JP6383151B2 - 脳損傷治療用ｓｔｅｐ誘導ペプチド - Google Patents

Description

政府支援研究に関する報告
本発明はＮＩＮＤＳによって認可された政府支援５Ｒ０１ＮＳ０５９９６２−０４に関する発明である。米国政府は、本発明に関し、一定の権利を有する。
関連出願に関する相互参照

本出願は、２０１０年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６１/３８３，２０８号の優先権を主張する出願であり、その全体を援用する出願である。
配列リスト

本明細書には配列リストを添付する。この配列リストは、７１２０１０２_ＳＥＱ_ＳＴ２５．ｔｘｔのタイトルもつ.ｔｘｔ ｆｉｌｅであり、サイズは１２ｋｂである。配列リストの全体をここに援用するものとする。

発作などの虚血性損傷、外傷による病変や各種の神経疾患を原因とする脳損傷は顕著なニューロ減成を生起することが多く、損傷度は中程度から重篤にわたり、時には患者の死を招くこともある。現在の治療法には限界があり、例えば脳への初期損傷を原因とするダメージを局限化または元の状態に戻すのではなく、侵襲的な外科手術や損傷後のリハビリ治療に頼っている。

Lipton S. A. and Rosenberg P. A. (1994) Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. The New England journal of medicine 330, 613-622. Arundine M. and Tymianski M. (2004) Molecular mechanisms of glutamate-dependent neurodegeneration in ischemia and traumatic brain injury. Cell Mol Life Sci 61, 657-668. Barone F. C, Irving E. A., Ray A. M., Lee J. C, Kassis S., Kumar S., Badger A. M., Legos J. J., Erhardt J. A., Ohlstein E. H., Hunter A. J., Harrison D. C, Philpott K., Smith B. R., Adams J. L. and Parsons A. A. (2001a) Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase provides neuroprotection in cerebral focal ischemia. Medicinal research reviews 21, 129-145. Barone F. C, Irving E. A., Ray A. M., Lee J. C, Kassis S., Kumar S., Badger A. M., White R. R, McVey M. J., Legos J. J., Erhardt J. A., Nelson A. H., Ohlstein E. H., Hunter A. J., Ward K., Smith B. R., Adams J. L. and Parsons A. A. (2001b) SB 239063, a second-generation p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor, reduces brain injury and neurological deficits in cerebral focal ischemia. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 296, 312-321. Luo J., Wang Y., Yasuda R. P., Dunah A. W. and Wolfe B. B. (1997) The majority of N-methyl-D-aspartate receptor complexes in adult rat cerebral cortex contain at least three different subunits (NR1/NR2A/NR2B). Molecular pharmacology 51, 79-86. Tovar K. R. and Westbrook G. L. (1999) The incorporation of NMDA receptors with a distinct subunit composition at nascent hippocampal synapses in vitro. J Neurosci 19, 4180- 4188. Kohr G. (2006) NMDA receptor function: subunit composition versus spatial distribution. Cell and tissue research 326, 439-446. Liu Y., Wong T. P., Aarts M., Rooyakkers A., Liu L., Lai T. W., Wu D. C, Lu J., Tymianski M., Craig A. M. and Wang Y. T. (2007) NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. J Neurosci 27, 2846-2857. Tu W., Xu X., Peng L., Zhong X., Zhang W., Soundarapandian M. M., Balel C, Wang M., Jia N., Zhang W., Lew F., Chan S. L., Chen Y. and Lu Y. (2010) DAPK1 interaction with NMDA receptor NR2B subunits mediates brain damage in stroke. Cell 140, 222-234. Rodrigues S. M., Schafe G. E. and LeDoux J. E. (2001) Intra-amygdala blockade of the NR2B subunit of the NMDA receptor disrupts the acquisition but not the expression of fear conditioning. J Neurosci 21, 6889-6896. Zhao M. G., Toyoda H., Lee Y. S., Wu L. J., Ko S. W., Zhang X. H., Jia Y., Shum F., Xu H., Li B. M., Kaang B. K. and Zhuo M. (2005) Roles of NMDA NR2B subtype receptor in prefrontal long-term potentiation and contextual fear memory. Neuron 47, 859-872. Walker D. L. and Davis M. (2008) Amygdala infusions of an NR2B- selective or an NR2A-preferring NMDA receptor antagonist differentially influence fear conditioning and expression in the fear-potentiated startle test. Learning & memory (Cold Spring Harbor, N.Y 15, 67-74. Boulanger L. M., Lombroso P. J., Raghunathan A., During M. J., Wahle P. and Naegele J. R. (1995) Cellular and molecular characterization of a brain-enriched protein tyrosine phosphatase. J Neurosci 15, 1532-1544. Bult A., Zhao F., Dirkx R., Jr., Raghunathan A., Solimena M. and Lombroso P. J. (1997) STEP: a family of brain-enriched PTPs. Alternative splicing produces transmembrane, cytosolic and truncated isoforms. European journal of cell biology 72, 337-344. Pulido R., Zuniga A. and Ullrich A. (1998) PTP-SL and STEP protein tyrosine phosphatases regulate the activation of the extracellular signal-regulated kinases ERKl and ERK2 by association through a kinase interaction motif. The EMBO journal 17, 7337-7350. Paul S., Snyder G. L., Yokakura H., Picciotto M. R., Nairn A. C. and Lombroso P. J. (2000) The Dopamine/Dl receptor mediates the phosphorylation and inactivation of the protein tyrosine phosphatase STEP via a PKA-dependent pathway. J Neurosci 20, 5630-5638. Paul S., Olausson P., Venkitaramani D. V., Ruchkina I., Moran T. D., Tronson N., Mills E., Hakim S., Salter M. W., Taylor J. R. and Lombroso P. J. (2007) The striatal-enriched protein tyrosine phosphatase gates long-term potentiation and fear memory in the lateral amygdala. Biological psychiatry 61, 1049-1061. Poddar R. and Paul S. (2009) Homocysteine-NMDA receptor-mediated activation of extracellular signal-regulated kinase leads to neuronal cell death. Journal of neurochemistry 110, 1095-1106. Xu J., Kurup P., Zhang Y., Goebel-Goody S. M., Wu P. H., Hawasli A. H., Baum M. L., Bibb J. A. and Lombroso P. J. (2009) Extrasynaptic NMDA receptors couple preferentially to excitotoxicity via calpain-mediated cleavage of STEP. J Neurosci 29, 9330-9343. Nguyen T. H., Liu J. and Lombroso P. J. (2002) Striatal enriched phosphatase 61 dephosphorylates Fyn at phosphotyrosine 420. The Journal of biological chemistry 277, 24274-24279. Braithwaite S. P., Xu J., Leung J., Urfer R., Nikolich K., Oksenberg D., Lombroso P. J. and Shamloo M. (2008) Expression and function of striatal enriched protein tyrosine phosphatase is profoundly altered in cerebral ischemia. The European journal of neuroscience 27, 2444-2452. Bullock R, Zauner A, Woodward J, Young HF. Massive persistent release of excitatory amino acids following human occlusive stroke. Stroke. 1995;26:2187-2189 Davalos A, Castillo J, Serena J, Noya M. Duration of glutamate release after acute ischemic stroke. Stroke. 1997;28:708-710 Mehta SL, Mannas N, Raghubir R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 2007;54:34-66 Chazot PL. The nmda receptor nr2b subunit: A valid therapeutic target for multiple ens pathologies. Curr Med Chem. 2004;11:389-396 Dirnagl U, Iadecola C, Moskowitz MA. Pathobiology of ischaemic stroke: An integrated view. Trends Neurosci. 1999;22:391-397 Kemp JA, McKernan RM. Nmda receptor pathways as drug targets. Nat Neurosci. 2002;5 Suppl:1039-1042 Lipton SA. Failures and successes of nmda receptor antagonists: Molecular basis for the use of open-channel blockers like memantine in the treatment of acute and chronic neurologic insults. NeuroRx. 2004;1: 101-110 Nito C, Kamada H, Endo H, Niizuma K, Myer DJ, Chan PH. Role of the p38 mitogen-activated protein kinase/cytosolic phospholipase a2 signaling pathway in blood-brain barrier disruption after focal cerebral ischemia and reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 2008;28:1686-1696 Iadecola C, Niwa K, Nogawa S, Zhao X, Nagayama M, Araki E, Morham S, Ross ME. Reduced susceptibility to ischemic brain injury and n-methyl-d-aspartate-mediated neurotoxicity in cyclooxygenase-2-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 ;98: 1294-1299. Deb I, Poddar R, Paul S. Oxidative stress-induced oligomerization inhibits the activity of the non-receptor tyrosine phosphatase STEP61. J Neurochem. 2011 ;116:1097-1111. Braithwaite SP, Adkisson M, Leung J, Nava A, Masterson B, Urfer R, Oksenberg D, Nikolich K. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 2006;23:2847-2856. Candelario-Jalil E, Gonzalez-Falcon A, Garcia-Cabrera M, Leon OS, Fiebich BL. Wide therapeutic time window for nimesulide neuroprotection in a model of transient focal cerebral ischemia in the rat. Brain Res. 2004 ; 1007:98- 108. Lombroso, P. J., Naegele, J. R., Sharma, E., and Lerner, M. (1993) J Neurosci 13(7), 3064-3074 Bult, A., Zhao, F., Dirkx, R., Jr., Sharma, E., Lukacsi, E., Solimena, M., Naegele, J. R., and Lombroso, P. J. (1996) J Neurosci 16(24), 7821-7831 Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., and Lombroso, P. J. (2003) Nature neuroscience 6(1), 34-42 Thomas, G. M., and Huganir, R. L. (2004) Nature reviews 5(3), 173-183 Snyder, E. M., Nong, Y., Almeida, C. G., Paul, S., Moran, T., Choi, E. Y., Nairn, A. C., Salter, M. W., Lombroso, P. J., Gouras, G. K., and Greengard, P. (2005) Nature neuroscience 8(8), 1051-1058 Mukherjee, S.; Poddar, R.; Deb, I., Paul, S., (2011) "Dephosphorylation of Specific Sites in the KIS domain leads to Ubiquitin-Mediated Degradation of the tyrosine Phosphatase" (In preparation) Deb, I.; Poddar, R.; Paul, S.; (2011) "Oxidative stress induced dimerization inhibits the activity of the non-receptor tyrosine phosphatase STEP61" Journal of Neurochemistry (In publication)

各種の研究は、ニューロ減成には興奮毒性のグルタメート受容体の活性化に関与し、その後に虚血性損傷、外傷による病変、および広範な神経疾患が発症することを示している（Ｌｉｐｔｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ １９９４；Ａｒｕｄｉｎｅ ａｎｄ Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ ２００４）。病理学的状態では、神経伝達物質であるグルタメートの過剰放出が、グルタメート受容体のＮＭＤＡサブタイプの活性化につながり、この活性化が興奮毒性による細胞死に関与していることが知られているｐ３８ミトゲン活性化蛋白質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）などのエフェクター分子のＣａ２＋過負荷および活性化を始めとする細胞内事象の有害なカスケードをトリガーする（Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２００１ａ；Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２００１ｂ）。近年の研究は、サブユニットを含むＮＲ２Ａ（ＮＲ２Ａ−ＮＭＤＡＲ）またはＮＲ２Ｂ（ＮＲ２Ｂ−ＮＭＤＡＲ）の存在によって定義される２つの機能上異なるＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）のプールの存在を示唆している（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｔｏｖａｒ ａｎｄ Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ１９９９；Ｋｏｈｒ ２００６）。一般に、ＮＲ２Ｂ−ＮＭＤＡＲは細胞死、それに続く興奮毒性損傷による脳ダメージをトリガーする（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｔｕ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ところが、ＮＲ２Ｂ−ＮＭＤＡＲ拮抗薬の投与は臨床的には奏功していない。これらが興奮毒性カスケードを阻害するだけでなく、受容体の生理学的機能に干渉するからである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｚｈａｏ ｅｔａｌ．２００５；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ２００８）。

即ち、ＮＭＤＡＲ信号伝達下流側の細胞内信号伝達カスケードを標的にした成分は、興奮毒性に干渉する治療方法を対象とする新規な化合物になり得ると考えられる。

（ＳＴｒｉａｔａｌリッチ化ホスファターゼ（ＳＴｒｉａｔａｌ Ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）またはＰＴＰＮ５としても知られている）脳リッチ化チロシンホスファターゼＳＴＥＰは、ＮＭＤＡＲの刺激後に活性化し、ニューロンの生死に関する重要な調節体として発現する一つのこのような標的分子である。ＳＴＥＰは、線条体、新生大脳皮質および海馬のニューロンに特異的に発現する（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５）。２つのＳＴＥＰイソ体であるＳＴＥＰ_６１およびＳＴＥＰ_４６（Ｂｕｌｔ ｅｔ ａｌ．１９９７）は、キナーゼ相互作用モチーフ即ちＫＩＭドメインと呼ばれる高度に保存された基質結合ドメインを含有する（Ｐｕｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＫＩＭドメイン内部の臨界的なセリン残基のリン酸化は、蛋白質キナーゼＡ（ＰＫＡ）経路のドーパミン/Ｄ１受容体依存活性化を介して媒介される（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２０００）。この残基がグルタメート/ＮＭＤＡ受容体刺激後にＣａ２＋依存ホスファターゼカルシニューリンによって脱リン酸化すると、ＳＴＥＰの基質に対する結合性が活性化する（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２００３）。次に、活性ＳＴＥＰが調節チロシン残基のチロシン脱リン酸化を介して基質に結合し、基質の活性を調節する。ＳＴＥＰの既知基質としては、ＥＲＫ（細胞外調節キナーゼ１/２）およびｐ３８ＭＡＰＫ（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｐｏｄｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）、Ｓｒｃ族チロシンキナーゼおよびＮＭＤＡＲサブユニット（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）があり、いずれもニューロンの生死に関与している。

ＳＴＥＰ_６１の概略図である。 ＳＴＥＰ_４６の概略図である。 ＰＫＡリン酸化部位＊が修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、本発明の一実施態様のＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。 ＰＫＡリン酸化部位＊およびＫＩＳ−ドメインリン酸化部位の両者が修飾された、本発明の別な実施態様のＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。 ＰＫＡリン酸化部位＊が修飾され、そしてさらにペプチドのＮ−末端にＴＡＴ配列を有する本発明のさらに別な実施態様のＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。 ＰＫＡリン酸化部位＊およびＫＩＳ−ドメインリン酸化部位の両者が修飾され、そしてさらにペプチドのＮ−末端にＴＡＴ配列を有する本発明の別な実施態様のＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。 ＰＫＡリン酸化部位＊が修飾され、そしてさらにペプチドのＮ−末端にＴＡＴ配列およびＫＩＭドメインのＣ−末端にｍｙｃ−ｔａｇを有する本発明のさらに別な実施態様のＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。 ＰＫＡリン酸化部位＊およびＫＩＳ−ドメインリン酸化部位の両者が修飾され、そしてさらにペプチドのＮ−末端にＴＡＴ配列およびＫＩＭドメインのＣ−末端にｍｙｃ−ｔａｇを有する本発明の別な実施態様のＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。 ＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドの注射部位を示す概略図である。 外因性のＴＡＴ−ＳＴＥＰを検出する抗ｍｙｃ抗体を投与した線条体の冠状断面の免疫組織化学を示す図である。 外因性のＴＡＴ−ＳＴＥＰを検出する抗ｍｙｃ抗体を投与した大脳皮質の免疫組織化学を示す図である。 虚血性症状の発症直前に治療薬を投与した生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）とＴＡＴ−ＳＴＥＰ−ｍｙｃ治療群の代表的なＴＴＣ（塩化トリフェニルテトラゾリウム）染色部分を示す図である。 梗塞体積の定量分析を示す図である。なお、梗塞体積は対側（対照）半球の百分率として表わされ、データは平均±ＳＥＭ（ｐ＜０．０１）である。 虚血性症状の発症１．５時間後に治療薬を投与した生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）とＴＡＴ−ＳＴＥＰ−ｍｙｃ治療群の代表的なＴＴＣ（塩化トリフェニルテトラゾリウム）染色部分を示す図である。 梗塞体積の定量分析を示す図である。なお、梗塞体積は対側（対照）半球の百分率として表わされ、データは平均±ＳＥＭ（ｐ＜０．０１）である。

本発明の各種実施態様において、本発明はニューロン特異性チロシンホスファターゼの修飾誘導体である複数の新規なペプチド配列を提供するものである。具体的には、新規なペプチド配列は、線条体リッチ化チロシンホスファターゼ（ＳＴＥＰ）の修飾誘導体である。各ペプチド配列において、ＳＴＥＰはグルタメート毒性、低酸素症および／または一過性虚血性傷害を原因とする脳損傷を緩和および治療できるように修飾されている。本発明のペプチド配列が治療に有効な脳損傷のタイプの実例を挙げると、発作を原因とする急性脳損傷、外傷性脳損傷、およびハンティントン舞踏病や統合失調症などの慢性疾患がある。さらに、本発明のペプチド配列はＰＴＳＤなどの恐怖体験記憶に関連する疾患の治療および緩和にも有効である。

大脳中において最もよく認められる興奮の神経伝達物質であるグルタメートは、虚血性発作における臨床的介入の主目標物質である。グルタメートが持続的に高くなることは、急性虚血性発作患者に少なくとも２４時間見られる症状である（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｄａｖａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。この持続的なグルタメート興奮毒性は、初期発症後数時間から数日間にわたる虚血性脳損傷の進行に関係があると考えられる。グルタメート毒性につながる症状は、虚血を原因として酸素およびグルコースが欠乏する結果、グルタメートが過剰に放出され、引き続き大脳中のすべての興奮受容体のうち約８０％を占めるグルタメート受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）−サブタイプが過剰活性化する間に発症する。グルタメートが媒介するＮＭＤＡＲ刺激が生じ、細胞間Ｃａ^２＋が大きく増加し、損傷した脳における炎症反応の進行および持続に関与する多数の信号伝達経路が活性化する（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。特にｐ３８ＭＡＰＫ信号伝達経路の活性化が虚血性脳損傷に関与し、反応性酸素種の炎症反応および発生に関与する主要酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２の産生に関係がある（Ｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉａｄｅｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ ａｎｄ ｂ）。ところが、ＮＭＤＡ受容体拮抗物質の薬学的応用における重要な関心は、これらが病理学的作用を阻害するだけでなく、興奮シナプス伝達および塑性を有するＮＭＤＡＲの生理学的機能に干渉することに向けられている（Ｃｈａｚｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｉｒｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。従って、ＮＭＤＡＲ刺激に続いて活性化し、ＮＭＤＡＲの病理学的作用に選択的に干渉する特異的な分子ターゲットを確認できれば、これは虚血性脳損傷の緩和に役立つ新規な化合物になる。

ＳＴＥＰは、中枢神経系において排他的に発現する細胞内蛋白質チロシンホスファクターゼ（ＰＴＰ）であり、またＳＴＥＰは、基底核、海馬、大脳皮質および関連構造のニューロンにおいて優先的発現する（Ｌｏｍｂｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ. １９９３，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ. １９９５）。ＰＴＰａｓｅのＳＴＥＰ族は、独立した一つの遺伝子の選択的スプライシングによって形成する膜関連（ＳＴＥＰ_６１）変異型および細胞質ゾル（ＳＴＥＰ_４６）の変異型の両者を含む(Ｂｕｌｔ ｅｔ ａｌ. １９９７)。ＳＴＥＰ_６１は、そのＮ−末端に付加的な１７２のアミノ酸が存在する点でＳＴＥＰ_４６とは相違する(Ｂｕｌｔ ｅｔ ａｌ. １９９６)。本明細書では、ＳＴＥＰタンパク質における特異的なアミノ酸残基については、ＳＴＥＰ_４６変異型のからカウントした番号で呼ぶことがある。本明細書で説明するＳＴＥＰタンパク質の１０７アミノ酸配列は、動物種間で高度に保存され、マウスとヒトとの間の配列相同性は９５％である（ＳＥＱ ＩＤ１とＳＥＱ ＩＤ２との比較）。本発明は、有効なペプチドを獲得するために多数の考えられるＳＴＥＰタンパク質の突然変異を実現するものである。本発明の突然変異部位が種間に保存される場合、本発明の各種のＳＴＥＰ系ペプチドは、多様な種からのＳＴＥＰタンパク質に基づくか、あるいはこれら種から誘導することができ、また本発明ペプチドは、治療対象および／又は研究対象の種に対して内因性の蛋白質から誘導されたペプチドか、あるいは誘導されないペプチドであってもよい。従って、本発明のペプチドは、配列リストに含まれる特異的なペプチドに限定されるものではない。

ＳＴＥＰは、他の二つのＰＴＰ、ＰＴＰＲＲおよびＨｅＰＴＰとともにキナーゼ相互作用モチーフ（ＫＩＭドメイン）と呼ばれる高度に保存された１６−アミノ酸基質−結合ドメインを含有するＰＴＰ族に属する（Ｐｕｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．１９９８）。調節セリン残基であるｓｅｒ４９（ＳＴＥＰ_６１におけるｓｅｒ２２１）は、ＫＩＭドメインの中央に位置し、この残基が脱リン酸化すると、ＳＴＥＰのその基質に結合できる能力が活性化する。ｓｅｒ４９のリン酸化を媒介するのは、ｃＡＭＰ/ＰＫＡ経路のドーパミン/Ｄ１受容体依存活性化であり（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２０００）、一方脱リン酸化を媒介するのはＣａ^２＋依存ホスファターゼ即ちカルシニューリンのグルタメート/ＮＭＤＡ受容体誘導活性化である（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２００３）。

ＫＩＭドメインに対する第２の保存ドメインカルボキシ−末端はＳＴＥＰ、ＰＴＰ−ＳＬおよびＨｅＰＴＰ内に存在する。以下にさらに詳しく記載するように、このドメイン、ここではキナーゼ特異性配列（ＫＩＳドメイン）と呼ぶドメインが２つのリン酸化部位、即ちＴｈｒ５９（ＳＴＥＰ_６１におけるＴｈｒ２３１）およびＳｅｒ７２（ＳＴＥＰ_６１におけるＳｅｒ２４４）を有し、これらがＳＴＥＰ蛋白質の安定性を調節するさいに重要な役割を果たすことが確認された。

図１および図２はそれぞれＳＴＥＰ_６１およびＳＴＥＰ_４６を示す概略図であり、ＳＴＥＰの活性化およびそれに続く減成に関与するホスファターゼドメイン、推定蛋白質分解部位（ＰＥＳＴ）、膜透過（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメイン（ＴＭ）、ポリプロリンリッチドメイン（ＰＰ）、キナーゼ相互作用モチーフ（ＫＩＭ）、キナーゼ特異性配列（ＫＩＳ）および上記リン酸化部位の位置を示す図である。さらに、分子内二量化に関与することが分かっているシステイン残基（ＳＴＥＰ_４６におけるＣｙｓ２３/ＳＴＥＰ_６１におけるＣｙｓ１９５）の位置、およびＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの両者によってリン酸化が可能であることが知られているスレオニン残基（ＳＴＥＰ_４６におけるＴｈｒ１８/ＳＴＥＰ_６１におけるＴｈｒ１９０）の位置も図示してある。

ＳＴＥＰが活性形態にある場合、細胞外調節キナーゼ１/２（ＥＲＫ１/２）、即ち記憶形成に関与する重要な蛋白質の活性を調節することによってシナプス組成を変調できる（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２００７およびＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｈｕｇａｎｉｒ ２００４）。活性ＳＴＥＰの場合、恐らくは上流側キナーゼＦｙｎの調節（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔａｌ．２００２）およびＮＲ２Ｂ−ＮＭＤＡ受容体サブユニットのチロシン脱リン酸化（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５）を通じて、シナプス膜に輸送されるＮＭＤＡ受容体に干渉することによってＮＭＤＡ受容体依存長期相乗作用を調節することも可能である。またいくつかの研究によると、活性ＳＴＥＰはｐ３８ＭＡＰＫの調節によって神経保護を行う役割を持つ（Ｐｏｄｄａｒ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

ＳＴＥＰ蛋白質の場合、ＮＭＤＡＲに干渉することが知られているため、ＳＴＥＰ蛋白質に基づく構成活性を示すペプチドは、虚血性脳損傷の治療、緩和および／または予防について考えられる候補である。図３は、本発明の一実施態様の構成活性を示すＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す図である。このペプチドは、ＫＩＭドメインおよびＫＩＳドメインを含むＳＴＥＰ_４６の第１の１０７アミノ酸を含有する。さらに、図３に示すように、ＰＫＡリン酸化部位＊として作用するセリン残基（Ｓｅｒ４９）は修飾されている（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３を参照）。本発明のこの実施態様では、標準的な点突然変異技術を使用してＳｅｒ４９をアラニンに変換している。このアラニンは、リン酸化できないため、構成活性を示すペプチドになる。ＰＫＡリン酸化部位を修飾すると、ＳＴＥＰ−誘導ペプチドのリン酸化による不活性化問題に対処することができる。

Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１１に記載されているようないくつかの研究によれば、活性ＳＴＥＰ蛋白質は減成しやすい。Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．の研究はその焦点を活性ＳＴＥＰのレベル調節におけるＫＩＳドメインの役割に向けている。本発明によれば、ＫＩＳドメインにおける２つのＳＰ/ＴＰ部位（図２、Ｔｈｒ５９およびＳｅｒ７２）の外因性リン酸化が、主にＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの基底活性を通じて媒介作用を行うことが確認された。これら２つの部位が脱リン酸化すると、活性形態のＳＴＥＰが選択的にユビキチン媒介プロテアソーム減成する。これら知見は、活性ＳＴＥＰのユビキチン媒介プロテアソーム減成が、二次的なｐ３８ＭＡＰＫの活性化にもつながることを含意している。

従って、生体内で安定性を示し、かつユビキチン−媒介プロテアソーム減成傾向のない活性ＳＴＥＰ−誘導ペプチドを製造できることが望まれている。

図４は、Ｓｅｒ４９が、リン酸化できないアラニンに変換し、そしてＴｈｒ５９およびＳｅｒ７２がグルタミン酸に変換し、リン酸化可能な形態を模倣できる、本発明の一実施態様のＳＴＥＰ−誘導ペプチドを示す概略図である（ＳＥＱ ＩＤ．Ｎｏ．４を参照）。なお、例えばアスパラギン酸等を始めとする他のホスホ擬態（phospho-mimics）も使用できることは言うまでもない。

Ｄｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１１に記載されているごく最近の研究によれば、ＳＴＥＰ_６１およびＳＴＥＰ_４６の酵素活性も分子内二量化によって調節できる。ＳＴＥＰの二量化の場合、いくつかのシステイン残基を包含する分子内ジスルフィド結合形成が関係し、酸化的ストレスがあると、ＳＴＥＰの二量体形成が増加し、結果として活性が低下する。分子内二量化に関与するこのような一つのシステイン残基（ＳＴＥＰ_４６におけるＣｙｓ２３/ＳＴＥＰ_６１におけるＣｙｓ１９５）は、本発明のＳＴＥＰ誘導ペプチドに存在する。虚血性損傷および／または再灌流時に酸化的ストレスがあると、ＳＴＥＰ誘導ペプチドの少なくとも一部が二量化する結果、治療効果が低下する可能性がある。従って、本発明は、突然変異Ｃｙｓ２３残基（システイン−アラニン変換）（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５）を含むＳＴＥＰペプチドを提供するものでもある。

本発明のＳＴＥＰ誘導ペプチドには別なリン酸化部位もあることが確認された（ＳＴＥＰ_４６におけるＴｈｒ１８/ＳＴＥＰ_６１におけるＴｈｒ１９０）。試験管研究によれば、この部位はＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの両者によってリン酸化することができる。リン酸化の機能的意味に基づいて、本発明はさらに非リン酸化性または模倣リン酸化性形態のＴｈｒ１８を提供するものである（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６，グルタミン酸に突然変異したＴｈｒ１８、およびＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７、アラニンに突然変異したＴｈｒ１８を参照）。

ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８は、上記で説明したすべての突然変異点を含むヒトＳＴＥＰペプチドのアミノ酸配列になる。

本発明のいくつかの実施態様の場合、過剰なグルタメート放出および酸化的ストレスを原因とする脳損傷の予防、治療または緩和に関する。即ち、本発明は、発作などを発症した結果この種の損傷に罹患しているか、罹患した患者の脳に送り込むことができるＳＴＥＰ誘導ペプチドを提供するものでもある。図５および図６は、ペプチドのＮ−末端にＴＡＴ配列を有する上記構成活性を示すＳＴＥＰ誘導ペプチドの概略図である。図５では、ＫＩＭドメインのリン酸化部位のみが変更され（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９を参照）、そして図６では、ＫＩＭドメインおよびＫＩＳドメイン両者のリン酸化部位が変更されている（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０を参照）。ＴＡＴは、ペプチド配列が細胞透過性になり、かつこれらペプチドが血液脳関門を横断できる１１アミノ酸ペプチドである。ＳＴＥＰ誘導ペプチドが血液脳関門を横断できるため、脳への直接的な手術を必要とする従来の治療機序よりも、侵襲性がかなり低い例えば大腿静脈などの静脈注射によって患者の脳へペプチドを送り込むことができる。当業者ならば、例えば公知の標的送り込みシステムやウィルス送り込みシステムなどの他の好適な送り込み機序に精通しているはずである。

実験目的では、研究対象分子に観察可能な標識（ｔａｇ）を付けることが有効な場合が多い。即ち、本発明はさらに観察可能な標識を付けたＳＴＥＰ誘導ペプチドを提供するものでもある。図７および図８は、Ｎ−末端にＴＡＴ配列を有する上記の構成活性を示すＳＴＥＰペプチドであって、ペプチドのＣ−末端を修飾してｍｙｃ標識を付けたＳＴＥＰ誘導ペプチドを示す概略図である。図７では、ＫＩＭドメインのリン酸化部位のみが変更され、そして図８では、ＫＩＭドメインおよびＫＩＳドメイン両者のリン酸化部位が変更されている。当業者ならば、ペプチドを修飾して、各種の観察可能な標識および機序を付け加えることについて精通しているはずである。

グルタメート毒性の細胞培養モデルを使用して、ＳＴＥＰ活性化の機能上の意味を調べ、興奮毒性ＮＭＤＡ受容体刺激の後のＳＴＥＰ活性化の機能上の意味を調べた。Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０に記載されているように、興奮毒性損傷に引き続き、ＮＲ２Ｂ−ＮＭＤＡ受容体が媒介してＣａ^２＋が増加し、ＳＴＥＰが脱リン酸化し、次に活性化することが実証された。Ｐｏｄｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０に記載されているように、基質捕獲突然変異体を使用して、ｐ３８ＭＡＰＫがＳＴＥＰの基質であり、そしてＳＴＥＰのＫＩＭドメインがＳＴＥＰ−ｐ３８相互作用に関与していることを確認した。ＳＴＥＰのＮＲ２Ｂ−ＮＭＤＡＲ媒介活性化が起きると、ｐ３８ＭＡＰＫ信号伝達経路が下方調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）され、細胞が持続的に生存する。ところが、ＮＭＤＡＲ刺激を持続的に与えると、活性ＳＴＥＰが減成し、ｐ３８ＭＡＰＫが二次的に活性化し、細胞死経路をトリガーする。これらの知見に基づいて、不可逆的にｐ３８ＭＡＰＫに結合できる構成活性形態のＳＴＥＰペプチドを産生した。ヒト免疫欠損ウィルスタイプＩ即ちＴＡＴの蛋白質導入ドメインに融合することによってこれは細胞透過性になった。興奮量のグルタメート（１００μＭ、３０分）で治療する前に、あるいは治療直後に培養ニューロンに精製ＴＡＴ−ＳＴＥＰｍｙｃペプチドを導入した場合、２４時間後にヘキストＤＮＡ染色法によって評価したところニューロン細胞死を阻止できた。さらにグルタメート毒性の動物モデルで研究を続けたところ、グルタメートの前に線条体に定位注射されたＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドによって生体内のグルタメート誘導興奮毒性細胞死を減らすことができた。

引き続き脳虚血症の試験管モデルとして酸素−グルコース欠損（ＯＧＤ）を使用して、虚血性損傷後の神経保護におけるＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドの作用役割を評価した。ペプチドの存在下および不在下で低酸素室（酸素−グルコース欠損、ＯＧＤ）において培養ニューロンをグルコース不含有干渉液に浸漬し、細胞生存性を２４時間後にヘキストＤＮＡ染色法によって試験した。この結果得られた知見によれば、ＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドで予め培養した場合、ＯＧＤ誘導細胞死に有意味な減少が見られる（発表原稿は準備中）。

以上説明してきた本発明の具体的な方法および組成物は、好ましい実施態様を代表するもので、例示であり、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書を検討すれば、他の目的、態様及び実施態様も当業者にとって明らかになるはずであり、いずれも特許請求の範囲に記載されている本発明の精神に包含されるものである。また、当業者にとって、本発明の範囲および精神から逸脱することなく以上開示してきた本発明に各種の置換および変更を加えることは容易なはずである。以上参考として開示してきた本発明は、本明細書において本質的なものとして具体的に開示していな一つか複数の要素、または一つか複数の限定要件なしでも実施可能である。以上参考として開示してきた方法およびプロセスは異なる工程順で実施することができ、また必ずしも本明細書および特許請求の範囲の工程順に限定されない。本明細書および特許請求の範囲において、単数表現は、文脈が明らかにそうではないこと示していない限り、複数表現を含意するものである。従って、例えば“一つのホスト細胞”は、複数の（例えば培養液または集団の）このようなホスト細胞を含意する。

本発明は、どのような状況においても以上具体的に記載してきた具体的な実施例、実施態様または方法に制限されるものではない。また、どのような状況においても特許庁の審査官またはその他の公務員や雇用人によってなされた陳述によって制限されるものではない。ただし、このような陳述が出願人による意見書において具体的に、かつ無条件または保留なしに明示されている場合にはこの限りではない。

本明細書で使用した用語・術語および表現は、記述を目的とするもので、制限を目的とするものではなく、このような用語・術語および表現を使用するさいに、図示の特徴および開示してきた特徴やその一部の等価物を排除するものではなく、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内で各種の変更が可能である。従って、本発明を好適な実施態様および選択的な特徴によって説明してきたが、当業者ならば、以上説明してきた技術思想の変更および改変を実施することができ、またこれら変更および改変も特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内に包含されるものである。

上記で言及した、および／または上記の特許文献および非特許文献はいずれも、本発明が対象とする技術分野の技術レベルを示す文献であり、各文献は個別に全体が援用されるように、あるいは全体が開示されているように援用されるものである。出願人は本明細書に、これら文献に記載されている一部または全部の知見および情報を物理的に援用する権利を保有するものである。

実験−ＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドを用いる脳損傷の予防、治療および緩和
（９０分間中位大脳動脈閉塞により塞栓症発作を発症させた後に２４時間再灌流処置する）脳虚血症の動物モデルを使用して、活性ＳＴＥＰの減成がニューロン細胞死および引き続き生じる脳損傷に寄与するかどうか、そして修飾ＳＴＥＰペプチドが虚血性脳損傷を緩和できるかどうかを評価した。まず、ＳＴＥＰの活性化、引き続き生じる減成、その後の脳虚血症および再灌流の時間的なプロファイルを調べ、これらのｐ３８ＭＡＰＫ活性化との相関関係を評価した。虚血性損傷後１５分経たないうちにｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化に急激ではあるが遷移的な増加が認められた。その後、３０分経過から時間が経つにつれてｐ３８リン酸化が減少し、９０分までに基底レベルに戻った。この虚血性損傷の結果、ｐ３８ＭＡＰＫが急激に活性化するだけではなく、ＳＴＥＰの脱リン酸化および引き続き生じる活性化が生じ、これは３０分で開始し、９０分までに完全な脱リン酸化が生じた。この結果、活性ＳＴＥＰがｐ３８ＭＡＰＫの活性化持続時間を制限することになる。減成による活性ＳＴＥＰの進行的な下方調節は、ｐ３８ＭＡＰＫの二次活性化に結果する再灌流後〜６時間目から明らかになる。ｐ３８ＭＡＰＫ経路の一次的ではないが二次的な活性化は、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化にリンクし、かつ炎症反応および反応性酸素種の発生に関与する（発表原稿は準備中）主要酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現と相関関係にある。以上の知見は、本発明の仮説に一致し、ＳＴＥＰが細胞死経路のネガティブな調節体であり、活性ＳＴＥＰの減成が信号カスケードをトリガーし、虚血性脳損傷につながることを示している。

次に、生体内に送り込まれた修飾ＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドが虚血性脳損傷を抑制できるかどうかを調べた。ここでの大きな技術的課題は、非侵襲的にペプチドを巧く脳内に送り込むことであった。図９〜図１５に、成獣ラットの大腿静脈にＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドを一回静脈注射した後、このペプチドは大脳皮質（図１０）および線条体（図１１）の両者において検出可能であったことを示す。これら実験では、雄のＷｉｓｔａｒラットの大腿静脈に図８のＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドを１ｍｌ（１ｍｇ/ｍｌ）一回静脈注射した（図９）。注射１時間後に検出を行った。

虚血性脳損傷の緩和におけるペプチドの効能を確認するために、ＳＥＱ ＩＤ．Ｎｏ．１１のＴＡＴ−ＳＴＥＰペプチドを発作開始の直前および１．５時間直後に静脈投与した。これらの知見から、急性虚血性発作前後のいずれかにおける細胞透過性ＳＴＥＰペプチドの静脈注射が、虚血性脳損傷に対して有意味な保護を与えることを実証できる。これら実験において、急性虚血性発作を発症させるために、Ｃａｄｅｌａｒｉｏ−Ｊａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００４に記載されている管内縫合法を使用して、雄のＷｉｓｔａｒラット（２６０〜２８０ｇｍ）に中位大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を９０分間発症させた。ＭＣＡＯ直前（図１２〜図１３）に、あるいはＭＣＡＯの１．５時間後（図１４〜図１５）にＴＡＴ −ＳＴＥＰペプチドまたは生理的食塩水を注射した後、２４時間再灌流を行った。発作開始の１．５時間後にペプチドを注射した場合でも、虚血性脳損傷を緩和できた事実は、内因性ＳＴＥＰの減成後のｐ３８ＭＡＰＫの二次活性が、細胞内死経路をトリガーしたことを示唆している。総合的に考えると、以上の知見は、修飾ＳＴＥＰ−誘導ペプチドが、興奮毒性が関与する疾病の、ＮＭＤＡＲ下流側にある代替的な治療標的対象になり得ることを暗示している。

Claims (14)

1. ＳＴＥＰタンパク質のＫＩＭドメインおよびＫＩＳドメインを具備してなるＳＴＥＰ誘導ペプチドであり、前記ＫＩＭドメインのセリン４９残基を非リン酸化性アミノ酸に変換させて易リン酸化部位のリン酸化を防止することでペプチドのＳＴＥＰ活性を活性化し、同時に、前記ＫＩＳドメインのスレオニン５９残基および／またはセリン７２残基を模倣リン酸化性アミノ酸に変換させて内因性ＳＴＥＰタンパク質よりも安定なペプチドとすることを特徴とする、ＳＴＥＰ誘導ペプチド(各残基はＳＴＥＰ _４６ 変異型からの番号付け（numbering）を用いる)。
   
2. 前記ＫＩＭドメインの前記セリン４９残基(前記ＳＴＥＰ_４６変異型からの番号付け（numbering）を用いて)がアラニンに変換されている請求項１に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
3. 前記ＫＩＳドメインの前記セリン７２残基(前記ＳＴＥＰ_４６変異型からの番号付け（numbering）を用いて)が模倣リン酸化性アミノ酸に変換されている請求項１又は２に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
4. 前記ＫＩＳドメインの前記スレオニン５９残基(前記ＳＴＥＰ_４６変異型からの番号付け（numbering）を用いて)が模倣リン酸化性アミノ酸に変換されている請求項１又は２に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
5. 前記ＫＩＳドメインの前記セリン７２残基(前記ＳＴＥＰ_４６変異型からの番号付け（numbering）を用いて)および前記スレオニン５９残基(前記ＳＴＥＰ_４６変異型からの番号付け（numbering）を用いて)の双方が模倣リン酸化性アミノ酸に変換されている請求項１又は２に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
6. 前記模倣リン酸化性アミノ酸がグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基である請求項１、２、３、４又は５に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
7. 前記模倣リン酸化性アミノ酸がグルタミン酸残基である請求項１、２、３、４、５又は６に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
8. Ｃｙｓ２３残基(前記ＳＴＥＰ_４６変異型からの番号付け（numbering）を用いて)がアラニンに変換されたものである請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
9. 前記ペプチドの1領域が細胞透過性となるようにさらに構成されている請求項１、２、３、４、５、６、７又は８に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
   
10. 細胞透過性となるように構成された前記ペプチドの前記１領域がＴＡＴドメインである請求項９に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
    
11. 観察可能なマーカーとして作用するように構成された領域をさらに有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
    
12. 観察可能なマーカーとして作用するように構成された前記領域がｍｙｃ領域である請求項１１に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
    
13. ＳＥＱ ＩＤ．Ｎｏ．４，８，１０または１１からなる群から選択される請求項１に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。
    
14. 過剰なグルタメートの作用から発症する脳損傷の作用を治療または緩和するために使用され、静脈注射により患者に送り込まれる請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＳＴＥＰ誘導ペプチド。

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