JP6363358B2

JP6363358B2 - 胞子または芽胞を用いた非水系物質変換方法およびバイオリアクター

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Publication number: JP6363358B2
Application number: JP2014038375A
Authority: JP
Inventors: 忍小田
Original assignee: Kanazawa Institute of Technology (KIT)
Current assignee: Kanazawa Institute of Technology (KIT)
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2018-07-25
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: JP2015159788A

Description

本発明は、胞子または芽胞を用いて物質変換（微生物変換）を行う技術に関する。具体的には、糸状菌もしくは放線菌の胞子、または細菌の芽胞のような、熱や圧力、薬剤や有機溶媒等のストレスに対して強い耐性を示す微生物細胞の含水性固定化物を、有機溶媒中で微生物変換反応に利用できる新規なバイオプロセスに関する。

糸状菌や放線菌、または細菌を生体触媒として用いる物質生産技術である微生物変換法は、それら微生物が有する酵素の高い基質特異性、酵素反応における位置選択性、および立体選択性に基づいて、種々の医薬品原料等の高付加価値化学品の合成に利用されてきた。微生物菌体やそれに含まれる酵素を用いた物質変換では、常温常圧下で正確に反応を進行させることが可能であるため、有機合成法では製造が困難な光学活性医薬品原料などの調製に極めて有効である。

上記の微生物変換法は、微生物細胞内に存在する数多くの酵素のうちの特定の酵素の触媒作用を利用する技術である。精製した酵素もしくは粗酵素を利用する酵素変換法と比較して、生体触媒コストが低いこと、酸化還元反応のような補酵素要求性反応やりン酸化反応のようなエネルギー要求性反応を触媒できることが、実用上の大きなメリットになる。しかしながら、微生物は通常は水中でのみ代謝活動が可能であるため、補酵素の再生やＡＴＰの生産と共役した微生物変換では、微生物が位置する反応溶媒は水に限られてきた。

その一方で、医薬品原料などの合成精密化学品の多くは水に対して難溶性である。また、医薬品原料を合成するために用いられる基質も水に難溶性である場合が多い。微生物変換法を用いる場合には、水に難溶な基質の変換は、微生物菌体中への基質の取り込み上非常に不利となる。また、水と基質の液／液ないしは液／固界面において強い微生物毒性（界面毒性）が発現して微生物が死滅してしまうことも致命的であった。

この微生物変換用基質が水難溶性である問題を克服するために、これまでに数多くの微生物変換システムが提案されてきた。例えば、基質の水溶性を引き上げるために界面活性剤を添加する方法（非特許文献１）、メタノールやジメチルスルホキサイド等の水混和性有機溶媒を添加する方法（非特許文献２）、またはヘキサデカンなどの水非混和性有機溶媒を添加する水−有機溶媒二相系反応法（非特許文献３）などが提案されてきた。

しかしながら、これら諸法においては、添加する界面活性剤（非特許文献４）や有機溶媒（非特許文献５）によって微生物がダメージを受けることや、多くの水難溶性基質もまた微生物に対して強い微生物毒性を発現することが知られている（非特許文献６）。これらの理由により、微生物変換法では、有用物質の実用的な生産に至った例は少ないのが現状であった。

これらの現状に鑑みて、本発明者らは、水難溶性基質の反応溶媒への溶解性の向上と、反応溶媒並びに水難溶性基質の微生物毒性を同時に回避可能な微生物変換システムを提案してきた。つまり、親水性ゲルと疎水性有機溶媒との固／液界面で微生物変換を行う固−液界面バイオリアクター（特許文献１）、並びに、中空微粒子を用いて液体培地と疎水性有機溶媒との液−液界面に増殖させた糸状菌を使う液−液界面バイオリアクター（特許文献２）である。これらの方法では、加水分解やエステル化反応はもちろん、位置・立体選択的水酸化（非特許文献３２）や不斉還元（非特許文献３３）、または、代謝と微生物的アセチル転移反応を組み合わせたカップリングシステム（非特許文献３４）などへの適用で、優れたパフォーマンスを実現してきた。

また、これらのバイオリアクターでは、微生物に対して実質的に毒性を発現しない有機溶媒、例えば、ｎ−デカンやジ−ｎ−ヘキシルエーテルなどの非極性有機溶媒に基質を溶解させて界面に存在する微生物に作用させる。そのため、基質は分子レベルで菌体中に取り込まれて反応に供される。その結果、反応速度は著しく向上する。また、有機溶媒に溶解させて基質を微生物菌体に作用させるため、有機溶媒が毒性基質並びに毒性産物のリザーバーとして機能する。その結果、それらの微生物毒性を著しく回避することが可能となる。固−液界面バイオリアクターはこれまでに、酸化、還元、加水分解、エステル合成、アセチル転移、微生物分解等の多くの反応で使用されてきた（非特許文献７）。また、液−液界面バイオリアクターも、加水分解、還元、水酸化、エポキシ化等の反応で、様々な有用物質の高濃度生産に適用されてきた（非特許文献８）。

また、有機溶媒耐性を有した微生物の探索（非特許文献１８）または育種改良（非特許文献１９）は、有機溶媒耐性酵素の創製（非特許文献２０）を主要な目的として、現在でも活発な検討が広く行われている。これまでに見出された最強の有機溶媒耐性菌は、ＩｎｏｕｅとＨｏｒｉｋｏｓｈｉが報告したシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）ＩＨ−２０００である。シュードモナス・プチダは、水層中濃度で５０％（ｖ／ｖ）もの高濃度のトルエン（ｌｏｇＰ＝２．５）に耐えて増殖することができる（非特許文献２１）。

有機溶媒存在下で微生物菌体を反応に供する例としては、例えば、ペニシリウム・ロクエフォルティー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ）の遊離胞子（非特許文献２５）または固定化胞子を用いて水／イソパラフィンの二相系で脂肪酸からメチルケトンを合成した例（非特許文献２６）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）やリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）の乾燥菌糸を用いたエステル化反応（非特許文献２７）、またはアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ）の固体化菌糸を用いた酢酸エチル／水層の二相系におけるステロイドの水酸化（非特許文献２８）についての報告がある。

一方、有機溶媒単層中での微生物変換の例としては、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）の乾燥菌糸をヘキサン中に添加し、ゲラニオールをエステル化してゲラニルアセタートを合成した例（非特許文献２９）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）の乾燥菌体を用いた２−アルカノールのエステル化による光学分割（非特許文献３０）、またはアスペルギルス・ナイガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）の乾燥菌体を用いた没食子酸のエステル化（非特許文献３１）などの例がある。

小田忍ら、特開平５−９１８７８号公報小田忍・熊谷博行、特開２００８−２９２５１号公報

Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５９，４１５（１９８１）．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ａ．ａｎｄＬｉｌｌｙ，Ｍ．Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５，４９５（１９８７）．Ｈｏｃｋｎｕｌｌ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄＬｉｌｌｙ，Ｍ．Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３，１４８（１９９０）．Ｂａｒ，Ｒ．ａｎｄＧａｉｎｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，３，１０９（１９８７）．Ｏｎｋｅｎ，Ｊ．ａｎｄＢｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６９，１６３（１９９９）．小田忍，バイオインダストリー，１７，３９（２０００）．小田忍，バイオサイエンスとインダストリー，７０，１２４（２０１２）．Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，Ｈ．ａｎｄＭｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｂ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，３６，６４７（１９７３）．Ｓｈｅｕ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄＦｒｅｅｓｅ，Ｅ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１１，５１６（１９７２）．Ｆｒｅｅｓｅ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４１，３２１（１９７３）．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｓ．ａｎｄＷｅｎｄｔ，Ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３，５６０（１９６７）．Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，Ｈ．ａｎｄＭｉｌｅｌｒ，Ｔ．Ｂ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３６，６５９（１９７３）．Ｈｕｎｋｏｖａ，Ｚ．ａｎｄＦｅｎｃｌ，Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２０，１２３５（１９７８）．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，４８，９８（１９７１）．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄＤｅＭｏｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９０，１４２０（１９６５）．Ｔｈｅ，Ｊ．Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８，８４０（１９７４）．Ｂｏｒｓｔ−Ｐａｕｗｅｌｓ，Ｇ．Ｗ．Ｆ．Ｈ．ａｎｄＤｏｂｂｅｌｍａｎｎ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２９０，３４８（１９７２）Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，１８７２（１９９２）．Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１７５４（１９９４）．Ｔａｎｇ，Ｘ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌ．，９９，７３８８（２００８）．Ｉｎｏｕｅ，Ａ．ａｎｄＨｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２６４（１９８９）．Ｒａｎｇｅｌ，Ｄ．Ｅ．Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌ．，９０，５５（２００５）Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，５６，４２（２０１３）Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，４５，９２２（２００８）．Ｃｒｅｕｌｙ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，６６９（１９９２）．Ｐａｒｋ，Ｏ．−Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２６，２３５（２０００）．Ｒｏｍａｎｏ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，４１，７１（２００６）．Ｈｏｕｎｇ，Ｊ．−Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，４８５（１９９４）．Ｃｏｎｖｅｒｔｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，２１６（２００２）．Ｍｏｌｉｎａｒｉ，Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８６，６２（１９９８）．Ｙｕ，Ｘ．−Ｗ．ａｎｄＬｉ，Ｙ．−Ｑ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，４０，４４（２００６）．Ｏｄａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，８２，１０５（２００９）．Ｏｄａ，Ｓ．ａｎｄＩｓｓｈｉｋｉ，Ｋ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，１３６４（２００８）．Ｏｄａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２，２２１６（１９９６）．Ｏｄａ，Ｓ．ａｎｄＯｈｔａ，Ｈ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，１５１５（１９９２）．Ｄｕｔｔａ，Ｔ．Ｋ．ａｎｄＳａｍａｎｔａ，Ｔ．Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３９，３０９（１９９９）．Ｄｅｍｙｔｔｅｎａｅｒｅ，Ｊ．Ｃ．Ｒ．ａｎｄＰｏｏｔｅｒ，Ｈ．Ｌ．，ＦｌａｖｏｕｒＦｒａｇｒ．Ｊ．，１３，１７３（１９９８）．Ｓｉｎｇｈ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，３９３（１９６８）．Ｖｅｚｉｎａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０，２２１（１９６８）．

しかしながら、固−液並びに液−液界面バイオリアクターに使用できる有機溶媒は、通常はｌｏｇＰ値（水／１−オクタノールの二相系における有機溶媒の分配計数の対数値）で５．０以上の疎水性有機溶媒に限られていた。極性が高い（ｌｏｇＰ値が小さい）有機溶媒ほど微生物菌体の構造や機能に対して様々な悪影響を与えることが知られている。例えば、細胞膜の破壊（非特許文献８）、胞子形成の阻害（非特許文献９）、栄養源の取り込みの阻害（非特許文献１０）、細胞膜の物質透過の阻害（非特許文献１１）、酸素の取り込みの阻害（非特許文献１２）、代謝系の阻害（非特許文献１３）、ＤＮＡ合成の阻害（非特許文献１４）、細胞質の収縮（非特許文献１５）、細胞内容物の漏出（非特許文献１６）、呼吸活性の阻害（非特許文献８）、細胞分裂の阻害（非特許文献１７）、または細胞の酸性化（非特許文献１３）といった、微生物の生存に関わる構造や機能の様々な障害が引き起こされることが報告されている。

また、従来の水／有機溶媒二相系反応では、これら従来の微生物変換を用いたとしても、水／油滴界面における界面毒性の発現や生成物の回収率の低下または回収コストの増大の問題を避けることが困難であった。そのため、実用化に至った例は極めて少なかった。また、有機溶媒単層中で胞子や乾燥菌体を用いた例はいずれもリパーゼやタンナーゼなどの加水分解酵素の逆反応（エステル化）に限られており、微生物の代謝または補酵素再生が必須となる酸化還元反応などを実施できた例は皆無であった。酸化還元反応、特にプロキラルなケトンの不斉還元や不活性炭素の水酸化反応等では、反応収率１００％の達成が理論上可能であり、製造コスト低減を十分に可能とする技術である。従って、反応溶媒を有機溶媒単層とし、なおかつ該有機層中で微生物を生きた状態、すなわち代謝活性を維持して補酵素を再生可能な状態で維持させて微生物変換に供することができるシステムの構築が、製薬業界を中心に強く望まれてきた。

また、従来のバイオリアクターで使用可能な有機溶媒は、例えばｎ−デカン（ｌｏｇＰ＝５．９８）やｎ−ドデカン（ｌｏｇＰ＝６．８０）などのノルマルパラフィン類、ジ−ｎ−ヘキシルエーテル（ｌｏｇＰ＝５．１２）のような中鎖エーテル類、またはＫＦ−９６Ｌ−１ＣＳ（ｌｏｇＰ＝６．６０）のような低粘度ジメチルシリコンオイルなど、高度に疎水性の有機溶媒に限られていた。固／液または液／液界面に位置する微生物は、有機層中の有機化合物の毒性を著しく回避することができるが、よりｌｏｇＰ値が低い中極性有機溶媒に対する耐性には改善の余地があった（非特許文献３５）。

また、水層と有機層との界面に位置する微生物は、有機層が毒性有機化合物のリザーバーとして機能すること、含水性の固定化担体（固−液界面バイオリアクター）または含水性の中空微粒子層（液−液界面バイオリアクター）の表面に位置する菌体は、水の薄層で保護されているために、液体培養系と比較して、有機溶媒分子による攻撃は比較的受け難い。しかしながら、極性が高い（すなわち、ｌｏｇＰ値が低い）有機溶媒は、菌体表面の水のバリアを透過して細胞膜を攻撃するため、溶媒耐性が極端に低下するという問題もあった。

さらに、微生物毒性の低い疎水性有機溶媒が溶解させ得る基質は、高度に脂溶性のものに限られる。そのため、微生物毒性の低い疎水性有機溶媒の適用範囲は実際上、非常に限られていた。医薬中間体等の精密化学品の基質は、中程度の極性を持った化合物が多く、水にも疎水性有機溶媒にも難溶であるものが多い。これら中程度の極性をもつ基質を高濃度で溶かし得る中極性有機溶媒を反応溶媒として用いることが可能な、新規な微生物変換システムの構築が強く期待されてきた。

このような有機溶媒耐性微生物に関する世界中の研究動向に対し本発明者は、使用可能な有機溶媒の極性の更なる引き上げ（ｌｏｇＰ値のさらなる引き下げ）と、１００％濃度の有機溶媒の使用を可能ならしめる新規なシステムの構築について、鋭意検討を重ねた。

本発明はこうした状況に鑑みてなされており、その目的とするところは、脂溶性の基質を効率良く物質変換する技術を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の物質変換方法は、培養槽に、胞子または芽胞、胞子または芽胞に栄養を供給するための水溶液、胞子または芽胞および水溶液を保持する担体を含む複合層と、脂溶性の基質を含み担体の一方の面に接触する有機層と、を形成させる第１のステップと、複合層に含まれる胞子または芽胞を生体触媒として、基質を反応させる第２のステップと、を含む。なお、本明細書中で物質変換（微生物変換）とは、胞子または芽胞を生体触媒として、基質を別の物質に変換することをいう。特に、脂溶性の基質を用いて微生物の代謝または補酵素再生が必須となる酸化還元反応を行うことにより、脂溶性の生成物を得ることをいう。

この態様によると、胞子または芽胞を生体触媒として、脂溶性の基質を効率良く物質変換することができる。特に、従来の物質変換方法によっては使用できなかった脂溶性の基質を用いることによって、従来の物質変換方法では生産できなかった様々な有機化合物を効率的に生産することができる。胞子または芽胞は菌体よりも有機溶媒に対する耐性が著しく高いため、胞子または芽胞の生存に影響を与えない基質として、様々な物質を選択することができる。さらに、有機層中に添加できる基質の濃度および有機層中に蓄積される反応生成物の濃度は、従来の液体培養法と比較して飛躍的に向上する。複合層と有機層の界面に位置する胞子または芽胞は、内部で代謝反応が起きているため、酸化還元反応のような補酵素要求性の反応や誘導酵素反応等も問題なく触媒することができる。また、本実施の形態の物質変換方法によると、生成物の回収も有機層からの取り出しのみで済む。そのため、煩雑な溶媒抽出工程を省略することができる。

物質変換方法において、有機層は、ｌｏｇＰ値が１．７〜４．３の有機溶媒を主溶媒としてもよい。この態様によると、中程度の極性をもつ基質を高濃度で溶かし得る中極性有機溶媒を、反応溶媒として用いることが可能となる。

物質変換方法において、胞子または芽胞は、糸状菌もしくは放線菌の胞子、または細菌の芽胞であってもよい。この態様によると、胞子または芽胞の代謝を利用することにより、様々な物質変換を行うことができる。

物質変換方法において、担体は、天然高分子もしくは合成高分子を主成分とする親水性ゲル、セルロース材を主成分とするろ過板もしくはビーズ、または無機材から板状もしくは粒状に形成された含水性を有する成形物であって、少なくとも一方の面に胞子または芽胞を吸着できてもよい。この態様によると、胞子または芽胞が担体に安定的に固定されるため、胞子または芽胞を生体触媒として用いた物質変換の効率をさらに向上させることができる。

物質変換方法において、担体に含まれる水溶液は、胞子または芽胞のエネルギー源として、糖質、脂肪酸またはポリオールの少なくとも１つを含み、窒素源を実質的に含まなくてもよい。この態様によると、胞子または芽胞が出芽することなく代謝が長期間にわたって維持されるため、胞子または芽胞を生体触媒として用いた物質変換を安定化させることができるとともに、物質変換の反応生成物の生成効率をさらに高めることができる。

物質変換方法において、第１のステップは、担体の他方の面に接触する水層を形成させることをさらに含んでもよい。この態様によると、胞子または芽胞へのエネルギー源の供給を安定化させて物質変換を長期間継続することができる。

本発明の別の態様は、バイオリアクターである。このバイオリアクターは、培養槽と、胞子または芽胞、胞子または芽胞に栄養を供給するための水溶液、胞子または芽胞および水溶液を保持する担体を含む複合層と、脂溶性の基質を含む有機溶媒から構成され、担体の少なくとも一方の面に接触する有機層と、を備える。胞子または芽胞の少なくとも一部は、有機溶媒と接することによって、脂溶性の基質を物質変換する。

なお、上述した各要素を適宜組み合わせたものも、本件特許出願によって特許による保護を求める発明の範囲に含まれうる。

本発明によれば、脂溶性の基質を効率良く物質変換することができる。

実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、第１の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。図１（Ｂ）は、第２の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

（概要）
筆者らは、液体培養系と比較して溶媒耐性を発揮できる培養システムとして、固／液界面または液／液界面培養法を土台としつつ、従来技術では使用不可能であった中極性溶媒にも耐性を付与できる、新規な微生物変換システムの構築を図った。その結果、様々なストレスに耐性を示し、かつ生体触媒として機能しうる胞子または芽胞を用いることによって、本課題を解決し得ることを見出した。

通常、胞子は、栄養源の枯渇や高温、または乾燥や毒物の存在といった様々なストレス条件下で形成される菌形態の一種である。長らく胞子は、代謝活動が停止している所謂休眠細胞として、広く認識されてきた。しかしながら一部の研究グループによって、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ）の固定化胞子を用いたプロゲステロンの１１α−水酸化反応（非特許文献３６）、ぺニシリウム・ジギタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｉｇｉｔａｔｕｍ）の胞子を用いたネロールとシトラールの酸化（非特許文献３７）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）によるステロイドのＣ−２０カルボニル基の還元など、胞子が代謝活性を維持しつつ、補酵素を再生し得る例がいくつか報告されている。

このように、胞子は栄養細胞が有する遺伝情報を全て保持していると同時に代謝も行なっているため、休眠細胞ではないと考えることができる。ただし、上記の３例はいずれも水溶液中での微生物変換反応の例であり、胞子や芽胞を有機溶媒中で使用した例は、これまで知られていなかった。

これに対し、本発明者は、熱や塩濃度、紫外線や放射線、または酸、アルカリ、化学薬品に対して強い抵抗性を示す糸状菌や放線菌の胞子並びに細菌の芽胞（非特許文献２２〜２４）を含水性固定化担体の表面に付着固定化した。次に該固定化物を、脂溶性基質を溶解せしめた中極性有機溶媒に投入して胞子または芽胞を固定化物／有機層との界面に配置させた。これにより、胞子または芽胞が生きた状態で有機層中の脂溶性基質を微生物変換できることを見出した。さらに、固定化担体中の水層に水溶性の糖質やポリオール類、または有機層中に脂溶性のアルカン類やエステル類などのエネルギー源を添加させ、なおかつ、窒素源を添加しないことにより、膨潤および出芽することなく胞子の代謝活性・補酵素再生を可能にできることを見出した。

以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において重複する説明は適宜省略する。

（第１の実施の形態）
本実施の形態の物質変換方法は、培養槽１２に、胞子または芽胞１４、胞子または芽胞１４に栄養を供給するための水溶液、胞子または芽胞１４および水溶液を保持する担体３２を含む複合層３０と、脂溶性の基質Ｘを含み担体３２の一方の面に接触する有機層４０と、を形成させる第１のステップと、複合層３０に含まれる胞子または芽胞１４を生体触媒として、基質Ｘを反応させて反応生成物Ｘ’を得る第２のステップと、を含む。

図１（Ａ）は、第１の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

本物質変換方法では、バイオリアクター１０を使用する。バイオリアクター１０は、培養槽１２と、複合層３０と、有機層４０とを含む。

培養槽１２は、耐有機溶媒性を有し、胞子または芽胞１４を培養して物質変換を行うための培養反応器である。水溶液および有機層４０中の有機溶媒がそれぞれバイオリアクター１０の内外で循環できるように、図示しない流入部および流出部を備えていてもよい。

複合層３０は、胞子または芽胞１４と、担体３２と、水溶液とから形成されたマット状（またはシート状、板状）の複合体である。本実施の形態では、複合層３０は胞子または芽胞１４を保持するだけではなく、水層としても機能する。

担体３２としては、有機溶媒に耐性があって、糸状菌や放線菌の胞子ないしは細菌の芽胞を少なくとも表面に吸着固定化できる担体（固定化担体）であれば、任意の担体を使用することができる。エネルギー源を溶解させた水溶液を内部に含む親水性ゲル、ろ過板（（ＮＡ−１００、東洋濾紙製など）もしくはビーズ、または板状もしくは粒状に形成された含水性を有する成形物が好適である。親水性ゲルの材料としては、たとえば寒天やアルギン酸カルシウムなどの天然高分子、ポリピニルアルコールなどの合成高分子が挙げられる。ろ過板もしくはビーズの主成分としては、たとえばセルロース材が挙げられる。含水性を有する成形物の材料としては、たとえば無機材が挙げられる。

担体３２には、少なくとも有機層４０と接する界面に胞子または芽胞１４が存在していればよい。つまり、界面の少なくとも一部に胞子または芽胞１４が存在していればよい。また、胞子または芽胞１４は基材の内部にも存在していてもよい。

本実施の形態に使用される胞子または芽胞１４としては、選択した有機溶媒に接触した状態にて基質Ｘを物質変換できさえすれば特に制約はない。標的とする微生物変換能を備えているか否かが、採択の基準となる。胞子または芽胞１４として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に代表される糸状菌の胞子、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属やマイクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属に代表される放線菌の胞子、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に代表される細菌の芽胞を好適に使用することができる。

胞子または芽胞１４の形成には、既知の培養方法を使用することができる。胞子または芽胞１４に含まれる出芽した菌体は、できるだけ少ないことが好ましい。仮に出芽した菌体が含まれていたとしても、有機層４０から受ける毒性によって、脂溶性の基質Ｘを物質変換できないと考えられるため、特に問題はない。

水溶液は、水と胞子または芽胞１４に供給される栄養源とを含む水溶液である液体培地から形成される。水溶液の組成は、使用する胞子または芽胞１４の種類に応じて選定される。水溶液に添加されるエネルギー源は、グルコースやスクロースなどの糖質、脂肪酸またはポリオールなどの水溶性化合物であってもよい。また、水溶液は、窒素原子の含有量ができるだけ低いこと、特に窒素源を実質的に含まないことが好ましい。胞子または芽胞１４の出芽を防止することによって、胞子または芽胞１４を生体触媒とする物質変換の効率を高めるためである。窒素源としては、たとえばペプトン、酵母エキス等の有機態窒素源、硝酸ナトリウムや硫酸アンモニウム等の無機態窒素源が挙げられる。

有機層４０は、疎水性の有機溶媒を主溶媒とする。疎水性の有機溶媒としては、後述する胞子または芽胞１４が接触した場合に生育が著しく阻害される有機溶媒でなければ使用することができる。疎水性の有機溶媒は、水と相溶せず、かつ胞子または芽胞１４に対して実質的に毒性を示さない疎水性もしくは中極性の有機溶媒であることが好ましい。このような有機溶媒として、ｌｏｇＰ値（水／１−オクタノールの二相系における有機溶媒の分配係数の対数値）が５．０以上の有機溶媒だけではなく、従来技術では使用することができなかった５．０未満の有機溶媒を好適に使用することができる。ｌｏｇＰ値が１．７〜４．３の中極性有機溶媒を用いることが特に好ましい。これにより、有機溶媒中に溶解させる脂溶性の基質の濃度を大幅に高めることができる。

具体的には、ジ−ｎ−ヘキシルエーテル（ｌｏｇＰ＝５．１２）、イソアミルエーテル（ｌｏｇＰ＝４．２５）、２−エチルヘキシルアセテート（ｌｏｇＰ＝４．１３）、ビス（２−ブトキシエチル）エーテル（ｌｏｇＰ＝３．８６）、メチルシクロヘキサン（ｌｏｇＰ＝３．６１）、ジブチルエーテル（ｌｏｇＰ＝３．２１）、エチルベンゼン（ｌｏｇＰ＝３．１５）、１−オクタノール(ｌｏｇＰ=３．００)、スチレン（ｌｏｇＰ＝２．９５）、ｔｅｒｔ−ブチルアセテート（ｌｏｇＰ＝１．７６）などの有機溶媒を好適に使用することができる。なお、有機層４０は、複数の有機溶媒の混合物を主溶媒としてもよい。また、胞子または芽胞１４のエネルギー源として、脂溶性のアルカン類やエステル類などを有機層４０中に添加してもよい。

次に、バイオリアクター１０の製造方法を説明する。本実施の形態では、高圧蒸気滅菌可能な担体３２を用いる場合には、まず担体３２を培養槽１２中にて配置し、培養槽ごと高圧蒸気滅菌する。任意の組成の液体培地と所定量の胞子または芽胞１４とを混合し、滅菌後の培養槽１２に注入して該担体表面に胞子または芽胞１４を吸着固定化させる。この培養槽に有機溶媒を充填することによって有機層４０を形成する。なお、図１（Ａ）に示したバイオリアクター１０が製造できるのであれば、各物質を加える順序や滅菌方法はここで示したものに限られない。

次に、バイオリアクター１０を用いた物質変換について説明する。担体中の胞子または芽胞の働きにより、脂溶性の基質Ｘは、胞子または芽胞１４を生体触媒として、反応生成物Ｘ’に物質変換される。

有機層４０に添加される脂溶性の基質Ｘは、特に限定されない。上述の有機層４０に融解し、胞子または芽胞１４により代謝される任意の物質を基質Ｘとして使用することができる。基質Ｘとして、たとえばステロイド系の医薬品原料、テルペン系の医薬品原料、フラボン系の医薬品原料、抗生物質誘導体、抗がん活性物質誘導体など、具体的にはベンジルやプロゲステロンなどが挙げられる。胞子または芽胞１４と脂溶性の基質Ｘとを適宜組み合わせることにより、様々な反応生成物Ｘ’が得られる。

以上、本実施の形態の物質変換方法によれば、胞子または芽胞１４を生体触媒として、脂溶性の基質Ｘを効率良く物質変換することができる。特に、従来の物質変換方法によっては使用できなかった脂溶性の基質Ｘを用いることによって、従来の物質変換方法では生産できなかった様々な有機化合物を効率的に生産することができる。胞子または芽胞１４は菌体よりも有機溶媒に対する耐性が著しく高いため、胞子または芽胞１４の生存に影響を与えない基質Ｘとして、様々な物質を選択することができる。さらに、有機層４０中に添加できる基質Ｘの濃度および有機層４０中に蓄積される反応生成物Ｘ’の濃度は、従来の液体培養法と比較して飛躍的に向上する。複合層３０と有機層４０の界面に位置する胞子または芽胞１４は、内部で代謝反応が起きているため、酸化還元反応のような補酵素要求性の反応や誘導酵素反応等も問題なく触媒することができる。また、本実施の形態の物質変換方法によると、生成物の回収も有機層４０からの取り出しのみで済む。そのため、煩雑な溶媒抽出工程を省略することができる。

なお、有機層４０と複合層３０とは、いずれが上層であってもよい。たとえば比重が１よりも大きい有機溶媒を用いる場合には、有機層４０を複合層３０よりも下に配置する。

（第２の実施の形態）
図１（Ｂ）は、第２の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

本実施の形態では、第１の実施の形態のバイオリアクター１０において、担体３０の他方の面には水層２０が形成されており、第１の実施の形態よりも薄い担体３０が使用されている点が、第１の実施の形態とは異なる。

本実施の形態の物質変換方法によっても、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。加えて、エネルギー源の供給をより容易かつ継続的に行うことができる。

なお、担体３０の両面と接するように有機層４０を形成させてもよい。この場合には、担体３０の内部に形成された水層２０を循環させることによって、胞子または芽胞に水を供給することが好ましい。また、この場合には、複合層３０に含まれるエネルギー源を安定して供給するために、担体３２を厚く形成することが好ましい。

（用途）
上述した物質変換方法は、医薬品原料の生産などに適用することが想定される。たとえば様々な酸化還元反応に用いることができる。このような反応として、たとえば基質Ｘとしてベンジルを用いて（Ｓ）−ベンゾインを生成する反応、基質Ｘとしてプロゲステロンを用いて１１α−ヒドロキシプロゲステロンを生成する反応が挙げられる。胞子または芽胞１４を適宜選択することにより、これらの生産を容易に効率化することができる。

（実施例１）
アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＮＢＲＣ３２０７４は、芳香族ジケトンであるべンジルの２つのカルボニル基のうちの片方だけを立体選択的に還元して、光学分割剤や医薬品原料として有用な（Ｓ）−ベンゾインを与える。

ポテト・デキストロースアガーを用いて本株の胞子を大量に調製し、遠心分離による水洗を繰り返して培地由来の窒素源を除去した。該胞子をグルコース１０．０ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ５ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２０ｍｇ、ＣａＣｌ_２１０ｍｇ、蒸留水１．０Ｌよりなる窒素源無添加培地で２．０ｘ１０^７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌとなるように胞子懸濁液を調製した。この胞子懸濁液２５ｍｌを、３枚に重ねたろ過板（ＮＡ−１００、東洋濾紙製：直径５ｃｍ、厚さ３ｍｍ）に接種し、一番上のろ過板上面に該胞子を固定化した。その後、ベンジルを１％レベルで溶解させたメチルシクロヘキサン（ｌｏｇＰ＝３．６１）５ｍｌを該固定化物の胞子マット上に重層した。２５℃で加温・静置し、５日目と１０日目に有機層をサンプリングして、高速液体クロマトグラフィーで（Ｓ）−ベンゾインの濃度を定量した。

その結果、５日目で２．７７ｇ／Ｌ、１０日目で６．２６ｇ／Ｌの（Ｓ）−ベンゾインの蓄積が確認された。

（比較例１）
本比較例は、胞子をろ過板に固定化せず、振盪培養した点が実施例１と異なる。具体的には、実施例１で調製した胞子懸濁液２５ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに分注し、直ちに１％ベンジル／メチルシクロヘキサン溶液５ｍｌを添加して、２５℃、２００ｒｐｍで加温・振盪を１０日間継続した（水／メチルシクロヘキサン二相系反応）。振盪開始後５日目と１０日目に有機層を採取して、高速液体クロマトグラフィーで（Ｓ）−ベンゾインの濃度を測定した。

その結果、５日目で０．１６ｇ／Ｌ、１０日目で０．１８ｇ／Ｌの（Ｓ）−ベンゾインしか生産されていなかった。つまり、振盪培養では、メチルシクロヘキサンの強い毒性発現が確認された。

（実施例２）
リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）ＮＢＲＣ５７８１は、プロゲステロンの１１位をα−水酸化して、医薬中間体として有用な１１α−ヒドロキシプロゲステロンを生成する。

本株をポテト・デキストロースアガーで培養することにより、その胞子を大量に採集した。遠心分離にて繰り返し水洗して培地由来の窒素源を除去した後、グルコース１０．０ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ５ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２０ｍｇ、ＣａＣｌ_２１０ｍｇ、蒸留水１．０Ｌよりなる窒素源無添加培地で３．０ｘ１０^９ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌとなるように胞子懸濁液を調製した。該胞子懸濁液５００μｌを、上記の窒素源無添加培地に寒天を１．５％レベルで、添加および溶解させて調製した寒天平板（表面積３８．５ｃｍ^２）の表面に植菌し、余分な水分を除去した後に２％プロゲステロン／エチルベンゼン（ＬｏｇＰ＝３．１５）３ｍｌを重層し、２８℃で１０日間加温・静置した。加温開始５日目と１０日目にサンプリングして、有機層中の１１α−ヒドロキシプロゲステロンの蓄積濃度を高速液体クロマトグラフィーで定量した。

その結果、５日目で２．２１ｇ／Ｌ、１０日目で４．０８ｇ／Ｌの１１α−ヒドロキシプロゲステロンの蓄積が認められた。

（比較例２）
実施例２で調製した胞子懸濁液２５ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに分注し、直ちに２％プロゲステロン／エチルベンゼン溶液５ｍｌを添加して、２８℃、２００ｒｐｍで加温および振置を１０日間継続した（水／エチルベンゼン二相系反応）。振盪開始後５日目と１０日目に有機層を採取して、高速液体クロマトグラフィーで１１α−ヒドロキシプロゲステロンの濃度を測定した。

その結果、５日目で０．０５ｇ／Ｌ、１０日目で０．０８ｇ／Ｌの１１α−ヒドロキシプロゲステロンしか生産されていなかった。つまり、振盪培養では、エチルベンゼンの強い毒性発現が確認された。

（実施例３）
水層と有機層の界面における種々の胞子または芽胞の生育性を確認した。

ＰＤＡ平板中央に各種カビマットの切片（２株；１ｘ１ｍｍ）を植菌し、ただちに有機溶媒を平板上に重層した。具体的には、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＮＢＲＣ６３４１とＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａＡＴＣＣ１４６９２を用いた。有機溶媒としては、ジ−ｎ−ヘキシルエーテル（ｌｏｇＰ＝５．１２）、イソアミルエーテル（ｌｏｇＰ＝４．２５）、２−エチルヘキシルアセテート（ｌｏｇＰ＝４．１３）、ビス（２−ブトキシエチル）エーテル（ｌｏｇＰ＝３．８６）、メチルシクロヘキサン（ｌｏｇＰ＝３．６１）、ｔｅｒｔ−ブチルアセテート（ｌｏｇＰ＝１．７６）を用いた。溶媒の揮発を避けるため容器（５０ｍｌ）は密栓し、２日毎に内部の気相を空気３０ｍｌで置換しつつ、２５℃で静置培養した。

その結果、ジ−ｎ−ヘキシルエーテル（ｌｏｇＰ＝５．１２）、イソアミルエーテル（ｌｏｇＰ＝４．２５）および２−エチルヘキシルアセテート（ｌｏｇＰ＝４．１３）では、いずれの株も良好に増殖した。また、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＮＢＲＣ６３４１は、ビス（２−ブトキシエチル）エーテル（ｌｏｇＰ＝３．８６）およびメチルシクロヘキサン（ｌｏｇＰ＝３．６１）でも良好に増殖した。一方、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａＡＴＣＣ１４６９２は、ｔｅｒｔ−ブチルアセテート（ｌｏｇＰ＝１．７６）において良好に増殖した。以上の結果より、ｌｏｇＰが５未満、特に４．３未満の有機溶媒に晒されても、ゲル−有機溶媒界面では糸状菌胞子が生存可能なことが明らかとなった。また、ｌｏｇＰ＝約１．７という過酷な条件でも胞子が増殖可能であることも明らかとなった。

以上、本発明を上述の実施の形態を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく、実施の形態の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれうる。

１０バイオリアクター、１２培養槽、１４胞子または芽胞、２０水層、３０複合層、３２担体、４０有機層

Claims

培養槽に、胞子または芽胞、前記胞子または芽胞に栄養を供給するための水溶液、前記胞子または芽胞および前記水溶液を保持する担体を含む複合層と、脂溶性の基質を含み前記担体の一方の面に接触する有機層と、を形成させる第１のステップと、
前記複合層に含まれる胞子または芽胞を生体触媒として、前記基質を反応させる第２のステップと、を含み、
前記有機層は、ｌｏｇＰ値が１．７〜３．８６の有機溶媒を主溶媒とし、
前記第２のステップにおける基質の反応が補酵素要求性の反応であり、前記胞子または芽胞は生きた状態で前記反応を行うことを特徴とする物質変換方法。
前記胞子または芽胞は、糸状菌もしくは放線菌の胞子、または細菌の芽胞であることを特徴とする請求項１に記載の物質変換方法。
前記担体は、天然高分子もしくは合成高分子を主成分とする親水性ゲル、セルロース材を主成分とするろ過板もしくはビーズ、または無機材から板状もしくは粒状に形成された含水性を有する成形物であって、少なくとも前記一方の面に前記胞子または芽胞を吸着し得ることを特徴とする請求項１または２に記載の物質変換方法。
前記担体に含まれる水溶液は、前記胞子または芽胞のエネルギー源として、糖質、脂肪酸またはポリオールの少なくとも１つを含み、窒素源を実質的に含まないことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質変換方法。
前記第１のステップは、前記担体の他方の面に接触する水層を形成させることをさらに含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質変換方法。
培養槽と、
胞子または芽胞、前記胞子または芽胞に栄養を供給するための水溶液、前記胞子または芽胞および前記水溶液を保持する担体を含む複合層と、
脂溶性の基質を含む有機溶媒から構成され、前記担体の少なくとも一方の面に接触する有機層と、を備え、
前記胞子または芽胞の少なくとも一部は、前記有機溶媒と接することによって、前記脂溶性の基質を物質変換し、前記脂溶性の基質の物質変換は補酵素要求性の反応であり、前記胞子または芽胞は生きた状態で前記物質変換を行い、
前記有機層は、ｌｏｇＰ値が１．７〜３．８６の有機溶媒を主溶媒とすることを特徴とするバイオリアクター。