JP6370706B2 - プロテアーゼ活性化受容体の調節剤 - Google Patents

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Description

本発明は、一般に、プロテアーゼ活性化受容体−2(PAR2)を調節することが可能な化合物、およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、PAR2の調節剤、それらの調製、および生物学的研究のための手段としてまたはそれらが単独で使用されるかまたは他の治療法と併用されるかにかかわらず、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患などの療法のための作用物質または薬剤としてのそれらの使用に関する。
プロテアーゼ活性化受容体−2(Protease activated receptor−2:PAR2)は、公知の内因性細胞外配位子を有さず、トリプシン、トリプターゼ、およびカテプシンGなどの多くのセリンプロテアーゼを含むプロテアーゼによって活性化される点で一意のGタンパク質共役受容体(G−protein coupled receptor:GPCR)である。セリンプロテアーゼは、膜結合受容体の細胞外N末端の一部を開裂させて、受容体に結合し、活性化を引き起こすことによって連結配位子として働く新たな配列を露出させる。
PAR2は、全身に広まると、関節炎、炎症性腸疾患、膵炎、および心血管疾患を含む急性および慢性炎症性疾患における炎症誘発性メディエータとして関与している。PAR2はまた、胃潰瘍、結腸炎、喘息、および肝線維症などの病態において抗炎症性および保護性があると報告されているが、これについてはまだ議論が分かれている。PAR2の活性化は、胃、結腸、乳房および膵臓の癌を含む多くの癌の増殖、転移および血管新生に関連付けられてきた。これに関連して、PAR2の小分子調節剤は、抗炎症性、炎症誘発性、抗増殖性または増殖性の作用物質の新たな種類として潜在的な関心を集めている。
最近、様々な血栓形成促進性分子(プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−1、組織因子など)および他のシステイン/セリンプロテアーゼ(カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、第VII因子、第X因子、トリプシン様セリンプロテアーゼなど)の循環の増加が食餌性肥満およびメタボリック・シンドロームに関与していることが確認された後、これらの疾患のための新規な治療標的としての炎症性GPCRに対する関心が集まっている。
飽和脂肪および炭水化物をますます多く含む人の食事は、代謝系および免疫系に過負荷を掛け、肥満、代謝機能不全および免疫障害を引き起こすものと考えられる。この栄養素の過剰摂取は、脂肪組織の慢性炎症状態を引き起こし、肥満を促進し、脂肪細胞機能および免疫細胞分布を変更し、これらは両方とも代謝機能不全を引き起こすようである。慢性代謝機能不全は、肥満、II型糖尿病および心血管疾患につながることがあり、それらの治療は、世界中の医療システムにとっての大きな課題である(非特許文献1)(非特許文献2)。過剰なカロリー摂取に加えて、現代の座りがちなライフスタイルは、肥満ならびに関連する代謝性疾患および心血管疾患(現在まとめて「メタボリック・シンドローム」と呼ばれる)を引き起こす重要な因子である(非特許文献3)(非特許文献4)。
メタボリック・シンドロームには、過剰な内臓脂肪沈着、高血圧症、グルコースおよびインスリン恒常性異常、インスリン抵抗性、内皮障害、心血管肥大、炎症、血管炎症、アテローム性動脈硬化症、心室収縮機能不全、線維症および脂肪肝疾患などの合併症が伴う。この多因子症候群を処置するための有効な治療および予防の選択肢の特定は、非常に困難であることが分かっており、肥満およびメタボリック・シンドロームの発生および進行の両方に大きな役割を果たすことが示されている、慢性炎症としての脂肪症、代謝および心血管機能不全に対処し得る抗炎症薬の開発に対して新たに注目が集まっている。
脂肪組織の動的成分の中には、脂肪細胞ならびに、脂肪細胞機能に間接的に寄与する、マクロファージ、単球、T細胞および肥満細胞などの多くの様々な免疫細胞がある。肥満の発生の際に初期に脂肪組織中にある免疫細胞(特に、マクロファージ)の数の変化は、脂肪症および代謝機能不全を引き起こす酸化および炎症カスケードを伝播するものと現在考えられている。脂肪組織におけるマクロファージ活性化を引き起こすシグナルは分かっていない。相次ぐエビデンスが、脂肪細胞および/またはマクロファージによって局所的に生成される飽和脂肪酸および脂質メディエータが、炎症細胞活性化、脂肪細胞の増殖、発達および機能不全に少なくとも部分的に関与し、したがって、肥満および代謝障害に寄与し得ることを示唆している。様々な炎症性脂質誘発性Gタンパク質共役受容体(GPCR)が、肥満、脂肪組織免疫細胞依存性炎症、インスリン分泌および心血管恒常性の調節に寄与する細胞内タンパク質をシグナル伝達するものと考えられる。
トリプシンは、膵臓トリプシンが見られる消化管、ならびにトリプシノーゲンの発現が実証されている結腸、気道上皮、神経および血管内皮細胞、皮膚、腸、腎臓および膵臓におけるPAR2の強力な活性剤である。肥満細胞トリプターゼは、PAR2の重要な活性剤でもあり、肥満細胞において高度に発現され、多くの炎症性疾患、内分泌疾患および他の疾病と強く関連している。組織因子VIIaなどの血栓形成促進性因子は、PAR2の切断、N末端内でコードされた受容体活性化配列の露出、それによって、脂肪組織およびマクロファージにおけるPAR2シグナル伝達の活性化にも関与している。より低い効力(nMの濃度の代わりにμM)ではあるが、連結配位子のヒトおよびマウスの配列にそれぞれ対応するヘキサペプチドSLIGKV−NHおよびSLIGRL−NHが、セリンプロテアーゼの代わりにヒトPAR2を活性化し得る。
より強力なペプチド作動薬が、PAR2向けに作製された。ヘキサペプチド類似体、2−フロイル−LIGRL−NHは、SLIGRL−NHより約20倍高い作動薬効力を有し、PAR1よりPAR2に対して選択的である。セリンを他の複素環に置き換えると、等しい効力のPAR2作動薬が得られ、C末端ロイシンの代わりの大きい芳香族基は、PAR2作動薬効力に同様の向上を与える(非特許文献5)(非特許文献6)(非特許文献7)(非特許文献8)(非特許文献9)。250,000種の薬剤様の(drug−like)化合物のスクリーニングにより、2−フロイル−LIGRL−NHと同様の作動薬効力、PAR2に対するいくらかの選択性および生体内での代謝的安定性を有するPAR2の2つの小分子作動薬が生成された(非特許文献10)。
PAR2の第1の公知の拮抗薬は、わずかミリモル濃度で受容体に対する親和性を有し、非PAR受容体を上回るPAR2に対する選択性が最もなさそうである(非特許文献11)。PAR2について報告される第2の拮抗薬は、μMの濃度で活性であるが、トリプシン、トリプターゼおよび他のプロテアーゼのような内因性のPAR2活性剤に対して完全に不活性であるか(非特許文献12)または部分作動薬の作用または可能な作動薬に誘発されるシグナル伝達のいずれかにより、拮抗薬および作動薬としての二重の機能を有する(非特許文献13)。より最近になって、低いマイクロモル濃度で活性を有するPAR2拮抗薬が報告されており、他のPARよりPAR2に対して選択的であり、プロテアーゼおよび合成PAR2作動薬による受容体活性化を可逆的に阻害することが分かった(非特許文献14)。
1つの態様において、本発明は、低いマイクロモルまたはサブマイクロモル濃度で使用される場合、PAR2を選択的に調節することができる新規な種類の化合物を提供するのが有利である。構造的特性、および調べられる細胞内経路に応じて、これらの新規な化合物は、作動薬または拮抗薬のいずれかとして作用することができ、生物学的研究のための手段としてまたは抗炎症性、炎症誘発性、抗増殖性または増殖性の療法のための作用物質として有用であり得る。
肥満に対する現在の治療は、食欲、代謝またはカロリーおよび食物からの栄養素の吸収を変えることによって、患者の体重を減少または制御することによって機能し、例えば、オルリスタット(Xenical)は、長期使用がFDAによって現在承認されている。オルリスタットは、膵臓リパーゼを阻害することによって、腸内の脂肪吸収を減少させる。第2の薬剤である、リモナバント(Acomplia)は、内在性カンナビノイド系の特異的な阻害によって作用する。FDAに承認された複合薬Qsymiaは、食欲を抑制する刺激剤であるフェンテルミンと、抗けいれん剤であるトピラマートとを含む。しかしながら、これまで、メタボリック・シンドロームの症状の改善または緩和におけるPAR2の阻害剤の役割は、報告されていない。
意外なことに、PAR2の特定の拮抗薬が、肥満、メタボリック・シンドロームならびに脂肪炎症、II型糖尿病、線維症および心血管疾患を含むその関連する疾病および疾患を改善し、予防し、または緩和することができることがここで分かった。
したがって、別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、脂肪炎症、II型糖尿病、線維症および心血管疾患の治療および/または予防におけるPAR2拮抗薬の使用を有利に提供する。本発明の態様は、PAR2拮抗作用が、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病に特徴的なインスリンおよびグルコース不耐性、心血管疾患に特徴的な心血管の異常(cardiovascular irregularity)、およびコラーゲン沈着によって定義される線維症の治療および/または予防に有効であるという事実に基づくものである。
クローン病および潰瘍性大腸炎は、共通の病理を有する炎症性腸疾患(IBD)の一般的な形態である。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸を侵し、クローン病は、結腸および回腸の複数の領域を侵し、それぞれの病態は、特徴的な模様の粘膜の潰瘍(ulcerative mucosa)を有する。意外なことに、PAR2の拮抗薬が、現在の治療と比較して改良された効力で、炎症性腸疾患を予防または緩和することができることがここで分かった。したがって、別の態様において、本発明は、炎症性腸疾患の治療および/または予防におけるPAR2拮抗薬の使用を有利に提供する。
Iyer,A.et al,Nat Rev Endocrinol 2009,6,71−82 Iyer,A.& Brown,L.Drug Discovery Today:Disease Mechanisms 2011 Potenza,M.V.& Mechanick,J.I.,Nutrition in Clinical Practice 2009,24,560−77 Simmons,R.K.et al.Diabetologia 2010,53,600−5 McGuire, J. J. et al, J Pharmacol Exp Ther 2004, 309, 1124−31 Barry G. D. et al, Bioorg Med Chem 2007, 27, 5552−7 Hollenberg, M. D., et al, J Pharmacol Exp Ther 2008, 326, 453−62 Boitano, C., et al, J Med Chem 2011, 54, 1308−13 Flynn, A. N., et al, J Biological Chem 2011, 286, 19076−88 Seitzberg, J. G., et al. J Med Chem 2008, 51, 5490−3) Kelso,E.B.,et al.J Pharmacol ExpTher 2006,316,1017−24 Kanke,T.,et al.Br J Pharmacol 2009,158,361−371 Goh,F.G.,et al.Br J Pharmacol 2009,158,1695−1704 Barry G.D.et al,J.Med.Chem.2010,53,7428−40
一態様において、本発明は、式(I):
(式中、
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、または−C(O)Rであり;ここで、
が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される1つ以上の置換基で任意に置換される、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5員または6員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよく;または
が、それが結合される窒素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成し;
が、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基であり、ここで、C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される1つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または環式基または複素環式基が、任意に置換される芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基と縮合され;
が、水素またはC〜Cアルキルであり;
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;
が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン(dioxalane)、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルであり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基と縮合されたピペリジンを形成し;
ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環あるいはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよく;またはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、さらなるC〜C10環式基またはC〜C10複素環式基とさらに縮合され;
が、水素またはC〜Cアルキルであり;
が、C〜Cアルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環であり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるC〜C芳香族または脂肪族環式基または複素環式基を形成し;
12が、水素またはC〜Cアルキルである)
の化合物;および
その塩であって;
ただし、化合物が、5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン]、5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[インダン−1,4’−ピペリジン]、5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[オクタヒドロ−1H−インデン−1,4’−ピペリジン]または5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリンでない化合物またはその塩を提供する。
さらなる態様において、本発明は、式(Ia):
(式中、
11が、アルキル、アミノ、またはフェニルから選択される1つ以上の基で任意に置換される、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5員または6員の不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよく;
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;
が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルであり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し;ここで、フェニル、ベンジルまたは複素環が、アルキル、アルキルオキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよい)によって表される式(I)の化合物;および
その塩を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物、またはその塩に受容体を曝露する工程を含む、PAR2の活性を調節する方法を提供する。
一態様において、本発明の化合物はPAR2拮抗薬である。
さらなる態様において、本発明の化合物はPAR2作動薬である。
さらなる態様において、本発明の化合物は、PAR2によって媒介される特定の細胞内シグナル伝達経路のための「バイアス(biased)」配位子に応じて、所与のアッセイではPAR2拮抗薬であり得るが、異なるアッセイではPAR2作動薬であり得る。
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物、またはその塩を、好ましくは、薬学的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤および/または補助剤とともに含む医薬組成物を提供する。
さらに他の態様において、本発明は、本発明に係る化合物、またはその塩を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体を処置する予防または治療方法を提供する。好ましくは、疾病または疾患は、炎症性の疾病または疾患、または増殖性の疾病または疾患である。
別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のPAR2拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の式(I):
(式中、
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、または−C(O)Rであり;ここで、
が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される1つ以上の置換基で任意に置換される、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5員または6員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよく;または
が、それが結合される窒素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成し;
が、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基であり、ここで、C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される1つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または環式基または複素環式基が、任意に置換される芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基と縮合され;
が、水素またはC〜Cアルキルであり;
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;
が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルであり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基と縮合されたピペリジンを形成し;
ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環あるいはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよく;またはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、さらなるC〜C10環式基またはC〜C10複素環式基とさらに縮合され;
が、水素またはC〜Cアルキルであり;
が、C〜Cアルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環であり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるC〜C芳香族または脂肪族環式基または複素環式基を形成し;
12が、水素またはC〜Cアルキルである)によって表されるPAR2拮抗薬;および
その塩を投与する工程を含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、炎症性腸疾患を治療する方法であって、本発明に係る式(I)の化合物、またはその塩を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
さらに他の態様において、本発明は、望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体の予防または治療処置への、式(I)の化合物、またはその塩の使用を提供する。好ましくは、疾病または疾患は、炎症性の疾病または疾患、または増殖性の疾病または疾患である。
別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のためのPAR2拮抗薬の使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための、本明細書において定義される式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬の使用を提供する。
さらに他の態様において、本発明は、望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体の予防または治療処置のための薬剤の製造における、式(I)の化合物、またはその塩の使用を提供する。好ましくは、疾病または疾患は、炎症性の疾病または疾患、または増殖性の疾病または疾患である。
別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造のためのPAR2拮抗薬の使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、本明細書において定義される式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬の使用を提供する。
HT29細胞におけるPAR2作動薬6についての3点濃度の棒グラフのグラフ表示。 PAR2拮抗薬18によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬24によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬26によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬27によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬30によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬39によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬42によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。 PAR2拮抗薬18、30、42、44が実験の足浮腫を緩和する能力のグラフ表示。拮抗薬18、30、42または44(オリーブ油中10mg/kgを経口投与(p.o.)、n=3)により、2−f−LIGRLO−NH(足当たり350μg、拮抗薬の経口投与の2時間後)によって誘発される足浮腫が軽減された。 ラット血漿(薬剤を投与していないWistarラットに由来する)中の公知のペプチド作動薬SLIGRL−NHおよび2−f−LIGRLO−NHと比較したPAR2拮抗薬(18、30、40、42および44)の安定性のグラフ表示。 ラットの肝臓のホモジネート(薬剤を投与していないWistarラットに由来する)中の公知のペプチド作動薬SLIGRL−NHおよび2−f−LIGRLO−NHと比較したPAR2拮抗薬(18、30、40、42および44)の安定性のグラフ表示。 ヒト初代単球由来マクロファージに対するパルミチン酸の影響のグラフ表示。 食餌性肥満ラットにおけるPAR2拮抗薬52による肥満および脂肪組織免疫炎症性細胞浸潤の調節のグラフ表示。 PAR2 mRNAのリアルタイムPCR遺伝子定量のグラフ表示。 脂肪組織炎症におけるPAR2拮抗薬52の調節のグラフ表示。 食餌誘発性ラットにおけるPAR2拮抗薬52による代謝パラメータの調節のグラフ表示。 PAR2拮抗薬52で処置されたラットにおける肝臓、骨格筋および膵臓中の脂肪酸酸化の影響のグラフ表示。 食餌性肥満ラットにおけるPAR2拮抗薬52による心血管の構造および機能の調節のグラフ表示。 PAR2拮抗薬52によるラットにおける実験の足浮腫の緩和のグラフ表示。 PAR2拮抗薬52によるコラーゲン誘発性関節炎の病態生理の予防的改善のグラフ表示。 染色した足関節切片の顕微鏡写真とともに、PAR2拮抗薬52の予防的投与による関節炎発症(arthritogenesis)の際の組織病理学的変化の緩和のグラフ表示。 PAR2拮抗薬52による病変関節における関節炎様のコラーゲン損失、肥満細胞脱顆粒およびマクロファージ集積の減少を示す、グラフ表示および染色した足関節切片の顕微鏡写真。 ラットのTNBS誘発性慢性大腸炎モデルのTNBS誘発性病様症状ならびにスルファサラジンおよび化合物52によるその緩和のグラフ表示。
上記の病態生理学におけるその明らかな役割の証拠にもかかわらず、PAR2の生物学的機能は、特に生体内レベルにおいて、依然としてよく理解されていない。このように実質的な進展がないことの原因は、主に、さらなる研究のためのPAR2の強力でかつ選択的な、生物学的に利用可能な作動薬および拮抗薬がないことにある。
構造活性関係研究は、ヘキサペプチド作動薬SLIGKV−NHおよびSLIGRL−NHから出発して、これらのペプチド配位子がPAR2に結合しそれを活性化するのに必要な特定の側鎖官能基を決定できるようにした。この情報を用いることによって、初めて、強力で、選択的でかつ経口で有効な、受容体の非ペプチド性の調節剤を合理的に設計し、開発することができた。この過程において、新規な化合物における、受容体認識に必要な断片および作動薬または拮抗薬の機能性を与える領域を決定することができた。ある実施形態において、これらの新規な化合物は、異常なPAR2発現および/または活性に関連する疾病または疾患を治療または予防する手段を提供する。
本明細書において、当業者に周知のいくつかの用語が使用される。それにもかかわらず、明瞭にするために、いくつかの用語が定義される。
本明細書に使用される際の「非置換」という用語は、置換基が存在せず、または唯一の置換基が水素であることを意味する。
本明細書において、特に定義されない限り、「任意に置換される」という用語は、基が、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、アルキニルオキシ、アミノ、アミノアシル、チオ、アリールアルキル、アリールアルコキシ、アリール、アリールオキシ、アシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、スルホ、ホスホノ、ホスホリルアミノ、ホスフィニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロキシ、オキシアシル、オキシム、オキシムエーテル、ヒドラゾン、−NHC(NH)NH、オキシアシルアミノ、オキシスルホニルアミノ、アミノアシルオキシ、トリハロメチル、トリアルキルシリル、ペンタフルオロエチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメタンチオ、トリフルオロエテニル、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−(置換アルキル)アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロシクリル、アミノ、ならびにアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルから選択される異なる置換基を有する非対称二置換アミンから選択される1つ以上の基でさらに置換されるかまたは(縮合された多環式基を形成するように)縮合されても、またはされなくてもよいことを意味するものと解釈される。
特定の実施形態において、好ましい置換基は、アルキル、フェニル、アルコキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、トリハロアルキルオキシまたは式−C(O)NHCHR(式中、Rが−C(O)NHであり、RがC〜Cアルキルアミンである)の基から独立して選択される1つ以上の基である。
基または基の一部としての「アルキル」は、特に断りのない限り、直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素基、好ましくはC〜C10アルキル、より好ましくはC〜Cアルキル、最も好ましくはC〜Cを指す。好適な直鎖状または分枝鎖状のC〜Cアルキル置換基の例としては、メチル、エチル、n−プロピル、2−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ヘキシルなどが挙げられる。
本明細書における「アミノ」という用語は、水素、アルキル、アリールまたはそれらの組合せで置換される窒素ラジカルを指す。
本明細書において、正式名称、一般的な三文字表記(例えばSer、Leu、Ile、Gly、Arg、Lys、ValまたはCha)または一文字表記(例えばS、L、I、G、R、KまたはV)のいずれかによる、セリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、リジンまたはバリンなどの天然アミノ酸、あるいはシクロヘキシルアラニンなどの非天然アミノ酸を含むアミノ酸への言及は、特に規定されない限り、L−異性体を意味するものと解釈される。
「アルキルアミン」という用語は、本明細書に定義されるアルキル基にさらに結合されるアミンを指し、規定されない限り、モノ−およびジ−アルキルアミンの両方を含む。アルキル基は、好ましくはC〜C10アルキル基である。この基は、窒素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
「アルキルアミド」という用語は、式−C(O)NR(式中、R置換基の少なくとも1つが、本明細書において定義されるアルキル基を表す)の基を指す。アルキルアミドは、規定されない限り、モノ−およびジ−アルキルアミドの両方を含む。当業者は、モノ−アルキルアミドの場合、残りのR置換基が水素を表すことを認識するであろう。アルキル基は、好ましくはC〜C10アルキル基である。この基は、窒素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
「アミノアルキル」という用語は、少なくとも1つのアミンでさらに置換される、本明細書において定義されるアルキル基を指す。好ましいアミノアルキル基は、C〜C10アミノアルキル基である。アミノアルキル基の例としては、以下に限定はされないが、モノ−またはジ−アミノメチル、1−アミノエチル、1,1−ジアミノエチル、1,2−ジアミノエチルおよび−C(NH)(NH)が挙げられる。この基は、アルキル炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
「アミドアルキル」という用語は、少なくとも1つのアミド基でさらに置換される、本明細書において定義されるアルキル基、すなわち式アルキル−C(O)NHの基を指す。好ましいアミドアルキル基は、C〜C10アミドアルキル基である。この基は、アルキル炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
基または基の一部としての「アリール」は、好ましくは環当たり5〜12個の原子を有する、任意に置換される単環式、または縮合された多環式の、芳香族炭素環(全て炭素である環原子を有する環構造)を表す。アリール基の例としては、フェニルなどの単環式基、ナフチルなどの縮合された多環式基などが挙げられる。典型的に、アリール基が、C〜C10アリール基である。
二環式または多環式基に言及して使用される際の「縮合」という用語は、オルト−またはペリ−縮合された二環式または多環式環系などの、環の少なくとも2つが共通のC−C結合を共有する二環式または多環式環系を指す。「縮合」という用語は、二環式または多環式スピロ環系などの、1つのみの共通のC原子を共有する二環式または多環式環系も含む。
「アリールアミン」という用語は、本明細書において定義されるアリール基にさらに結合されるアミンを指し、規定されない限り、モノ−およびジ−アリールアミンの両方を含む。アリール基は、好ましくはC〜C10アリール基である。この基は、窒素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
「アミノアリール」という用語は、少なくとも1つのアミンでさらに置換される、本明細書において定義されるアリール基を指す。好ましいアミノアリール基は、C〜C10アミノアリール基である。この基は、アリール炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
基または基の一部としての「アルコキシ」という用語は、アルキルが本明細書において定義されるとおりであるアルキル−O−基を指す。好ましくは、アルコキシは、C〜C10アルコキシである。例としては、以下に限定はされないが、メトキシおよびエトキシが挙げられる。
「環」または「環式基」という用語は、好ましくは環当たり3〜10個の炭素を含有する、飽和、部分不飽和または完全不飽和の単環式または縮合またはスピロ多環式環系を指す。
本明細書において使用される「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。
「ヒドロキシアルキル」という用語は、少なくとも1つの−OH基でさらに置換される、本明細書において定義されるアルキル基を指す。好ましいヒドロキシアルキル基は、C〜C10ヒドロキシアルキル基である。この基は、アルキル炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
「複素環」または「複素環基」という用語は、環原子として窒素、硫黄および酸素からなる群から選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含有する飽和、部分不飽和または完全不飽和の単環式、二環式または縮合された多環式またはスピロ多環式環系を指す。各環は、好ましくは3〜10員、より好ましくは4〜7員である。好適な複素環置換基の例としては、以下に限定はされないが、それぞれ1〜3つの置換基でさらに置換され得る、ピロール、フラン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、トリアゾール、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、フラザン、オキサジアゾール、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジンおよびピラジンが挙げられる。
本発明のある好ましい実施形態において、一般式(I)に関して、以下の定義の1つ以上が当てはまる:
a)Rが、それぞれがアルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される1つ以上の置換基でさらに任意に置換され得る、ピロール、ピリジン、ピラジン、フラン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、トリアゾール、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、フラザン、またはオキサジアゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
b)Rが、それぞれがアルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される1〜3つの置換基でさらに置換され得る、フラン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピラゾール、トリアゾール、オキサゾールまたはイソオキサゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
c)Rが、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される基で任意に置換されるイソオキサゾールカルボニルであり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
d)Rが、それが結合される炭素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成する。
e)Rが、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基であり、ここで、C〜C環式基またはC〜C複素環基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される1つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または環式基または複素環基が、任意に置換される芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基と縮合される。
f)Rが、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される1つ以上の置換基で任意に置換されるシクロヘキサンまたはフェニルから選択され、または環式基または複素環基が、任意に置換される芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基と縮合される。
g)Rが、シクロヘキサン、フェニル、(p−メチル)フェニル、(p−アミノ)フェニル、(p−ヒドロキシ)フェニルまたはインドールから選択される。
h)Rが、水素またはメチルから選択される。
i)Rが、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;Rが、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり、ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルである。
j)Rが、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;Rが、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、アリールアミン、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるベンジル基である。
k)Rが水素であり;Rが、アルキルまたはアルコキシで置換されるベンジル基である。
l)Rが水素であり;Rが、−C(O)NHCHR10で置換されるベンジル基であり;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルである。
m)Rが水素であり;Rが、アルキルまたはアルコキシおよび基−C(O)NHCHR10から選択される基で置換されるベンジル基であり、ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルである。
n)組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基と縮合され;ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環または縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよく、または縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基が、さらなるC〜C10環式基またはC〜C10複素環基と縮合される。
o)Rが、水素またはC〜Cアルキルである。
p)Rが、C〜Cアルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環である。
q)組み合わされたRおよびRが、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換される、C〜C環式基、フェニルまたはC〜C複素環式基を形成する。
一般式(I)に関するさらなる実施形態において、以下の定義の1つ以上が当てはまる:
r)Rが、それぞれがアルキルまたはフェニルから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換され得る、ピロール、ピリジン、ピラジン、フラン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、トリアゾール、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、フラザン、またはオキサジアゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
s)Rが、それぞれがアルキルまたはフェニルから選択される1〜3つの置換基でさらに置換され得る、フラン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピラゾール、トリアゾール、オキサゾールまたはイソオキサゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
t)Rが、アルキルまたはフェニルから選択される基で任意に置換されるイソオキサゾールカルボニルであり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
u)Rがシクロヘキサンである。
v)Rが水素である。
w)Rが、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;Rが、アルキル、アルコキシ、アリールアミン、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり、ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルである。
x)Rが、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;Rが、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるベンジル基である。
y)Rが水素であり;Rが、アルキルまたはアルコキシで置換されるベンジル基である。
z)Rが水素であり;Rが、−C(O)NHCHR10で置換されるベンジル基であり;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルである。
aa)Rが水素であり;Rが、アルキルまたはアルコキシおよび基−C(O)NHCHRから選択される基で置換されるベンジル基であり、ここで、Rが−C(O)NHであり、RがC〜Cアミノアルキルである。
ab)組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し;ここで、フェニル、ベンジルまたは複素環が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ac)Rがメチルである。
ad)Rがエチルである。
さらなる態様において、本発明は、式(Ia):
(式中、
11が、アルキル、アミノ、またはフェニルから選択される1つ以上の基で任意に置換される、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5員または6員の不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよく;
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;
が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で置換されるベンジル基であり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基と縮合され;ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環または縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよく;または縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、さらなるC〜C10環式基またはC〜C10複素環式基と縮合される)によって表される式(I)の化合物;および
その塩を提供する。
好ましい実施形態において、R11がイソオキサゾールである。
したがって、好ましい態様において、本発明は、式(Ib):
(式中、
が、水素、C〜Cアルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり;
が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルであり;または
組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基と縮合され;ここで、フェニル、ベンジル、複素環または縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルオキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルキルオキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよい)によって表される式(I)の化合物;および
その塩を提供する。
さらに好ましい実施形態において、式(I)の化合物に関して、R11がイソオキサゾールであり、Rが水素であり、Rが、任意に置換されるベンジル基である。
したがって、さらなる態様において、本発明は、式(Ic):
(式中、
、RおよびRが、個々に、水素、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、C〜C複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−C(O)NHCHR10から選択される基を表し;ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルであり;または
組み合わされたRおよびRまたはRおよびRがジオキサランを形成する)によって表される式(I)の化合物;および
その塩を提供する。
式(Ic)に関する好ましい実施形態において、RおよびRが水素であり、Rが−C(O)NHCHR10であり、ここで、Rが、−C(O)NHであり、R10が、C〜Cアミノアルキルである。
式(Ic)に関する別の好ましい実施形態において、RまたはRのうちの一方が、メチル、メトキシまたはエトキシであり、他方が水素であり、Rが水素である。
式(Ic)に関するさらなる好ましい実施形態において、組み合わされたRおよびRまたはRおよびRがジオキサランを形成し、残りのRまたはRが水素である。
別のさらなる好ましい実施形態において、式(I)の化合物に関して、R11がイソオキサゾールであり、組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキル、アミノアリールまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し;ここで、
フェニル、ベンジルまたは複素環が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよい。
したがって、別の態様において、本発明は、式(Id):
(式中、
、RおよびRが、独立して、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキル、アミノアリールまたは複素環から選択される基を表し、または組み合わされたRおよびRまたはRおよびRが、縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基を形成し;ここで、
フェニル、ベンジル、複素環または縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基またはC〜C複素環基が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよい)によって表される式(I)の化合物;または
その塩を提供する。
さらに他の好ましい実施形態において、式(I)の化合物は:
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチルフェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(4−メトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−クロロ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−ニトロ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−フルオロ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3−フルオロ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(4−フルオロ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(3−[アミノメチル]フェニル)−アミノ−4−アミノブタン−1−カルボキサミド;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(3−[アミノメチル]フェニル)−アミノ−3−アミノプロパン−1−カルボキサミド;または
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(p−フルオロフェニル)ピペラジン.
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(6,7−ジメトキシ−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン);
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−{1−(メチルスルホニル)スピロ[インドリン−3,4’−ピペリジン]};
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−{3H−3−オキソ−スピロ[イソベンゾフラン−1,4’−ピペリジン]};
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(4−オキソ−スピロ[クロマン−2,4’−ピペリジン]);
からなる群から選択される。
他の好ましい実施形態において、式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬は:
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−メトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3−メトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−メチル)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−エトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−プロポキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−イソプロポキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−ブトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−イソブトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−トリフルオロメチル)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3−トリフルオロメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−トリフルオロメチル)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(1,3−ジオキサラン)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3,4−ジクロロ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2,4−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2,5−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3,4−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2,3−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2,3,4−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2,6−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−メトキシ−5−トリフルオロメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2,4−ジメトキシ)フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3,5−ビス(トリフルオロメチル))フェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(4−フェニル)ピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(p−メトキシ)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(p−クロロ)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(o−トリフルオロメチル)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(o−フェニル)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(m−フェニル)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(p−フェニル)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(p−フェノキシ)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(2,5−ジメトキシ)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(4−ベンジル)ピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−2S−(tert−ブチルアミド)ピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−4−(4−アセトアミド)フェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−3−(o−フルオロ)アミノフェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−3−(m−フルオロ)アミノフェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−3−(p−フルオロ)アミノフェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−3−(o−トリフルオロメチル)アミノフェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−3−(m−トリフルオロメチル)アミノフェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−3−(p−トリフルオロメチル)アミノフェニルピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロクロマン−2,4’−ピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−[(S)−N−(tert−ブチル)]ピペリジン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノジメチル−(2−メトキシ)フェニル;
からなる群から選択される。
さらに他の好ましい実施形態において、式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬は:
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−ベンズイミダゾール;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−2−ビフェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−3−ビフェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−4−ビフェニル;
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−2−ナフタレン;
5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−アミノメチル−(2−メトキシ)フェニル;
Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
5−(3−アミノ−イソオキサゾリル)−Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[クロマン−2,4’−ピペリジン];
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[インダン−1,4’−ピペリジン];
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[オクタヒドロ−1H−インデン−1,4’−ピペリジン];または
5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(4−オキソ−スピロ[クロマン−2,4’−ピペリジン])
からなる群から選択される。
式(I)の化合物が、少なくとも2つの不斉中心を有し、したがって、2つ以上の立体異性体で存在することが可能であることが理解されよう。本発明の化合物が、単一のジアステレオマーとして存在することが非常に望ましく、ここで、シクロヘキシルアラニンおよびイソロイシン残基の不斉炭素原子は、L−配置を有する。したがって、本発明は、シクロヘキシルアラニンおよびイソロイシン残基の少なくとも2つの不斉中心に対して実質的に純粋な、例えば、約95%〜97%のdeまたは99%超のdeなどの約90%超のdeの立体異性体の化合物、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物にも関する。このようなジアステレオマーは、例えばキラル中間体を用いた不斉合成によって調製されてもよく、または混合物は、従来の方法、例えば、クロマトグラフィー、または分割剤の使用によって分割され得る。
さらに、式(I)は、必要に応じて、溶媒和形態ならびに非溶媒和形態の化合物を包含することが意図される。したがって、各式は、水和形態ならびに非水和形態を含む、示される構造を有する化合物を含む。
本発明の化合物が塩として存在し得ることが理解されよう。本発明の新規な生物活性化合物は、薬学的に許容できる塩として被験体に投与され得る。しかしながら、薬学的に許容できない塩も、薬学的に許容できる塩の調製における中間体としてまたは生物学的研究のための手段としてこれらが有用であり得るため、本発明の範囲内に含まれることが理解されよう。
本発明の塩に適用されるおよび/または本発明の方法に使用される際の「薬学的に許容できる」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なリスク/治療ベネフィット比を超える過度の毒性、刺激、アレルギー、または同様の負の反応を伴わずに、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適した塩を指す。好ましくは、薬学的に許容できる塩は、患者に投与するのに適した塩である。したがって、本発明は、本発明の化合物のいずれか1つの薬学的に許容できる塩にも及ぶ。
薬学的に許容できる塩は、一般に、当該技術分野において公知であり、本発明の場合、本発明の化合物の比較的非毒性の有機塩または無機塩を含む。このような塩の例としては、以下に限定はされないが、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、酢酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ラウリルスルホン酸塩、グルコヘプトン酸塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ステアリン酸塩、パルミチン酸塩、吉草酸塩、安息香酸塩、ナフチル酸塩(naphthylate salt)、メシル酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩などの酸付加塩が挙げられる(例えば、Bergeら,「J.Pharm.Sci.1977年」,66,1−19を参照)。さらに、薬学的に許容できる塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類塩、およびアンモニウム塩などの塩基性塩も含まれる。例えば、薬学的に許容できる塩基性塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩が挙げられる。さらに、例えば、リジン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N−メチルグルカミン)、プロカインおよびトリスの塩を含む有機塩も使用され得る。本発明の化合物中の塩基性窒素含有基は、例えば、アルキルハロゲン化物(メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物を含む低級アルキルハロゲン化物など)、長鎖ハロゲン化物(例えば、デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物)、アラルキルハロゲン化物(例えば、ベンジルおよびフェネチルの臭化物)、ジアルキル硫酸塩(例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルの硫酸塩)を含む様々な有機作用物質で四級化され得る。
本発明の化合物の塩は、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、酢酸エチルなど、およびそれらの混合物との溶媒和物の形態で存在することもできる。
プロドラッグ誘導体も、本発明の範囲に含まれ、広義で、生体内で本発明の化合物に転化される化合物を包含する。このような誘導体は、当業者が容易に考え付くものであり、例えば、アルキルまたはアシル基、酸化物、糖類またはオリゴペプチドでさらに変性される化合物を含み、これらは、本体が容易に開裂されて、本発明に係る活性化合物が得られる。すなわち、「プロドラッグ」という用語は、生体内でその治療的に有効な形態または利用可能な形態に転化されるまで完全には有効でないかまたは利用可能でない本発明の前駆体または変性された化合物を指す。
本発明の化合物を調製するための方法が、本発明のさらなる実施形態として提供され、以下の一般的な手順によって示される。
化合物は、保護アミノ酸を用いて合成され得る。アミノ保護基は、一般に、当業者に公知であり、化学反応からアミノ基を保護する(またはブロックする)のに適しているが、所望の化学反応が分子中の他の位置で行われた後に容易に除去可能である基に関する。保護基が、所望の反応(または一連の反応)後に除去されるため、それらの性質およびサイズは特に重要でない。アミノ保護基の例としては、以下に限定はされないが、アセチル、プロピオニル、ブチリル、フェニルアセチル、ベンゾイルまたはトルイル基などのアシル保護基;アリールオキシ−アルカノイル保護基;メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、tert−ブチルジカルボニル(Boc)、2−ヨードエトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル保護基;カルボベンジルオキシ(Cbz)、4−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド(Fmoc)などのアラルコキシカルボニル(aralkoxycarbonyl)保護基;または4−メトキシ−2,3,6−トリメチルフェニルスルホニル(Mtr)、ペンタメチル−2,3−ジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル(Pbf)または2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)などのアリールスルホニル保護基が挙げられる。好ましいアミノ保護基は、Boc、Cbz、Fmoc、およびベンジルである、より好ましいアミノ酸保護基はBocである。
一般に、化合物は、Boc−保護されたイソロイシン残基、1種以上のカップリング試薬または活性化試薬およびN.N−ジイソプロピルエチルアミン(N.N−diisopropylethylamine:DIPEA)などの塩基が好適な体積の溶媒に溶解された溶液相中で合成される。
アミノ基へのカルボキシル基のカップリングを進行させるためにカルボキシル基を活性化するのに使用されるカップリング試薬は、一般に、当業者に周知であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド(dicyclohexylcarbodiimide:DCC)およびジイソプロピルカルボジイミド(diisopropylcarbodiimide:DIC)などのカルボジイミドカップリング試薬ならびに1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(HOBt)、1−ヒドロキシ−7−アザ−ベンゾトリアゾール(HOAt)、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、2−(1H−7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム(HATU)、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびO−(1H−6−クロロベンゾトリアゾール−1−イル)1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)などのトリアゾールカップリング試薬を含み得る。
一般に、上記の反応は、以下に限定はされないが、ジメチルホルムアミド(dimethylformamide:DMF)、N−メチルピロリジン(N−methylpyrolidine:NMP)、トリフルオロエタノール(triflouroethanol:TFE)、ヘキサフルオロイソプロパノール(hexafluoroisopropanol:HFIP)、ジクロロメタノール(dichloromethanol:DCM)、またはクロロホルムを含む、溶液相ペプチド合成に適した溶媒または溶媒の混合物中で行われ得る。好ましい実施形態において、反応は、DMF中で行われる。
次に、溶液は、式(I)の化合物の置換基RおよびRによって表されるC末端部分を有するアミノに加えられ、反応が完了するまで撹拌される。一般に、反応は、室温で行われる。カップリング反応の完了は、エレクトロスプレーイオン化質量分析(electrospray ionisation mass spectroscopy:ESI MS)または他の形態の分光法によって決定される。
次に、中間化合物は、反応混合物から単離され、粗生成物は、DCM中のトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid:TFA)の溶液で処理されて、イソロイシンN末端Boc−保護基が除去される。次に、溶液は、N下で蒸発され、洗浄され、ろ過され、減圧下で蒸発される。次に、後続のアミノ酸およびN末端カルボン酸が、同じ条件下で順次カップリングされる。最終的な粗生成物が、逆相高性能液体クロマトグラフィー(reverse phase high performance liquid chromatography:rpHPLC)によって精製される。本発明の化合物は、高分解能質量分析(high−resolution mass spectroscopy:HRMS)およびプロトン核磁気共鳴分光法(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy:H NMR)によって特性決定され、化合物の純度が、分析的逆相HPLCによって評価される。
本発明の化合物は、受容体を活性化するかまたは天然連結配位子の活性を阻害することによるPAR2活性を調節するそれらの能力によって特定されており、このため、本明細書において「作動薬」、「拮抗薬」、「阻害剤」、「PAR2阻害剤」、「PAR2の阻害剤」などと呼ばれる場合がある。特定の細胞型のまたは特定の方法で評価されたPAR2拮抗薬は、異なる細胞型のまたは異なる方法で評価されたPAR2作動薬または部分作動薬であってもよく、その逆も同様であることに留意することが重要である。例えば、1つの細胞型からの細胞内のカルシウムの放出を活性化する化合物が作動薬または部分作動薬である一方、このような放出を阻害する化合物が拮抗薬であり得る。しかしながら、これらの「作動薬」および「拮抗薬」の効果は、異なる細胞において所与の化合物またはPAR2配位子で逆になることがあり、または逆の反応が、異なる報告アッセイ(例えばERKリン酸化またはcAMP刺激)を用いて観察され得る。
本明細書における「PAR2拮抗薬」という用語は、天然の連結配位子または合成PAR2作動薬への受容体の曝露の後の細胞内カルシウムの放出を少なくとも阻害する化合物を指す。例えば、実施例に記載されるアッセイなどの細胞に基づいたインビトロアッセイの使用によって、このような化合物を決定するための技術が当業者には周知である。
本発明の「拮抗薬」、「阻害剤」、「PAR2阻害剤」または「PAR2の阻害剤」は、天然連結配位子などの天然作動薬によって、PAR2受容体に結合し、PAR2受容体の活性化を阻害する化合物であり、PAR2受容体の拮抗薬ならびに受容体の逆作動薬として働く化合物を含む。拮抗薬が、受容体において結合する作動薬によって誘発される活性化を阻止することによって作用する一方、逆作動薬も、受容体を占有し、作動薬の非存在下で受容体活性化の構造レベルを減少させることによって機能する。本発明の化合物がPAR2の活性化を阻害する能力は、熟練した取扱者が利用可能な任意の数の手段、例えば、実施例に記載される方法などの、細胞内カルシウム動員を含むいくつかの下流マーカーに対するPAR2阻害の効果を測定するインビトロアッセイ、細胞内環状アデノシン一リン酸(cyclic adenosine monophosphate:cAMP)刺激またはERK1/2リン酸化によって評価され得る。
「配位子」という用語は、受容体の特異的結合パートナーを指し、これには、以下に限定はされないが、受容体作動薬、部分作動薬、混合された作動薬、拮抗薬および薬剤などの、天然連結PAR2配位子ならびに結合されていない内因性の細胞外配位子が含まれる。「受容体」という用語は、配位子の特異的結合パートナーを指し、これには、限定はされないが膜結合受容体が含まれる。
本発明の化合物がPAR2を調節する能力は、当業者に利用可能な何種類もの手段、例えば、実施例に記載される方法などの、細胞内カルシウム動員を含むいくつかの下流マーカーに対するPAR2調節の効果を測定するインビトロアッセイ、細胞内環状アデノシン一リン酸(cyclic adenosine monophosphate:cAMP)刺激またはERK1/2リン酸化によって評価され得る。
好ましくは、理論に制約されるものではないが、本発明の化合物は、受容体に結合することによって、また、天然連結配位子が受容体結合領域に接触し、または連結配位子と競合し、または受容体の他の箇所に結合して拮抗薬活性の作動薬を誘発するのを防ぐことによって、PAR2の活性化を阻害または増幅する。PAR2の拮抗薬は、以下に限定はされないが、本明細書に記載される結合されていない内因性配位子および合成作動薬を含む、PAR2に対する他の配位子の活性を阻害することによって作用することもできる。
活性化プロテアーゼの非存在下でPAR2に結合し、それを活性化する本発明の化合物も、本発明のある態様のために好ましい。
本発明の一態様において、細胞を、化合物、またはその塩に曝露する工程を含む、PAR2の活性を調節する方法が提供される。細胞を、化合物、またはその塩に曝露する工程は、インビトロ、生体外または生体内で行われ得る。
例えば、細胞を化合物に曝露する工程がインビトロまたは生体外で行われる場合、本発明の方法は、生物学的研究のための手段としてまたは被験体におけるPAR2活性を調節するための特定の化合物(単独でまたは組み合わせて)の効力を測定するための診断手段として使用され得る。例えば、PAR2を発現する細胞は、被験体から除去され、本発明の1種以上の化合物、またはその塩に曝露され得る。化合物(または複数の化合物)がPAR2の活性を調節する能力は、当業者に公知の方法によっていくつかの下流マーカーのいずれか1つを測定することによって評価され得る。したがって、特定の化合物が別の化合物より有効であるかどうかを確認し、具体的な治療計画を該当する被験体に合わせて調整することができる。
好ましい実施形態において、細胞を、化合物、またはその塩に曝露する工程は生体内で行われる。
本発明の一実施形態において、異常なPAR2発現および/または活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体を処置する予防または治療方法が提供される。具体的な疾病および疾患としては、以下に限定はされないが、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、膵炎、心血管疾患、胃潰瘍、大腸炎、喘息、線維症および線維性疾患、血管炎症などの急性および慢性炎症性疾患、ならびにてんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および線維性疾患、心血管疾患などの炎症性疾患に関連する他の病態、ならびに胃、結腸、大腸、乳房、膵臓、脳または肝臓の癌などを含むがこれらに限定されない癌などの増殖性疾患が挙げられる。
好ましい実施形態において、予防または治療方法は、本明細書に記載される望ましくないまたは不十分なPAR2活性に関連する疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を有する被験体に、その疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を治療し、治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、修正し、改善し、好転させ、またはそれに作用するために、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与する工程を含む。予防的治療は、望ましくないまたは不十分なPAR2活性に関連する疾病または疾患の発症率を低下させ得る。
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドロームを治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のPAR2拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。
「メタボリック・シンドローム」は、以下に限定はされないが、腹部肥満、脂肪炎症、脂質異常症、高血糖、血栓形成促進性状態および高血圧症を包含し、これらは、II型糖尿病、インスリン抵抗性および心血管疾患の発症の個体のリスクを上昇させる(Van Gaal,L.F.,et al,Nature 2006,444,875−80;Reaven,G.M.,Diabetes 1988,37,1595−1607;Dandona,P.,et al,Circulation 2005,111,1448−54;Zimmet,P.Z.,et al,Med J Aust 2005,183,175−6;Ferrannini,E.,Ann Med 2006,38,42−51;Symonds,M.E.,et al,Nat Rev Endocrinol,2009)。メタボリック・シンドロームには、以下に限定はされないが、過剰な内臓脂肪沈着、高血圧症、グルコースおよびインスリン恒常性異常、インスリン抵抗性、内皮障害、心血管肥大、炎症、血管炎症、アテローム性動脈硬化症、心室収縮機能不全、線維症および脂肪肝疾患などの合併症が伴う(Van Gaal,L.F.,et al.,Nature 2006,444,875−80;Zimmet,P.Z.,et al.,Med J Aust 2005,183,175−6)。
飽和脂肪および加工糖を多く含む食事は、脂肪組織中に脂肪酸およびグルコースを過剰に吸収させ、免疫細胞の浸潤および炎症ストレス経路の活性化を促進し、インスリン抵抗性、II型糖尿病、高脂血、高血圧症および心血管疾患を引き起こす。炎症および代謝過程は、共通の細胞内標的、PAR2を有するいくつかのタンパク質分解酵素によって媒介される。理論に制約されるものではないが、肥満が、脂肪組織、主に、マクロファージなどの脂肪免疫細胞におけるPAR2発現の増加と生体内で相関することが理論化されている。一般的な食物脂肪である、パルミチン酸は、ヒトマクロファージにおけるインビトロでのPAR2発現を増加させ、PAR2拮抗薬によって阻害され得る炎症性サイトカイン(例えばIL−1β、IL−6)のPAR2誘発性分泌を増幅する。したがって、PAR2発現は、肥満と相関し、食餌脂肪酸によって刺激される有望な新規なバイオマーカーである。PAR2活性化は、炎症/代謝機能不全の実質的な原因であり、PAR2拮抗作用は、食餌性肥満ならびに炎症、代謝および心血管機能不全を予防および治療するのに有効である。
したがって、一実施形態において、本発明は、肥満を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のPAR2拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、II型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のPAR2拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、線維症を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のPAR2拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のPAR2拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態において、PAR2拮抗薬は、本発明に係る式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬であろう。
研究により、PAR2が、様々な疾病において炎症反応を促進することが示されている。PAR2は、トリプシン、肥満細胞トリプターゼおよび組織因子VIIAを含む多くのセリンプロテアーゼおよび他のプロテアーゼによって活性化され、多くのセリンプロテアーゼおよび他のプロテアーゼは、体重増加に重要であり得る脂肪組織マクロファージの調節に寄与する可能性がある。しかしながら、PAR2は、多くのこのようなプロテアーゼ酵素の主要な細胞内標的であるため、複数の活性化プロテアーゼの何らかの影響を阻止するための考えられる治療標的である。理論によって本発明を制約することを意図するものではないが、パルミチン酸などの、洋風の食事に豊富な脂肪酸が、マクロファージ、ならびに脂肪細胞および脂肪免疫細胞などの免疫細胞上および免疫細胞中のPAR2の発現の増加に主に関与する内因性の要因として働き得ると仮定される。脂肪酸および多くのプロテアーゼはまた、PAR2の発現を上方制御し得ることも提案される。次に、PAR2は、様々な増加した循環プロテアーゼおよびおそらくこれまでに報告されていない内因性作動薬によって切断されて、食餌性肥満の際の脂肪組織炎症ならびに代謝および心血管機能不全が誘発される。
したがって、第2の仮説は、PAR2の拮抗薬が、マクロファージ、他の免疫細胞、脂肪細胞、膵臓細胞および肝細胞における任意のPAR2に媒介される下流のシグナル伝達を制御し、それによって、メタボリック・シンドロームに対する内因性プロテアーゼの影響を緩和するのに有効であり得ることである。したがって、強力かつ特異的なPAR2拮抗薬が、食餌性肥満およびメタボリック・シンドロームを緩和し得ると想定される。
本発明の予防または治療方法は、本明細書に記載される望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を有する被験体に、その疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を治療し、治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、修正し、改善し、好転させ、またはそれに作用するために、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容できる塩の組合せを投与する工程も含み得る。予防的治療は、望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患の発症率を低下させ得る。ある実施形態において、本発明の化合物またはその薬学的に許容できる塩の組合せは、本発明の化合物またはその薬学的に許容できる塩の1つのみを用いる予防または治療方法と比較して、PAR2活性の阻害の強化を提供し得る。
本明細書に記載される予防または治療方法が、当該技術分野において現在用いられている他の治療法との何種類もの組合せで使用され得ることも、当業者によって理解されよう。
PAR2発現および/または活性が増大または減少される条件、および前記活性を減少または増大させることが望ましい条件が、当該技術分野において公知の診断または予測アッセイのいずれかまたはその組合せによって、当業者によって特定され得る。例えば、被験体から得られる生物試料(例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、脂肪組織、脳組織および/またはそれに由来する細胞)が、PAR2発現および/または活性について分析され得る。このような病態としては、以下に限定はされないが、関節炎、結腸炎および炎症性腸疾患、膵炎、肝臓、腎臓および泌尿生殖器系の疾病、心血管疾患、脳卒中、胃潰瘍、喘息、線維症および線維性疾患などの自己免疫または炎症性疾患、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満およびII型糖尿病、代謝障害、消化器疾患、神経変性疾患および呼吸器疾患、皮膚および皮下組織の疾病、筋肉、骨および腱の疾病などの炎症性疾患に関連する他の病態、ならびに胃、結腸、大腸、乳房または膵臓の癌を含む癌などの増殖性疾患が挙げられる。
上記の方法は、以下に限定はされないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラットおよびマウスを含む全ての哺乳動物、ならびにニワトリ、鳥類、は虫類および細菌などの下等生物を含む任意の種の予防および治療処置に適していると考えられる。
別の実施形態において、望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患の予防または治療処置のための、本明細書において定義される式(I)の化合物の使用が提供される。
好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のためのPAR2拮抗薬の使用を提供する。
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための、本発明に係る式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬の使用を提供する。式(I)の化合物は、式(I)または(Ia)の化合物であり得る。
別の実施形態において、本発明は、望ましくないPAR2活性に関連する疾病または疾患の予防または治療処置のための薬剤の製造における、本明細書において定義される式(I)の化合物の使用を提供する。式(I)の化合物は、式(Ia)の化合物であり得る。
好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造のためのPAR2拮抗薬の使用を提供する。
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、II型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明に係る式(I)の化合物によって表されるPAR2拮抗薬の使用を提供する。式(I)の化合物は、式(I)または(Ia)の化合物であり得る。
本発明の別の実施形態において、式(I)の化合物、またはその塩(本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる)を含む医薬組成物が提供される。好ましい実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤および/または補助剤を含み得る。
本発明の医薬組成物は、単独でまたは治療用化合物などの他の化合物とともに用いられ得る。
本明細書において使用される際の「薬学的に許容できる担体」という用語は、好ましくは、医薬品投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物は、一般に、その意図される投与経路と適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分:注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための作用物質を含み得る。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基を用いて調整され得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで作製された、アンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアルに封入され得る。
注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌注射溶液または分散体の即時調製のための滅菌水溶液(水溶性である場合)または分散体および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL.(商標)(BASF,Parsippany,N.J.)またはリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline:PBS)が挙げられる。いずれの場合も、組成物は、無菌でなくてはならず、容易な注入性(syringability)が存在する程度の流体であるべきである。
それは、製造および貯蔵の条件下で安定性であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、または液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒度の維持によってまたは界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの組み込みによって達成され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、またはソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含むことによってもたらすことができる。
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上に挙げた成分の1つまたはその組合せとともに適切な溶媒に所要量の活性化合物を組み込んだ後、ろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および上に挙げたものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、その予め滅菌ろ過された溶液から、活性成分の粉末に加えて任意のさらなる所望の成分が得られる。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口の治療的投与のため、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、シロップ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物は、オリーブ油または他の油、または洗口剤として使用するための流体などの流体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合される結合剤、および/または補助剤材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチなどが、以下の成分、または同様の性質を有する化合物:微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤;でんぷんまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはステロート(sterote)などの潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤;スクロースまたはサッカリンなどの甘味料;またはペパーミント、メチルサリチル酸塩、またはオレンジ香料などの着香料のいずれかを含有し得る。
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器またはディスペンサー、または噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
全身投与も、経粘膜または経皮手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、透過されるバリアに適切な浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、一般に、当該技術分野において公知であり、これには、例えば、経粘膜投与のため、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与が、鼻腔用スプレーまたは坐薬を用いて行われ得る。化合物は、坐薬(例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む)または直腸投与用の停留かん腸の形態で調製され得る。
経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野において一般に公知の軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームへと製剤化される。
一実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、徐放性製剤などの、化合物が身体から急速に排除されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかである。材料は、Alza Corporation社およびNova Pharmaceuticals,Inc.から市販品として得ることもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的としたリポソームを含む)を、薬学的に許容できる担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号明細書に記載されるように、当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態の経口または非経口組成物を製剤化することが有利である。本明細書において使用される際の「投薬単位形態」は、好ましくは、治療される被験体の単回の投薬として適した物理的に個別の単位を指し;各単位は、必要な医薬担体と合わせて、所望の治療効果を生じるように計算される所定の量の活性化合物を含有する。
本発明に係る医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、LD50(個体群の50%致死量)およびED50(個体群の50%に治療効果のある用量)を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な医薬的手順によって決定され得る。毒性作用と治療効果との用量比は、治療指数であり、それは、比率LD50/ED50として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方、非感染細胞への考えられる損傷を最小限に抑えるために、このような化合物を罹患組織の部位に標的化し、それによって副作用を軽減する送達系を設計することに注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投薬量を配合するのに使用され得る。投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わずにED50を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意の化合物では、治療効果のある用量を、細胞培養アッセイから最初に推測することができる。用量は、細胞培養中で決定される際にIC50(すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む血中血漿濃度範囲を達成するように、動物モデル中で配合され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中濃度が、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
当業者は、用いられる特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時期、投与経路、排せつ速度、任意の複合薬、調節される発現または活性の程度、疾病または疾患の重症度、前処置および存在する他の疾病を含む特定の要因が、被験体を有効に治療するのに必要な投薬量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。
上記の適応症では、適切な投薬量は、例えば、用いられる化合物、被験体の年齢、性別、体重および全身的な身体状態、投与形態、病態の性質および/または重症度または所望の効果に応じて変わることになる。これらの特徴のバランスを取ることによって、適切な投薬量を決定することは十分に医師の一般技能の範囲内である。ただし、例として、好適な1日投薬量は、約0.1〜約2000mg/体重kg、好ましくは約0.2〜約100mg/体重kg、より好ましくは約0.5〜約200mg/体重kg、さらにより好ましくは約1〜約50mg/体重kgの範囲内である。
本発明に使用される手順の実施例が、これ以降により詳細に説明される。しかしながら、以下の説明があくまで例示的なものであり、上述した本発明の一般性に対する限定として決して解釈されるべきではないことを理解されたい。
一般式(I)の化合物を調製するための方法
以下の実施例は、本発明の代表例であり、本発明の例示的な化合物を調製するための詳細な方法を提供する。
一般的なアミノ酸カップリング手順(A):
化合物を、例えば、FmocまたはBoc−保護されたアミノ酸を用いて溶液相中で合成することができる。一実施例において、Boc−保護されたイソロイシン(1.2〜1.5当量)を、DMF(0.2〜0.5M)中のHBTUまたはBOP(1.5当量)およびDIPEA(1.5当量)を用いて10分間活性化した。次に、溶液を遊離アミンに加え、反応が完了するまで混合物を撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCOで(2回)洗浄した。有機層をMgSO上で乾燥させ、真空中で乾燥させた。次に、粗生成物をDCM中20%のTFAで処理し、1〜2時間撹拌して、Boc−保護基を除去した。反応混合物をN下で蒸発させることによってTFAを除去した。残渣をDCMに溶解させ、飽和NaHCOで(2回)洗浄し、MgSOを用いて乾燥させ、ろ過し、真空中で蒸発させた。次に、Boc−保護されたシクロヘキシルアラニンアミノ酸(Boc−Cha−OH)および任意に置換される複素環カルボン酸を、同じ条件下で順次カップリングした。各カップリング反応をESI MSによって監視したところ、大抵の反応は一晩で完了した。
一般的なHPLC精製および分析方法:
全ての粗生成物を、Phenomenex C18カラム(300Å、21.2×250mm)を用いて、調整可能な吸光度検出器(λ 214nM)を備えた半分取rpHPLCによって精製した。精製された化合物を、HRMSおよびH NMR(400MHzまたは600MHz)によって特性決定し、純度を、分析rpHPLC(Phenomenex C18カラム、300、4.6×250mm、λ 214、230および254nm)によって評価した。全ての化合物は、95%以上の純度であった。
分析rpHPLC方法:50〜100%のBで10分間、100%のBでさらに10分間
溶媒A:HO中0.1%のTFA、溶媒B:10%のHO中0.1%のTFA、90%のアセトニトリル(半分取および分析rpHPLCの場合)。
高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析(High−resolution electrospray ionisation mass spectroscopy:HRMS)測定値を、内部標準物質としてギ酸ナトリウムクラスターを用いて、100μL/時におけるMeCNへの直接注入によって陽イオンモードでDionex LCシステム(Chromeleon)を備えたBruker micrOTOF質量分析計において得た。Bruker Daltonics Data Analysis 3.4ソフトウェアを用いてデータを処理した。質量精度は、1ppmの誤差より良好であった。
実施例1.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−フルオロ)フェニル(6)の調製。
スキーム1.a)DMF中のBoc−Ile−OH、HBTU/DIPEA;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール5−カルボン酸、HBTU/DIPEA
化合物6を、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって合成した。
H NMR(400 MHz、CDCl):δ 0.79〜0.86(m,8H)、0.88〜0.98(m,1H)、1.01〜1.23(m,5H)、1.27〜1.37(m,1H)、1.39〜1.49(m,1H)、1.63〜1.77(HOピークとのHの重なり)、1.81〜1.88(m,1H)、4.40〜4.45(dd,1H,J=5.6,14.8Hz)、4.51〜4.57(dd,1H,J=6.0,14.8Hz)、4.70〜4.76(m,1H)、6.63(br s,1H)、6.87〜6.89(br s,1H)、6.91〜6.92(d,1H,J=2Hz)、7.00〜7.10(m,2H)、7.22〜7.36(m,3H)、8.30〜8.31(d,1H,J=1.6Hz)。
HRMS:[MH]487.2715(C2636FN についての計算値)487.2718(実測値)。
実施例2.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−メトキシ)フェニル(18)の調製。
スキーム2.a)DMF中のBoc−Ile−OH、HBTU/DIPEA;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール5−カルボン酸、HBTU/DIPEA。
化合物18を、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって合成した。
H NMR(400MHz、CDCl):δ 0.82〜0.86(m,7H)、0.88〜1.00(m,2H)、1.04〜1.22(m,1H)、1.25〜1.37(m,2H)、1.40〜1.46(m,1H)、1.59〜1.73(m,7H)、1.77〜1.84(m,2H)、3.86(s,3H)、4.19〜4.23(dd,1H,J=6.8,8.8Hz)、4.37〜4.42(dd,1H,J=6、14.4Hz)、4.46〜4.51(dd,1H,J=6,14.4Hz)、4.60〜4.65(m,1H)、6.19〜6.21(t,1H,J=5.6Hz)、6.50〜6.53(d,1H,J=8.8Hz)、6.87〜6.93(m,3H)、6.99〜7.01(d,1H,J=7.2Hz)、7.23〜7.29(m,2H)、8.331〜8.335(d,1H,J=1.6Hz)。
HRMS:[MH]499.2915(C2739 についての計算値)499.2915(実測値)
実施例3.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(2−イソプロポキシ)フェニル(24)の調製。
スキーム3.a)2−ヨードプロパン、DBU、140℃;b)NHOH;c)Zn、HCOONH
工程a:マイクロ波反応バイアル中に、サリチルアルデヒド(1当量)、DMF、DBU(1当量)および対応する2−ヨードプロパンを入れた。容器を密閉し、混合物にBiotage Initiatorマイクロ波反応器(140℃、10分間)において照射した。反応の進行を、TLC(PE/EtOAc 4:1、生成物Rf約0.5)によって監視した。完了したら、反応混合物を冷まし、EtOAcで希釈し、飽和NaCOで(3回)洗浄して、出発材料サリチルアルデヒドを除去した。有機相をMgSO上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、黄色の液体としての生成物(70%の収率)が得られ、それをさらに精製せずに使用した。
工程b:得られたアルデヒドを、MeOH/HO(1:1)中のヒドロキシルアミン塩酸塩(2当量)およびNaOH(4当量)で処理し、室温で1時間撹拌した。完了した後、反応溶液を蒸発乾固させ、次に、EtOAcに再度溶解させ、1MのHClで(2回)、飽和NaHCOで(2回)および塩水で(1回)洗浄した。有機相をMgSO上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、ワックス質の固体(90%の収率)が得られた。
工程c:出発材料のMeOH中のオキシムに、ギ酸アンモニウム(2当量)および亜鉛末(2当量)を加え、反応混合物を1時間還流させた。反応混合物を、セライトパッドを通してろ過し、MeOHで洗浄し、ろ液を蒸発させた。不純粗生成物を分取HPLCで精製した。一般的なアミノ酸カップリング手順Aに記載されるように、精製されたアミンを、Boc−保護されたイソロイシンにカップリングして、24を得た。
H NMR(600MHz、CDCl)、δ 0.81〜0.87(m,6H)、0.87〜1.01(m,2H)、1.06〜1.34(m,6H)、1.36〜1.38(t,6H,J=6Hz)、1.40〜1.49(m,1H)、1.63〜1.73(m,6H)、1.76〜1.84(m,1H)、4.19〜4.22(dd,1H,J=6.6,9.0Hz)、4.38〜4.42(dd,1H,J=6.0,14.4Hz)、4.44〜4.48(dd,1H,J=6.0,14.4Hz)、4.59〜4.65(m,2H)、6.21〜6.23(t,1H,J=6Hz)、6.58〜6.60(d,1H,J=9.6Hz)、6.86〜6.89(m,2H)、6.91〜6.92(d,1H,J=1.8Hz)、7.01〜7.03(d,1H,J=9Hz)、7.22〜7.24(m,1H)、8.33〜8.34(d,1H,J=1.8Hz)。
HRMS:[MH]527.3228(C2943 についての計算値)527.3231(実測値)。
実施例4.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(1,3−ジオキサラン)フェニル(26)の調製。
スキーム4.a)CHBr、CuO、KCO、DMF、160℃;b)HNOH、MeOH−HO;c)NH4CHO、Pd/C。
工程a:DMF(16mL)を含む丸底フラスコ中に、2,3−ジヒドロキシベンズアルデヒド(2.0g、14.5mmol)、ジブロモメタン(1.4mL、17.4mmol)、酸化第二銅(0.11g、1.45mmol)、KCO(2.4g、17.4mmol)を加え、反応混合物を、160℃で一晩還流させた。反応混合物を、セライトパッドを通してろ過し、ろ過ケーキをCHClで洗浄した。ろ液をHOで(3回)洗浄した。有機層をMgSO上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、暗褐色の油が得られた。Kugelrohr蒸留装置(沸点120℃/0.1mm)を用いて油を蒸留したところ、黄色の油としての生成物(1.5g、69%の収率)が得られた。
工程b:得られたアルデヒドを、MeOH/HO(1:1)中のヒドロキシルアミン塩酸塩(2当量)およびNaOH(4当量)で処理し、室温で1時間撹拌した。完了した後、反応溶液を蒸発乾固させ、次に、EtOAcに再度溶解させ、1MのHClで(2回)、飽和NaHCOで(2回)および塩水で(1回)洗浄した。有機相をMgSO上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、白色の固体(70%の収率)が得られた。
工程c:出発材料のMeOH中のオキシム(2.5mmol)に、ギ酸アンモニウム(2当量)およびPd/C(100mg)を加え、反応混合物を、室温で48時間撹拌した。反応混合物を、セライトパッドを通してろ過し、MeOHで洗浄し、ろ液を蒸発させた。不純粗生成物を分取HPLCで精製した。一般的なアミノ酸カップリング手順Aに記載されるように、精製されたアミンを、Boc−保護されたイソロイシンにカップリングして、26を得た。
H NMR(600MHz、DMSO−d)、δ 0.84〜0.90(m,6H)、0.90〜1.01(m,2H)、1.05〜1.23(m,4H)、1.29〜1.37(m,1H)、1.43〜1.50(m,1H)、1.60〜1.75(m,6H)、1.76〜1.81(m,1H)、1.84〜1.92(m,1H)、4.25〜4.27(dd,1H,J=7.2,9.0Hz)、4.39〜4.42(dd,1H,J=6,15Hz)、4.47〜4.51(dd,1H,J=6,15Hz)、4.62〜4.66(m,1H)、5.96〜5.97(m,2H)、6.19〜6.24(m,1H)、6.52〜6.58(m,1H)、6.74〜6.80(m,3H)、6.91(d,1H,J=1.8Hz)、7.03〜7.08(m,1H)、8.33〜8.34(d,1H,J=1.8Hz)。
HRMS:[MNa]535.2527(C2736Na についての計算値)535.2528(実測値)。
実施例5.式(27)によって表される5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノメチル−(3,4−ジクロロ)フェニルの調製。
スキーム5.a)DMF中のBoc−Ile−OH、HBTU/DIPEA;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール5−カルボン酸、HBTU/DIPEA
化合物27を、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって合成した。
H NMR(600MHz、DMSO−d):δ 0.79〜0.82(m,6H)、0.85〜0.91(m,2H)、1.03〜1.16(m,4H)、1.23〜1.29(m,1H)、1.40〜1.47(m,1H)、1.48〜1.53(m,1H)、1.56〜1.76(m,7H)、4.15〜4.17(t,1H,J=8.4Hz)、4.22〜4.30(m,2H)、4.54〜4.58(m,1H)、7.15〜7.16(d,1H,J=1.8Hz)、7.21〜7.23(dd,1H,J=1.8,7.8Hz)、7.47(d,1H,J=1.8Hz)、8.04〜8.05(d,1H,J=8.4Hz)、8.58〜8.60(t,1H,J=6Hz)、8.75〜8.76(d,1H,J=1.8Hz)、8.93〜8.94(d,1H,J=8.4)。
HRMS:[MH]537.2030(C2635Cl についての計算値)537.2028(実測値)。
実施例6.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−(4−フェニル)ピペリジン(30)の調製。
スキーム6.a)Mg、THF、65℃;b)Pd/C、触媒HCl、50psi;c)THF中4MのHCl
工程a:グリニャール反応:乾燥した、窒素充填した二つ口丸底フラスコに、削り屑状マグネシウム(magnesium turning)(500mg、20mmol)、少量のヨウ素結晶および乾燥THF(3.8mL)を入れた。温水浴(55〜65℃)中で撹拌しながら、無水THF(5mL)中のブロモベンゼン(20.05mmol)の溶液を、乾燥したシリンジに入れ、溶液の1/3を、フラスコ中にゆっくりと移して、反応を開始させた(注:色がゆっくりと暗褐色から淡褐色へと変化した)。混合物が沸騰し始めたら、水浴を除去し、混合物を、乾燥THF(5mL)で希釈した。次に、残っているブロモベンゼン溶液をフラスコにゆっくりと加えた。混合物を20分間還流させた(65℃)後、混合物を氷水浴中で冷却し、乾燥THF(5mL)中の1−Boc−4−ピペリドン(2g、10mmol)の溶液を滴下添加した(その間、白色の固体が形成された)。添加したら、混合物を室温でさらに30分間撹拌した。10%のクエン酸の冷却された溶液を加え、混合物を1分間撹拌した(結果として、粘着性の固体が形成された)。ジエチルエーテルおよび水を加えて、固体を溶解させ、層を分離させた。水層をエーテルで(2回)洗浄した。組み合わされた有機層を、水で(1回)洗浄し、無水MgSO上で乾燥させ、ろ過し、真空中で蒸発させた。粗生成物を、石油スピリット/酢酸エチル(4:1)で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、白色の結晶の生成物(0.96g、34.5%の収率)が得られた。
工程b:水素化分解:EtOH(20mL)中の、上記の粗生成物(200mg)と、10%のPd/Cと、触媒量の濃HCl(1.2mL)との混合物を、50psiで1時間水素化した。Pd/Cを、セライトパッドを通してろ過し、溶媒を真空中で蒸発させた。
工程c:Boc脱保護:上記の粗生成物を、THF(4mL)中4MのHCl(4mL)で1時間処理した。THF溶媒およびHClを蒸発させ、残渣をDCMに溶解させ、飽和NaHCOで(2回)洗浄した。有機層をMgSO上で乾燥させ、ろ過し、真空中で蒸発させた。一般的なアミノ酸カップリング手順Aに記載されるように、残渣アミン(110.4mg、95%の収率)を、Boc−保護されたイソロイシンにカップリングして、30を得た。
H NMR(400MHz、CDCl):δ 0.84〜1.02(m,7H)、1.08〜1.26(m,4H)、1.32〜1.54(m,2H)、1.57〜1.83(m,10H)、1.94〜2.05(m,3H)、2.68〜2.83(m,2H)、3.16〜3.26(m,1H)、4.11〜4.20(m,1H)、4.64〜4.72(m,1H)、4.73〜4.80(m,1H)、4.87〜4.93(q,1H,J=6.8Hz)、6.76〜6.84(t,1H,J=9.2Hz)、6.93〜6.95(br d,1H,J=2Hz)、7.05〜7.11(t,1H,J=8Hz)、7.17〜7.25(m,3H)、7.29〜7.34(m,2H)、8.33〜8.34(d,1H,J=1.6Hz)。
HRMS:[MH]523.3279(C3043 についての計算値)523.3280(実測値)。
実施例7.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[クロマン−2,4’−ピペリジン](37)の調製。
スキーム7.a)DMF中のBoc−Ile−OH、HBTU/DIPEA;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール5−カルボン酸、HBTU/DIPEA
化合物を、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって合成した。
H NMR(600MHz、DMSO−d)、δ 0.85〜1.00(m,8H)、1.11〜1.24(m,6H)、1.49〜1.59(m,3H)、1.60〜1.72(m,6H)、1.74〜1.85(m,4H)、1.86〜2.00(m,1H)、2.01〜2.22(m,1H)、2.77〜2.82(m,1H)、3.15〜3.28(m,1H)、3.57〜3.69(m,1H)、3.92〜4.00(m,1H)、4.40〜4.47(m,1H)、4.68〜4.76(m,1H)、4.88〜4.92(t,1H,J=8.4Hz)、6.68(br s,2H)、6.82〜7.14(m,4H)、7.31〜7.57(m,1H)、8.34〜8.35(d,1H,J=1.2Hz)。
HRMS:[MH]565.3384(C3245 についての計算値)565.3385(実測値)。
実施例8.5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−アミノジメチル−(2−メトキシ)フェニル(39)の調製。
スキーム8.a)DMF中のBoc−Ile−OH、HBTU/DIPEA;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール5−カルボン酸、HBTU/DIPEA
化合物39を、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって合成した。
H NMR(600MHz、DMSO−d):δ 0.75〜0.76(d,1H,J=6.6Hz)、0.78〜0.81(t,1H,J=7.8Hz)、0.86〜0.88(m,4H)、0.90〜0.96(m,2H)、1.00〜1.15(m,3H)、1.18〜1.22(m,1H)、1.32〜1.38(m,1H)、1.45〜1.59(m,2H)、1.60〜1.78(m,6H)、1.83〜1.88(m,1H)、2.80(s,1H)、3.09(s,2H)、3.82(s,3H)、4.3〜4.65(m,4H)、6.86〜6.88(t,1H,J=7.2Hz)、6.94〜6.96(m,1H)、7.01〜7.11(m,1H)、7.19〜7.20(m,1H)、7.26〜7.33(m,1H)、8.33〜8.35(d,1H,J=9Hz)、8.78〜8.79(m,1H)、8.96〜8.99(m,1H)。
HRMS:[MH]513.3071(C2841 についての計算値)513.3071(実測値)。
実施例9.5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−アミノメチル−(2−メトキシ)フェニル(40)の調製。
スキーム9.a)DMF中のMeI、LiOBu;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール−5−カルボン酸、HBTU/DIPEA
工程a:Boc−Thr−アミノメチル−(2−メトキシ)フェニル(0.541mmol、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって2−メトキシベンジルアミンおよびBoc−Thr−OHから調製された)の粗生成物を、DMF(3mL)に溶解させた。リチウムtert−ブトキシド(28.4mg、0.568mmol、1.05当量)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。ヨウ化メチル(37μL、0.595mmol、1.1当量)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、酢酸エチル(20mL)で希釈し、塩水(30mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ(MgSO)、ろ過し、ロタベーパ(rotavapor)で蒸発乾固させた。
工程b〜e:一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって、上記の粗生成物を脱保護し、Boc−Cha−OHおよびイソオキサゾール−5−カルボン酸と順次カップリングして、化合物40を得た。
H NMR(400MHz、CDCl)、δ 0.85〜1.40(m,9H)、1.60〜1.81(m,7H)、3.37(s,3H)、3.77〜3.84(m,1H,Thrのβ−CH)、3.84(s,3H)、4.38〜4.46(m,2H、PhCH)、4.50(dd,1H,J=6.4,3.2Hz,Thrのα−CH)、4.63〜4.69(m,1H,Chaのα−CH)、6.84〜6.91(m,3H)、7.02〜7.12(m,3H)、7.21〜7.27(m,2H)、8.31(d,1H,J=2Hz);13C NMR(100MHz、CDCl)、δ 171.4、168.7、162.2、157.4、155.6、151.0、129.5、129.0、125.7、120.6、110.2、106.9、75.6、56.9、55.6、55.2、51.4、40.2、39.7、34.1、33.6、32.5、26.2、26.0、25.9、14.0。
HRMS:[MH]501.2708(C2637 についての計算値)501.2708(実測値)。
実施例10.5−(3−アミノ−イソオキサゾリル)−Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン](42)の調製。
スキーム10.a)DMF中のBoc−Ile−OH、HBTU/DIPEA;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中の3−アミノイソオキサゾール−5−カルボン酸、BOP/DIPEA。
化合物を、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって合成した。
H NMR(400MHz、CDCl)、δ 0.86〜2.23(m,26H)、3.05〜3.16(m,1H)、3.44〜3.59(m,1H)、4.19〜4.26(m,1H)、4.37(塊(lump)、DOと部分的に交換可能な、DOHと重なったNH)、4.60〜4.77(m,2H)、4.93〜5.01(m,1H)、6.47(s,1H)、6.82〜6.87(m,2H)、7.18〜7.49(m,6H);13C NMR(100MHz、CDCl、アミド結合回転による2つの回転異性体)、δ 171.9(0)/171.8(4)、170.6(8)/170.6(4)、163.6、162.0、155.8、150.7(5)/150.7(0)、142.8/142.5、139.7/139.3、131.1/131.0、127.4/127.3、125.7、125.5、121.8、121.6/121.4、99.9、53.1、51.9/51.8、51.5/51.4、45.6/45.1、41.5/41.4、40.2/40.1、37.9(4)/37.8(8)、34.1、34.0、33.6(2)/33.5(9)、33.4/33.2、32.4(2)/32.4(0)、26.2、26.1(3)/26.1(0)、26.0、24.2、16.0/15.6、11.4/11.2。
HRMS:[MH]562.3388(C3244 についての計算値)562.3388(実測値);
実施例11.5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン](44)の調製。
スキーム11.a)MeI、LiOBu、DMF;b)DCM中20%のTFA;c)DMF中のBoc−Cha−OH、HBTU/DIPEA;d)DCM中20%のTFA;e)DMF中のイソオキサゾール−5−カルボン酸、HBTU/DIPEA
工程a:Boc−Thr−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン](0.270mmol、一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがってスピロ[インデン−1,4’−ピペリジン]およびBoc−Thr−OHから調製された)の粗生成物を、DMF(3mL)に溶解させた。リチウムtert−ブトキシド(23mg、0.284mmol、1.05当量)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。ヨウ化メチル(18.5μL、0.297mmol、1.1当量)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、酢酸エチル(20mL)で希釈し、塩水(30mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ(MgSO)、ろ過し、ロタベーパで蒸発乾固させた。
工程b〜e:一般的なアミノ酸カップリング手順Aにしたがって、上記の粗生成物を脱保護し、Boc−Cha−OHおよびイソオキサゾール−5−カルボン酸と順次カップリングして、化合物44を得た。
H NMR(400MHz、CDCl)、δ 0.88〜1.32(M,8H)、1.36〜1.50(m,3H)、1.63〜2.16(m,9H)、3.07〜3.17(m,1H)、3.44〜3.53(m,1H)、3.35(s)/3.40(s,3H、2つの回転異性体のOMe)、3.66(m,1H,Thrのβ−CH)、4.17(br s,1H)、4.65〜4.72(m,1H)、4.72〜4.79(m,1H,Chaのα−CH)、5.12(1H,dd,J=8.0,4.0Hz,Thrのα−CH)、6.83(d,1H,J=6.0Hz)、6.85(d,1H,J=6.0Hz)、6.96(d,1H,J=1.6Hz)、7.19〜7.40(m,6H)、8.35(d,1H,J=2Hz);13C NMR(100MHz、CDCl、アミド結合回転による2つの回転異性体)、δ171.9(0)/171.8(4)、170.6(8)/170.6(5)、163.6、162.1、155.8、150.8/150.7、142.8/142.5、139.7/139.3、131.1/131.0、127.4/127.3、125.7/125.5、121.8、121.6/121.4、99.9、53.1、51.9/51.8、51.5/51.4、45.6/45.1、41.5/41.1、40.2/40.1、37.9(4)/37.8(8)、34.1、34.0、33.6(2)/33.5(9)、33.4/33.2、32.4(2)/32.4(0)、26.2、26.1(3)/26.1(0)、26.0、24.2、16.0/15.6、11.4/11.2。
HRMS:[MH]549.3071(C3141 についての計算値)549.3076(実測値)。
式(I)のさらなる例示的な化合物が、以下の表1〜4に提供される。
実施例12.PAR2活性化の測定。
本発明の化合物がPAR2を活性化する能力を、カルシウム動員アッセイによって評価し得る。1つの細胞型からの細胞内カルシウムの放出を活性化する化合物が作動薬または部分作動薬である一方、このような放出を阻害する化合物が拮抗薬であり得ることが理解される。しかしながら、これらの「作動薬」および「拮抗薬」の効果は、異なる細胞において所与の化合物またはPAR2配位子で逆になることがあり、または逆の反応が、異なる報告アッセイ(例えばERKリン酸化またはcAMP刺激)を用いて観察され得る。これらのアッセイに使用される全ての細胞培養試薬を、Invitrogen社(Carlsbad,CA)およびSigma Aldrich社(St.Louis,MO)から購入する。細胞株を、ATCC社(Manassas,VA)によって提供される情報に基づいて、37℃および5%のCOにおける培地中で培養する。これらの実験に使用され得る細胞株としては、以下に限定はされないが、ヒト細胞株HT29、HEK293、MM96L、Saos−2、MG−63、HeLa、JAM、A549およびHOP62が挙げられる。一般的なアッセイプロトコルは、選択される細胞株に応じてわずかに変わり得る。一般に、細胞培養継代の際、細胞解離溶液(cell dissociation solution:CDS,Sigma Aldrich社)をトリプシンの代わりに用いて、表面から細胞を解離させる。リポ多糖(Lipopolysaccharide:LPS)およびトリプシンを、Sigma Aldrich社から購入する。トリコスタチン(Trichostatin:TSA)およびPAR2活性化ペプチド、2f−LIGRLO−NHを、社内で合成する。ELISAセットをBD Pharmingen社(San Jose,CA)から購入し、サイトカインアレイキットをRayBiotecho社(Norcross,GA)から購入する。抗PAR抗体をSanta Cruz Biotechnology社(Santa Cruz,CA)から購入し、Alexa−Fluor 488とコンジュゲートした抗ヤギ抗体をInvitrogen社から購入する。
ウェル当たり約2×10〜4×10個の細胞で、96ウェルの黒壁透明底プレート中で細胞を一晩播種する。実験の当日に、上清を除去し、細胞を、4μM〜2mMのFluo−3AM、25μLのプルロニック酸(pluronic acid)、1%のウシ胎仔血清(FBS)、2.5mMのプロベネシド(probenecid)および20mMのHEPES)とともに色素ローディング緩衝液(dye loading buffer)(Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)中で37℃で1時間インキュベートする。次に、細胞をHBSSで2回洗浄し、Polarstar蛍光分光計(BMG,Durham NC)に移す。
作動薬活性を測定するために、様々な濃度における読み取りが開始した10秒後に、本発明の化合物を個々のウェルに加え、480nmまたは495nmの励起波長および520nmの発光波長におけるプレートの底部からの蛍光をリアルタイムで測定する。HBSSを社内で調製し、全ての他の試薬をInvitrogen社(Carlsbad)から購入する。プレートは、DKSH社(Zurich)によって供給される。カルシマイシン(A23187,Invitrogen)を用いて、最大蛍光を測定し、個々の結果をそれに応じて正規化する。一般式(I)の例示される化合物の結果を、以下の表5および6に示す。さらに、PAR2作動薬6についての上述した作動薬アッセイのグラフ表示を、図1に示し、後述する。
3つの異なる濃度の6を、HT29細胞に室温で加える。したがって、各データ点で反復測定を行った。各データ点は、平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、100μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。30μMにおいて、6は最大50%の反応率を示しており、これは、6のEC50が約30μMであることを示す。
実施例13.PAR2作動薬阻害(拮抗作用)の測定。
本発明の化合物がトリプシンまたは合成PAR2作動薬によるPAR2の活性化を阻害する能力を、実施例12に上述される細胞内カルシウム放出アッセイによって測定する。
細胞を上で概説したように調製し、次に、トリプシンまたは合成作動薬のいずれかを作動薬EC80に等しい濃度で加える前に、推定上の拮抗薬で30分間処理する。本発明の化合物がPAR2の活性化を阻害する能力を、以下の表7、8および9に例示する。さらに、合成実施例(18、24、26、27、30、39および42)によって表されるPAR2拮抗薬についての上述した拮抗薬アッセイのグラフ表示を図2〜8に示し、以下に詳細に説明する。
PAR2配位子18。PAR2拮抗薬18によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図2に示す。化合物18を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NH(図2A、n=5)または100nMのトリプシン(図2B、n=1)で処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHまたは100nMのトリプシンによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
PAR2配位子24。PAR2拮抗薬24によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図3に示す(n=1)。化合物24を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHで処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
PAR2配位子26。PAR2拮抗薬26によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図4に示す(n=1)。化合物26を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHで処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
PAR2配位子27。PAR2拮抗薬27によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図5に示す(n=2)。化合物27を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHで処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半数阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
PAR2配位子30。PAR2拮抗薬30によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図6に示す(n=8)。化合物30を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHで処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
PAR2配位子39。PAR2拮抗薬39によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図7に示す(n=1)。化合物39を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHで処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
PAR2拮抗薬42。PAR2拮抗薬42によるHT29細胞における細胞内Ca2+放出の阻害のグラフ表示を図8に示す(n=1)。化合物42を、実験の前に室温で30分間HT29細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、1μMのPAR2作動薬2f−LIGRLO−NHで処理した。各データ点は平均±SEMを表す。蛍光の純変化を、1μMの2f−LIGRLO−NHによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化(反応率%)を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度(IC50)値を、Graphpad Prism v5における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
実施例14.本発明の化合物の抗炎症活性の評価。
本発明の化合物が急性および慢性炎症性疾患の両方に関連する症状を改善する能力を、当業者に周知のいくつかの動物モデルによって決定することができ、その一般的な実施例を以下に示す。
薬物動態
動物
雄および雌のWistarラット(8〜9週齢、それぞれ200〜250gおよび250〜300g)を、一般に、食物および水を備える保有設備の規格にしたがって12時間の明暗周期に維持する。
短期間の薬物動態
雄のWistarラットに頸静脈カテーテルを外科的に埋め込む。自由行動動物の留置カテーテルから大量の血液を採取する。(ヘパリン化された)血液試料を、本発明の化合物(10mg/kgで経口投与(p.o.))を投与する5分前、ならびに投与の30分後、1〜6時間後、8時間後および24時間後に採取する。血液を8Krpmで5分間遠心分離し、血漿をアセトニトリルで3回(v/v)希釈し、後に使用するために−80℃で貯蔵する。
長期間の薬物動態
カテーテルを埋め込んでいない動物の一部に、本発明の化合物の経口投与を4日間連続で行う(n=6)。5日目に、ラットを安楽死させ(CO吸入)、心穿刺によって血漿を採取する。脳脊髄液(cerebrospinal fluid:CSF)を大槽から採取し、腹腔内脂肪を採取する。清潔な、血液を含まないCSF試料を、アセトニトリルで2回希釈し、ボルテックスし、8Krpmで5分間遠心分離する。脂肪を、等体積(mL/g)のMillipore水中で均一化する。試料の一部をアセトニトリル(3×w/v)で希釈し、後に使用するために−80℃で貯蔵する。
流体試料の調製
検量線:本発明の化合物を含む各ストック溶液を、アセトニトリル中で9.15、4.57、0.92、0.46、0.09、0.046、0.009および0.005μMで調製する。薬剤で処置していないラットに由来する新鮮血漿の200μLの試料を200μLのストック溶液に移した後、400μLのアセトニトリルを加える。混合物を1分間ボルテックスし、10分間超音波で分解し、13Krpmで5分間遠心分離し、後に使用するために−80℃で貯蔵する。
上清をMillipore水(3×体積)およびtert−ブチルメチルエーテル(tert−butyl methyl ether:TBME、CHROMASOLV(登録商標)Plus、HPLC用、99.9%、Sigma Aldrich製、3×体積)で希釈する。試料をボルテックスし、水/アセトニトリル相が凍結されるまでドライアイス上に置いておく。有機相をマイクロチューブ中にデカントし、回転真空濃縮器(Quantum Scientific社によって供給されるChrist Beta−RVC)を用いて濃縮する。100μLのアセトニトリルを残渣に加え、ボルテックスし、LCMS/MSによって直ぐに分析する。
急性炎症モデル:PAR2誘発性足浮腫
使用される方法は、既述の方法(Kelso,E.B.ら,「Arthritis Rheum 2007年」,56,765−71;Kelso,E.B.ら,「J Pharmacol Exp Ther 2006年」,316,1017−24;およびVergnolle,「N.J Immunol 1999年」,163,5064−9)に基づくものである。雄のWistarラット(群当たりn=3)を使用する。簡潔に述べると、5または10mg/kgの本発明の化合物(オリーブ油に溶解させた状態での強制経口投与(p.o.)、約500μL、体重により調整)をラットに与える。対照の動物は、オリーブ油(500μLの経口投与(p.o.))のみを受ける。2時間後、PAR2作動薬2−フロイル−LIGRLO(足当たり、生理食塩水中350μg、100μL)を、30Gの針を用いて、右足の肉球の足底面に(足蹠皮下投与(i.pl.)で)注射する。生理食塩水のみを受ける左足が対照としての役割を果たす。足の厚さおよび幅を、デジタルキャリパー(World Precision Instruments社,USA)を用いて30分後および1時間ごとに測定し、膨張の面積(mm;厚さに幅を乗算した値)を計算し、各個々の足の基準値からの変化のパーセンテージとして表す。例示的なPAR2配位子18、30、42および44についての結果を図9に示す。
急性炎症モデル:λ−カラギーナン誘発性足浮腫
使用される方法は、既述の方法(Kelso,E.B.ら,「J Pharmacol Exp Ther」 316:1017−1024;およびFlick,M.J.ら,「J Clin Invest」 117:3224−3235)に基づくものである。雄のWistarラット(群当たりn=4)を使用する。簡潔に述べると、10mg/kgの本発明の化合物(オリーブ油に溶解させた状態での強制経口投与(p.o.)、500μL)をラットに与える。対照の動物は、オリーブ油(500μLの経口投与(p.o.))のみを受ける。30分後、λ−カラギーナン(生理食塩水中1% w/v、100μL)を、30Gの針を用いて、右足の肉球の足底面に(足蹠皮下投与(i.pl.)で)注射する。上記と同様に、生理食塩水のみを受ける左足が対照としての役割を果たす。足の幅および厚さを、1〜6時間、8時間および24時間の時点で測定する。データを、基準値からの正規化された面積(mm)の変化として表す。
慢性炎症モデル:コラーゲン誘発性関節炎
プロトコルは、既述のプロトコル(Earp,J.C.ら,「Biopharm Drug Dispos」 2008年;Lin,H.S.ら,「Br J Pharmacol」 2007年,150,862−72;Nishikawa,M.ら,「Arthritis Rheum」 2003年,48,2670−81;およびOlofsson,P.ら,「Arthritis Rheum」 2003年,48,2332−42)に基づくものである。雌のWistarラットを使用する(200〜250g、合計n=14)。コラーゲンによる免疫付与を0日目に開始し、その際、200μgのコラーゲンを、200μL(50:50の0.05Mの酢酸およびフロイント不完全アジュバント)中で、30Gの針を用いて尾の付け根に皮下投与する。シャム手術動物(sham animal)は、コラーゲン抜きの媒体(50:50の0.05M酢酸およびフロイント不完全アジュバント)を受ける。7日後(7日目)、同じ処置を追加免疫として与える。本発明の化合物(オリーブ油中10mg/kg、500μL、経口投与(p.o.)、体重により調整)を試験被験体に7日目以降毎日投与し、関節炎の対照およびシャム手術動物は、強制投与によるオリーブ油媒体のみを受ける。足の測定(上記のような)、体重、臨床スコアおよび機械的侵害受容閾値を、10日目〜28日目に1日おきに測定する。後足のみを測定する。膨張の面積(mm)を計算し、基準値からの変化のパーセンテージとして表す。個々の足の膨張が20%を超えたときに足に関節炎の作用があるとみなし、これは、シャム手術動物群で観察される最大足面積変化(すなわち実験の時間経過のみにより予測される成長)である。
臨床的測定.
以下の条件を組み込んだ臨床スコアを、専門の研究者によって観測的に測定する:移動度:0:跛行(limp)なし、完全な後肢体重支持。1:軽度の跛行、移動度の低下。2:片方の後肢での体重支持の減少/体重支持なし。移動度の低下。3:両方の(2本の)後肢での体重支持なし、移動度ほとんどなし。炎症;0:発赤なし、膨張なし、および関節炎症状なし。1:軽度の発赤および膨張。2:関節炎症状の発現(足指の縮め)、中程度の膨張および発赤。3:重度の膨張および発赤、重度の関節炎症状(足底反射の喪失、足指の縮め、ハンドリング時の後足の回外および内転)。不快感/疼痛;0:発声なし、通常の挙動。1:軽い発声のみ。2:発生の増加およびハンドリング時の軽い後退。3:運動時の自発的な発声(教唆に必要なハンドリングなし)。臨床スコアを、含まれる足の数を3つのスコアに乗算した値の和(最大合計スコアは18、上記を参照)として表す。
組織病理学および関節の健康の評価
終点(28日目)で、COを用いてラットを安楽死させる。後足の皮を剥ぎ、切断し、4%のパラホルムアルデヒド(pH7.4)に4℃で7日間入れる。足を72時間脱灰し(10%のHCl;0.18%(w/v)のEDTA:HO中0.09%(w/v)の酒石酸塩)、組織学的分析のためにパラフィンろうに埋め込む。標準的なプロトコルを用いて、切片を10μmで切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン(haematoxylin and eosin:H&E)、マッソントリクローム染色(Masson’s Trichrome stain:MTC)またはアルシアンブルー/サフラニン−Oで染色する。少なくとも6つの切片の脛骨/距骨/踵骨の関節を、動物ごとに撮像(image)し、評価し/染色法、処置について盲検下に置かれた専門家によって採点する。
H&E切片を、以下のとおりに、以下の改変された指針(Woodruff,T.M.ら,「Arthritis Rheum」 2002年,46,2476−85)を用いて採点する。浮腫;0:健常な組織、血漿細胞浸潤なし。1:滑膜外腔(extra−synovial space)中への軽度の血漿細胞浸潤。2:滑膜外腔中への中程度の血漿細胞浸滑、膜への浸潤が開始する。3:重度の血漿細胞浸潤、滑膜中の米粒体および炎症細胞の発生。滑膜の過形成;0:正常な組織。1:軽度の滑膜腫脹。2:中程度の滑膜腫脹。3:重度の膨張および滑膜腔の成長。軟骨/骨の侵食;0:正常な軟骨。1:関節軟骨への炎症細胞の軽度の付着。2:炎症細胞の中程度の付着が、関節軟骨の第1の層を侵食し始める。3:重度の炎症細胞の付着ならびに軟骨層、軟骨膜および下層の骨の浸食。パンヌス形成;0:パンヌスなし。1:パンヌスが形成され始める。2:パンヌスが滑膜に入る。3:パンヌスが軟骨/骨を浸食し始める。合計病理組織学的スコアを、全てのスコアの和(合計スコアは12)として表す。コラーゲン損失を、マッソントリクローム染色した切片において、既述したのと同様の脛骨の関節面の赤色染色(アニリンブルーの損失)の相対的比率にしたがって定性的に採点する。0:関節面における赤色染色なし、1:0〜25%の表面に現れる赤色、2:25〜50%の表面に現れる赤色、3:50%超の関節面において染色された赤色(最大スコアは3)。アルシアンブルー/サフラニン−O分染により、既述したのと同様に、肥満細胞の活性化状態を決定した。各切片を、脛骨/距骨の関節の上側および下側の領域で、100倍で撮像する。動物当たり少なくとも6つの切片を撮像する(ラット当たり12個を超える分析切片)。細胞をImageJ 1.42qソフトウェアを用いて画像から計数する。青色が存在しない赤色の細胞を不活性であるとみなす。青色染色が見えるが、ある程度の赤色染色がまだある細胞を活性であるとみなす。目に見える赤色染色がない(青色のみがある)細胞を脱顆粒されているものとみなす。
実施例15.本発明の化合物の抗増殖活性の評価。
本発明の化合物が異常な細胞増殖を緩和する能力を、限定はされないが、以下に示される一般的な実施例を含む、当業者に周知のいくつかのアッセイによって測定することができる。
細胞DNA中へのトリチウム化したチミジンの組み込み。
初代ヒト腎尿細管細胞を、48ウェルプレート中で、ホルモン規定無血清(hormonally defined serum free)DMEM/F12中で90%コンフルエントになるまで成長させる。次に、それらを追加の成長因子を含まないDMEMで2回洗浄し、この塩基性媒体中でさらに24時間培養する。この時点で、無血清DMEM中の本発明の化合物を細胞に加え、次に、それらをさらに24時間培養する。[メチル−H]−チミジン(TRA120,GE Healthcare社)、媒体のmL当たり4μCi(0.15MBq)を、培養の最後の6時間加える。試験期間の終了時に、媒体を除去し(そして、サイトカイン放出の測定のために−80℃で貯蔵し)、細胞を氷冷PBSで2回、次に、氷冷10%トリクロロ酢酸で3回、10分間にわたって洗浄する。細胞をもう1回メタノールで洗浄する。次に、細胞層を空気乾燥させ、1%のドデシル硫酸ナトリウムを含有する200μLの0.3MのNaOHを37℃で1時間加えることによって可溶化する。混合した後、50μLを取り出し、ベータ−計数器で計数するために1mLのシンチレーション流体に入れる。そのままの毎分壊変数(raw dpm)に4を乗算し、1000で除算すると、細胞増殖のプロット値が得られる。
実施例16.ラットの血漿および肝臓のホモジネート中の本発明の化合物の安定性
組織液
血液および肝臓を、薬剤を投与していない雄および雌のWistarラット(8〜9週齢、それぞれ200〜250gおよび250〜300g)から採取する。血液を8Krpmで5分間遠心分離する。血漿をプールし、後に使用するために−80℃で貯蔵する。ラットの肝臓を均一化し、3つの体積のPBSで希釈し、ろ布でろ過する。ろ液を安定性試験に直接使用する。
流体試料の調製
各化合物をDMSO中に溶解させて、5mMのストック溶液を作製する。10μLのストックをラット血漿または肝臓のホモジネート(490μL)のいずれかで希釈して、10μM(三重反復)の出発濃度を構成する。混合物をボルテックスし、37℃でインキュベートする。0分、30分、60分および180分の各時点で、100μLの混合物を取り、300μLのアセトニトリルで希釈する。混合物をボルテックスし、遠心分離する。350μLの液体をマイクロチューブに移し、回転真空濃縮器(Quantum Scientific社によって供給されるChrist Beta−RVC)を用いて濃縮する。100μLのアセトニトリル−水(9:1、v/v)を残渣に加え、ボルテックスし、LCMS/MSによって直ぐに分析する。これらの実験からのデータを、ゼロの時点(t)でのLCMS/MSトレースから記録されるピーク面積のパーセントとして表す。
一般に、化合物(18、30、42および44)は、ラット血漿中で安定であり(3時間後に80%超が存在する)、ラットの肝臓のホモジネート中で様々な程度に分解される(図10および11)。結果は、化合物が肝臓中で主に代謝されるという仮説を裏付けるものである。
実施例17.マクロファージ炎症、脂肪症、脂肪組織炎症および代謝機能を調節する際のPAR2拮抗薬の評価。
PAR2がマクロファージ炎症に特異的に関連しているかどうかを調べるために、ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)におけるPARのmRNAレベルに対するパルミチン酸の影響を測定した(図12)。HPRTに対して正規化された、HMDMにおけるPARのリアルタイムPCR測定は、PAR2の発現が、PARファミリーの残り(PAR1、PAR3およびPAR4)よりかなり高かったことを示し、これは、マクロファージにおけるPAR2の調節的な役割を示す(図12A)。パルミチン酸の存在下でのHMDMにおけるPAR2 mRNAの増加は用量依存的であった(図12B)。PAR2の倍率変化を、非処理の試料と比べて計算した。図12CおよびDは、パルミチン酸が、HMDMからの炎症誘発サイトカイン、IL−6およびIL−8の分泌を刺激することを示す。エラーバーは、平均±SEMであり;P<0.05、**P<0.01、***P<0.001である。パルミチン酸によるヒトマクロファージ(HMDM)のインビトロでの刺激は、PAR2のmRNA濃度および炎症性サイトカイン(IL6およびIL8)のタンパク質発現の濃度に依存する増加(20倍未満)を示した。これは、飽和脂肪酸が、マクロファージに関連した脂肪組織炎症および脂肪細胞機能不全に大きな役割を果たし得るPAR2活性化を誘発することを示唆する(図12B、C、およびD)。
選択的なPAR2拮抗薬52を用いて、炭水化物および脂肪を多く含む食餌(HCHF)を与えられたラットの脂肪症、脂肪組織炎症および代謝機能を調節する際のPAR2拮抗作用の治療可能性を評価した。週1回の体重測定(0〜16週間)を、コーンスターチCS(●)および高炭水化物高脂肪(HCHF)(○)を与えられたラット(図13A)、ならびにHCHF(○)およびHCHF+PAR2拮抗薬52(▲)で処置されたラット(図13B)について記録した。さらに、週1回の胴囲測定を、CS(●)、HCHF(○)、HCHF+PAR2拮抗薬52(▲)で処置されたラット(図13C)について記録した。図13Dは、CS(■)、HCHF(■)、HCHF+PAR2拮抗薬52(□)で処置されたラットの二重X線発光分光法による身体組成測定を示す。
コーンスターチ(CS)のみを含有する低炭水化物低脂肪食(lean diet)を与えられたラットと比べて、HCHF食餌を16週間与えられたラットは肥満になり、54±4%の体重および206±43%の総脂肪量、特に、内臓(腹部)脂肪が、0週から16週まで増加した(図13A〜G)。図13Fは、HCHF食餌を16週間与えられ、処置を受けていないラットの、16週の時点での腹部脂肪体の画像である。図13Gは、HCHF食餌を16週間、およびPAR2拮抗薬52(5mg/kg/日を経口投与(p.o.))を8〜16週で与えられたラットの、16週の時点での腹部脂肪体を示す。脂肪組織(図14A)ならびにその2つの成分分画、すなわち脂肪細胞および間質血管細胞(SVC)分画(図14B)におけるPAR2発現の増加が、HCHF食餌によって全て高められ、脂肪症の増加と正に相関していた。局所的な脂肪組織炎症も、HCHF食餌によって増加した(図15A〜F)。知見により、様々な内因性シグナル(HCHF食餌で消費されるパルミチン酸などの飽和脂肪酸)が、マクロファージをプライミングして、PAR2のそれらの発現を増加させ得ることが示される。
CS(●)、HCHF(○)およびHCHF+52(▲)で処置されたラットの収縮期血圧測定(図16A)、CS(●)、HCHF(○)およびHCHF+PAR2拮抗薬52(▲)で処置されたラットの経口グルコース負荷(図16B)、CS(●)、HCHF(○)、HCHF+PAR2拮抗薬52(▲)で処置されたラットのインスリン負荷(図16C)、CS、HCHFおよびHCHF+PAR2拮抗薬52で処置されたラットの血漿脂質濃度(図16DならびにCS、HCHFおよびHCHF+52で処置されたラットの血漿肝臓酵素(図16E、CSに対するP<0.05;**HCHFに対するP<0.05)を含む、PAR2拮抗薬52による代謝パラメータの調節を、食餌性肥満ラットにおいて測定した。Wistarラットによる16週間のHCHF食餌の後、多くの代謝指標(図13および図16)が緩和され、またはPAR2拮抗薬52(10mg/kg/日)の8〜16週の毎日の経口投与によって改善され、体重増加(8〜16週のHCHF、21±1%;+52、X±X%;図13A)、総脂肪量(52、X%;図13D)、内臓(腹部)脂肪沈着ならびにPAR2の全体的な脂肪、脂肪細胞およびSVC発現(図13〜14)が予防された。16週間にわたるHCHF食餌によって誘発される、全体的な脂肪、脂肪細胞および間質血管細胞(SVC)におけるPAR2発現の増加は、8〜16週のPAR2拮抗薬52による処置によって予防され、PAR2 mRNA濃度は、CSを与えられたラットのPAR2 mRNA濃度に匹敵していた(図14)。
慢性脂肪細胞および代謝機能不全の発生は、脂肪組織への免疫細胞の浸潤または動員の増加にも関連している(Lumeng,C.N.,et al.,J Clin Invest 2007,117,175−84;Nishimura,S.et al.,Nat Med 2009,15,914−20;Liu,J.et al.,Nat Med 2009,15,940−45)。後腹膜脂肪組織中への免疫細胞浸潤を、組織化学的分析によって評価し、組織化学的分析により、CSラットの脂肪組織における単細胞としての単球/マクロファージの非常に少ない分布が示された(図15A、B、C)。しかしながら、HCHFラットの脂肪組織における単球/マクロファージの密度は、通常、間質全体にわたる細胞群においてはるかに高かった。マクロファージ活性化は、2つの異なる分化状態、M1、「古典的活性化(classically activated)」およびM2、「選択的活性化(alternatively activated)」に大きく分けられ得る。これらの状態の分類は、表面マーカーの発現、代謝酵素およびケモカインの分泌に大きく依存している。M1または「古典的活性化」マクロファージは、TNF−αおよびIFN−γなどの細胞媒介性炎症反応に応答して産生される。これらのM1マクロファージは、一般に、向上した抗菌機能ならびに炎症性ケモカインおよびメディエータの産生に関連している。M2または「選択的活性化」は、IL−4またはIL−13の存在下で誘発される。M2マクロファージは、M1マクロファージより炎症性メディエータの産生の効率が低く、その代わりに、高レベルの抗炎症性および創傷治癒メディエータを分泌する。
マクロファージに関連した炎症が、代謝機能不全の発生に重要であることを考えて、本発明者らは、脂肪組織における炎症状態および代謝面に対する52の有益な効果を調べた。HCHFを与えられたラットに由来する脂肪組織は、M1特異的な炎症性遺伝子、Il6(IL−6)、Ccl2(MCP−1)およびCcl9(MIP−1)の増加した発現を示した一方、PAR2拮抗薬52で処置されたラットは、M1特異的な遺伝子の著しい減少を示した(図15D、E)。対照的に、M2特異的な遺伝子、Mcr2(C型マンノース受容体2)、Mgl1(マクロファージガラクトース型のC型レクチン1)、Ym1(キチナーゼ3様3)およびArg1(アルギナーゼ1)の発現は、HCHFを与えられたラットにおいて減少したが、52で処置されたラットにおいて回復または上方制御された(図15D、E)。M1およびM2関連遺伝子以外に、脂質およびエネルギー代謝に関与する代謝遺伝子を調べた。肥満は、脂肪酸代謝、細胞ストレスおよび脂肪細胞分化に関与する遺伝子の調節異常とともに発生することが多い。PAR2シグナル伝達も、脂肪酸酸化の調節異常に関与している。後腹膜脂肪組織において、インスリン抵抗性の発生に関与するPparg(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ(peroxisome proliferator−activator receptor−γ))、Ucp2(脱共役タンパク質2)およびAdipoq(アディポネクチン)の遺伝子コード化が、HCHFを与えられたラットにおいて変化された(図15F)。PAR2拮抗薬52による処置により、これらの変化が軽減された(図15F)。総合すると、52は、潜在的に、M2表現型へのマクロファージの分化を阻止し(skewer)、脂肪組織におけるM1マクロファージの集積を防止し、したがって、脂肪組織炎症、脂肪細胞および代謝機能を改善する(図15〜17)。
肝臓、骨格筋および膵臓における脂肪酸酸化が、CS、HCHFおよびHCHF+PAR2拮抗薬52による処置の後、ラットにおいて観察された。図17A〜Cは、CS(A)、HCHF(B)およびHCHF+PAR2拮抗薬52(C)で処置されたラットにおける肝細胞超微細構造および脂肪沈着の代表的画像(20倍の倍率)を示す。図17Dは、コーンスターチ(CS)、高炭水化物高脂肪(HCHF)およびPAR2拮抗薬とともにHCHFで処置した群(HCHF+52)のラットの骨格筋における代謝遺伝子を示す。図17Eは、異なる群のラット肝臓における代謝遺伝子を示す。図17Fは、膵臓における代謝遺伝子の発現を示す。mRNAの発現を、18s rRNAに対して正規化し、倍率変化を、CS試料と比べて計算した。エラーバーは、平均±SEMであり;P<0.05、**P<0.01、***P<0.001である。
CS、HCHF、HCHF+化合物52で処置されたラットにおける拡張期スティフネス定数(diastolic stiffness constant)測定(図18A)およびCS、HCHF(処置前の8週間の時点)、HCHFおよびHCHF+化合物52で処置されたラットの心臓の構造の心エコー特性評価(図18B)を含む、食餌性肥満ラットにおけるPAR2拮抗薬52による心血管の構造および機能の調節も測定した(図18)。図18CおよびDは、CS、HCHF(処置前の8週間の時点)、HCHFおよびHCHF+化合物52で処置されたラットの心臓の機能の心エコー特性評価を示す。図18E〜Gは、CS(●)、HCHF(○)およびHCHF+C5aRA(▼)で処置されたラットにおけるノルアドレナリン(E)、ニトロプルシドナトリウム(F)およびアセチルコリン(G)に対する血管オルガンバス反応(vascular organ bath response)を示す。CS(H)、HCHF(I)およびHCHF+PAR2拮抗薬52(J)で処置されたラットの左心室における間質コラーゲン沈着の代表的な画像(40倍の倍率)。図18KおよびLは、左心室の血管周囲(K)および間質(L)領域におけるコラーゲン沈着の面積のグラフ表示である。CSに対するP<0.05;**HCHFに対するP<0.05。
HCHF対CS食餌によるラットにおいて増加した代謝パラメータは、グルコースおよびインスリン負荷の障害(図16B〜C)、増加した血漿脂質および肝臓酵素(図16D〜E)、増加した収縮期血圧血圧(図16A)ならびに心臓の構造および機能の異常(図18)を含んでいた。PAR2拮抗薬52が、(例えば、心臓の左心室における)増加したコラーゲン沈着によって測定される、食餌性心臓線維症の発症に対する強力な阻害効果を有していたことは注目すべきである。PAR2拮抗作用のこの抗線維化効果は、心血管疾患だけでなく、コラーゲン沈着に起因する組織および器官線維症が組織または器官の機能不全を引き起こす多くの他の適応症についても、重要な治療特性であり得る。
パラメータは、上昇したトリグリセリドおよび収縮期血圧を除いて、8〜16週にPAR2拮抗薬52による処置によって緩和された(図16AおよびD)。さらに、CSを与えられたラットと比較してHCHFラットに見られる増加した脂肪症は、52による処置によって予防された(図17A、B、C)。肝臓におけるエネルギー消費および脂肪酸酸化に関与する遺伝子の発現を分析した際、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ(Pparg)、Srebf1(ステロール調節因子結合転写因子1)、Ucp2、Ppargc1a、Cpt(カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ)およびPnpla2(脂肪トリグリセリドリパーゼ)の上方制御が、非処置のHCHFラットに対してPAR2拮抗薬52で処置されたラットにおいて検出された(図17F)。上記で調べたPPAR−γおよび関連する代謝遺伝子は全て、インスリン抵抗性の改善に関与し、マクロファージおよび肝臓脂質代謝、ミトコンドリア発生およびトリグリセリド加水分解を調節することが周知である(Odegaard,J.I.,et al.,Nature 2007,447,1116−20;Chawla,A.,Circ Res 2010,106,1559−69;Memon,R.A. et al.,Endocrinology 2000,141,4021−31;Sookoian,S.et al.,Hepatology 2010,52,1992−2000;Ong,K.T.,et al.,Hepatology 2010)。骨格筋において、Pparg(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ)、Ucp2および3(脱共役タンパク質2/3)およびPdk4(デヒドロゲナーゼキナーゼ4)などの、脂質代謝およびエネルギー消費に関与する遺伝子が、HCHFを与えられたラットにおいて抑制された(図17G)。代謝および転写因子に関与するGlut2(グルコース輸送体2)およびBeta2(塩基性ヘリックスループヘリックス転写因子)のリアルタイム分析は、HCFHを与えられたラットにおいて抑制されるが、PAR2拮抗薬52で処置すると回復される。Iapp(膵島アミロイドポリペプチド)、Atf3(活性化転写因子3)、Fas(CD95)およびId−1(DNA結合1の阻害剤)などの他の遺伝子は、HCHF食餌によって上方制御された(図17F、G)。52による処置により、骨格筋および膵臓の両方におけるこの遺伝子発現の変化が軽減された(図17F、G)。これらの結果は、肝臓、骨格筋および膵臓における脂質処理および脂肪酸酸化遺伝子の発現の変化とともに、HCHFを与えられたラットにおけるPAR2の拮抗作用が代謝を向上させ、処置されたラットの脂肪症および代謝症状(metabolic symptom)の減少と相関することを示唆する。
要約すると、新規なPAR2拮抗薬の経口投与は、肥満および脂肪症の著しい減少ならびにグルコースおよびインスリン不耐性、脂肪組織炎症、脂肪酸代謝の肥満に関連する変化ならびに複数の脂質および心血管の異常の改善とともに、HCHFラットの代謝機能不全の古典的な症状を改善した。これらの効果は、食餌性肥満の際の脂肪組織における脂肪細胞およびマクロファージの両方の上および中におけるPAR2の発現およびシグナル伝達に起因していた。さらに、細胞外信号またはパルミチン酸およびプロテアーゼなどの内因性配位子は、脂肪組織マクロファージまたは他の内在する浸潤免疫細胞をプライミングし、それによって、食餌性肥満およびメタボリック・シンドロームにおけるPAR2の増加した発現および活性化を維持するための内因性の要因として働き得る。
実施例18.PAR2は、グルコース恒常性を調節する。
方法:グルコース促進インスリン分泌。ラット膵臓およびマウスMIN6 β細胞を、15%のウシ胎仔血清、10U/mLのペニシリン、10U/mLのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンおよび60mMの2−メルカプトエタノールが補充されたDMEM(25mMのグルコース)中で培養した。MIN6 β細胞を継代し、非酵素的細胞解離溶液(Sigma−Aldrich)を用いて採取した。グルコース促進インスリン分泌(GSIS)を、次に記載されるように行った。MIN6 β細胞を、96ウェルプレート中で、0.8×106/mLで播種し、48時間培養した。細胞を、グルコースを含まないKrebs緩衝液で2回洗浄した(NaCl 119mM、KCl 4.74mM、CaCl 2.54mM、MgCl 1.19mM、KHPO 1.19mM、NaHCO 25mM、HEPES(pH7.4)10mMおよび0.05%のBSA)。細胞を、2.5mMのグルコースが補充されたKrebs緩衝液とともに、30分間にわたって化合物52で前処理した。インキュベーションの後、細胞を、グルコースを含まないKrebs緩衝液で2回洗浄した。グルコース(2.5mMおよび25mM)および化合物を、特定の濃度で加え、1時間インキュベートした。上清を収集し、インスリン濃度を、ELISA(Abcam)によって測定した。
結果:膵機能不全の病因は、慢性的な栄養過剰および高い脂肪酸に関連しているため、化合物52の生体内およびインビトロでの効果を、ラットの膵臓およびマウスのMIN6 β細胞において評価した。定量的なRT−PCR分析により、代謝および転写に関与する膵臓遺伝子Glut2(グルコース輸送体2)およびBeta2(塩基性ヘリックスループヘリックス転写因子)が、コーンスターチ(CS)を与えられたラットと比べて、炭水化物および脂肪を多く含む食餌(HCFH)を与えられたラットにおいて抑制されたが、化合物52で処置するとHCFHを与えられたラットにおいて正常化されたことが示された。インスリン産生およびストレス反応の媒介に関与する遺伝子、Iapp(膵島アミロイドポリペプチド)、Atf3(活性化転写因子3)、Fas(CD95)およびId−1(DNA結合1の阻害剤)が、HCHFラットにおいて上方制御されたが、化合物52による生体内での処置によって緩和された。HCHF食餌を与えられたラットは、グルコースおよびインスリン不耐性の異常を発生したが、化合物52による処置により、経口グルコース負荷試験においてグルコース負荷が改善され、インスリン負荷試験においてインスリンに対する反応性が改善された。化合物52による処置の後、HCHFを与えられたラットは、非処置のCSを与えられたラットと同等のインスリン感受性を有していた。PAR2作動薬および化合物52を、マウスのMIN6 β細胞におけるグルコース促進インスリン分泌(GSIS)および細胞内カルシウム動員についてインビトロでさらに評価した。2f−LIGRLO−NHの投与により、MIN6におけるグルコース促進インスリン感受性が阻害された一方、化合物52による前処理により、インスリン分泌が正常化された。3種の異なるPAR2作動薬(トリプシン、SLIGRL−NH2、2f−LIGRLO−NH)がそれぞれ、濃度依存的にMIN6 β細胞における細胞内カルシウム放出を活性化した。これらのデータは、PAR2活性化、インスリン調節およびグルコース恒常性の間の密接な関連を裏付けている。
実施例19.ヒトおよびラットの肥満が、PAR2発現を増加させる。
一対の大網および皮下脂肪生検(n=11)を、Mater Medical Research Instituteから入手した。試料を、世界保健機関(World Health Organization)によって規定されるボディー・マス・インデックス(BMI)にしたがって、痩身被験体(n=2、BMI=21.4±1.2kg/m)、過体重被験体(n=5、BMI=27.3±1.8kg/m)および肥満被験体(n=4、BMI=32.9±1.5kg/m)に分類した。11人の痩身、過体重および肥満の人の小規模なコホートについて、ヒトの脂肪組織におけるPAR2 mRNA発現が、体重とともに増加することが分かった。被験体のボディー・マス・インデックス(BMI)は、被験体の大網および皮下脂肪組織におけるPAR2発現と正に相関しており、これは、PAR2発現が、ヒトの肥満の新規なバイオマーカーである可能性があることを示唆する。肥満とPAR2 mRNA発現との間のこの関係が、高炭水化物高脂肪の食餌を18週間与えられたWistarラットにおいて裏付けられ、このWistarラットは、低脂肪のコーンスターチの食餌を与えられたラットと比べて、脂肪組織におけるPAR2 mRNA発現の15倍の増加およびPAR2タンパク質発現の2倍の増加を示した。この増加したPAR2発現の4分の3は、肥満に関連した慢性炎症の発症に関与する広範囲の浸潤したマクロファージおよび他の免疫細胞を含む、ラットの脂肪組織の非脂肪細胞間質血管分画に関連していた。
実施例20.実験の関節炎におけるPAR2拮抗作用。
ヒトプロテアーゼ活性化受容体2拮抗薬が、マクロファージ活性化、肥満細胞脱顆粒およびコラーゲン誘発性関節炎を緩和する。
PAR2拮抗薬52を、ヒトマクロファージにおけるPAR2誘発性の細胞内Ca2+放出の拮抗作用、λ−カラギーナン(1%)またはβ−トリプターゼ(20μg)によって誘発される急性のラット足浮腫の阻害、およびラットのコラーゲン誘発性関節炎における疾患修飾性抗炎症活性について調べた。組織を、コラーゲン損失、マクロファージ浸潤、肥満細胞脱顆粒、および血漿薬物動態について分析し、それらを測定した。
PAR2拮抗薬52は、ヒトマクロファージにおいて報告される化合物(ENMD−1068)より1000倍強力なPAR2拮抗薬であった。PAR2拮抗薬52は、足底内の(intraplantar)λ−カラギーナンまたはβ−トリプターゼによって誘発される足浮腫を軽減したが、インビトロでのトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害しなかった。PAR2拮抗薬52は、ラットに経口投与可能であり(F=55%、10mg/kg/日/経口投与(p.o.))、コラーゲン誘発性ラット関節炎を緩和し;疾病に関連する病理学的および組織病理学的変化(足浮腫、マクロファージ浸潤、肥満細胞脱顆粒、パンヌス形成、滑膜の過形成、コラーゲン分解)を改善した。
材料および方法
動物。雄および雌のWistarラット(8〜9週齢、250±50g)を繁殖させ、クイーンズランド大学(University of Queensland)(Australia)のAustralian Institute for Bioengineering and Nanotechnologyで飼育した。動物を、食物および水が提供された飼育設備の規格にしたがって12時間の明暗周期に維持する。全ての実験は、クイーンズランド大学(University of Queensland)の動物倫理委員会によって承認された。
薬剤および化学薬品。ウシのII型コラーゲン(鼻軟骨に由来する)、フロイント不完全アジュバントおよびヘパリンは、Sigma(Aust.)によって供給されるものであった。ヒト組み換え肺β−トリプターゼを、Promegaから購入した。2フロイル−LIGRLO−NH、PAR2拮抗薬52およびENMD−1068を、文献にしたがって合成した。PAR2拮抗薬52を、オリーブ油に溶解させ、特に記載しない限り、強制経口投与(10mg/kg/経口投与(p.o.)、ポリプロピレン栄養管、18G×75mm、Instech Solomon(Aust))によって投与した。
マクロファージの分化、培養およびカルシウム動員アッセイ。末梢血単核細胞を、Ficoll−paque密度遠心分離(GE Healthcare Bio−Science,Uppsala,Sweden)を用いて、軟膜から単離した(Australian Red Cross,Kelvin Grove,QLD)。CD14単球を、CD14 MACS電磁ビーズ(Miltenyi Biotech,Auburn,CA,USA)を用いて陽性に選択した(positively select)。単球を、M−CSF(PeptroTech Inc,Rocky Hill,NJ,USA)を用いて完全培地中でHMDMへと分化させた。播種の5日後、HMDMに、CSF−1を含有する50%の新鮮な完全培地を補充し、7日目に使用するための再度平板培養した。
トリプターゼ活性アッセイ。β−トリプターゼ(10ng/μL、100μL)±PAR2拮抗薬52(20μM)を15分間インキュベートし、それに、基質トシル−Gly−Pro−Arg−pNA(250μM)を加えた。吸光度を、1時間にわたって41秒ごとに405nmにおける光学密度として測定した(FLUOstar Optima,BMG labtech,Aust.)。
薬物動態。雄のWistarラットに、頸静脈カテーテルを外科的に埋め込んだ。(ヘパリン化された)血液試料を、麻酔されていない無拘束ラットのカテーテルから、PAR2拮抗薬52(10mg/kgで経口投与(p.o.))を投与する5分前ならびに投与の30分後、1〜6時間後、8時間後および24時間後に採取した。カテーテルを埋め込まれていないラットに、PAR2拮抗薬52(10mg/kg/日を経口投与(p.o.))を4日間連続で与えた(n=6)。5日目に、血漿、脳脊髄液(CSF)、足組織および腹腔内の脂肪を、LCMS分析のために採取した。
PAR2誘発性足浮腫。既述の方法(Kelso EB et al.,J Pharmacol Exp Ther 2006,316(3):1017−24;Suen JY et al.,Br J Pharmacol 2011,doi:10.1111/j.1476−5381.2011.01610.x.)に基づいて、PAR2拮抗薬52(10mg/kgを皮下投与(s.c.);n=4)、ENMD−1068(100mg/kgを皮下投与(s.c.);n=4)または媒体対照(DMSOを皮下投与(s.c.);n=2)を、雄のWistarラットに投与した。基準値の足の厚さおよび幅を、デジタルキャリパー(World Precision Instruments,USA)を用いて測定し、面積(mm;厚さ×幅)で表した。15分後、2フロイル−LIGLRO−NH(100μLの生理食塩水中350μg/足)を、右後足の肉球に注射した(足底内、足蹠皮下投与(i.pl.))。生理食塩水のみを受ける左後足が対照としての役割を果たした。別の実験において、媒体(500μLのオリーブ油)対PAR2拮抗薬52(500μLのオリーブ油中10mg/kgを経口投与(p.o.))のみを、2つの群のラット(群当たり4匹)に経口投与した。2時間後、β−トリプターゼ(ヒト組み換え肺、100μLの生理食塩水中20μg)を、各群の全ての動物の右後足の肉球に注射した(対照のために左後足には媒体を注射した)。全ての実験において、足の膨張を測定し、面積(mm;厚さ×幅)で表し、各個体の足の基準値からの変化の%としてプロットした。
λ−カラギーナン誘発性足浮腫。方法は、文献(Kelso EB et al.,J Pharmacol Exp Ther 2006,316(3):1017−24;Kawabata A et al.,Peptides 2001,23(6):1181−3)に基づくものであった。雄のWistarラット(群当たりn=4)に、10mg/kgのPAR2拮抗薬52(オリーブ油に溶解させた状態での強制経口投与(p.o.)、500μL)を与えた。対照の動物は、オリーブ油のみを受けた。30分後、λ−カラギーナンを、右後足の肉球に投与した(生理食塩水中1% w/v、100μL、足蹠皮下投与(i.pl)、左足の肉球には生理食塩水対照)。足の厚さおよび幅を、1〜6時間、8時間および24時間(上記のように)の時点で測定し、膨張を面積(mm)で表し、各個体の足の基準値からの変化の%としてプロットした。
コラーゲン誘発性関節炎。プロトコルは、既述のプロトコルに基づくものであった(Lin HS et al.,Br J Pharmacol 2007,150(7):862−72;Nishikawa M et al.,Arthritis Rheum 2003,48(9):2670−81)。雌のWistarラット(200〜250g、n=14)を、0日目に、ウシ鼻コラーゲン(200μg、50:50の0.05Mの酢酸およびフロイント不完全アジュバント、尾の付け根に皮下投与(s.c.))で免疫付与した。シャム手術動物(sham animal)は、媒体のみ(コラーゲンなし;50:50の0.05Mの酢酸およびフロイント不完全アジュバント、尾の付け根に皮下投与(s.c.))を受けた。同じ用量の追加免疫を、7日目に与えた。PAR−2拮抗薬52(オリーブ油中10mg/kg、500μL、経口投与(p.o.)、体重により調整)またはオリーブ油媒体(関節炎の対照およびシャム手術動物)の毎日の経口投与を7日目に開始した。足の厚さおよび幅(上記のような)、体重、疾患活動性スコアおよび機械的侵害受容閾値を、10〜28日目に1日おきに測定した。
疾患活動性指数(DAI)および機械的痛覚過敏を評価し、0〜4+で質的に採点した。DAIは、移動度の変化、炎症および不快感/疼痛を含む、複数の特徴的な疾患病状に基づくものである(最大合計スコアは18)。足底の機械的侵害受容閾値を、Semmes Weinstein Von Frey Anaesthesiometers(Touch Test Sensory Evaluators,Stoelting,IL,USA)を用いて測定した。
組織病理および関節の評価。28日目に、全てのラットを安楽死させ、後足を、4%のパラホルムアルデヒド中に固定し、脱灰し、パラフィンろうに埋め込み、10μmで切断した。切片を、一般的な組織構造についてはH&Eで、コラーゲン損失についてはマッソントリクローム(Masson’s Trichrome)でまたは肥満細胞についてはアルシアンブルー/サフラニン−Oで染色した ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Lam</Author><Year>2010</Year><RecNum>106</RecNum><record><rec-number>106</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="22rsxpsvof9tvge5dp0xss2oaz5z29trsfpx">106</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Lam, D. K.</author><author>Schmidt, B. L.</author></authors></contributors><auth-address>Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University of California - San Francisco, San Francisco, CA 94143-0440, USA.</auth-address><titles><title>Serine proteases and protease-activated receptor 2-dependent allodynia: a novel cancer pain pathway</title><secondary-title>Pain</secondary-title></titles><periodical><full-title>Pain</full-title></periodical><pages>263-72</pages><volume>149</volume><number>2</number><edition>2010
/03/02</edition><dates><year>2010</year><pub-dates><date>May</date></pub-dates></dates><isbn>1872-6623 (Electronic)&#xD;0304-3959 (Linking)</isbn><accession-num>20189717</accession-num><urls><related-urls><url>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&amp;db=PubMed&amp;dopt=Citation&amp;list_uids=20189717</url></related-urls></urls><custom2>2861734</custom2><electronic-resource-num>S0304-3959(10)00085-0 [pii]&#xD;10.1016/j.pain.2010.02.010</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>(42)。組織マクロファージを、標準的なIHC技術を用いて、ED1モノクローナル抗体(未成熟ラットマクロファージ/単球については、Serotec)を用いて標識した。ImageJ 1.42qソフトウェアを用いて、足当たり複数(>6)の画像から顕微鏡分析および細胞計数を行った。
データ分析。全ての実験結果を、平均±SEMとして表した。GraphPad Prism(v5.0a、San Diego,CA)を用いてデータを分析した。3つ以上の群を含むデータセットについては二元配置反復測定ANOVA。個々の時点については、一元配置ANOVAを使用し、群を、ボンフェローニの事後検定(Bonferroni post−test)を用いて比較した。スチューデントのt検定を、2つのデータセットのデータ比較に使用した。有意性は、p<0.05に設定された。
PAR2拮抗薬52は、経口投与可能である。強制経口投与によるPAR2拮抗薬52(10mg/kg)を与えられたラットに由来する血液を、Tmax 4.0±0.6時間、Cmax 1.7±0.4μMおよびT1/2 1.13±0.13時間で、薬剤の血漿濃度(C)について分析した。24時間後、PAR2拮抗薬52は血漿中に存在しなかった。この化合物は、静脈内(i.v.)投与するのに十分に水溶性でないが、経口バイオアベイラビリティ(F 約55%、n=3)を、所与の用量(10mg/kgを経口投与(p.o.))で、C曲線(AUC 0〜6時間)下の面積から決定することができた。
予め4日間にわたってPAR2拮抗薬52(10mg/kg/日を経口投与(p.o.))を受けた動物から死後に採取された血漿および脂肪組織は、第4の投与の24時間後の時点で比較的高いPAR2拮抗薬52Cを有していた(0.5±0.1μM、n=6、24時間の時点で単回投与Cより約30%多い)。腹腔内脂肪も、比較的高い濃度のPAR2拮抗薬52を有していた(0.15±0.02μM、n=6、24時間の時点でCの約30%)。PAR2拮抗薬52は、脳脊髄液から検出されず(LCMS/MS検出限界<1.8nM、n=3)、これは、PAR2拮抗薬52が、血液髄液関門を有効に越えなかったことを示唆し、これは、このような大きい疎水性薬剤には意外ではない(CLogP 5.8)。
PAR2拮抗薬52は、PAR2作動薬誘発性浮腫を減少させる。PAR2拮抗薬52を、研究者によって広く使用されるPAR2ペプチド作動薬、2フロイル−LIGLRO−NH(350μg/足)によって誘発される足浮腫および炎症のラットモデルにおいて生体内で評価して、インビトロおよび生体内でのPAR2機能を調べた(2)。
要約すると、図19は、PAR2拮抗薬52が、ラットの実験の足浮腫を緩和することを示す。(A)PAR2拮抗薬52(DMSO中10mg/kgを皮下投与(s.c.)、n=3)は、2フロイル−LIGRLO−NH(350μg/足、1時間の時点で最大の膨張が示された)によって誘発される足浮腫を軽減し、ENMD−1068(100mg/kgを皮下投与(s.c.)、n=3)は軽減しなかった。(B)経口投与されたPAR2拮抗薬52(オリーブ油中10mg/kgを経口投与(p.o.))は、β−トリプターゼ(20μg/足)によって誘発される浮腫を予防した。(C)β−トリプターゼ誘発性浮腫は、滑膜外(extrasynovium)における肥満細胞脱顆粒に関連し、これは、PAR2拮抗薬52による前処理(10mg/kg、n=4/群)によって改善された。(D)PAR2拮抗薬52(20μM)は、発色性基質トシル−Gly−Pro−Arg−pNA(405nmにおける光学密度としての吸光度、n=4〜5)におけるβ−トリプターゼ(1ng/mL)の酵素活性を阻害しなかった。(E)1%のλ−カラギーナンの足底内投与が、持続的な浮腫を誘発し、これは、PAR2拮抗薬52(10mg/kgを経口投与(p.o)、n=4/群、p<0.05)によって50%まで減少された。データを平均±SEMとして表した。
PAR2拮抗薬52(10mg/kgを皮下投与(s.c.))は、足浮腫を強く軽減することが分かった一方、比較例の化合物ENMD−1068は、ラットのPAR2誘発性の急性炎症のこのモデルにおいて100mg/kgの皮下投与(s.c.)で効果を有さなかった(図19A)。PAR2拮抗薬52は、他のPAR2作動薬、例えばトリプシン、SLIGRL−NH2およびGB110によって誘発される足浮腫を抑制することが最近分かった。
経口で与えた場合、PAR2拮抗薬52(10mg/kg)は、内因性PAR2作動薬β−トリプターゼ(20μg/100μL/足)の足底内注射によって2時間後に誘発されるラットの足浮腫を強く抑制した(図19B)。このタイミングにより、より高い血中濃度の拮抗薬(Cmax 4時間)が、最大の足浮腫がトリプターゼによって誘発されたとき(トリプターゼの投与の30分後)に存在することが可能になる。滑膜外における脱顆粒肥満細胞の数が、アルシアンブルー/サフラニン−O染色によって組織学的に検出した際に、β−トリプターゼで処置されたラットにおいて著しく増加したが、PAR2拮抗薬52の前処理によって抑制された(p<0.05、図19C)。この領域における肥満細胞の総数は、β−トリプターゼに応答して変化しなかった。LCMS/MSを用いて、PAR2拮抗薬52も、投与(0.035μM)の3時間後に足組織ホモジネートにおいて検出され、これは、化合物が、効果が測定される標的組織に到達したことを示す。ヒトβ−トリプターゼ(1ng/mL)のインビトロでの活性が、PAR2拮抗薬52(20μM)によって阻害されなかった(図19D)ことから、この抗炎症活性は、β−トリプターゼ酵素の直接の阻害によるものではなかった。これは、ラットの生体内でのトリプターゼの炎症誘発作用が、PAR2を介して媒介され、PAR2拮抗薬によって生体内で阻止され得るという考えを裏付けている。PAR2拮抗作用が、PAR2の内因性タンパク質分解作動薬によって促進される肥満細胞脱顆粒を生体内で防止することも結論付けられ得る。
PAR2拮抗薬52は、カラギーナン誘発性足浮腫を軽減する。1%のλ−カラギーナンの足底内投与は、対照ラットにおいて長期にわたる著しい足浮腫を誘発した(n=4、図19E)。カラギーナンの30分前のPAR2拮抗薬52(10mg/kgを経口投与(p.o.)、n=4)による予防的治療により、6時間の時点で最も顕著であった膨張が著しく軽減された(約50%)。膨張は、この急性炎症モデルにおいて完全に改善されなかったが、これは、浮腫誘発(Tmax 4時間)の時点でCmaxに達していない実験の時間経過に関連し得る。したがって、PAR2拮抗薬52は、2フロイル−LIGLRO−NHおよびトリプターゼによって誘発されるPAR2特異的炎症、ならびにカラギーナンによって誘発される非特異的炎症を阻害した。
PAR2拮抗薬52は、コラーゲン誘発性関節炎を改善する。経口投与されたPAR2拮抗薬52が、ラットの炎症性疾患、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)の慢性モデルにおいても抗炎症性であったかどうかを判定するために、試験を行った。
要約すると、図20は、予防的PAR2拮抗薬52が、コラーゲン誘発性関節炎の病態生理を改善することを示す。PAR2拮抗薬52(10mg/kg/日を経口投与(p.o.))は、(A)後足膨張の著しい減少、(B)関節炎の兆候のある動物の著しい減少および(C)非処置のCIA−対照と比較したDAIの減少(p<0.05、二元配置ANOVA、(B)ではカイ二乗)を引き起こした。(D)PAR2拮抗薬52は、CIAに関連する機械的痛覚過敏も予防した(p<0.05、ANOVA)。シャム手術動物(黒塗りの丸);n=3、CIA−対照(黒塗りの四角)n=6、PAR2拮抗薬52(白抜きの三角);n=5。データを平均±SEMとして表した。
コラーゲン接種は、特に、後肢における進行性の足膨張を誘発する(図20A)。20日目まで、CIA−対照群の全てのラットが、少なくとも片方の足に関節炎の兆候があり(図20B)、66±16%の膨張を有していた(n=6)。膨張は、CIA−対照動物において、28日目に基準値を90±16%超えるまで増大し続けた(図20A)。対照的に、PAR2拮抗薬52による処置(10mg/kg/日を経口投与(p.o.)、n=5)は、60%の動物が、28日目までに発症したことを示し、その全てが、25±9%の軽度の(最大)膨張を示したに過ぎなかった(CIA−対照からp<0.05、図20AおよびB)。足膨張の増大は、観察されたDAIと相関していた。典型的に、ラットは、17日目に炎症兆候(膨張および発赤)の出現を示した。CIA−対照動物は、徐々に悪化するDAIを示し、28日目までに9.5±2.4まで増加した(図20C)。PAR2拮抗薬52で処置された動物は、関節炎様の兆候の発生をかなり防がれ、28日目に軽度のDAIスコアを示したに過ぎなかった(最大DAI 1.6±0.9(p<0.05)、図20C)。シャム手術動物は、関節炎疾患の兆候を示さなかった。足膨張に関連する機械的侵害受容閾値は、28日目にシャム手術動物と比較してCIA−対照において約30%低かったが(p<0.05)、この影響は、PAR2拮抗薬52による処置によって取り除かれた(CIA−対照からp<0.05、図20D)。
PAR2拮抗薬52は、関節炎発症の際の組織病理学的変化を防止する。
図21に示されるように、PAR2拮抗薬52の予防的投与は、関節炎発症の際の組織病理学的変化を改善する。(A)H&E染色した足関節切片(脛骨距骨関節)の代表的な顕微鏡写真は、CIA−対照と比較した、PAR2拮抗薬52で処置された動物の減少した関節炎の組織病理を示す。滑膜外の炎症細胞浸潤(白抜きの矢印)、滑膜の過形成(白抜きの矢尻)、軟骨/骨侵食(黒塗りの矢印)ならびにパンヌスおよび米粒体の形成(黒塗りの矢尻)が全て減少される(スケールバー200μm)。(B)全ての4つのパラメータ(滑膜の過形成、浮腫、骨/軟骨侵食、パンヌス形成)についてのCIA−対照およびPAR2拮抗薬52で処置された動物の組織病理学的採点により、PAR2拮抗薬52で処置されたラットにおいて著しく減少された組織病理が定量化される。シャム手術動物は、組織病理を示さなかった(p<0.05、スチューデントのt検定、対照n=6、PAR2拮抗薬52 n=5)。データを平均±SEMとして表した。
H&Eで染色された脛骨距骨関節の組織学的検査により、CIA−対照動物が、浮腫、炎症細胞浸潤、滑膜の過形成、滑膜の米粒体、パンヌス形成、軟骨損傷および骨侵食などの、関節炎疾患に関連する重度の主要な組織病理を有していたことが示された(図21AおよびB)。PAR2拮抗薬52の連日投与により、全ての組織病理学的変化がほぼ完全に予防された(CIA−対照からp<0.05、図21B)。マッソントリクロームで染色された組織は、より多い割合のアニリンブルー染色を有するCIA−対照と比較して、PAR2拮抗薬52で処置されたラットにおいて著しく減少したコラーゲン損失を示した(図22AおよびD)。これは、H&Eで染色された切片において観察される軟骨/骨侵食の結果とよく一致していた。免疫組織化学により、ED1陽性マクロファージの数が、CIA−対照動物において、特に、滑膜、パンヌスおよび関節面の内層内で、著しく増加されたことが示された(図22C、p<0.05)。H&Eの観察結果によれば、PAR2拮抗薬52は、CIA−対照におけるED1−マクロファージの関節炎様の上方制御を予防し、シャム手術動物の細胞数との差を示さなかった(図22CおよびF)。全ての組織学的に染色された組織において、シャム手術動物には、関節炎の兆候がなかった。
PAR2拮抗薬52は、関節炎様の肥満細胞脱顆粒を防止する。
図22に示されるように、PAR2拮抗薬52は、病変関節における関節炎様のコラーゲン損失、肥満細胞脱顆粒およびマクロファージ集積を防止する。(A)マッソントリクロームで染色された足関節切片(脛骨距骨関節)。黒塗りの矢尻は、コラーゲンおよび骨分解の部位(赤色の染色、スケールバー200μm)を示す。(B)ラット足切片における示差的なアルシアンブルー/サフラニン−Oで染色された肥満細胞(不活性(赤色)、活性(赤色/青色の混合)、脱顆粒(青色)。スケールバー20μm)。(C)ED−1(DAB、褐色)で染色されたラット足切片は、シャム手術動物およびPAR2拮抗薬52で処置された動物の両方と比較した、CIA−対照における浸潤マクロファージ(矢印)の著しい増加を示す(スケールバー200μm)。(D)定量化されたコラーゲン損失は、PAR2拮抗薬52がコラーゲン侵食を防止することを示す(p<0.05)。(E)シャム手術動物およびPAR2拮抗薬52で処置された動物の両方と比較した、CIA−対照における著しく活性が高い脱顆粒肥満細胞の割合を示す染色された肥満細胞の定量分析(p<0.05、ANOVA)。(F)ED−1で染色されたマクロファージは、シャム手術動物よりCIAにおいてより多い数の浸潤マクロファージを示し、これは、PAR2拮抗薬52による処置(10mg/kg/日の経口投与(p.o.))によって正常化された。(G)足膨張%および活性/脱顆粒肥満細胞%の回帰分析は、強い相関を示す(Pearson r=0.85、p<0.05)。全てのデータについて、シャム手術動物n=3、CIA−対照 n=4、PAR2拮抗薬52 n=4。データを平均±SEMとして表した。
示差的なアルシアンブルー/サフラニン−O染色(図22B)は、肥満細胞活性化および脱顆粒が、CIA−対照において33%多かったことを示した。全肥満細胞の3分の2が、活性であるかまたは脱顆粒されていた。PAR2拮抗薬52で処置された動物は、シャム手術動物と比較して肥満細胞活性化状態の差を示さず、全ての肥満細胞の約80%が不活性であり、5%未満が脱顆粒されていた(図22E)。全肥満細胞数の差は全ての処置群間で測定されなかった(76.7±6.7個の細胞/mm、n=13)。回帰分析は、足膨張と活性肥満細胞との間(活性であるかまたは脱顆粒されているとみなされる細胞を含む;Pearson r=0.85、p<0.05、図22G)、および活性肥満細胞のパーセントと滑膜のマクロファージ数との間(Pearson r=0.89、p<0.005)の強い正の相関を示し、これは、CIAモデルにおける活性な肥満細胞、マクロファージおよび足膨張の間の機能的関連を裏付けている。肥満細胞と異なり、マクロファージ数と足膨張との間の弱い相関があり(Pearson r=0.63、p=0.025)、これは、マクロファージが、観察される膨張自体にそれほど寄与せず、骨および軟骨侵食に寄与し得ることを示唆する(図22Cを参照)。
実施例21.結腸細胞、大腸炎および炎症性腸疾患の調節。
クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)は、共通の病理を有する慢性炎症性腸疾患(IBD)の一般的な形態である。UCは、結腸および直腸を侵し、CDは、結腸および回腸の複数の領域を侵し、それぞれの病態は、特徴的な模様の粘膜の潰瘍を有する。IBDは、狭窄に関連する腸穿孔、結腸直腸癌、および多臓器機能不全の後に敗血症を発症するリスクを高める。
結腸細胞の調節。ヒト結腸直腸腺癌(HT29)細胞を、カルシウム結合色素(Fura3)緩衝液を用いて、37℃で1時間インキュベートした。細胞を、様々な濃度の化合物52または既に報告された化合物N1−3−メチルブチリル−N4−6−アミノヘキサノイル−ピペラジン(ENMD−1068)で15分間処理した後、2フロイル−LIGRLO−NH(1M)を加えた。細胞内カルシウム動員を、対応する拮抗薬濃度に対してプロットされた蛍光の差によって測定し、拮抗薬の効力の測定を可能にした。化合物52が、ヒトHT29結腸細胞における細胞内カルシウム放出を阻害することが分かった。化合物52は、既に報告された化合物ENMD−1068より、結腸細胞におけるPAR2活性化のより強力な拮抗薬であった(IC50が5mMに対して8M)。
PAR2誘発性急性結腸炎症。Wistarラットを、一晩絶食させ、化合物52(10mg/kgを経口投与(p.o.))または媒体(オリーブ油)のいずれかの単回の経口投与を受けさせた2時間後に、イソフルランで麻酔した。ポリエチレンカテーテル(1.7mmの外径)を、肛門を介して結腸内に8cm挿入し、それを通して、SLIGRL−NH(1mg/ラット)または生理食塩水媒体(500l)を投与した。ラットを10分間麻酔したまま、40°の角度に保って、肛門からの漏れを防いだ。食物および水を与えてラットを回復させた。全てのラットを、誘発の10時間後に殺処分し、疾患活動性指数(DAI)および顕微鏡的疾患(macroscopic disease)(以下の疾患活動性指数を参照)について適切に採点した。結腸組織を、湿潤/乾燥比およびMPOアッセイのために採取した。化合物52は、このPAR2作動薬で誘発される急性結腸炎症における抗炎症活性を示した。PAR2作動薬SLIGRL−NHによってラットにおいて誘発された急性結腸炎症は、化合物52(10mg/kg)の経口投与によって阻害され、浮腫、ムチン減少、PAR2受容体内在化、および肥満細胞症が著しく減少された。
TNBS誘発性慢性大腸炎モデル。0日目に、ラットを秤量し、スルファサラジン(オリーブ油中100mg/kgを経口投与(p.o.))、化合物52(オリーブ油中10mg/kg)、または媒体(500lのオリーブ油を経口投与(p.o.))のいずれかのそれぞれの処置を与え、水を自由に与えながら24時間絶食させた。翌日(1日目)、ラットを秤量し、それぞれの化合物を投与し、イソフルランで麻酔した。ポリエチレンカテーテルを直腸内に挿入した(8cm)。対照および薬剤で処置された動物に、TNBS(生理食塩水および250lの、水中50%のエタノール中80mg/kg)の結腸内投与を受けさせた(Fiorucci et al.,2001)。シャム手術動物には、TNBSを等体積の水に代えて、媒体のみを投与した。ラットを、傾斜位(40°)に30分間保ち、次に、食物および水を与えて回復させた。ラットに、それぞれの化合物を毎日投与し、秤量し、全体的な健康および疾患進行について採点した。より早期に死亡しない限り、実験の8日目に全てのラットを殺処分した。疾患進行および死後の結腸組織病理を、以下の方法によって採点した。PAR2およびトリプターゼの共局在(co−localization)を、免疫組織化学を用いて調べた。
疾患活動性指数(DAI)。急性および慢性モデルの両方についてのDAIが、処置内容を知らされていない専門家によって、評価され、採点された。スコアには、移動度、胃腸病変、不快感、および全身性疾病行動の基準が組み込まれていた(それぞれ0〜3で採点された)。いずれかの基準において段階3に達したいずれの動物も、CO吸入によって安楽死させ、疾病に関連する死亡として報告した。スコアを合計し、合計疾患スコア(最大12)として表した。DAIを、急性試験では終点のみ(10時間)で、および慢性TNBS試験では毎日測定した。
顕微鏡的疾患指数。結腸を、死後解剖し、一部の多少の修正を加えた(最大スコアが14)、既述の顕微鏡的疾患スコア(Bobin−Dubigeon et al.,2001)に基づいて顕微鏡的疾患スコアを与えた。結腸長さ全体を、回結腸および結腸直腸接合部の間で取り出した。長さおよび最大膨張幅を測定した。病変のある結腸の切片を、生化学分析、組織学、および湿潤/乾燥重量のために採取した。
組織学および免疫組織化学。標準的なプロトコルを用いて、組織試料を、パラフィンろうに埋め込み、ミクロトームで切断し(5m)、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)またはアルシアンブルー、pH1.0、およびサフラニン−Oのいずれかで染色した。免疫組織化学のために、組織を、標準的な10mMのクエン酸塩抗原賦活化(citrate antigen retrieval)および4時間の(一次)インキュベーションプロトコルを用いて、PAR2に対する抗体(N19 1:100、Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)および/または肥満細胞トリプターゼ(AA1;1:100;Abcam Inc.,Cambridge,MA)で標識した。標準的なImageJアルゴリズム(National Institutes of Health,Bethesda,MD)を用いて、全ての蛍光画像に、バックグラウンド除去および輝度向上を行って、染色パターンを明確にした。
腸壁の厚さ。腸壁の厚さを、処置内容を知らされていない調査員によって測定した。ImageJソフトウェア(1.42q)を用いて、H&Eで染色された顕微鏡写真(20個のレンズ)から測定を行った。画像画素をミクロン(0.143画素/m)まで調整し、外側の環状筋から内側の陰窩基底部までの距離を測定した。
ミエロペルオキシダーゼおよびELISA。固定されていない結腸切片を、4℃/0.5%の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム/リン酸緩衝生理食塩水緩衝液(100mg/mL w/v、pH6.0)中で均質にし、4℃で10分間にわたって13,000rpmで遠心分離した。上清(100l)を(二通り)96ウェルプレートに移し、それにジアニシジン(20l、1%のH/リン酸緩衝生理食塩水中2.85mg/ml)を加え、吸引によって混合した。プレートを、室温(暗所中)で15分間インキュベートさせ、次に、蛍光光度計(FLUOstar Optima;BMG Labtech GmbH,Offenburg,Germany)に移した。吸光度を450nmで読み取った。データを絶対光学密度単位として表した。製造業者の使用説明書にしたがって、組織ホモジネートにおけるサイトカイン発現(腫瘍壊死因子およびインターロイキン−6)を、ELISA(BD Biosciences,San Jose,CA)を用いて測定した。
データ分析。実験結果を平均S.E.Mとして表した。データを、Prismソフトウェア(v5.0a;Graph−Pad Software,San Diego,CA)によって分析した。統計比較を、3つ以上の群を含む時間データセットについて二元配置反復測定ANOVAを用いて行った。個々の時点については、データを、一元配置ANOVAを用いて分析し、群を、ボンフェローニの事前比較(Bonferroni planned comparison)を用いて比較した。有意性は、p 0.05に設定された。
結果。ラットの慢性大腸炎は、化合物52(10mg/kg/日を経口投与(p.o.))によって改善され、死亡率および病変(結腸閉塞、潰瘍、壁の厚さ、およびミエロペルオキシダーゼ放出を含む)が、臨床的に使用される薬剤であるスルファサラジン(100mg/kg/日で経口投与(p.o.))より効果的に減少された。化合物52とスルファサラジンによる処置は両方とも、2日目以降、TNBS−対照と比較してDAIの著しい改善を示した(図23AおよびB;シャム手術動物からp<0.05;**p<0.01;***p<0.001;n=10;ANOVA二元配置反復測定による事前比較)。化合物52で処置されたラットは、DAIからのほぼ完全な回復を示した。化合物52による処置はまた、TNBSによる死亡を防ぐのに、スルファサラジンよりはるかに有効であった(図23C、33.3%の死亡率に対して8.3%の死亡率、p<0.05)。急性および慢性の実験の大腸炎の両方におけるPAR2拮抗薬のこれらの疾患修飾性は、PAR2およびPAR2活性化プロテアーゼについての病因的役割ならびに結腸の炎症性疾患におけるPAR2拮抗作用についての治療可能性を強く裏付けている。
文献、作業、材料、デバイス、物品などの説明は、あくまでも本発明の内容を提供するために本明細書に含まれる。これらの事項のいずれかまたは全てが従来技術の基礎の一部を成し、優先日以前に存在していたために本発明に関連する分野に共通の一般的な知識であったことは示唆も提示もされていない。
本明細書における、任意の従来の刊行物(またはそれから得られる情報)への言及、または公知の任意の事項は、該当する従来の刊行物(またはそれから得られる情報)または公知の事項が、本明細書が関する技術分野に共通の一般的な知識の一部を成すという認識または承認または何らかの形態の示唆として解釈されず、また、解釈されるべきではない。
本明細書および後続の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」という用語、ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などの活用形は、記載される整数または工程あるいは整数または工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数または工程あるいは整数または工程の群の除外を意味するものと理解されない。

Claims (5)

  1. 有効量の式(Ia):
    (式中、
    11が、アルキル、アミノ、またはフェニルから選択される1つ以上の基で任意に置換される、NおよびOから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5員または6員の不飽和複素環であり、ここで、前記フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに任意に置換されてもよく;
    組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族C〜C環式基と縮合されたピペリジンを形成し;ここで、前記縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよく;または前記縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基が、さらなるC〜C10環式基またはC〜C10複素環式基と縮合される)によって表されるPAR2拮抗薬;および
    その塩を含む、メタボリック・シンドローム、肥満、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防するための薬剤。
  2. 式(Ia)の前記化合物が、式(Ib):
    (式中、
    組み合わされたRおよびRが、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族C〜C環式基と縮合されたピペリジンを形成し;ここで、前記縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルオキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルキルオキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよい);および
    その塩によって表される、請求項1に記載の薬剤。
  3. 式(Ia)の前記化合物が、式(Id):
    (式中、
    組み合わされたRおよびRまたはRおよびRが、縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基を形成し;ここで、前記縮合された芳香族または脂肪族C〜C環式基が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される1〜3つの置換基でさらに置換されてもよい);および
    その塩によって表される、請求項1または2に記載の薬剤。
  4. Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
    5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
    5−(3−アミノ−イソオキサゾリル)−Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
    5−イソオキサゾリル−Cha−Thr(Me)−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
    5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[インデン−1,4’−ピペリジン];
    5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[インダン−1,4’−ピペリジン];または
    5−イソオキサゾリル−Cha−Ile−スピロ[オクタヒドロ−1H−インデン−1,4’−ピペリジン]
    からなる群から選択される、有効量のPAR2拮抗薬を含む、メタボリック・シンドローム、肥満、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防するための薬剤。
  5. メタボリック・シンドローム、肥満、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項1に記載の式(Ia)によって表されるPAR2拮抗薬の使用。
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AU2011284801B2 (en) * 2010-07-28 2016-01-28 The University Of Queensland Modulators of protease activated receptors
TW201602109A (zh) 2013-09-25 2016-01-16 維泰克斯製藥公司 作為par-2訊息傳遞路徑之抑制劑之咪唑并嗒
WO2016138132A1 (en) * 2015-02-25 2016-09-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dipeptidyl peptidase-iv(dpp4) inhibitors, methods and compositions for suppressing adipose tissue inflammation
US20220193048A1 (en) 2019-04-05 2022-06-23 Universite De Bretagne Occidentale Protease-activated receptor-2 inhibitors for the treatment of sensory neuropathy induced by a marine neurotoxic poisoning

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5578593A (en) 1992-12-11 1996-11-26 Merck & Co., Inc. Spiro piperidines and homologs promote release of growth hormone
CN1192746A (zh) * 1995-07-07 1998-09-09 财团法人相模中央化学研究所 肽衍生物和血管紧张素iv受体激动剂
US8804518B2 (en) * 2010-02-26 2014-08-12 Qualcomm Incorporated Quality of service (QoS) acquisition and provisioning within a wireless communications system
AU2011284801B2 (en) * 2010-07-28 2016-01-28 The University Of Queensland Modulators of protease activated receptors
WO2012033518A1 (en) 2010-09-09 2012-03-15 The Scripps Research Institute Methods and compositions for treating metabolic disorders

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