JP6383938B2 - 高濃度脂肪組織由来間葉系幹細胞含有脂肪による声門閉鎖不全の治療 - Google Patents
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Description
[1]体脂肪と脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、声門閉鎖不全治療用細胞製剤。
[2]前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、前記体脂肪の2倍〜40倍に相当する量の体脂肪から分離された細胞である、[1]に記載の細胞製剤。
[3]脂肪組織由来間葉系幹細胞の含有量が、1ml当たり1.6×105個〜3.3×106個である、[1]に記載の細胞製剤。
[4]前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、体脂肪から分離した脂肪組織由来幹細胞を培養して得られた細胞である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の細胞製剤。
[5]生体から分離した体脂肪を有効成分とした第1構成要素と、脂肪組織由来間葉系幹細胞を有効成分とした第2構成要素と、からなるキットであることを特徴とする、[1]に記載の細胞製剤。
[6]脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その投与時に、生体から分離した体脂肪が併用投与されることを特徴とする、[1]に記載の細胞製剤。
[7]一側声帯麻痺に伴う声門閉鎖不全の治療に用いられる、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の細胞製剤。
[8]声門閉鎖不全治療用細胞製剤を製造するための、体脂肪と脂肪組織由来間葉系幹細胞の使用。
[9]声門閉鎖不全の患者に対して、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の細胞製剤を投与するステップを含む、声門閉鎖不全の治療法。
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物(ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等)を含む。免疫拒絶の問題を回避するため、本発明の細胞製剤を適用する対象(患者)と同一の個体から脂肪組織(自己脂肪組織)を採取することが好ましい。但し、同種の動物の脂肪組織(他家)又は異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団(本明細書では「SVF画分」ともいう)として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1〜10分間、800〜1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
SVF画分にはADSCsの他、他の細胞成分(内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等)が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞をADSCsとして本発明の細胞製剤に用いる。
本発明の一態様では、上記(3)の操作の代わりに又は上記(3)の操作の後に以下の低血清培養を行う。そして、その結果得られた細胞をADSCsとして本発明の細胞製剤に用いる。
SVF画分の細胞、上記選択培養(3)の結果得られた細胞、又は上記低血清培養(4)の結果得られた細胞を、別途用意した体脂肪と混合することにより、本発明の細胞製剤を構成することができる。得られた細胞を、体脂肪との混合の前に、生理食塩水や適当な緩衝液(例えばリン酸系緩衝液)等に懸濁しておくことにしてもよい。
声門閉鎖不全に対する有効な治療法を確立するため、ADSCsと脂肪の併用の有効性を検討することにした。具体的には、皮下の脂肪組織から分離装置を用いて抽出したADSCsを脂肪に混和することで高濃度ADSCs含有脂肪を作成し、これを内視鏡下に大型動物一側声帯麻痺モデルの声帯筋内に注入し、治療効果と安全性を検討した。
B−1.概要
対象動物:ブタ2頭(マイクロミニピッグ)
生産者:富士マイクラ株式会社
体重:約20kg
B−2a.右声帯麻痺モデル作製
手術時間:19分、48分
出血量:10ml以下
手術方法:全身麻酔下にて仰臥位で手術した。まず、超音波検査にて頸部の診察を行い、声帯、気管、甲状腺などの位置を確認し、輪状軟骨下縁にて皮膚を横切開し、周囲を剥離して甲状腺、輪状軟骨、甲状軟骨、気管を同定した。第2、3気管の右側深部にて右反回神経を確認した。神経周囲より遊離し剪刀にて切離し、両端を非吸収糸(絹糸2-0)にて結紮した。出血がないことを確認し、皮下(吸収糸;バイクリル3-0)皮膚(非吸収糸;絹糸1-0)で縫合した。その後に内視鏡にて右声帯が麻痺しているのを確認した後、全身麻酔から覚醒させた。覚醒後に呼吸状態が問題ないこと、嗄声になっていることを確認した。
手術時間:45分、85分
出血量:10ml以下
手術方法:全身麻酔下に仰臥位をとり、臨床で行うのと同様の手技で皮下にエピネフリン含有生理食塩液(0.001% )500 mlを注入し18Gの皮下脂肪吸引管にて50ml自己脂肪組織を吸引した。この組織から細胞分離装置CellutionTM (サイトリ・セラピューティクス社)により脂肪由来幹細胞を抽出した(5ml溶液となる)。止血を確認した後に腹部を包帯で圧迫した。
全身麻酔下にて仰臥位で喉頭展開をして、右声帯の麻痺が残存し、声帯の萎縮が見られることを確認した。Fat例用の移植材料として、脂肪1mlと乳酸リンゲル液0.5mlを混和し、計1.5mlとした。ADSCs例用の移植材料として、脂肪1mlとADSCs液0.5ml(脂肪5mlに含まれるADSCsに相当する)を混和し、計1.5ml(約0.5×106個のADSCsを含む)とした。内視鏡下にて両例ともに左声帯筋内に注入した。注入後は漏出のないように綿球にて刺入部をしばらく圧迫した。呼吸状態に問題ないことを確認し終了とした。
B−3a.超音波検査
全身麻酔下、仰臥位で頸部を固定して、全体をBモード、カラードプラー法にて観察した。
全身麻酔下、非挿管にて喉頭展開をした。軟性内視鏡(Karl Storz社製)を用いて経口的に両声帯の形状、色調、動きを観察した。両声帯を観察した。
喉頭展開をしてから、非接触式血流計を用いて左右声帯をそれぞれ計測し、記録した。20秒程度安定した数値が出るのを確認して、血流の値を計測し記録した。5回以上計測して、最高値をその時点での血流計の値とした。
麻酔:吸入麻酔を使用して、撮影中の動きアーチファクト(motion artifact)が出ない程度に呼吸を抑制する。
CT撮影:仰臥位、頸部伸展位で固定して、喉頭の全体が入る撮像範囲を確保し、舌骨の約1cm上方から第2気管輪まで1 mmスライスで撮影した。造影剤はオムニパーク(非イオン性ヨード系造影剤,第一三共株式会社)2 mL/kgを使用し、動脈相を撮影した。
マイクロミニピッグを歩行時雑音等が入らないように後方から抱きかかえるとほぼ同じリズムで鳴く。この声を90度指向性マイクロフォンを用い、PCM録音した。このとき、鳴き声は吸気音でなく呼気音であることを確認した。録音した音声を音響分析ソフトウエアにより音響分析と音声波形分析に供した。
C−1.超音波検査
超音波検査の結果を図1に示す。ADSCs例(上)では注入部に十分な量の移植材料が残存している。Fat例(下)では移植材料(脂肪)の残量量が少ない。
内視鏡検査の結果を図2(ADSCs例)及び図3(Fat例)に示す。ADSCs例(図2右下)では注入から1ヶ月の時点で右声帯内の萎縮が改善している。対照的にFat例(図3右下)には萎縮の残存を認める。
非接触式血流計による測定結果を図4に示す。ADSCs例(上)は移植材料の注入後に劇的な血流の改善を認めた。特筆すべきことに、注入後30日目の血流量は、神経切断前と同等以上であった。
CT検査の結果を図5に示す。ADSCs例では造影CT(右上)において注入部位に造影効果を認め、血流の増加が示唆される。Fat例(右下)では同様の造影効果は認められない。
1)音響分析ソノグラム
ソノグラムは時間変化を横軸に縦に周波数で表し、音声の共鳴など可視化したグラフである。声帯の振動が一定に保たれると連続的な縞模様が描出される。最も下の縞が基本周波数を示す。安定した発声中央1.0秒を図6に示した。いずれの個体も反回神経切断により、一番下の基本周波数を示す帯(フォルマント)の連続性、安定性が低下し、咽頭腔での共鳴を示す、高い周波数での帯一定にならない(左中央、右中央)。注入術後は、ADSCs例(左下)ではフォルマントの形成は明瞭で、基本周波数の断続性はFat例(右下)よりも少なく、より処置前の音声に近いまたはほぼ同程度の音声を再獲得していると判断できる。
片側声帯が麻痺することにより正常側の声帯振動にも影響されることが予想される。音声波形を直接表示し、ADSCs例とFat例で比較した(図7)。横幅は0.1秒で表示した。いずれの個体も反回神経切断により音声波形は小さく、周期性が乱れている(左中央、右中央)。注入術術後にいずれも周期性は改善するも(左下、右下)、ADSC例(左下)ではより密に波形が見られる。つまり、高い周波数が安定して見られ、振幅の乱れの少ない音声が再獲得できている。Fat例(右下)では処置前に比べ波形の繰り返しの間隔が広く、それぞれの波形も安定しない。特に波形の密な周波数の高い成分は安定してでていない。
幹細胞は多分化能と自己複製能を併せ持つ細胞であり、ADSCsは現在、虚血性心疾患や下肢虚血、乳房再建などに広く応用されている。Yoshimuraらは豊胸のために、脂肪吸引によって得られた脂肪の移植の際に自家脂肪とADSCsを混合移植する方法を考案し、その後の研究でも移植組織の容量の維持効果の高いことが報告されている(Yoshimura K: Cell assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation : supportive use of adiposed derived stem cells. Aesthet Plast Surg, 32:48-55,2008.(非特許文献7);Sterodimas A: Autologous fat transplantation versus adiposed-derived stem cell-enriched lopografts: A study. Aesthet Surg J, 31: 682-693, 2011.(非特許文献8))。
Claims (8)
- 体脂肪と脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、声門閉鎖不全治療用細胞製剤。
- 前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、前記体脂肪の2倍〜40倍に相当する量の体脂肪から分離された細胞である、請求項1に記載の細胞製剤。
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞の含有量が、1ml当たり1.6×105個〜3.3×106個である、請求項1に記載の細胞製剤。
- 前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、体脂肪から分離した脂肪組織由来幹細胞を培養して得られた細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 生体から分離した体脂肪を有効成分とした第1構成要素と、脂肪組織由来間葉系幹細胞を有効成分とした第2構成要素と、からなるキットであることを特徴とする、請求項1に記載の細胞製剤。
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する声門閉鎖不全治療用細胞製剤であって、その投与時に、生体から分離した体脂肪が併用投与されることを特徴とする、前記声門閉鎖不全治療用細胞製剤。
- 一側声帯麻痺に伴う声門閉鎖不全の治療に用いられる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞製剤。
- 声門閉鎖不全治療用細胞製剤を製造するための、体脂肪と脂肪組織由来間葉系幹細胞の使用。
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