JP6391127B2 - Licorice plant cultivation method, hydroponic cultivation apparatus, and propagation method - Google Patents
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Description
本発明は、カンゾウ属植物株、識別マーカー、増殖方法、及び、水耕栽培装置に関する。 The present invention relates to a licorice plant strain, an identification marker, a growth method, and a hydroponic cultivation apparatus.
カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物は、マメ科（Leguminosae）の多年草で、中国北部、ロシア南部、中央アジア、地中海地方などの乾燥地帯に主に自生する。例えば、中国北部などに自生するウラルカンゾウ（G. uralensis）、地中海地方などに広く自生するスペインカンゾウ（G.glabra）などが広く知られている。 Glycyrrhiza plants are perennials of the leguminous family (Leguminosae) and grow primarily in dry areas such as northern China, southern Russia, Central Asia and the Mediterranean. For example, larva (G. uralensis) that grows naturally in northern China, and Spanish licorice (G. glabra) that grows widely in the Mediterranean region are widely known.
東洋医学（漢方）の分野では、古くから、カンゾウ属植物のストロンを含む根部を乾燥させたものなどが生薬「甘草」として重用されている。甘草の乾燥粉末・エキスなどには、抗炎症作用、抗潰瘍作用、抗アレルギー作用、鎮咳作用、抗癌作用、抗ウイルス作用及び抗菌作用等の様々な薬理活性があり、医薬品としても重要なグリチルリチン酸（Ｃ４２Ｈ６２Ｏ１６）が含まれる。カンゾウ属植物においては、グリチルリチン酸はカリウム塩とカルシウム塩の混合物として蓄積され、これを総じてグリチルリチンという。甘草の主な薬効成分としてのグリチルリチン酸は、トリテルペン配糖体の一つで、カンゾウ属植物の根部などに多く含有し、この根部から抽出・精製することにより、製造される。 In the field of oriental medicine (Chinese medicine), dried roots containing strons of the licorice plant have long been used as the herbal medicine “licorice”. Licorice dry powder / extract has various pharmacological activities such as anti-inflammatory, anti-ulcer, anti-allergic, antitussive, anticancer, antiviral and antibacterial, and is also important as a pharmaceutical. Acid (C 42 H 62 O 16 ) is included. In licorice plants, glycyrrhizic acid accumulates as a mixture of potassium and calcium salts, which are collectively referred to as glycyrrhizin. Glycyrrhizic acid, which is the main medicinal component of licorice, is one of the triterpene glycosides. It is contained in the roots of licorice plants and is extracted and purified from the roots.
グリチルリチン酸を製造するための原材料として、野生のカンゾウ属植物が収穫され用いられている。一方、カンゾウ属植物の乱獲による環境破壊や資源の枯渇化の問題が顕在化している。そのため、カンゾウ属植物を安定供給するための栽培・増殖方法を確立することが望まれている。例えば、特許文献１には、グリチルリチン酸含有の割合が高く保持されたまま、カンゾウ属植物を継代し増殖しうるカンゾウ属植物株及びカンゾウ属植物増殖方法が開示されている。 Wild licorice plants are harvested and used as a raw material for producing glycyrrhizic acid. On the other hand, problems of environmental destruction and resource depletion due to over-exploitation of licorice plants have become apparent. Therefore, it is desired to establish a cultivation / proliferation method for stably supplying licorice plants. For example, Patent Document 1 discloses a licorice plant strain and a licorice plant growth method that can subculture and grow licorice plants while maintaining a high glycyrrhizic acid-containing ratio.
特許文献１に開示されるカンゾウ属植物株は、自生しているカンゾウ属植物に比べ、グリチルリチン酸を多く含有している。しかしながら、このカンゾウ属植物株は、他のカンゾウ属植物株に比べて増殖能があまり高くないため、短期間で効率的に増殖することが困難な場合がある。このため、グリチルリチン酸含有の割合を高く保持したまま、カンゾウ属植物を継代し増殖し得る新たなカンゾウ属植物株が求められている。 The licorice plant strain disclosed in Patent Document 1 contains a larger amount of glycyrrhizic acid than a naturally occurring licorice plant. However, since this licorice plant strain has a less proliferative ability than other licorice plant strains, it may be difficult to efficiently grow in a short period of time. For this reason, there is a need for a new licorice plant strain that can subculture and grow licorice plants while maintaining a high glycyrrhizic acid-containing ratio.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、グリチルリチン酸含有の割合を高く保持したまま、カンゾウ属植物を継代し増殖し得るカンゾウ属植物株等を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a licorice plant strain and the like that can subculture and proliferate licorice plants while maintaining a high proportion of glycyrrhizic acid.
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るカンゾウ属植物株は、
配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有する、ことを特徴とする。
In order to achieve the above object, a licorice plant strain according to the first aspect of the present invention comprises:
It has the arrangement | sequence in any one of sequence number 1-9 of a sequence table, It is characterized by the above-mentioned.
前記配列は、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１（以下、「ＧｕＩＶ１」と記載する）株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２（以下、「ＧｕＩＶ２」と記載する）株、又は、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１（以下、「Ｇｕ＃１１」と記載する）株におけるＳＱＳ（スクアレン合成酵素）２遺伝子、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子又はＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子の部分配列でもよい。 The sequence is the Uralphanthus Gu2-3-2 strain, GuTS71-08IV1 (hereinafter referred to as “GuIV1”) strain, GuTS71-08IV2 (hereinafter referred to as “GuIV2”) strain, or GuTS71-08 strain seedlings It may be a partial sequence of SQS (squalene synthase) 2 gene, CYP88D6 gene, or CYP72A154 gene in clone strain identification number 11 (hereinafter referred to as “Gu # 11”).
本発明の第２の観点に係る配列表の配列番号１又は２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーは、
配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする。
An identification marker for identifying a licorice plant strain having the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing according to the second aspect of the present invention,
It consists of a sequence that is the same, complementary or reverse complementary to the sequences of SEQ ID NOs: 10 and 11 in the sequence listing.
It is characterized by that.
本発明の第３の観点に係る配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーは、
配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする。
An identification marker for identifying a licorice plant strain having any one of SEQ ID NOs: 3 to 6 in the sequence listing according to the third aspect of the present invention,
It consists of a sequence that is the same, complementary, or reverse complementary to SEQ ID NO: 12 of the Sequence Listing and SEQ ID NO: 13 and / or 14 of the Sequence Listing.
It is characterized by that.
本発明の第４の観点に係る配列表の配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーは、
配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列、又は、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする。
The identification marker for identifying a licorice plant strain having any one of SEQ ID NOs: 7 to 9 in the sequence listing according to the fourth aspect of the present invention,
It consists of the sequence of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 and / or 17 of the sequence listing, or the same, complementary or reverse complementary sequence to the sequences of SEQ ID NO: 18, 19 of the sequence listing.
It is characterized by that.
本発明の第５の観点に係る増殖方法は、
植物体の茎葉部を株の根元より切除し、当該切除した茎葉部から葉を切除して茎切片を露出し、
前記露出した植物体の茎切片を水で湿潤し、
前記湿潤した植物体の茎切片を流水で処理し、
前記流水で処理した植物体の茎切片を挿し床に挿し木する、
ことを特徴とする。
The proliferation method according to the fifth aspect of the present invention includes:
Excising the foliage of the plant from the root of the strain, excising the leaves from the excised foliage and exposing the stem section,
Wetting the exposed stem section of the plant with water,
Treating the wet plant stem section with running water;
Insert the stem section of the plant treated with the flowing water and cut it on the floor,
It is characterized by that.
前記植物体は、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなってもよい。 The said plant body may consist of a licorice plant strain which has the arrangement | sequence in any one of sequence number 1-9 of a sequence table.
本発明の第６の観点に係る水耕栽培装置は、
養液を貯留する養液槽と、
前記養液槽内に略鉛直方向に形成され、上端開口部に植物体を設置する一又は複数の筒状部と、
前記養液槽内の養液の水位を変動させる水位変動手段と、を備え、
前記水位変動手段は、前記植物体の根部の先端が前記養液槽の上端位置と下端位置との間の中間位置に達するまで、前記養液の水位を当該中間位置より上の第１の位置に設定し、その後当該中間位置より下の第２の位置に設定する、
ことを特徴とする。
The hydroponic cultivation apparatus according to the sixth aspect of the present invention is:
A nutrient solution tank for storing the nutrient solution;
One or a plurality of cylindrical parts that are formed in a substantially vertical direction in the nutrient solution tank and install a plant in the upper end opening,
Water level changing means for changing the water level of the nutrient solution in the nutrient solution tank,
The water level changing means is configured to change the water level of the nutrient solution to a first position above the intermediate position until the tip of the root of the plant body reaches an intermediate position between the upper end position and the lower end position of the nutrient solution tank. And then set to a second position below the intermediate position,
It is characterized by that.
前記植物体は、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなってもよい。 The said plant body may consist of a licorice plant strain which has the arrangement | sequence in any one of sequence number 1-9 of a sequence table.
前記第１の位置は、前記養液槽の上端位置から１〜１０ｃｍ下の位置であり、前記第２の位置は、前記養液槽の下端位置から１〜１０ｃｍ上の位置でもよい。 The first position may be a position 1 to 10 cm below the upper end position of the nutrient solution tank, and the second position may be a position 1 to 10 cm above the lower end position of the nutrient solution tank.
前記筒状部は、前記養液を吸収する材料で形成されてもよい。 The cylindrical portion may be formed of a material that absorbs the nutrient solution.
本発明によれば、グリチルリチン酸含有割合の高いカンゾウ属植物の増殖を行うことができるため、生薬の甘草又はグリチルリチン酸の生産効率を向上できる。 According to the present invention, licorice plants having a high glycyrrhizic acid content ratio can be grown, so that the production efficiency of herbal licorice or glycyrrhizic acid can be improved.
（カンゾウ属植物株）
本発明の実施形態に係るカンゾウ属植物株は、薬効成分として有用なグリチルリチン酸を根部に多量に含有するカンゾウ属植物株であり、継代し増殖し得る株である。
(Licorice plant strain)
The licorice plant strain according to an embodiment of the present invention is a licorice plant strain containing a large amount of glycyrrhizic acid useful as a medicinal component at the root, and is a strain that can be subcultured and proliferated.
本明細書において「カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物」は、根部にグリチルリチン酸を含有する植物であるが、根部以外の茎部、葉などにグリチルリチン酸を含有する植物でもよい。例えば、ウラルカンゾウ（G. uralensis）、スペインカンゾウ（G. glabra）、チョウカカンゾウ（G. inflata）、G. acanthocarpa、G. aspera、G. astragalina、G. bucharica、G. echinata、G. eglandulosa、G. foetida、G. foetidissima、G. gontscharovii、G. iconica、G. korshinskyi、G. lepidota、G. pallidiflora、G. squamulosa、G. triphylla、G. yunnanensis、これらカンゾウ属植物の変種などが適用可能であり、ウラルカンゾウ及びスペインカンゾウが好適であり、ウラルカンゾウがより好適である。 In the present specification, the “Glycyrrhiza plant” is a plant containing glycyrrhizic acid in the root portion, but may be a plant containing glycyrrhizic acid in stems, leaves or the like other than the root portion. For example, G. uralensis, G. glabra, G. inflata, G. acanthocarpa, G. aspera, G. astragalina, G. bucharica, G. echinata, G. eglandulosa, G. foetida, G. foetidissima, G. gontscharovii, G. iconica, G. korshinskyi, G. lepidota, G. pallidiflora, G. squamulosa, G. triphylla, G. yunnanensis, varieties of these licorice plants are applicable Ural licorice and Spanish licorice are preferred, and Ural licorice is more preferred.
根部（地下部）は、根・ストロンなどを、茎部（茎葉部、地上部）は茎・頂芽・シュート・節・葉などを広く包含する。茎部の切片は、二以上の節を含むように２〜２０ｃｍ程度の長さに調製することが好ましい。切片の調製は、例えば、鋏・カッター・メスなど、公知の切断手段などを用いて行うことができる。 The root part (underground part) broadly includes roots, strons, and the like, and the stalk part (stem and leaf part, above-ground part) widely includes stems, top buds, shoots, nodes, leaves, and the like. The stem section is preferably prepared to have a length of about 2 to 20 cm so as to include two or more nodes. The section can be prepared using, for example, a known cutting means such as a scissors, a cutter, and a knife.
本カンゾウ属植物株として、例えば、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株、Ｇｕ＃１１株のいずれかが挙げられる。本出願人は、これらの株を、独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部育種生理研究室（所在地：日本国茨城県つくば市八幡台１−２）内において自己寄託し、維持・保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲することを保証する。 Examples of the licorice plant strain include, for example, any of Uralanthus Gu2-3-2 strain, GuIV1 strain, GuIV2 strain, and Gu # 11 strain. The present applicant has made a self-deposit of these strains within the National Institute of Biomedical Research, Medicinal Plant Resource Research Center Tsukuba Research Department Breeding Physiology Laboratory (location: 1-2, Yahatadai, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) Maintained and preserved. The Applicant guarantees that it will be distributed to a third party subject to compliance with each law if it falls under each item of Article 27-3 of the Japanese Patent Law Enforcement Regulations.
ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株、Ｇｕ＃１１株は、ＳＱＳ（スクアレン合成酵素）２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２部分、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有する。ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列、及び、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列は、グリチルリチン酸を含む二次代謝物（リキリチン、イソリキリチン、グリシクマリン等）を根部に多量に含有させ、株を継代し増殖し得る植物に必要な配列である。 Uralphanthus Gu2-3-2 strain, GuIV1 strain, GuIV2 strain, Gu # 11 strain are a base sequence in exon 1 to exon 3 part of SQS (squalene synthase) 2 gene, a base sequence in intron 7 part of CYP88D6 gene, It has a base sequence in the intron 1 to intron 2 portion and exon 3 to intron 4 portion of the CYP72A154 gene. The base sequence in the exon 1 to exon 3 part of the SQS2 gene, the base sequence in the intron 7 part of the CYP88D6 gene, and the base sequence in the intron 1 to intron 2 and exon 3 to intron 4 part of the CYP72A154 gene include glycyrrhizic acid. It is a sequence necessary for plants that can contain a large amount of secondary metabolites (such as liquiritin, isoliquiritin, and glycicmarin) at the roots, and can be propagated by passage.
配列表の配列番号１、２の配列は、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列の部分配列である。また、配列表の配列番号３〜６の配列は、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列の部分配列である。配列表の配列番号７〜９の配列は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２部分、エキソン３〜イントロン４部分を含むエキソン１〜エキソン５部分における塩基配列である。配列番号１〜９の配列は、カンゾウ属植物株の遺伝子に、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列の部分配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列の部分配列、及び／又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有するか否かを判別するために有用な配列であり、遺伝子に配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、根部に多量のグリチルリチン酸を含有する株であると判別できる。 The sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing are partial sequences of base sequences in exon 1 to exon 3 of the SQS2 gene. The sequences of SEQ ID NOs: 3 to 6 in the sequence listing are partial sequences of the base sequence in the intron 7 portion of the CYP88D6 gene. The sequences of SEQ ID NOs: 7 to 9 in the Sequence Listing are base sequences in exon 1 to exon 5 part including intron 1 to intron 2 part and exon 3 to intron 4 part of CYP72A154 gene. The sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 include, in the gene of licorice plant strain, partial sequence of base sequence in exon 1 to exon 3 part of SQS2 gene, partial sequence of base sequence in intron 7 part of CYP88D6 gene, and / or CYP72A154 gene is a sequence useful for determining whether or not it has a base sequence in intron 1 to intron 2 and exon 3 to intron 4 of the gene, and the gene has any sequence of SEQ ID NOs: 1 to 9 A plant strain can be identified as a strain containing a large amount of glycyrrhizic acid at the root.
本カンゾウ属植物株は、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列の部分配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列の部分配列、又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有する株であり、これらの部分配列である配列番号１〜９のいずれかの配列を有する。 This licorice plant strain has a partial sequence of base sequence in exon 1 to exon 3 of SQS2 gene, a partial sequence of base sequence in intron 7 of CYP88D6 gene, or intron 1 to intron 2 of exon 3 of CYP72A154 gene. It is a strain having a base sequence in the intron 4 portion, and has any one of these partial sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9.
本カンゾウ属植物株は、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列、又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列の相同性が、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上である塩基配列を有してもよい。 This licorice plant strain has a base sequence in exon 1 to exon 3 part of SQS2 gene, a base sequence in intron 7 part of CYP88D6 gene, or a base sequence in intron 1 to intron 2 and exon 3 to intron 4 part of CYP72A154 gene May have a nucleotide sequence of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more.
以上のように、配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、グリチルリチン酸の含有割合が高い株であり、配列番号１〜９の配列を検出することにより、グリチルリチン酸の含有割合が高い株を識別することができる。 As described above, the licorice plant strain having any of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 is a strain having a high content of glycyrrhizic acid, and by detecting the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9, A strain having a high content can be identified.
（識別マーカー）
本発明の実施形態に係る識別マーカーは、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株を識別するマーカーである。本識別マーカーを用いて、カンゾウ属植物株から抽出するＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法により該当する領域を増幅し、その増幅産物を解析することにより、薬効成分として有用なグリチルリチン酸を根部に多量に含有するカンゾウ属植物株を識別できる。
(Identification marker)
The identification marker which concerns on embodiment of this invention is a marker which identifies the licorice plant strain with a high content rate of glycyrrhizic acid. Glycyrrhizic acid useful as a medicinal component by amplifying the corresponding region by PCR (Polymerase Chain Reaction) method using DNA extracted from licorice plant strain as a template using this identification marker and analyzing the amplified product Can be identified.
本識別マーカーは、配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、又は、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、からなる。ここで、相補的とは、各塩基のａ（アデニン）とｔ（チミン）とを、ｇ（グアニン）とｃ（シトシン）とを入れ換えた状態をいう。また、逆相補的とは、塩基配列の５’末端と３’末端とを入れ換えた状態をいう。 This identification marker is the same as the sequence of SEQ ID NO: 10 or 11 in the sequence listing, complementary or reverse complementary sequence, SEQ ID NO: 12 in the sequence listing, and the same as the sequence of SEQ ID NO: 13 and / or 14 in the sequence listing A complementary or reverse complementary sequence, SEQ ID NO: 15 in the sequence listing, and a sequence identical to, complementary to or reverse complementary to the sequence listing SEQ ID NO: 16 and / or 17, or a sequence listing SEQ ID NO: It consists of the same, complementary or reverse complementary sequences as the 18 and 19 sequences. Here, complementary means a state in which a (adenine) and t (thymine) of each base are replaced with g (guanine) and c (cytosine). The term “reverse complementary” refers to a state in which the 5 ′ end and the 3 ′ end of the base sequence are interchanged.
配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＳＱＳ２遺伝子のイントロン１〜イントロン２を増幅し得る配列からなるプライマーである。配列番号１０の配列は、フォワードプライマーに相当し、配列番号１１の配列は、リバースプライマーに相当する。この識別マーカーにより、配列表の配列番号２の配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。 The identification marker consisting of the same, complementary or reverse complementary sequence as the sequences of SEQ ID NOs: 10 and 11 is a primer consisting of a sequence capable of amplifying intron 1 to intron 2 of the SQS2 gene. The sequence of SEQ ID NO: 10 corresponds to the forward primer, and the sequence of SEQ ID NO: 11 corresponds to the reverse primer. With this identification marker, a licorice plant strain having the sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be detected.
配列番号１２、及び、配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７を増幅し得る配列からなるプライマーである。配列番号１２の配列は、フォワードプライマーに相当し、配列番号１３、１４の配列は、リバースプライマーに相当する。この識別マーカーにより、配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。なお、リバースプライマーに相当する配列表の配列番号１３、１４の配列については、どちらか一方を使用してもよく、また、両方使用してもよい。 The identification marker consisting of the sequence of SEQ ID NO: 12 and the same, complementary or reverse complementary sequence as the sequences of SEQ ID NO: 13 and / or 14 is a primer consisting of a sequence capable of amplifying intron 7 of the CYP88D6 gene. The sequence of SEQ ID NO: 12 corresponds to the forward primer, and the sequences of SEQ ID NOS: 13 and 14 correspond to the reverse primer. By this identification marker, a licorice plant strain having any one of the sequence numbers 3 to 6 in the sequence listing can be detected. In addition, about the sequence | arrangement of sequence number 13 and 14 of a sequence table corresponding to a reverse primer, either one may be used and both may be used.
配列番号１５、及び、配列番号１６及び／又は１７の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２を増幅し得る配列からなるプライマーであり、配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のエキソン３〜イントロン４を増幅し得る配列からなるプライマーである。配列番号１５、１８の配列は、フォワードプライマーに相当し、配列番号１６、１７、１９の配列は、リバースプライマーに相当する。この識別マーカーにより、配列表の配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。なお、リバースプライマーに相当する配列表の配列番号１６、１７の配列については、どちらか一方を使用してもよく、また、両方使用してもよい。 The identification marker consisting of SEQ ID NO: 15 and the same, complementary or reverse complementary sequence as the sequences of SEQ ID NO: 16 and / or 17 is a primer consisting of a sequence capable of amplifying intron 1 to intron 2 of the CYP72A154 gene. The identification marker comprising the same, complementary or reverse complementary sequence as the sequences of SEQ ID NOs: 18 and 19 is a primer comprising a sequence capable of amplifying exon 3 to intron 4 of the CYP72A154 gene. The sequences of SEQ ID NOs: 15 and 18 correspond to forward primers, and the sequences of SEQ ID NOs: 16, 17 and 19 correspond to reverse primers. By this identification marker, a licorice plant strain having any one of the sequence numbers 7 to 9 in the sequence listing can be detected. In addition, about the sequence | arrangement of sequence number 16 and 17 of a sequence table corresponding to a reverse primer, either one may be used and you may use both.
配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、上述したように、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株である。ＰＣＲ法により、本識別マーカーを用いて、これらグリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株のＤＮＡを増幅できるため、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株と他のカンゾウ属植物株とを区別することができる。これにより、本識別マーカーを用いることにより、簡易かつ高精度に、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株を検出することができる。 As described above, the licorice plant strain having any one of the sequence numbers 1 to 9 is a licorice plant strain having a high content of glycyrrhizic acid. Since this identification marker can be used to amplify the DNA of licorice plant strains having a high glycyrrhizic acid content by PCR, the licorice plant strain having a high glycyrrhizic acid content and other licorice plant strains Can be distinguished. Thereby, by using this identification marker, a licorice plant strain having a high content of glycyrrhizic acid can be detected easily and with high accuracy.
ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅する方法は、通常公知の方法を用いることができる。例えば、リアルタイム−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primers）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（SingleStrand Conformation Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（RestrictionFragment Length Polymorphism）法などの通常公知の方法を用いることができる。また、ＰＣＲした後の増幅産物については、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの通常公知の方法を用いて、増幅産物を検出できる。また、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認してもよい。また、ＰＣＲ法の反応条件（温度、時間等）は、ＤＮＡ含有量、及び、酵素の種類・量によって変化するものであり、任意である。 As a method for amplifying DNA by the PCR method, a generally known method can be used. For example, a generally known method such as a real-time-PCR method, a PCR-SSP (Sequence Specific Primers) method, a PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) method, a PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) method can be used. As for the amplification product after PCR, the amplification product can be detected using a generally known method such as agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis or the like. Alternatively, the amplification product may be bound to a solid phase such as a microplate, and the amplification product may be confirmed by fluorescence or enzymatic reaction. The reaction conditions (temperature, time, etc.) of the PCR method vary depending on the DNA content and the type and amount of the enzyme, and are arbitrary.
カンゾウ属植物株からＤＮＡを抽出する方法は、フェノール法、市販の核酸抽出用のキット、装置を用いる通常公知の方法を用いることができる。 As a method for extracting DNA from a licorice plant strain, a generally known method using a phenol method, a commercially available kit or apparatus for nucleic acid extraction can be used.
以上のように、配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号１又は２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別（区別）することができる。また、配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。また、配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号７、８のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができ、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号９の配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、グリチルリチン酸を含む二次代謝物の含有割合が高い株であるため、配列番号１０〜１９の配列を有する識別マーカーを用いることにより、二次代謝物の含有割合が高いカンゾウ属植物株を検出することができる。 As described above, the identification marker comprising the same, complementary, or reverse complementary sequence as the sequences of SEQ ID NOs: 10 and 11 in the sequence listing identifies the licorice plant strain having the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 of the sequence listing. Can be distinguished. Moreover, the identification marker which consists of a sequence which is the same as that of sequence number 12 of a sequence table, and sequence number 13 and / or 14 of a sequence table, a complementary, or reverse complement is any of sequence number 3-6 of a sequence table. A licorice plant strain having such a sequence can be detected. Moreover, the identification marker which consists of a sequence which is the same as that of sequence number 15 of a sequence table, and sequence number 16 and / or 17 of a sequence table, a complementary or reverse complement is any of sequence number 7 and 8 of a sequence table. A licorice plant strain having such a sequence can be detected, and an identification marker comprising a sequence identical to, complementary to, or reversely complementary to the sequences of SEQ ID NOs: 18 and 19 in the sequence listing is represented by SEQ ID NO: 9 of the sequence listing. Licorice plant strains having the sequence can be detected. Since the licorice plant strain having any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 is a strain having a high content of secondary metabolites including glycyrrhizic acid, use an identification marker having the sequence of SEQ ID NOs: 10 to 19 Thus, a licorice plant strain having a high secondary metabolite content can be detected.
（増殖方法）
本発明の実施形態に係る植物体の増殖方法は、植物体の茎を挿し穂として、挿し床に挿すことにより、植物体の個体数を増やす方法である。本増殖方法では、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源、発根促進剤が含まれた液体培地などを必要としないため、安価で、かつ、簡単な操作で、植物体を増殖することができる。
(Proliferation method)
The method for growing a plant according to an embodiment of the present invention is a method for increasing the number of plant bodies by inserting the stem of the plant body into an insertion floor as an insertion ear. Since this growth method does not require carbon dioxide fertilization, a light source of a specific wavelength range, a liquid medium containing a rooting promoter, etc., the plant can be grown at a low cost and with a simple operation. .
まず、植物体の茎葉部（地上部）を（親）株の根元より切除し、茎葉部の根元を直ちに純水に浸ける。次に、茎葉部からすべての葉を切除して２節を含む約３〜１０ｃｍ長の茎切片を調製し、茎切片を直ちに純水に浸ける。次に、純水を流しながら（流水処理しながら）茎切片を、閉鎖温室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で１時間、静置する。次に、鉢に充填したバーミキュライトを純水で良く湿潤させて中央に穴を開け、静置した茎切片を挿し木する。そして、挿し木した茎切片を、１日１回１０分間、灌水しながら、グロースチャンバー室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%、照度25,000〜30,000 lux）で栽培する。 First, the foliage part (ground part) of the plant body is excised from the root of the (parent) strain, and the root part of the foliage is immediately immersed in pure water. Next, all the leaves are cut from the stem and leaves to prepare a stem section having a length of about 3 to 10 cm including 2 nodes, and the stem section is immediately immersed in pure water. Next, the stem section is allowed to stand in a closed greenhouse (25 ° C., 16 hours light period, relative humidity 60%) for 1 hour while flowing pure water (with running water treatment). Next, the vermiculite filled in the pot is thoroughly moistened with pure water, a hole is made in the center, and the stationary stem section is cut. Then, the cut stem section is cultivated in a growth chamber (25 ° C., 16 hours light period, 60% relative humidity, illuminance 25,000 to 30,000 lux) while irrigating once a day for 10 minutes.
以上の手順で植物体を栽培することにより、同一クローン由来の株を多数栽培できるため、植物体の大量増殖に有用である。また、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源、特定の液体培地などを必要としないため、安価で、かつ、簡単な操作で、植物体を増殖することができる。さらに、これらの手順は、全て閉鎖温室内で行うことができるため、気候の影響などを受けずに栽培でき、また、一年を通じての収穫が可能になるという利点がある。 By cultivating a plant body according to the above procedure, many strains derived from the same clone can be cultivated, which is useful for mass growth of the plant body. Moreover, since carbon dioxide fertilization, a light source in a specific wavelength range, a specific liquid medium, and the like are not required, a plant can be grown at a low cost and with a simple operation. Furthermore, since all of these procedures can be performed in a closed greenhouse, they can be cultivated without being affected by the climate, and can be harvested throughout the year.
本植物体は、配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなる植物であるが、これらのカンゾウ属植物に限定されず、マオウ属植物のシナマオウなどの薬用植物であってもよい。また、葉を切除する植物体の茎切片長は、植物体、栽培環境などによって適宜変更できる。 This plant body is a plant consisting of a licorice plant strain having any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, but is not limited to these licorice plants, and is a medicinal plant such as cinnamon Also good. Further, the stem section length of the plant body from which the leaf is cut can be appropriately changed depending on the plant body, the cultivation environment, and the like.
親株の植え付け材料は、特に限定されない。例えば、種子から苗を育成し、その苗を増殖（栽培）に供してもよいし、水耕栽培・圃場栽培・組織培養などにより得られたカンゾウ属植物株を栽培に供してもよいし、それらの株から所定長の茎切片を調製し、その茎切片を栽培に供してもよい。 The planting material for the parent strain is not particularly limited. For example, seedlings are grown from seeds, the seedlings may be subjected to growth (cultivation), or licorice plant strains obtained by hydroponics, field cultivation, tissue culture, etc. may be subjected to cultivation, A stem section of a predetermined length may be prepared from these strains, and the stem section may be subjected to cultivation.
温度、湿度、照度、照明時間などの栽培環境は、植物体によって適宜変更でき、また、流水処理時間も任意である。また、茎切片を洗浄する水は、純水に限定されず、窒素分、リン分、カリウム分、金属成分などの植物の生長に必要な成分を含有する水溶液を用いることもできるし、水道水あるいは井戸水を用いることもできる。また、茎切片を純水に浸漬する時間は、植物体によって適宜変更できる。 Cultivation environments such as temperature, humidity, illuminance, and lighting time can be appropriately changed depending on the plant body, and running water treatment time is also arbitrary. The water for washing the stem section is not limited to pure water, and an aqueous solution containing components necessary for the growth of plants such as nitrogen, phosphorus, potassium and metal components can be used, and tap water can be used. Or well water can also be used. Moreover, the time for immersing the stem section in pure water can be appropriately changed depending on the plant body.
茎切片は、任意の節数を含むものを用いることができ、例えば、１節でも良いし、３節以上でも良い。茎切片を、２以上の節を含むように２〜２０ｃｍ程度の長さに調製することが好ましく、より好ましくは３〜１０ｃｍ程度の長さに調製することである。茎切片の調製は、例えば、鋏・カッター・メスなど、公知の切断手段などを用いて行うことができる。 As the stem section, one containing any number of nodes can be used. For example, the stem section may be one node or three or more nodes. It is preferable to prepare the stem section to a length of about 2 to 20 cm so as to include two or more nodes, and more preferably to a length of about 3 to 10 cm. Stem slices can be prepared, for example, using a known cutting means such as a scissors, a cutter, or a knife.
挿し木に用いる土（支持体）は、バーミキュライトに限定されず、公知の支持体を用いることができる。例えば、ロックウール、ハイドロボール、ココピート、パミスサンド、オアシス及び、これらの混合物を用いることもできる。また、養液肥料、オーキシンなどの発根促進剤、メネデールなどの植物活力素を用いてもよい。 The soil (support) used for cutting is not limited to vermiculite, and a known support can be used. For example, rock wool, hydroball, cocopyt, pumice sand, oasis, and mixtures thereof can be used. Moreover, you may use nutrient solution fertilizer, rooting promoters, such as auxin, and plant vitality elements, such as Menedale.
植物体を栽培するための養液は、水、又は、窒素分、リン分、カリウム分、金属成分などの植物の生長に必要な成分を含有する水溶液であればよく、公知のものを用いることができる。 The nutrient solution for cultivating the plant body may be water or an aqueous solution containing components necessary for plant growth such as nitrogen, phosphorus, potassium, and metal components, and a known solution should be used. Can do.
（水耕栽培装置）
本発明の実施形態に係る水耕栽培装置１００について、図１を参照して説明する。水耕栽培装置１００は、主として根を薬用部位とする薬用植物の栽培に適しており、植物を支持するためにパミスサンドなどの支持体を有さないため、より簡便に、低コストで、植物体を栽培できる装置である。
(Hydroculture device)
A hydroponic cultivation apparatus 100 according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. The hydroponic cultivation apparatus 100 is suitable for the cultivation of medicinal plants mainly having roots as medicinal sites, and does not have a support such as pumice sand to support the plant, so that the plant body is simpler and less expensive. It is a device that can grow.
水耕栽培装置１００は、養液槽１１０、上板部１２０、筒状部１３０、支持部１４０、養液１５０、水位変動手段（図示せず）を備える。 The hydroponic cultivation apparatus 100 includes a nutrient solution tank 110, an upper plate portion 120, a cylindrical portion 130, a support portion 140, a nutrient solution 150, and a water level changing means (not shown).
養液槽１１０は、養液１５０を貯留するための槽である。養液槽１１０の上端開口部には、上板部１２０が載置される。 The nutrient solution tank 110 is a tank for storing the nutrient solution 150. The upper plate portion 120 is placed in the upper end opening of the nutrient solution tank 110.
養液槽１１０は、例えば、外寸：幅55.1cm×奥行39.9cm×高さ30.7cmからなるポリプロピレン製コンテナであるが、公知のものを広く利用でき、特に限定されない。また、材質は、特に限定されないが、長期間、養液１５０を貯留しても劣化の少ないものが好ましい。例えば、熱可塑性樹脂（高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂など）製のもの、発泡性樹脂（発泡ポリスチレン、発泡ポリプロピレン、発泡ポリウレタンなど）製のものなどを利用できる。 The nutrient solution tank 110 is a polypropylene container having, for example, outer dimensions: width 55.1 cm × depth 39.9 cm × height 30.7 cm, but well-known containers can be widely used and are not particularly limited. Moreover, although a material is not specifically limited, A thing with little deterioration is preferable even if the nutrient solution 150 is stored for a long period of time. For example, those made of thermoplastic resin (high density polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polystyrene, ABS resin, AS resin, acrylic resin, etc.), those made of foamable resin (foamed polystyrene, foamed polypropylene, foamed polyurethane, etc.), etc. Can be used.
上板部１２０は、植物体を定植するための１又は複数の穴１２１が形成され、穴１２１には、支持部１４０により支持（固定）された植物体が設置される。 The upper plate part 120 is formed with one or a plurality of holes 121 for planting a plant body, and the plant body supported (fixed) by the support part 140 is installed in the hole 121.
上板部１２０の材質は、公知のものを用いることができ、特に限定されないが、一定の強度を有し、外力によって変形せず、耐水性があり、長期間の栽培によっても溶解・腐食しない素材が好ましい。例えば、発泡性樹脂（発泡スチロール、ポリスチレンフォーム、発泡ポリプロピレン、硬質発泡ウレタンなど）製のもの、軽量プラスチック、木材、同形状のポリタンクなどは、比較的安価で、目的の形状に成形・加工しやすく、耐久性にも優れ、好適である。 A known material can be used as the material of the upper plate part 120, and it is not particularly limited, but has a certain strength, is not deformed by an external force, has water resistance, and does not dissolve or corrode even after long-term cultivation. A material is preferred. For example, those made of foamable resin (such as polystyrene foam, polystyrene foam, foamed polypropylene, rigid foamed urethane, etc.), lightweight plastic, wood, and plastic tanks of the same shape are relatively inexpensive and easy to mold and process into the desired shape. It is excellent in durability and suitable.
筒状部１３０は、植物体の根部をその筒内で伸長させ、また、管内の根の過度の乾燥を防ぎ、養液を根に供給するためのものであり、筒状部１３０の上端開口部に植物体が設置される。筒状部１３０は、上板部１２０の穴１２１から挿入され、養液槽１１０内で略鉛直方向に形成されるよう設置される。筒状部１３０は、例えば、不織布からなり、養液１５０を吸収し、毛細管現象により、植物体の根部に養液１５０を供給する。筒状部１３０の下端開口部、養液１５０を吸収する側面部から、養液１５０が自由に出入りでき、養液槽１１０内の水位と筒状部１３０内の水位がほぼ同じになるように形成されている。 The cylindrical part 130 is for extending the root part of the plant body in the cylinder, preventing excessive drying of the roots in the pipe, and supplying nutrient solution to the root. A plant is installed in the part. The cylindrical part 130 is inserted from the hole 121 of the upper plate part 120 and installed so as to be formed in a substantially vertical direction in the nutrient solution tank 110. The tubular portion 130 is made of, for example, a nonwoven fabric, absorbs the nutrient solution 150, and supplies the nutrient solution 150 to the root of the plant body by capillary action. The nutrient solution 150 can freely enter and exit from the lower end opening of the cylindrical portion 130 and the side portion that absorbs the nutrient solution 150, so that the water level in the nutrient solution tank 110 and the water level in the cylindrical portion 130 are substantially the same. Is formed.
筒状部１３０の長さ・径の大きさは、植物種や根部の太さ・長さに応じて、適宜設定できる。例えば、筒状部１３０の長さは１０ｃｍ〜１ｍ、孔径は直径２〜２０ｃｍが好適である。また、筒状部１３０の材質は、吸水性および通気性が高く略筒型形状を有する公知のものを用いることができる。 The length and diameter of the cylindrical portion 130 can be appropriately set according to the plant species and the thickness and length of the root portion. For example, the length of the cylindrical portion 130 is preferably 10 cm to 1 m, and the hole diameter is preferably 2 to 20 cm. Moreover, the material of the cylindrical part 130 can use the well-known thing which has high water absorption and air permeability, and has a substantially cylindrical shape.
支持部１４０は、植物体（の基部、根部）を支持するためのものであり、例えば、水分を吸収するスポンジ状の部材から形成される。植物体の基部、根部に支持部１４０が巻き付けられ、支持部１４０が巻き付けられた植物体が上板部１２０の穴１２１から差し込まれることにより、植物体が筒状部１３０に固定され、設置される。 The support part 140 is for supporting a plant body (its base part, root part), and is formed of, for example, a sponge-like member that absorbs moisture. The support part 140 is wound around the base part and the root part of the plant body, and the plant body around which the support part 140 is wound is inserted from the hole 121 of the upper plate part 120, whereby the plant body is fixed to the tubular part 130 and installed. The
支持部１４０の長さ・径の大きさは、植物種や根部の太さ・長さに応じて、適宜設定できる。また、支持部１４０の材質は、合成樹脂製の板状物など、公知のものを用いることができる。 The length and diameter of the support part 140 can be appropriately set according to the plant species and the thickness and length of the root part. Moreover, the material of the support part 140 can use a well-known thing, such as a synthetic resin plate-shaped object.
養液１５０は、水若しくは肥料・各種栄養素などが溶解した水であり、養液槽１１０に貯留される。養液１５０は、栽培する植物種などに応じて、公知のものを適宜利用できる。 The nutrient solution 150 is water in which water or fertilizers and various nutrients are dissolved, and is stored in the nutrient solution tank 110. As the nutrient solution 150, a known solution can be appropriately used depending on the plant species to be cultivated.
水位変動手段は、養液槽１１０に貯留される養液１５０の水位を調節するものである。水位変動手段は、例えば、供給ポンプ、排水ポンプ、水位センサー、植物体感知センサー、タイマーなどから構成され、養液１５０の量（水位）、養液１５０の給排水速度、タイミングなどを制御する。 The water level changing means adjusts the water level of the nutrient solution 150 stored in the nutrient solution tank 110. The water level changing means is composed of, for example, a supply pump, a drainage pump, a water level sensor, a plant body sensor, a timer, and the like, and controls the amount (water level) of the nutrient solution 150, the supply / drain rate of the nutrient solution 150, timing, and the like.
水位変動手段は、植物体が水耕栽培装置１００に設置（定植）されてから、植物体の根部の先端が、養液槽１１０の上端位置（開口部）と下端位置（底面部）との中間位置（または、筒状部１３０の上端位置と下端位置との中間位置）に達するまで、養液１５０の水位をこの中間位置より上の位置になるように設定し、植物体の根部の先端がこの中間位置に達した後は、養液１５０の水位を中間位置より下の位置になるように設定する。より好ましくは、水位変動手段は、植物体の根部の先端が中間位置に達するまで、養液１５０の水位を、養液槽１１０の上端位置から１〜１０ｃｍ下の位置、または、５ｃｍ下に設定し、植物体の根部の先端が中間位置に達した後は、養液１５０の水位を、養液槽１１０の下端位置から１〜１０ｃｍ上の位置、または、５ｃｍ上に設定する。 After the plant body is installed (fixed planting) in the hydroponic cultivation apparatus 100, the water level changing means is configured so that the tip of the root of the plant body is located between the upper end position (opening portion) and the lower end position (bottom portion) of the nutrient solution tank 110. Until reaching the intermediate position (or the intermediate position between the upper end position and the lower end position of the tubular part 130), the water level of the nutrient solution 150 is set to be a position above this intermediate position, and the tip of the root of the plant body After reaching the intermediate position, the water level of the nutrient solution 150 is set to a position below the intermediate position. More preferably, the water level changing means sets the water level of the nutrient solution 150 to a position 1 to 10 cm below or 5 cm below the upper end position of the nutrient solution tank 110 until the tip of the root of the plant body reaches an intermediate position. And after the front-end | tip of the root part of a plant body reaches an intermediate position, the water level of the nutrient solution 150 is set to the position 1-10 cm above the lower end position of the nutrient solution tank 110, or 5 cm above.
養液１５０の水位は、植物体の根部の大きさ（長さ）、養液槽１１０の大きさ（深さ）に応じて、適宜設定できるものであり、植物体の根部（特に細根）に養液１５０を供給できればよいため、植物体の根部の伸長に合わせて、逐次設定変更できる。また、養液１５０の水位を変動（設定変更）した場合、また、定期的に、植物体の根部から生長した細根を切除することもできる。 The water level of the nutrient solution 150 can be appropriately set according to the size (length) of the root portion of the plant body and the size (depth) of the nutrient solution tank 110, and the root level of the plant body (particularly the fine root). Since it is only necessary to supply the nutrient solution 150, the setting can be sequentially changed according to the elongation of the root of the plant body. Moreover, when the water level of the nutrient solution 150 is changed (setting change), the fine roots grown from the root of the plant body can also be removed periodically.
水耕栽培装置１００で栽培する植物体の種類は特に限定されないが、カンゾウ属植物体、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物体に適用できる。また、水耕栽培装置１００は、グロースチャンバー室、閉鎖温室、ガラス温室、ビニールハウス、培養庫など、植物の生育に必要な環境を提供できる任意の場所に設置される。例えば、水耕栽培装置１００は、グロースチャンバー室内に設置され、グロースチャンバー室内において、温度、湿度、照明時間が適宜設定変更され、植物体を栽培するのに適した環境が提供される。 Although the kind of plant body cultivated with the hydroponic cultivation apparatus 100 is not specifically limited, It can apply to the licorice genus plant body and the licorice genus plant body which has the arrangement | sequence of any one of sequence number 1-9 of a sequence table. Moreover, the hydroponic cultivation apparatus 100 is installed in arbitrary places which can provide an environment required for the growth of plants, such as a growth chamber room, a closed greenhouse, a glass greenhouse, a greenhouse, and an incubator. For example, the hydroponic cultivation apparatus 100 is installed in a growth chamber room, and the temperature, humidity, and lighting time are appropriately set and changed in the growth chamber room, and an environment suitable for cultivating a plant body is provided.
以上のように、水耕栽培装置１００を用いることにより、植物体の収穫部位（地下部組織）を肥大させることができる。また、水耕栽培装置１００では、植物体を支持するためにパミスサンドなどの支持体を使用していないため、より簡便に、低コストで、効率的に植物体を栽培できる。 As described above, by using the hydroponic cultivation apparatus 100, the harvested part (underground tissue) of the plant body can be enlarged. Moreover, since the hydroponic cultivation apparatus 100 does not use a support body such as pumice sand to support the plant body, the plant body can be cultivated more simply, efficiently at a low cost.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, an Example does not limit this invention.
（カンゾウ属植物の検出）
配列表の配列番号１０〜１９の配列からなる識別マーカー（プライマー）を用いて、配列番号１〜９の配列を有するカンゾウ属植物体を検出した。まず、各カンゾウ属植物体から葉１枚を採取し、採取した葉及びステンレスビーズ（φ4.8mm）２個を2.0mL滅菌凍結保存チューブ（アシスト製）に取り、ビーズ破砕装置（トミー精工製Micro Smash MS-100） を用いて葉を破砕し、DNeasy PlantMini Kit（QIAGEN製） を用いて各カンゾウ属植物体のゲノムDNAを調製した。
(Detection of licorice plants)
Licorice plants having the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 were detected using an identification marker (primer) comprising the sequences of SEQ ID NOs: 10 to 19 in the sequence listing. First, one leaf was collected from each licorice plant, and the collected leaves and two stainless beads (φ4.8mm) were placed in a 2.0mL sterilized cryopreservation tube (Assist), and the bead crusher (Tomy Seiko Micro) The leaves were crushed using Smash MS-100), and genomic DNA of each licorice plant was prepared using DNeasy PlantMini Kit (QIAGEN).
調製したゲノムDNAの溶液をそのまま、または、DNase free水を加え、10 ng/μLになるように希釈し、これを鋳型にGoTaq Green Master Mix（Promega製）またはExTaq（タカラバイオ製）を用いて、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン２を含むイントロン１〜イントロン２、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７、及び、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅した。増幅により得られたＰＣＲ増幅産物は、１％アガロースゲルで電気泳動し、増幅バンドのパターンを比較した。 Prepare the genomic DNA solution as it is or add DNase free water and dilute to 10 ng / μL, and use GoTaq Green Master Mix (Promega) or ExTaq (Takara Bio) as a template. The partial sequences of intron 1 to intron 2 containing exon 2 of the SQS2 gene, intron 7 of CYP88D6 gene, and intron 1 to intron 2 and exon 3 to intron 4 of the CYP72A154 gene were amplified. PCR amplification products obtained by amplification were electrophoresed on a 1% agarose gel, and the patterns of amplification bands were compared.
ＳＱＳ２遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１０の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１１の配列からなるリバースプライマーを用いた。また、イントロン７の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１２の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１３、１４の配列からなるリバースプライマーを用いた。また、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１５の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１６、１７の配列からなるリバースプライマーを用い、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のエキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１８の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１９の配列からなるリバースプライマーを用いた。 As a primer for amplifying a partial sequence of intron 1 to intron 2 of the SQS2 gene, a forward primer composed of the sequence of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer composed of the sequence of SEQ ID NO: 11 were used. As a primer for amplifying a partial sequence of intron 7, a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 12 and a reverse primer consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14 were used. In addition, as a primer for amplifying a partial sequence of intron 1 to intron 2 of the CYP72A154 gene, a forward primer composed of the sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer composed of the sequences of SEQ ID NOs: 16 and 17 were used, and exons 3 to 3 of the CYP72A154 gene As a primer for amplifying a partial sequence of intron 4, a forward primer composed of the sequence of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer composed of the sequence of SEQ ID NO: 19 were used.
ＳＱＳ２遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するＰＣＲ機器には、iCycler（Bio-Rad製）を、ＰＣＲ酵素には、Go Taq Green Master Mix（Promega製）を、それぞれ用いた。イントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、Go Taq Green Master Mix 3μL、forward primer(10 μM) 1μL、reverse primer (10 μM) 1 μL、鋳型ゲノムDNA 1μL (total 6μL)に調製し、94℃ 5 min(分) → [94℃ 30 sec(秒) → 58℃ 30 sec → 72℃ 1min]×30サイクル → 72℃ 10 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。 ICycler (manufactured by Bio-Rad) was used as a PCR apparatus for amplifying the partial sequence of intron 1 to intron 2 of the SQS2 gene, and Go Taq Green Master Mix (manufactured by Promega) was used as the PCR enzyme. As PCR conditions for amplifying partial sequences of intron 1 and intron 2, the PCR reaction solution per sample is Go Taq Green Master Mix 3 μL, forward primer (10 μM) 1 μL, reverse primer (10 μM) 1 μL, template genome Prepare DNA 1μL (total 6μL), 94 ℃ 5 min (min) → [94 ℃ 30 sec (second) → 58 ℃ 30 sec → 72 ℃ 1min] x 30 cycles → 72 ℃ 10 min → 4 ℃ ∞ PCR was performed.
また、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７の部分配列を増幅するＰＣＲ機器には、2720Thermal Cycler（ABI製）を、ＰＣＲ酵素には、ExTaq（タカラバイオ製）を、それぞれ用いた。イントロン７の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、ExTaq 0.1μL、10 × ExTaq buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、forward primer (10 μM) 1μL、reverse primer (10 μM) 1μL、ddH2O12.3μL、genome DNA (10 ng/μL) 2μLに調製し、94℃ 2 min → [94℃ 30 sec → 60℃ 30 sec → 72℃ 45 sec]×30サイクル → 72℃ 5 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。 Further, 2720 Thermal Cycler (manufactured by ABI) was used as a PCR device for amplifying a partial sequence of intron 7 of CYP88D6 gene, and ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) was used as a PCR enzyme. As PCR conditions for amplifying a partial sequence of intron 7, the PCR reaction solution per sample was ExTaq 0.1 μL, 10 × ExTaq buffer 2 μL, dNTPs 1.6 μL, forward primer (10 μM) 1 μL, reverse primer (10 μM) 1 μL , DdH 2 O 12.3 μL, genomic DNA (10 ng / μL) 2 μL, 94 ° C 2 min → [94 ° C 30 sec → 60 ° C 30 sec → 72 ° C 45 sec] x 30 cycles → 72 ° C 5 min → PCR was performed under the condition of 4 ° C ∞.
また、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅するＰＣＲ機器には、2720 Thermal Cycler（ABI製）を、ＰＣＲ酵素には、GoTaq Green Master Mix（Promega製）を、それぞれ用いた。イントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、Go Taq Green Master Mix 3μL、forward primer(10μM) 1μL、reverse primer (10μM)、鋳型ゲノムDNA 1μL (total 6μL) に調製し、94℃ 2 min → [94℃ 30sec → 62℃ 30sec → 72℃ 45 sec]×30サイクル → 72℃ 5 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。また、エキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、Go Taq Green Master Mix 3μL、forward primer(10μM) 1μL、reverse primer (10μM) 1μL、鋳型ゲノムDNA 1μL、ddH2O 4.5μL (total 15μL)に調製し、94℃ 2 min → [94℃ 30 sec → 60℃ 30sec → 72℃ 1 min]×30サイクル → 72℃ 5 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。 In addition, 2720 Thermal Cycler (manufactured by ABI) is used as a PCR device for amplifying partial sequences of intron 1 to intron 2 and exons 3 to intron 4 of CYP72A154 gene, and GoTaq Green Master Mix (manufactured by Promega) is used as a PCR enzyme. , Respectively. As PCR conditions for amplifying a partial sequence of intron 1 to intron 2, PCR reaction solution per sample is 3 μL of Go Taq Green Master Mix, 1 μL of forward primer (10 μM), reverse primer (10 μM), 1 μL of template genomic DNA (total PCR was performed under the conditions of 94 ° C. 2 min → [94 ° C. 30 sec → 62 ° C. 30 sec → 72 ° C. 45 sec] × 30 cycles → 72 ° C. 5 min → 4 ° C.∞. As PCR conditions for amplifying the partial sequence of exon 3 to intron 4, the PCR reaction solution per sample is Go Taq Green Master Mix 3 μL, forward primer (10 μM) 1 μL, reverse primer (10 μM) 1 μL, template genomic DNA Prepare 1 μL, ddH 2 O 4.5 μL (total 15 μL), 94 ° C. 2 min → [94 ° C. 30 sec → 60 ° C. 30 sec → 72 ° C. 1 min] × 30 cycles → 72 ° C. 5 min → 4 ° C. PCR was performed.
図２は、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。図２中において、λ/PstIはマーカーであり、１〜３２はＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンを区別するための名称であり、Ｇｕ２３２−６＃６はＧｕＴＳ７１−０８系統以外の実生クローンの名称である。同図に示すように、配列表の配列番号１２、１３の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の両方又は一方の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。このＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株は配列番号３〜６の配列を含むため、配列番号１２〜１４の識別マーカーは、配列番号３〜６の配列を有するカンゾウ属植物体を識別できる識別マーカーであることが明らかとなった。 FIG. 2 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product of the CYP88D6 gene. In FIG. 2, λ / PstI is a marker, 1-32 are names for distinguishing GuTS71-08 strain seedling clones, and Gu232-6 # 6 is a name of a seedling clone other than GuTS71-08 strain. . As shown in the figure, when the identification markers (primers) of SEQ ID NOs: 12 and 13 in the sequence listing were used, licorice plants having both or one of the GuIV1 strain and GuIV2 strain could be detected. Since this GuIV1 strain and GuIV2 strain include the sequences of SEQ ID NOs: 3 to 6, the identification markers of SEQ ID NOs: 12 to 14 are identification markers that can identify licorice plants having the sequences of SEQ ID NOs: 3-6. It became clear.
なお、配列番号１２、１４のプライマーセットではイントロン７配列を増幅可能であるのに対し、配列番号１２、１３のプライマーセットではＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株に特徴的なイントロン７配列のみの増幅が可能であった。また、ＧｕＩＶ１株とＧｕＩＶ２株では増幅されるイントロン７配列の長さが異なるため、お互いに区別が可能であった。 The primer set of SEQ ID NOs: 12 and 14 can amplify the intron 7 sequence, whereas the primer set of SEQ ID NOs: 12 and 13 can amplify only the intron 7 sequence characteristic of the GuIV1 and GuIV2 strains. there were. In addition, since the length of the amplified intron 7 sequence was different between the GuIV1 strain and the GuIV2 strain, they could be distinguished from each other.
図３は、ＳＱＳ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。図３中において、λ/PstIはマーカーであり、＃１〜＃３はウラルカンゾウ株を区別するための名称であり、＃１はＧｕＩＶ２株、＃２はＧｕ２−３−２株、＃３はＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１の株（Ｇｕ＃１１株）である。同図に示すように、配列表の配列番号１０、１１の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、＃３であるＧｕ＃１１株は、ＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するカンゾウ属植物体であるため、配列表の配列番号１０、１１の識別マーカーは、ＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、配列番号１０、１１の識別マーカーを用いた場合、Ｇｕ２−３−２株では、ＰＣＲ産物を与えないため（＃２）、配列番号１０、１１の識別マーカーを用いることにより、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列と、Ｇｕ２−３−２株タイプの配列とを識別（区別）できた。 FIG. 3 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product of the SQS2 gene. In FIG. 3, λ / PstI is a marker, # 1 to # 3 are names for distinguishing Uralcanzo strains, # 1 is a GuIV2 strain, # 2 is a Gu2-3-2 strain, and # 3 is It is a strain with strain identification number 11 (Gu # 11 strain) of a GuTS71-08 strain seedling clone. As shown in the figure, when the identification markers (primers) of SEQ ID Nos. 10 and 11 in the sequence listing were used, licorice plants having a GuIV2 strain type sequence could be detected. In addition, since the Gu # 11 strain which is # 3 is a licorice plant having a GuIV1 strain type sequence, the identification markers of SEQ ID Nos. 10 and 11 in the sequence listing are licorice plants having a GuIV1 strain type sequence. I was able to detect my body. Further, when the identification markers of SEQ ID NOS: 10 and 11 are used, the Gu2-3-2 strain does not give a PCR product (# 2), so by using the identification markers of SEQ ID NOs: 10 and 11, the GuIV1 strain, The sequence of the GuIV2 strain type and the sequence of the Gu2-3-2 strain type could be identified (differentiated).
図４は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。図４中において、λ/PstIはマーカーであり、＃１〜＃４はウラルカンゾウ株を区別するための名称であり、＃１はＧｕ２−３−２株、＃２はＧｕＩＶ２株、＃３はＧｕＩＶ１株、＃４はＧｕ＃１１株であり、＃５は水である。同図に示すように、配列表の配列番号１５、１６の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、Ｇｕ２−３−２株及びＧｕ＃１１株の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、配列表の配列番号１５、１７の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、配列表の配列番号１８、１９の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株及びＧｕ＃１１株の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。このため、配列番号１５〜１９の識別マーカーを用いることにより、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列、Ｇｕ２−３−２株タイプの配列、Ｇｕ＃１１株タイプの配列をそれぞれ識別（区別）できた。 FIG. 4 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of a PCR amplification product of CYP72A154 gene. In FIG. 4, λ / PstI is a marker, # 1 to # 4 are names for distinguishing Uralcanzo strains, # 1 is Gu2-3-2 strain, # 2 is GuIV2 strain, and # 3 is GuIV1 strain, # 4 is Gu # 11 strain, and # 5 is water. As shown in the figure, when the identification markers (primers) of SEQ ID NOs: 15 and 16 in the sequence listing were used, licorice plants having the sequences of the Gu2-3-2 strain and the Gu # 11 strain could be detected. Moreover, when using the identification markers (primers) of SEQ ID NOs: 15 and 17 in the sequence listing, licorice plants having the sequences of GuIV1 strain and GuIV2 strain could be detected. Moreover, when the identification markers (primers) of SEQ ID Nos. 18 and 19 in the sequence listing were used, licorice plants having the sequences of GuIV1 strain, GuIV2 strain and Gu # 11 strain could be detected. Therefore, by using the identification markers of SEQ ID NOs: 15 to 19, the GuIV1 strain, GuIV2 strain type sequence, the Gu2-3-2 strain type sequence, and the Gu # 11 strain type sequence could be identified (differentiated), respectively. .
以上の結果から、配列番号１０、１１の識別マーカーは、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列を有するＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株、つまり、配列番号１、２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別できた。また、配列番号１２〜１４の識別マーカーは、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列を有するＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株、つまり、配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別できた。また、配列番号１５〜１７の識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２部分における塩基配列、配列番号１８、１９の識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のエキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有するＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株及びＧｕ＃１１株、つまり、配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別できた。 From the above results, the identification markers of SEQ ID NOs: 10 and 11 are Gu2-3-2 strains, GuIV1 strains and GuIV2 strains having base sequences in exon 1 to exon 3 of the SQS2 gene, that is, SEQ ID NOs: 1 and 2 A licorice plant strain with sequence could be identified. Further, the identification markers of SEQ ID NOs: 12 to 14 have Gu2-3-2 strain, GuIV1 strain and GuIV2 strain having a base sequence in the intron 7 portion of the CYP88D6 gene, that is, any sequence of SEQ ID NOs: 3-6. A licorice plant strain could be identified. The identification markers of SEQ ID NOs: 15 to 17 are base sequences in the intron 1 to intron 2 portion of the CYP72A154 gene, and the identification markers of SEQ ID NOs: 18 and 19 are Gu2 having the base sequence in the exon 3 to intron 4 portion of the CYP72A154 gene. The strains of licorice having the sequence of any one of SEQ ID NOs: 7 to 9 could be identified, such as the -3-2 strain, the GuIV1 strain, the GuIV2 strain, and the Gu # 11 strain.
（グリチルリチン酸量の測定）
Ｇｕ＃１１株、及び、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列においてＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株から植出した植物体に含まれるグリチルリチン酸量を測定した。
(Measurement of the amount of glycyrrhizic acid)
Measures the amount of glycyrrhizic acid contained in plants planted from GuTS71-08 strain seedling clones having GuIV1 and / or GuIV2 strain type sequences in the intron 7 portion of Gu # 11 and CYP88D6 gene. did.
Ｇｕ＃１１株について、培養苗を径3cmのジフィーセブン水でふくらむタネまき土ポット（サカタのタネ製）に植出し、培養庫（25℃、14時間明期、相対湿度40%）で２９日間馴化後、ハイドロボールを支持体とする養液栽培装置に移植した。養液栽培装置に移植した培養苗を、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で２００日間、さらに閉鎖温室（25℃、14時間明期、相対湿度55%）で１６２日間（計３６２日間）養液栽培（マツザキ1号及びマツザキ2号、栽培２０６日後までは標準濃度の２５％、その後は標準濃度の５０％）した後、植物体を収穫し、植物体の根の収量及び二次代謝物含量を測定した。図５は、養液栽培３６２日後のＧｕ＃１１株の植物体を示す図である。図５に示す植物体について、根の収量及び二次代謝物含量を測定した。 For the Gu # 11 strain, the cultured seedlings are planted in a seed pot (made by Sakata Seed), which is inflated with 3cm diameter Jiffy Seven water, and cultured for 29 days in a culture chamber (25 ° C, 14 hours light period, relative humidity 40%) After acclimatization, it was transplanted to a hydroponic cultivation apparatus using a hydroball as a support. The cultured seedlings transplanted to the hydroponics device are grown for 200 days in a growth chamber (25 ° C, 16 hours light period, relative humidity 60%), and in a closed greenhouse (25 ° C, 14 hours light period, relative humidity 55%). After 162 days (a total of 362 days) hydroponics (Matsuzaki No. 1 and Matsuzaki No. 2, up to 206 days after cultivation, 25% of the standard concentration, and then 50% of the standard concentration), harvest the plant, Root yield and secondary metabolite content were measured. FIG. 5 is a diagram showing a plant body of Gu # 11 strain after 362 days of hydroponics. The root yield and secondary metabolite content of the plant shown in FIG. 5 were measured.
二次代謝物含量を測定する際の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）条件を以下のように設定した。HPLCのカラムに、TSKgel ODS-100V（径4.6mm×長さ250mm、粒径5μm、東ソー株式会社製）を、ガードカラムに、TSKguardgel ODS-100V（径3.2mm×長さ15mm、粒径5μm、東ソー株式会社製）を用いた。移動相に、アセトニトリル（溶媒A）と１％酢酸（溶媒B）とを混合して用いた。溶出開始から０〜２１分間は溶媒Aの混合比率を２０〜７６％に直線的に上げ、２１〜２２分間は溶媒Aの混合比率を７６〜１００％に直線的に上げ、２２〜２４分間は溶媒Aの混合比率を１００％にし、２４〜２５分間は溶媒Aの混合比率を１００〜２５％に直線的に下げ、流速1.0mL/min、カラム温度４０℃に設定した。定量検出はUV254nmで、定性検出（検出ピークの同定）はUV200〜400nmで行った。 High performance liquid chromatography (HPLC) conditions for measuring secondary metabolite content were set as follows. TSKgel ODS-100V (diameter 4.6 mm x length 250 mm, particle size 5 μm, manufactured by Tosoh Corporation) is used for the HPLC column, and TSKguardgel ODS-100V (diameter 3.2 mm × length 15 mm, particle size 5 μm) is used for the guard column. Tosoh Corporation) was used. A mixture of acetonitrile (solvent A) and 1% acetic acid (solvent B) was used for the mobile phase. From 0 to 21 minutes from the start of elution, the solvent A mixing ratio is linearly increased to 20 to 76%, and for 21 to 22 minutes, the solvent A mixing ratio is linearly increased to 76 to 100% and for 22 to 24 minutes. The mixing ratio of solvent A was set to 100%, the mixing ratio of solvent A was linearly decreased to 100 to 25% for 24 to 25 minutes, and the flow rate was set to 1.0 mL / min and the column temperature was set to 40 ° C. Quantitative detection was performed at UV 254 nm, and qualitative detection (detection peak identification) was performed at UV 200 to 400 nm.
その結果、Ｇｕ＃１１株の根（径1mm以上）の乾燥重量：4.82 g、グリチルリチン酸収量：129.2 mgであり、Ｇｕ＃１１株の乾燥根の二次代謝物含量は、グリチルリチン酸：2.68%乾燥重量、リキリチン：1.70%乾燥重量、イソリキリチン：0.15%乾燥重量、グリシクマリン：0.11%乾燥重量であった。このため、Ｇｕ＃１１株は、高二次代謝物生産能を有することが明らかとなった。 As a result, the dry weight of the root of Gu # 11 strain (diameter 1 mm or more) was 4.82 g, the yield of glycyrrhizic acid was 129.2 mg, and the secondary metabolite content of the dry root of Gu # 11 strain was glycyrrhizic acid: 2.68% The dry weight, liquiritin: 1.70% dry weight, isoliquiritin: 0.15% dry weight, and glycycmarin: 0.11% dry weight. For this reason, it was revealed that the Gu # 11 strain has a high secondary metabolite production ability.
また、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列においてＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株について、Ｇｕ＃１１株と同様に、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で８４〜９６日間、養液栽培した後、植物体の根における二次代謝物含量を測定した。二次代謝物含量を測定する際のHPLC条件は以下のように設定した。HPLCのカラムに、ACQUITY UPLC BEH C18（径2.0mm×長さ50mm、粒径1.7μm、waters製）を用いた。移動相に、0.1％ギ酸（溶媒A）とアセトニトリル（溶媒B）とを混合して用いた。溶出開始から0〜0.45分間は溶媒Aの混合比率を８０％に、０．４５〜６．５分間は溶媒Aの混合比率を８０〜３０％に直線的に下げ、６．５〜６．７５分間は溶媒Aの混合比率を３０〜０％に直線的に下げ、６．７５〜７分間は溶媒Aの混合比率を80%にし、流速0.8mL/min、カラム温度４０℃に設定した。定量検出は、グリチルリチン酸はUV254nmで、リキリチン及びイソリキリチンは316nmで、グリシクマリンは350nmで行った。 In addition, as for the GuTS71-08 strain seedling clone strain having a GuIV1 strain and / or GuIV2 strain type sequence in the intron 7 portion of the CYP88D6 gene, the growth chamber chamber (25 ° C., 16 hours) After the hydroponics for 84 to 96 days in the light period, relative humidity 60%, the secondary metabolite content in the root of the plant body was measured. The HPLC conditions for measuring the secondary metabolite content were set as follows. ACQUITY UPLC BEH C18 (diameter 2.0 mm × length 50 mm, particle diameter 1.7 μm, manufactured by waters) was used for the HPLC column. The mobile phase was mixed with 0.1% formic acid (solvent A) and acetonitrile (solvent B). From 0 to 0.45 minutes after the start of elution, the mixing ratio of solvent A is linearly decreased to 80%, and the mixing ratio of solvent A is linearly decreased to 80 to 30% for 0.45 to 6.5 minutes. The mixing ratio of solvent A was linearly lowered to 30 to 0% for minutes, the mixing ratio of solvent A was set to 80% for 6.75 to 7 minutes, the flow rate was set to 0.8 mL / min, and the column temperature was set to 40 ° C. Quantitative detection was performed at 254 nm for glycyrrhizic acid, 316 nm for liquiritin and isoliquiritin, and 350 nm for glycycumarin.
図６は、ＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株の植物体において、二次代謝物含量を測定した結果を示す図である。図６中において、ＩＶ１はＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列においてＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株であり、ＩＶ２は同塩基配列においてＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株であり、ＩＶ１＋ＩＶ２は、同塩基配列においてＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の両タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株である。また、７１＃１〜７１＃３２は、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株を区別するための名称である。同図に示すように、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株の植物体は、二次代謝物含量が高いことが明らかとなり、特にＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するクローンでは７１＃１２が、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するクローンでは７１＃１が、ＧｕＩＶ１株とＧｕＩＶ２株の両方のタイプを有するクローンでは７１＃３１が、二次代謝物含量割合が高い優良カンゾウ属植物株であることが明らかとなった。 FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring secondary metabolite content in a plant of a GuTS71-08 strain seedling clone strain having a GuIV1 strain and / or GuIV2 strain type sequence. In FIG. 6, IV1 is a GuTS71-08 strain seedling clone having a GuIV1 strain type sequence in the base sequence in the intron 7 portion of the CYP88D6 gene, and IV2 is a GuTS71-08 GuTS2 08-type sequence in the same base sequence. It is a lineage seedling clonal strain, and IV1 + IV2 is a GuTS71-08 lineage seedling clonal strain having both types of sequences of GuIV1 and GuIV2 in the same nucleotide sequence. Moreover, 71 # 1-71 # 32 is a name for distinguishing a GuTS71-08 system | strain seedling clone strain | stump | stock. As shown in the figure, it is clear that the plant body of the GuTS71-08 strain seedling clone strain having the GuIV1 strain and GuIV2 strain type sequences has a high secondary metabolite content, and in particular, the clone having the GuIV1 strain type sequence. 71 # 12 is a clone having a GuIV2 strain type sequence, 71 # 1 is a clone having both types of GuIV1 strain and GuIV2 strain, and 71 # 31 is a superior licorice plant having a high secondary metabolite content ratio. It became clear that it was a stock.
以上の結果から、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有する植物体、つまり、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、グリチルリチン酸を含む二次代謝物含量割合が高いカンゾウ属植物株であることが明らかとなった。 From the above results, plants having the GuIV1 strain and GuIV2 strain type sequences, that is, the licorice plant strain having any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 in the Sequence Listing are secondary metabolite content containing glycyrrhizic acid. It became clear that it is a licorice plant strain with a high ratio.
（カンゾウ属植物の挿し木による増殖）
高含量のグリチルリチン酸を生産する、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株を親株として、カンゾウ属植物の地上茎の挿し木による増殖を行った。
(Proliferation by cuttings of licorice plants)
The Gu # 11 strain, GuIV1 strain and GuIV2 strain, which produce a high content of glycyrrhizic acid, were used as parent strains to grow licorice plants by cuttings on the ground stem.
Ｇｕ＃１１株及びＧｕＩＶ１株については２２８日間、ＧｕＩＶ２株については２３６日間、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）でパミス（登録商標）を支持体とする養液栽培（大塚ハウス1号6g+大塚ハウス2号4g/8L、標準濃度の50%）した後、各株からなるカンゾウ属植物の地上茎（茎葉）を株の根元より切除し、直ちに純水を張った2Lポリビーカーに茎の根元を浸けた。全ての葉を茎より切除して2節を含む約3〜10cm長の茎切片を調製し、直ちに2Lポリビーカー中の純水に浸け、閉鎖温室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で１時間、純水による流水処理（水流の下に茎切片の入った2Lポリビーカーを置き、そのまま水を流しながら静置）を行った。シロイヌナズナ用屋内育成・種子回収キットアラシステム（ビーエム機器株式会社製）にバーミキュライト（有限会社タカムラ製）を充填し、純水で良く湿潤させて中央にピンセットで穴を開け、流水処理が完了した茎切片を挿し（挿し木し）、１日１回１０分間、アラトレイ（水受けトレイ）に灌水しながら、グロースチャンバー室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%、光源：岩崎電気社製メタルハライドランプセラルクス、照度25,000〜30,000 lux）で栽培管理した。 Hydroponic cultivation using Pumice (registered trademark) as a support in a growth chamber (25 ° C, 16 hours light period, 60% relative humidity) for 228 days for Gu # 11 and GuIV1 strains and 236 days for GuIV2 strains (Otsuka House No. 1 6g + Otsuka House No. 2 4g / 8L, 50% of the standard concentration), then the ground stems (stems and leaves) of the licorice genus plants consisting of each strain were excised from the root of the strain, and immediately 2L filled with pure water I dipped the root of the stem in a poly beaker. Cut out all leaves from the stem and prepare a stem section of about 3-10cm length including 2 nodes. Immediately soak in pure water in a 2L poly beaker and place in a closed greenhouse (25 ° C, 16 hours light period, relative humidity 60%) for 1 hour with pure water (2 L polybeaker with a stalk section was placed under the water flow and left still while flowing water). Stem after completion of running water treatment by filling vermiculite (manufactured by Takamura Co., Ltd.) with vermiculite (manufactured by Takamura Co., Ltd.), dampening well with pure water, and making a hole with tweezers in the center. Insert a section (cutting) once a day for 10 minutes while irrigating the aura tray (water tray), in the growth chamber (25 ° C, 16 hours light period, relative humidity 60%, light source: Metal halide manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.) Cultivation management was carried out at a lamp cerralx, illuminance 25,000-30,000 lux
図７（ａ）〜（ｃ）は、挿し木から３１日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株を示す図である。また、表１は、挿し木から３７日後のＧｕ＃１１株及び３８日後のＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の発根率の結果である。さらに、図８は、発根した挿し木苗を水耕栽培装置に移植した後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。
図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、カンゾウ属植物の地上茎を挿し木することにより、カンゾウ属植物株を増殖できた。また、表１に示すように、各株の発根率は、Ｇｕ＃１１株：60.0%、ＧｕＩＶ１株：61.3%、ＧｕＩＶ２株：62.6%であった。さらに、図８に示すように、挿し木苗は、発根後も生育し続けることが明らかとなった。 As shown in FIGS. 7 (a) to (c), a licorice plant strain could be grown by cutting a ground stem of a licorice plant. Moreover, as shown in Table 1, the rooting rate of each strain was Gu # 11 strain: 60.0%, GuIV1 strain: 61.3%, and GuIV2 strain: 62.6%. Furthermore, as shown in FIG. 8, it has been clarified that cutting seedlings continue to grow even after rooting.
以上の結果から、カンゾウ属植物を堀上収穫してストロンを調製することなく、カンゾウ属植物の地上茎を挿し木することにより増殖が可能であり、さらに、挿し木苗も水耕栽培によりに旺盛に生育する。このため、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、及び、ＧｕＩＶ２株、つまり、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物は、容易にかつ指数的に増殖可能な株であることが明らかとなった。 From the above results, it is possible to proliferate by cutting the stalk of the licorice plant by cutting the ground stem of the genus licorice, without harvesting the licorice plant by moat and preparing the stron, and the cutting seedlings also grow vigorously by hydroponics . Therefore, the Gu # 11 strain, the GuIV1 strain, and the GuIV2 strain, that is, the licorice plant having any one of the sequence numbers 1 to 9 in the sequence listing is a strain that can easily and exponentially grow. It became clear.
（水耕栽培装置）
支持体を使用していない水耕栽培装置を用いて、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、及び、ＧｕＩＶ２株を栽培した。
(Hydroculture device)
The Gu # 11 strain, the GuIV1 strain, and the GuIV2 strain were cultivated using a hydroponic cultivation apparatus that did not use the support.
ストロン挿しにより増殖させたＧｕＩＶ１株のストロン部、及び、地上茎挿し木により増殖させたＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株の茎の基部を、予め水で湿らせたアクアサプライヤｆマットSR180（幅3cm×長さ17.5cm）で包み、予め水で湿らせたフロートミニ用苗床スポンジ（径5.1cm）に挟み、径4cmの穴を有する本実施形態の水耕栽培装置に設置した。また、同苗の基部を予め水で湿らせたフロートミニ用苗床スポンジ（径5.1cm）に挟み、その周りを予め水で湿らせたアクアサプライヤｆマットSR180（幅12.5cm×17.5cmで円筒型に成型）で包み、径4cmの穴を有する実施形態に係る水耕栽培装置（養液槽の外寸cm：縦68.4×横42.3×高さ16、養液面が高い状態に相当）に設置した。肥料養液（大塚ハウス1号6g+大塚ハウス2号4g/8L：標準濃度の50%）をタンクに入れ、水面の高さを苗床スポンジがある水耕栽培装置の上面から約5cm下（または、苗の基部から約10cm下）に保ちながら水耕栽培を行った。 Aqua supplier f mat SR180 (width 3 cm × length) in which the stron part of GuIV1 strain grown by insertion of stron and the bases of stems of Gu # 11 and GuIV2 strains grown by cuttings on the ground were previously moistened with water. 17.5 cm), sandwiched between float mini nursery sponges (diameter 5.1 cm) previously moistened with water, and installed in the hydroponic cultivation apparatus of this embodiment having a 4 cm diameter hole. Aqua supplier f mat SR180 (12.5 cm x 17.5 cm in width and cylindrical shape), the base of the seedling is sandwiched between float mini nursery sponges (diameter 5.1 cm) previously moistened with water ) And installed in a hydroponic cultivation apparatus according to an embodiment having a hole with a diameter of 4 cm (external size cm of nutrient solution tank: vertical 68.4 × horizontal 42.3 × height 16, equivalent to a high nutrient surface) did. Put the fertilizer nutrient solution (Otsuka House No. 1 6g + Otsuka House No. 2 4g / 8L: 50% of the standard concentration) into the tank, and the water level is about 5cm below the top of the hydroponics device with the nursery bed sponge (or Hydroponic cultivation was carried out while maintaining the seedling at about 10 cm below the base.
図９（ａ）、（ｂ）は、水耕栽培を開始してから１週間後、５週間後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。同図に示すように、支持体を使用していない水耕栽培装置を用いても、カンゾウ属植物株を栽培することができた。 FIGS. 9A and 9B are diagrams showing the Gu # 11 strain and the GuIV2 strain one week and five weeks after the start of hydroponics. As shown in the figure, the licorice plant strain could be cultivated even using a hydroponic cultivation apparatus that did not use a support.
次に、水耕栽培装置を用いて水耕栽培開始２５〜７８日後に、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１、ＧｕＩＶ２株の地上茎を切除して植物体を穴から抜き取り、苗床スポンジとアクアサプライヤｆマットSR180を取り除いて根の最大根幅を計測した。 Next, 25 to 78 days after the start of hydroponic cultivation using a hydroponic cultivation apparatus, the ground stems of Gu # 11, GuIV1, and GuIV2 are excised and the plant body is extracted from the hole, and the nursery sponge and aqua supplier f mat SR180. And the maximum root width of the roots was measured.
図１０（ａ）、（ｂ）は、水耕栽培を開始してから７１日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。同図に示すように、各株の根の気相部分（養液面より上の部分）が肥大し、細根（養液面より下の部分）が発達した。 FIGS. 10A and 10B are diagrams showing the Gu # 11 strain and the GuIV2 strain 71 days after the start of hydroponics. As shown in the figure, the gas phase part (the part above the nutrient solution surface) of the root of each strain was enlarged and the fine root (the part below the nutrient solution surface) was developed.
次に、各株の細根を切除して、再び苗の基部を予め水で湿らせたフロートミニ用苗床スポンジ（径5.1cm）に挟み、その周りを予め水で湿らせたアクアサプライヤｆマットSR180（幅12.5cm×30cmの上下2ヶ所をホッチキスでとめ、円筒型に成型）で包み、径4cmの穴を有する本実施形態の水耕栽培装置（養液槽の外寸cm：縦55.1×横39.9×高さ30.7、養液面が低い状態に相当）に設置した。養液槽の水面の高さを、水耕栽培装置の下面から5〜15cm（または、苗の基部から15〜25cm）を維持するように肥料養液（大塚ハウス1号6g+大塚ハウス2号4g/8L：標準濃度の50%）を供給しながら、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で、さらに水耕栽培を行った。水耕栽培５３〜６６日後（はじめの水耕栽培から９１〜１４２日後）に植物体の地下部を収穫し、根の生育、収量及び二次代謝物含量の調査を行った。 Next, aqua supplier f mat SR180 was prepared by excising the fine roots of each strain and sandwiching the base of the seedling again with a float mini nursery sponge (diameter 5.1 cm) previously moistened with water. The hydroponic cultivation device of this embodiment having a 4cm diameter hole (wrapped in a cylindrical shape). 39.9 x height 30.7, corresponding to a state where the nutrient solution level is low). Fertilizer nutrient solution (Otsuka House No. 1 6g + Otsuka House No. 2 4g) to maintain the water level of the nutrient solution tank at 5-15cm from the bottom of the hydroponics device (or 15-25cm from the base of the seedling) Hydroponic cultivation was further performed in a growth chamber room (25 ° C, 16 hours light period, relative humidity 60%) while supplying / 8L (50% of the standard concentration). The underground part of the plant body was harvested 53 to 66 days after hydroponics (91 to 142 days after the first hydroponics), and the root growth, yield and secondary metabolite content were investigated.
図１１（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る水耕栽培装置（養液面が低い状態に相当）に移植した直後、移植してから１３日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。また、図１２（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る水耕栽培装置を用いて水耕栽培を開始してから１３７日後（養液面が低い状態の装置に移植してから６６日後）のＧｕ＃１１株、１４２日後（養液面が低い状態の装置に移植してから６６日後）のＧｕＩＶ２株を示す図である。また、図１３は、水耕栽培を行ったＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の植物体において、根の収量、グリチルリチン酸収量及び二次代謝物含量を測定した結果を示す図である。また、表２は、実施形態に係る水耕栽培装置を用いて水耕栽培を開始してから１３７〜１４２日後（養液面が低い状態の装置に移植してから６４〜６６日後）のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の生育結果である。
図１１（ａ）、図１１（ｂ）、図１２（ａ）、図１２（ｂ）、表２に示すように、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株は、支持体を使用していない水耕栽培装置を用いても生育し、すべての株で根の肥大が認められた。特にＧｕ＃１１株は、最大根幅が1cm以上であり、径2mm以上の根の長さも最大であった。また、図１３に示すように、水耕栽培後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株の根（径2mm以上）のグリチルリチン酸含量は、Ｇｕ＃１１株：0.83%、ＧｕＩＶ１株：1.26%、ＧｕＩＶ２株：1.05%と高く、他の二次代謝物も多く生産されていた。 As shown in FIG. 11 (a), FIG. 11 (b), FIG. 12 (a), FIG. 12 (b), and Table 2, Gu # 11 strain, GuIV1 strain, and GuIV2 strain do not use a support. It grew even with a hydroponic cultivation device, and root enlargement was observed in all strains. In particular, the Gu # 11 strain had a maximum root width of 1 cm or more, and the maximum length of roots having a diameter of 2 mm or more. Moreover, as shown in FIG. 13, the glycyrrhizic acid content of the roots (diameter 2 mm or more) of the Gu # 11 strain, GuIV1 strain and GuIV2 strain after hydroponics is as follows: Gu # 11 strain: 0.83%, GuIV1 strain: 1.26% , GuIV2 strain: as high as 1.05%, and many other secondary metabolites were also produced.
以上の結果から、支持体を使用していない水耕栽培装置を用いても、カンゾウ属植物を効率的に栽培でき、栽培したカンゾウ属植物の根部からグリチルリチン酸を含む二次代謝物を効率的に生産できることが明らかとなった。また、水耕栽培装置において支持体を使用していないため、より簡便で、低コストで、単位面積あたりの栽培株数の増加が可能である。また、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物は、水耕栽培でも効率的に栽培が可能である。 From the above results, even with a hydroponic cultivation device that does not use a support, licorice plants can be efficiently cultivated, and secondary metabolites containing glycyrrhizic acid are efficiently produced from the roots of the cultivated licorice plants. It became clear that it can be produced. Moreover, since the support body is not used in the hydroponic cultivation apparatus, the number of cultivated strains per unit area can be increased more easily and at low cost. Moreover, the licorice plant which has the arrangement | sequence of any one of sequence number 1-9 of a sequence table can be cultivated efficiently also by hydroponics.
１００ 水耕栽培装置
１１０ 養液槽
１２０ 上板部
１２１ 穴
１３０ 筒状部
１４０ 支持部
１５０ 養液
DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 Hydroponic cultivation apparatus 110 Nutrient solution tank 120 Upper plate part 121 Hole 130 Cylindrical part 140 Support part 150 Nutrient solution
Claims (7)
前記養液槽内に略鉛直方向に形成され、上端開口部にカンゾウ属植物の植物体を設置する一又は複数の筒状部と、
前記筒状部において当該植物体の基部を支持する支持部と、
前記養液槽内の養液の水位を変動させる水位変動手段と、を備え、
前記水位変動手段は、前記植物体の根部の先端が前記養液槽の上端位置と下端位置との間の中間位置に達するまで、前記養液の水位を当該中間位置より上の第１の位置に設定し、その後当該中間位置より下の第２の位置に設定する、
ことを特徴とするカンゾウ属植物の水耕栽培装置。 A nutrient solution tank for storing the nutrient solution;
One or a plurality of cylindrical parts that are formed in the nutrient solution tank in a substantially vertical direction, and set up plants of the genus plant in the upper end opening,
A support portion for supporting the base of the plant body in the tubular portion;
Water level changing means for changing the water level of the nutrient solution in the nutrient solution tank,
The water level changing means is configured to change the water level of the nutrient solution to a first position above the intermediate position until the tip of the root of the plant body reaches an intermediate position between the upper end position and the lower end position of the nutrient solution tank. And then set to a second position below the intermediate position,
Hydroponic cultivation apparatus for licorice plant characterized by the above.
ことを特徴とする請求項１に記載のカンゾウ属植物の水耕栽培装置。 The licorice plant comprises a licorice plant strain having a DNA represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 in the sequence listing.
The hydroponic cultivation apparatus of the licorice plant of Claim 1 characterized by the above-mentioned.
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のカンゾウ属植物の水耕栽培装置。 The first position is a position 1 to 10 cm below the upper end position of the nutrient solution tank, and the second position is a position 1 to 10 cm above the lower end position of the nutrient solution tank.
The hydroponic cultivation apparatus for licorice plants according to claim 1 or 2.
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のカンゾウ属植物の水耕栽培装置。 The cylindrical portion is formed of a material that absorbs the nutrient solution.
The hydroponic cultivation apparatus for licorice plants according to any one of claims 1 to 3.
請求項１乃至４の何れか１項に記載の水耕栽培装置を用いて栽培する工程を含み、当該水耕栽培装置における前記植物体の根部の先端が前記養液槽の上端位置と下端位置との間の中間位置に達するまで、前記養液の水位を当該中間位置より上の第１の位置に設定し、その後当該中間位置より下の第２の位置に設定する、
ことを特徴とする、カンゾウ属植物株の栽培方法。 Obtaining a plant of a licorice plant,
It includes the process of growing using the hydroponic cultivation apparatus of any one of Claims 1 thru | or 4, and the front-end | tip position of the root part of the said plant body in the said hydroponic cultivation apparatus is the upper end position and lower end position of the said nutrient tank Until reaching an intermediate position between, and the water level of the nutrient solution is set to a first position above the intermediate position, and then set to a second position below the intermediate position,
A method for cultivating a licorice plant strain,
カンゾウ属植物の植物体の茎葉部を株の根元より切除し、当該切除した茎葉部から葉を切除して茎切片を露出し、
前記露出した植物体の茎切片を水で湿潤し、
前記湿潤した植物体の茎切片を流水で処理し、
前記流水で処理した植物体の茎切片を挿し床に挿し木することによって増殖する工程を含むことを特徴とする、請求項５に記載のカンゾウ属植物株の栽培方法。 The step of obtaining a plant body of the licorice plant,
The stem and leaf part of the plant body of the licorice plant is excised from the root of the strain, the leaves are excised from the excised stem and leaf part, and the stem section is exposed.
Wetting the exposed stem section of the plant with water,
Treating the wet plant stem section with running water;
6. The method for cultivating a licorice plant strain according to claim 5, comprising a step of proliferating by inserting a stem section of the plant treated with running water and cutting it on a floor.
ことを特徴とする請求項６に記載のカンゾウ属植物株の栽培方法。 The plant body comprises a licorice plant strain having a DNA represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 in the Sequence Listing,
The cultivation method of the licorice plant strain of Claim 6 characterized by the above-mentioned.
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