−Ｇ４１ＣのＣ末端にｉＲＧＤペプチドに対応するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が付加されたＨＳＰ−Ｇ４１Ｃ−ｉＲＧＤをコードするベクター（ｐＥＴ２１−ＨＳＰ１６．５−Ｇ４１Ｃ−ｉＲＧＤ）をテンプレートとして、インバースＰＣＲを行った。インバースＰＣＲには、配列番号２８に示すフォワードプライマー及び配列番号２９に示すリバースプライマーを用いた。反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、約２００ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから回収した。回収したＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｓｅＩで分解し、さらにＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（プロメガ社製）を使って精製した。

精製したＤＮＡをＮｄｅＩで消化し、さらに脱リン酸化処理をしたｐＥＴ２１−ＨＳＰ１６．５−Ｇ４１Ｃ−ｉＲＧＤにライゲーションした。以降は実施例１と同様にして、１〜３つのＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列が付加されたクローンを得た。改変型のＨＳＰの発現及び精製は、実施例１と同様に行った。

ＨＳＰはＮヘリックス領域を本来備えている。そこで、Ｎヘリックス領域に対応するアミノ酸配列が付加されていない改変型のＨＳＰ（ＨＳＰ−Ｇ４１Ｃ−ｉＲＧＤ）を「ＮＨｅｌｉｘ１」とする。Ｎヘリックス領域が１つ付加されると、ＨＳＰは本来備えるＮヘリックス領域と合わせて２つのＮヘリックス領域を有することになる。同様に、Ｎヘリックス領域が２つ付加されると、ＨＳＰは３つのＮヘリックス領域を有し、Ｎヘリックス領域が３つ付加されると、ＨＳＰは４つのＮヘリックス領域を有することになる。そこで、１つ、２つ及び３つのＮヘリックス領域に対応するアミノ酸配列が付加された改変型のＨＳＰを、それぞれ「ＮＨｅｌｉｘ２」、「ＮＨｅｌｉｘ３」及び「ＮＨｅｌｉｘ４」とする。ＮＨｅｌｉｘ１、ＮＨｅｌｉｘ２、ＮＨｅｌｉｘ３及びＮＨｅｌｉｘ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３０、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に示される。

（実施例４：Ｎヘリックス領域を付加した改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルへの造影剤の内包及び造影剤の緩和度の測定）
まず、Ｇｄイオンと錯化させたマレイミド化ＤＴＰＡを調製した。３０．９ｇのｐ−ＮＨ_２−Ｂｚ−ＤＴＰＡと１６．５ｇのスルホＥＭＣＳとを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）０．２５ｍｌに溶解し、室温で２０時間撹拌した。反応追跡は、薄層クロマトグラフィー（オクタデシルシリル（ＯＤＳ）、メタノール／水＝１／１）で行った。ＯＤＳカラムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより反応溶液を精製し、マレイミド化ＤＴＰＡを得た。

次に、溶液のｐＨを、１Ｍの塩酸で５付近に調整した後、１Ｍの塩化ガドリウム溶液４８μｌを加え、室温で２０時間撹拌して錯化させることで、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−マレイミドを得た。

Ｇｄ−ＤＴＰＡ−マレイミドは、改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセル内部の空洞表面にあるシステイン残基（野生型のＮ末端から４１残基目のグリシンを置換）に固定化することでナノカプセルに内包した。リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に各ナノカプセル溶液及びＧｄ−ＤＴＰＡ−マレイミドを加え、５０℃で１時間加熱撹拌した。放冷後、ナノカプセルに内包されなかった残余のＧｄ−ＤＴＰＡ−マレイミドを限外濾過により除去した。なお、ナノカプセルに固定化されたＧｄは、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）装置（７５００Ｃ、アジレント・テクノロジー社製）を用いて定量した。

Ｇｄ−ＤＴＰＡ−マレイミドを内包したナノカプセル溶液を、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、所定の濃度に調製した後、１．５Ｔ又は９．４Ｔの核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）装置を用いて、標準的なインバージョンリカバリー法により、Ｔ１緩和度を求めた。また、Ｔ１強調スピンエコー法によりＭＲＩ測定を行い、Ｔ１強調画像を取得した。

（結果）
図３は、ナノカプセル内に固定化されたＧｄの割合を示す。ＮＨｅｌｉｘ１で形成されたナノカプセルに対して、ＮＨｅｌｉｘ２及びＮＨｅｌｉｘ３で形成されたナノカプセルでは、Ｇｄの内包効率が向上した。

表１は、各ナノカプセルのＴ１緩和度を示す。ナノカプセルに内包されていないＧｄ−ＤＴＰＡに対して、ＮＨｅｌｉｘ４で形成されたナノカプセルでは、磁場１．５Ｔの場合で約１９倍、磁場９．４Ｔの場合で約５倍のＴ１緩和度が得られた。また、Ｎヘリックス領域が多いほど、Ｔ１緩和度が増加した。

図４は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ及び各ナノカプセルのＴ１強調画像を示す。ナノカプセルに内包されたＧｄ−ＤＴＰＡでは、Ｇｄ−ＤＴＰＡよりも高いＭＲシグナルが検出された。さらに、Ｎヘリックス領域が多いほど、より高いＭＲシグナルが検出された。このため、Ｎヘリックス領域を付加した改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルに、造影剤を内包することで、より高感度なＭＲＩ造影が可能になることが示唆された。

付加されたＮヘリックス領域はナノカプセル内部の空洞表面に位置し、ナノカプセル内部の疎水性を高める。これが疎水性相互作用としてナノカプセルの形成に寄与することで、ナノカプセルの構造的な剛直さが向上し、Ｇｄの内包効率及びＴ１緩和能が向上したと考えられる。

また、緩和度は、水交換率（τ_Ｍ）、回転相関時間（τ_Ｒ）が大きくなると低下する。ナノカプセルの構造的な剛直さ及び内部の疎水性の向上によって、τ_Ｍ及びτ_Ｒの少なくとも一方が小さくなることで緩和度が向上したと推察される。

（実施例５：ナノカプセルに内包した造影剤の膵癌移植マウスにおける評価）
実施例４で調製した改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルに内包された造影剤の造影感度を生体内で評価した。
１×１０^６個のヒト膵癌細胞ＡｓＰＣ−１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１高発現株）をマトリゲルと混合し、ＳＨＯマウスの皮下に移植した。ＳＨＯマウスを２〜３週間飼育して、癌部が十分に生着及び成長した後、１００μＭのＮＨｅｌｉｘ３で形成されたナノカプセル溶液１５０μｌを尾静脈から投与した。そのまま１２時間放置した後、９．４ＴのＭＲＩ装置を使用して、Ｔ１強調スピンエコー法によりＭＲＩ測定を行い、Ｔ１強調画像を取得した。対照として、野生型のＨＳＰで形成されたナノカプセルも同様に評価した。

図５は、担癌マウスの癌部付近のＴ１強調画像を示す。ＮＨｅｌｉｘ３で形成されたナノカプセルに内包された造影剤は、野生型のＨＳＰで形成されたナノカプセルに内包させた場合よりも癌部をより明確に描出した。ＮＨｅｌｉｘ３で形成されたナノカプセルは、Ｃ末端にｉＧＲＤペプチドに対応するアミノ酸配列を有している。このため、ｉＧＲＤペプチドがナノカプセルの外殻に呈示されるので、ｉＧＲＤペプチドに親和性の高いＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１を高発現している癌部に、ナノカプセルが効率よく輸送されていることが示された。このように、本実施例に係る改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルは、生体内においても送達部位で内包する薬物の薬効を十分に発揮させることができる。

（実施例６：分解シグナル配列を付加したＨＳＰの遺伝子クローニング、発現及び精製）
Ｃ末端にユビキチン化されうるＨＩＦ−１由来配列又はＰＥＳＴ配列を含むアミノ酸配列を付加した改変型のＨＳＰを発現するクローンを作製した。
ＨＩＦ−１由来配列を含む改変型のＨＳＰを発現するクローンの作製では、ＨＳＰ−Ｇ４１ＣのＣ末端に、所定残基数のリンカー配列を介して６個のヒスチジン残基が付加されたアミノ酸配列をコードするベクター（ｐＥＴ２１−ＨＳＰ１６．５−Ｇ４１Ｃ−Ｌ７−Ｈｉｓ）をテンプレートとしてインバースＰＣＲを行った。インバースＰＣＲには、リン酸化プライマーを用いた。フォワードプライマーの配列は、配列番号３１に示され、リバースプライマーの配列は、配列番号３２に示される。以降、実施例１と同様に目的のクローンを取得し、改変型のＨＳＰを発現させ、精製した。ＨＩＦ−１由来配列を含む改変型のＨＳＰ（ＯＤＤ５６）のアミノ酸配列は、配列番号９に示される。

ＰＥＳＴ配列を含む改変型のＨＳＰを発現するクローンの作製では、細胞接着において主要な役割を担うｐｒｅＳ１由来のアミノ酸配列を含むＨＳＰ−Ｇ４１Ｃのアミノ酸配列をコードするベクター（ｐＥＴ２１−ＨＳＰ１６．５−Ｇ４１Ｃ−ｐｒｅＳ１）をテンプレートとしてインバースＰＣＲを行った。インバースＰＣＲには、配列番号３３に示すフォワードプライマー及び配列番号３４に示すリバースプライマーを用いた。以降、実施例１と同様に目的のクローンを取得し、改変型のＨＳＰを発現させ、精製した。ＰＥＳＴ配列を含む改変型のＨＳＰ（ｍＯＤＣ）のアミノ酸配列は、配列番号１１に示される。

（実施例７：ＯＤＤ５６で形成されたナノカプセルのユビキチン化の確認）
野生型のＨＳＰで形成された野生型ナノカプセル及びＯＤＤ５６で形成されたＯＤＤ５６ナノカプセルをあらかじめＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８で標識した。次に、野生型ナノカプセル及びＯＤＤ５６ナノカプセルを、それぞれＨｅｌａ細胞ベースのキットＵｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯＭＯＬ社製）を使用してユビキチン化した。具体的な実験手順は下記のとおりである。

Ｓ−１００ ＨｅＬａ細胞抽出液１４ｕｌに１μＭのナノカプセル溶液１７．５ｕｌを加え、さらに７ｕｌの１０×Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．８μｌの５０ｍＭ ＤＴＴ、７μｌの５×ＡＴＰ−ＥＲＳ、２１．７ｕｌの滅菌水を添加して総体積７０μｌとした。当該溶液を３７℃のインキュベーターに入れ、０分、５分、１０分、２０分、４０分、６０分及び１２０分後に１０μｌずつサンプルリングした。サンプリングした溶液に４μｌのＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４ｘ）、２μｌの滅菌水を加え、９５℃で５分間加熱した。次に溶液を５０００×ｇで１分間遠心分離し、１５％ポリアクリルアミドゲルを使ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。なお、電気泳動は遮光下で行った。電気泳動の終了後、蛍光ゲルスキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ９０００）で撮影した。

（結果）
図６に示すように、Ｈｅｌａ細胞中において、ＯＤＤ５６ナノカプセルは、時間の経過とともに高分子量化した。ユビキチン化の特徴であるラダー状のパターンが確認できるため、ＯＤＤ５６ナノカプセルがユビキチン化されたことが示された。一方、野生型ナノカプセルでは、分子量に変化がなく、ユビキチン化されなかった。

（実施例８：ＯＤＤ５６ナノカプセルの経時変化の解析）
細胞内の取り込まれたＯＤＤ５６ナノカプセルの経時変化を追跡した。
あらかじめ２４穴プレートに５×１０^４個／ウェルとなるようにＨｅｌａ細胞を播種し、チミジンブロックにより細胞周期をＳ期に同調させておいた。蛍光物質Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８でそれぞれ標識した野生型ナノカプセル及びＯＤＤ５６ナノカプセルを、それぞれ１０μＭの濃度となるようにＰＢＳ緩衝液中に溶解した。ナノカプセル溶液を陽イオン性脂質ベースの細胞導入試薬ＢＩＯＰＯＲＴＥＲ（登録商標）を用いて、Ｓ期に同調させておいたＨｅｌａ細胞に形質転換した。キットに添付されたプロトコールにしたがってＨｅｌａ細胞を処理した後、形質転換直後を０時間とし、所定時間ごとに細胞をサンプリングした。サンプリングした細胞の培地を除去した後、１００μｌのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加えて十分に細胞を懸濁し、溶液中に含まれるナノカプセルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルへの添加量は総タンパク量をもとに調整した。なお電気泳動終了後、ナノカプセル由来の蛍光バンドを蛍光ゲルスキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ９０００）で撮影し、さらにそのゲルを抗β−アクチン抗体で免疫染色した。

（結果）
図７に示すように、ＯＤＤ５６ナノカプセルは、時間の経過とともに消失し、２４時間後には、ほぼ完全に消失した。一方、野生型のナノカプセルでは、２４時間後でも残存していた。ＯＤＤ５６ナノカプセルは、細胞内でより確実に分解され、消失することが示された。

（実施例９：ＯＤＤ５６ナノカプセルの薬物放出の評価）
まず、アポトーシス誘導剤ＲＯ３１−８２２０を野生型のナノカプセル及びＯＤＤ５６ナノカプセル各々に内包させた。２０μＭの濃度で野生型のナノカプセル及びＯＤＤ５６ナノカプセルをそれぞれ含む２００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に、１０μＭのアポトーシス誘導剤ＲＯ３１−８２２０メタンスルホン酸塩を添加し、６０℃で２時間、加熱攪拌した。その後、室温まで放冷し、残余のＲＯ３１−８２２０を限外濾過によって除去した。

続いて、２４穴プレートに５×１０^４個／ウェルのＨｅｌａ細胞を播種し、１０％ＦＣＳを含む１０００μｌのＤＭＥＭ培地をウェルに加えて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で一晩培養した。ウェル内の培地を２００ｕｌのＤＭＥＭ培地に交換し、適量のＢＩＯＰＯＲＴＥＲ（登録商標）を含む１０μＭのナノカプセル溶液（ＲＯ３１−８２２０を内包）を２５ｕｌと等量のＤＭＥＭ培地とを混合し、混合溶液をウェルに加えた。４時間培養した後、１０％ＦＣＳを含む１０００μｌのＤＭＥＭ培地にウェル内の培地を交換した。さらに４８時間培養した後、トリパンブルー染色により細胞の生存率を計測した。

（結果）
図８に示すように、ＲＯ３１−８２２０を内包したＯＤＤ５６ナノカプセルは、Ｈｅｌａ細胞のアポトーシスを誘導した。野生型のナノカプセルにＲＯ３１−８２２０を内包した場合は、Ｈｅｌａ細胞のアポトーシスは誘導されなかった。上記実施例８に示したように、ＯＤＤ５６ナノカプセルは細胞内で分解されて消失するため、内包されたＲＯ３１−８２２０が細胞内で効率よく放出されたことが示された。

（実施例１０：Ｇ４１Ｃナノカプセルの安全性評価）
６週齢のＩＣＲマウス（雄）に、生理食塩水に溶解した１００μＭのＧ４１Ｃナノカプセルを１００μｌ投与し、２４時間後及び４８時間後に尾部から血液を採取した。採取した血液を１時間、室温でインキュベートし、４℃で一晩、静置した。その後、４℃で１５分間、１７００×ｇで遠心分離し、上清を回収し、血清を得た。こうすることで、２５０μｌの血液から約１００μｌの血清が得られた。

得られた血清の生化学パラメータを、ＪＳＣＣ標準化対応法で測定した。測定した生化学パラメータは、腎機能障害の指標となるクレアチニン（ＣＲＥ）、肝臓、心筋及び骨格筋の障害の指標となるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、肝細胞、心筋及び骨格筋の障害の指標となるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、種々の細胞障害の指標となる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、及び筋肉の障害の指標となるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）である。
（結果）
表２は、Ｇ４１Ｃナノカプセルの投与から２４時間後の生化学パラメータを示す。コントロール群及び生理食塩水のみを投与した群と比較して、Ｇ４１Ｃナノカプセルを投与したマウスの生化学パラメータに大きな違いはなかった。

表３は、Ｇ４１Ｃナノカプセルの投与から４８時間後の生化学パラメータを示す。２４時間後の結果と同様に、コントロール群及び生理食塩水のみを投与した群と比較して、Ｇ４１Ｃナノカプセルを投与したマウスの生化学パラメータに大きな違いはなかった。

これらの結果により、Ｇ４１Ｃナノカプセルを投与しても、ほとんど毒性がないことが分かった。Ｇ４１Ｃナノカプセルと同様に、上記各実施例で検討した改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルにも顕著な毒性はないと考えられる。このため、当該改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルは、内包した薬物を、安全に、かつ効率よく標的部位に送達することができる。

本出願は、２０１３年３月２７日に出願された日本国特許出願２０１３−０６５６２７号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１３−０６５６２７号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明に係る改変型のＨＳＰで形成されたナノカプセルの内部の空洞には、抗癌剤、核酸医薬、遺伝子、造影剤及び蛍光プローブ等の多様な薬物を、十分なペイロードを確保しながら安定して内包させることが可能である。また、当該ナノカプセルは、細胞内で分解されて、内包した薬物を送達部位で効率よく放出することができる。このため、特定部位に効率的に薬物を送達でき、かつ、送達部位において内包する薬物の薬効をより発揮させることができる。従って、癌等の疾患の診断、副作用を抑えた予防及び薬物治療、さらには特定の分子を標的とする分子イメージング等に利用できる。

Claims (8)

1. 下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、
   該タンパク質の自己組織化によって形成された構造体である、
   ナノカプセル。
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、前記アミノ酸配列のＮ末端から３２残基又は３３残基までのアミノ酸配列から構成される疎水性ヘリックス領域が１個以上付加されたアミノ酸配列、
   （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列に、ユビキチン化されうる部位を構成するアミノ酸配列が前記構造体において外部に提示される位置にさらに付加されたアミノ酸配列、
   （ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＣ末端に、ｉＲＧＤペプチドに対応するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列、及び
   （ｄ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列に、１０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられたアミノ酸配列
2. 前記ユビキチン化されうる部位を構成するアミノ酸配列は、
   低酸素誘導因子−１のアミノ酸配列に含まれる配列番号８に示すアミノ酸配列である、
   ことを特徴とする請求項１に記載のナノカプセル。
3. 請求項１又は２に記載されたナノカプセルと、
   前記ナノカプセルに内包される薬物と、
   を含む組成物。
4. 前記薬物は、
   造影剤である、
   ことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
5. 前記薬物は、
   抗がん剤である、
   ことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
6. 下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、
   該アミノ酸配列からなるタンパク質は、自己組織化によって構造体を形成する、
   ポリヌクレオチド。
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、前記アミノ酸配列のＮ末端から３２残基又は３３残基までのアミノ酸配列から構成される疎水性ヘリックス領域が１個以上付加されたアミノ酸配列、
   （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列に、ユビキチン化されうる部位を構成するアミノ酸配列が前記構造体において外部に提示される位置にさらに付加されたアミノ酸配列、
   （ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＣ末端に、ｉＲＧＤペプチドに対応するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列、及び
   （ｄ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列に、１０個以下のアミノ酸の置換、欠失及び付加の少なくとも１つの改変がさらに加えられたアミノ酸配列
7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
8. 請求項７に記載の組換えベクターを含む形質転換体。