JP6361358B2 - 電気泳動装置 - Google Patents

Description

本発明は、キャピラリ電気泳動装置または流路を微細加工したプレート（チップ）上で電気泳動を行なう電気泳動装置に関するものである。

キャピラリ電気泳動装置は、一般に内径が１００μｍ以下の溶融シリカキャピラリ内に分離媒体（泳動バッファ溶液又は篩い分けポリマー溶液を含む泳動バッファ溶液）を充填し、キャピラリの一端に試料を導入した後、キャピラリの両端間に電圧を印加することで試料をキャピラリ内で電気泳動させて分離させるものである。キャピラリにおける分離性能の安定化のため、キャピラリ周辺は温度が一定に保たれる。キャピラリで分離された分析対象成分は蛍光その他の光学的又は電気化学的手法によりキャピラリの他端側で検出される。キャピラリ電気泳動装置には、搭載されるキャピラリが１本のものもあるし、複数本のものもある。

電気泳動に用いるプレートは、例えば電気泳動流路を内部に備えた基板と、電気泳動流路の両端部に配置されて泳動バッファ液を収容し、泳動バッファ液を介して電気泳動流路の端部と電気的に導通する一対のリザーバとを備えたものである（特許文献１参照。）。１つの基板に設けられる電気泳動流路の数が１つのものもあるし、複数のものもある。

キャピラリ又はプレートに形成した流路への試料の導入方法の１つとして電気的注入法（エレクトロカイネティックインジェクション法：ＥＫＩ法）がある（例えば、非特許文献１参照。）。電気的注入法は、分離媒体を充填した電気泳動流路の一端（注入端）を試料に接触させ、電気泳動流路の他端をバッファ溶液に接触させ、試料とバッファ溶液のそれぞれに電極を接触させた状態で両電極間に一定時間電圧を印加することで、所定量の試料を流路内に導入する。

電気泳動流路に試料を導入した後、試料注入端をバッファ溶液に接触させ、電気泳動流路両端のそれぞれのリザーバ内のバッファ溶液に電極を浸して両電極間に電圧を印加することで、試料の電気泳動を行なう。

特開２００８−８９４４０

蛋白質核酸酵素、38(3)、2243（1993） Anal. Chem., 1998, 70, 2248-2253

電気的注入法では、試料成分の移動度の差によって導入される試料成分の量的関係が試料本来の組成と異なるため、原理的に定量が困難である。

内部標準物質に対する任意の成分の相対移動度がわかっていればある程度は有効注入体積を補正することも可能であるが、注入速度、注入時の温度が一定である場合に限られるため限定的な補正とならざるを得ない。さらに、試料のイオン強度が分離バッファ溶液と異なる場合や、インターカレータ色素を含む分離媒体中に試料が注入される場合のように、注入時の移動度が変化する場合は補正がさらに困難になる。

キャピラリの一部を分割し、電気浸透流を擬似ポンプのように利用することにより、試料成分の移動度の差を軽減しようとする試みが種々研究レベルで報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）が、キャピラリの利便性を損ないコストもかかるため実用化された例はない

ある種の電気泳動用のプレートには、分離流路上にクロス流路を配置し、クロス部の試料組成が定常状態になるまで試料導入過程を継続させた後、クロス部の試料成分を全量注入するようになっているものがある。その場合には、試料成分固有の移動度の差による注入量の差異を回避することができる。しかしそのようなクロス部をもたない電気泳動用のプレートもあるし、またキャピラリ電気泳動装置の場合は、クロス流路を形成することは困難である。

本発明は、キャピラリ電気泳動装置やクロス部をもたない電気泳動用のプレートを備えた装置を対象として、電気的注入法により試料を注入する電気泳動方法及び装置において、定量的な分析を可能にすることを目的とするものである。

電気的注入法により注入した試料には試料成分ごとの注入量に差異があるので、本発明では、検出したピーク面積を試料成分ごとの注入速度に基づいて補正する。速度補正したピーク面積は試料成分ごとの注入量を表すので、ピーク面積を補正すれば定量分析が可能になる。

すなわち、本発明の電気泳動方法は、以下のステップを備えて電気泳動分離された試料成分を定量分析する方法である。（Ａ）電気泳動流路にその一端から試料を電気的に注入するステップ、（Ｂ）注入された前記試料を前記電気泳動流路の両端間に電圧を印加して電気泳動させて分離するステップ、（Ｃ）分離された試料成分を前記電気泳動流路の検出位置で検出するステップ、（Ｄ）検出された試料成分のピーク面積を求めるステップ、及び（Ｅ）求められたピーク面積を試料成分ごとの注入速度に基づいて補正するステップ。

そして、前記ステップ（Ｅ）における注入速度に基づく補正は、試料成分の相対移動度に基づく補正（Ｅ１）のほかに、（Ｅ２）試料成分ごとの試料注入時の線速度に基づく補正、及び（Ｅ３）試料注入時の電流積分値に基づく補正、のうちの少なくとも一方を含む。

本発明の電気泳動方法を実現する本発明の電気泳動装置は、電気泳動流路、前記電気泳動流路の一端への試料注入及び前記電気泳動流路での電気泳動のための電圧を前記電気泳動流路の両端間に印加する電源装置、並びに前記電気泳動流路により分離された試料成分を検出する検出器を備えた電気泳動部と、前記検出器からの電気泳動信号を取り込み試料成分ごとの定量分析を行う制御部と、を備えている。

そして、前記制御部は、前記電気泳動信号からピーク面積を求めるピーク面積算出部と、求められたピーク面積を試料成分ごとの注入速度に基づいて補正する補正部と、を備えている。前記補正部は注入速度に基づく補正を試料成分の相対移動度に基づいて行う相対移動度によるピーク面積補正部を備えており、前記補正部はさらに、注入速度に基づく補正を試料成分ごとの試料注入時の線速度に基づいて行う注入時線速度によるピーク面積補正部、及び注入速度に基づく補正を電流積分値に基づいて行う電流積分値によるピーク面積補正部のうちの少なくとも一方を備えている。

本発明よれば、試料を電気的に注入する電気泳動方法及び装置において、求められたピーク面積を試料成分ごとの注入速度に基づいて補正するようにしたので、原理的に困難だった定量が可能になる。しかも、キャピラリを加工したり、クロス流路を追加したりすることなくピーク面積を補正できるので、利便性を損なうことなく、かつ安価に定量することができる。

第１の実施例のキャピラリ電気泳動装置を概略的に示す構成図である。 第２の実施例の電気泳動装置示す図であり、（Ａ）は電気泳動用のプレートを平面図で示し制御装置等をブロック図で示す図、（Ｂ）は電気泳動用のプレートの試料注入端の拡大図である。（Ｃ）は試料注入端側を示す概略斜視図である。 第１の実施例及び第２の実施例における制御部を検出器と高圧電源とともに示すブロック図である。 一実施例のキャピラリ電気泳動方法を示すフローチャートである。 試料成分の移動度と注入体積との関係を示すグラフである。 − キャピラリ注入端からの距離と分離ピーク波形の関係を示す電気泳動波形の図である。 図６のデータに基づくサイズの異なるＤＮＡ試料成分ごとの注入端からの距離と線速度の関係を示すグラフである。 同データに基づくＤＮＡ試料成分サイズと線速度の関係を注入の初期状態（上のグラフ）と定常状態（下のグラフ）で示すグラフである。 試料注入時の電流値の時間変化を示すグラフである。 一実施例における電気泳動波形を示す図である。 同実施例の各試料成分濃度とピーク面積を測定されたままの時間軸基準で示すグラフである。 図１１のグラフのデータの時間軸を移動度軸に変換して移動度軸基準で示すグラフである。 図１２のグラフのデータに移動度による補正を行った後の各試料成分濃度とピーク面積の関係を示すグラフである。 図１３のグラフのデータにさらにインターカレータによる線速度による補正を行った後の各試料成分濃度とピーク面積の関係を示すグラフである。

一実施形態では、電気的注入法における試料成分の注入量の差異を各イオン成分の相対移動度の差により補正し、それに基づいて、求められたピーク面積を補正する。相対移動度の差は、例えばＤＮＡ鎖長により生じる。電荷量は一定でもＤＮＡ鎖長が異なると分子量が異なることにより相対移動度に差が生じる。

例えば、各イオン成分の相対移動度の差は、どの試料成分よりも移動度が大きい（ＤＮＡの場合は鎖長が最も短い）成分と、どの試料成分よりも移動度が小さい（ＤＮＡの場合は鎖長が最も長い）成分からなる２種類の既知濃度の内部標準物質を用い、任意の成分に対する相対移動度を算出する。すなわち、前記ステップ（Ａ）では、どの試料成分よりも移動度が小さい内部標準物質Ａと、どの試料成分よりも移動度が大きい内部標準物質Ｂの２種類を試料とともに前記キャピラリに注入し、前記ステップ（Ｅ）では、前記相対移動度として試料成分ごとの補間係数Ｆ_iを用いる。補間係数Ｆは、内部標準物質Ａの移動度μ_Aが０、内部標準物質Ｂの移動度μ_Bが１となるように規格化した係数である。このように、２種類の内部標準による相対移動度補正を行えば、試料のイオン強度が分離媒体としての分離バッファ液と異なる場合も求められたピーク面積を補正できる。

他の実施形態は、試料注入時の移動度変化を補正する。例えば、キャピラリがインターカレータ色素を含む分離媒体が充填されたものである場合には、試料成分とインターカレータ色素との複合体形成による電荷量変化などにより移動度が変化する。そこで、この実施形態は、注入速度に基づく補正として試料成分ごとの試料注入時の線速度に基づく補正を含む。試料注入時の線速度に基づく補正として、特定の条件下においてあらかじめ求められた線速度換算表を用いることができる。特定の条件とは、インターカレータ色素の種類、濃度、試料注入電圧・時間などである。このように、インターカレータ色素を含む系でも補正することにより、定量精度がさらに向上する。

さらに他の実施形態は、試料注入過程における電流変化による試料注入量を補正する。試料注入過程における電流変化は温度変化等により発生する。そこで、この実施形態は、試料注入時の電流積分値を算出するステップをさらに含み、注入速度に基づく補正として算出された電流積分値に基づく補正を含む。試料注入過程における電流値の変化に対し、注入時の線速度は直線的に変化する（ただし、ｐＨ、誘電率、イオン強度、粘度、ＤＮＡ鎖長、キャピラリ／試料のゼータ電位等で決まる係数は一定とする）。

一実施形態は、分析終了時に得られる各成分のピーク面積に対し、試料成分ごとの注入速度に基づいて補正をするに際し、試料成分ごとの注入量を試料成分の相対移動度に基づいて補正することが基本である。各成分の注入量は、具体的にはピーク面積として得られる。ピーク面積を得る際に、時間軸を検出点における移動速度（＝移動度に比例）に変換することにより補正する。すなわちピーク高さにその時の移動速度（＝[注入端−検出点間距離]／[泳動時間]）で積算し、（ｍＶ・μｍ）単位で表示したものである。さらに試料注入時の移動度変化による補正と、試料注入過程における電流変化による試料注入量の補正のうちのいずれか、又はその両方をさらに含むことが好ましい。分析終了時に得られる各成分のピーク面積又はそれから得られる値（単位は任意）を用いて、好ましくは、内部標準物質の既知濃度値から定量する。

このようにして、電気的な試料注入方法であっても定量性を大幅に改善することができる。好ましくは、クロス流路を用いるマイクロチップ電気泳動と同等の定量性に近づけることができる。

図１は第１の実施例のキャピラリ電気泳動装置を概略的に表わす。溶融石英キャピラリ２は泳動時には実線で示されるようにキャピラリ２の両端が泳動バッファ液４，６にそれぞれ浸され、高圧電源８から両泳動バッファ液４，６を介してキャピラリ２の両端間に泳動電圧が印加される。高圧電源８はキャピラリ２を流れる電流を検知する電流計を備えている。

泳動に先立ちキャピラリ２の一端に試料を注入するために、オートサンプラー１０が設けられている。オートサンプラー１０は複数の試料容器１２をサンプルプレートに保持し、分析しようとする試料を収容した試料容器１２を試料注入位置に移動させる。試料注入時には、キャピラリ２の一端が破線で示されるように試料容器１２の試料に浸され、その試料１２には電極も浸されて、試料１２と泳動バッファ液６の間に試料注入用の電圧が印加される。このようにして、キャピラリ２の一端に試料が注入される。

キャピラリ２の他端側の検出位置には検出器１４が配置されている。検出器１４は例えばＵＶ検出器（紫外可視吸光光度計）である。

キャピラリ２は恒温槽１６に収容されて一定温度に保たれる。

オートサンプラー１０の動作、高圧電源８による試料注入電圧の印加、高圧電源８による泳動電圧の印加などの制御を行うとともに、検出器１４の泳動信号を取り込んでデータ処理し、電気泳動により分離された試料成分の同定と定量の動作を行うために制御部２０が設けられている。制御部２０にはこのキャピラリ電気泳動装置のための専用コンピュータ２２が接続されている。

図２（Ａ）、（Ｂ）に第２の実施例の電気泳動装置で使用されるプレートの一例を示す。ガラス基板２６内に複数の電気泳動流路２４が互いに交差しないように配列され、ガラス基板２６の表面には電気泳動流路２４のカソード側の端部にリザーバ２８が取りつけられ、アノード側の端部にリザーバ３が取りつけられている。電気泳動流路２４は、例えば幅が９０μｍ、深さが４０μｍで、ガラス基板２６の長手方向に延び、アノード側からカソード側に向かって広がる放射状の領域に互いに交差しないように複数本、例えば３８４本が配列されている。

各リザーバ２８，３は、上部が開口した容器を構成しており、泳動バッファ液を収容し、底部において泳動バッファ液を介して電気泳動流路２４の端部と電気的に導通するようになっている。カソード側のリザーバ２８はその底部に電気泳動流路２４の一端につながる複数個、この例では３８４個の開口２４ａが配置されており、それらの開口２４ａが試料分注位置となっている。リザーバ２８は全ての開口２４ａが配置されている領域を囲む１つの容器となっている。アノード側のリザーバ３もその底部で電気泳動流路２４の他端とつながっている。

ガラス基板２６の材質としては、石英ガラスやホウ珪酸系ガラスを用いることができ、また、ガラス基板２６に替えて樹脂などの他の材質のものを用いることもできる。ここでは泳動分離された成分を光学的に検出するので透明材質のガラス基板２６を選択するが、光学的検出器以外の検出手段を使用する場合は、ガラス基板２６の材質は透明なものに限定されるものではない。

ガラス基板２６は２枚のガラス板を張り合わせたものとすることができる。電気泳動流路２４は一方のガラス板の接合面にリソグラフィーとエッチング（ウエットエッチング又はドライエッチング）により形成することができる。また開口２４ａなどは他方のガラス板又は同じガラス板で電気泳動流路２４の両端の位置にサンドブラストやレーザドリルなどの方法により貫通穴として形成することができる。

泳動に先立ち電気泳動流路２４の一端に試料を注入するために、ピペッタ機構により試料が試料分注用開口２４ａへ注入される。その後、試料分注用開口２４ａに注入されている試料にそれぞれの電極の先端が浸され、アノードリザーバ３の泳動バッファ液に浸された電極との間に所定の電圧が印加され、試料が泳動流路２４内に導入される。

その後、試料分注用開口２４ａ内に残留している試料がアスピレータなどの吸引機構により吸引して除去された後、カソードリザーバ３内に泳動バッファ液が供給される。電気泳動分離では、電気泳動流路２４の両端が泳動バッファ液内の電極を介して電源装置８に電気的に接続され電気泳動が開始される。

電気泳動流路２４のカソードリザーバ３側の検出位置にレーザー励起蛍光検出器などの検出器１４ａが配置されている。

図１の実施例と同様に、試料分注用開口２４ａへの試料注入動作、高圧電源８による試料注入電圧の印加、高圧電源８による泳動電圧の印加などの制御を行うとともに、検出器１４ａの泳動信号を取り込んでデータ処理し、電気泳動により分離された試料成分の同定と定量の動作を行うために制御部２０ａが設けられている。制御部２０ａにはこの電気泳動プレート電気泳動装置のための専用コンピュータ２２ａ接続されている。

制御部２０と２０ａ、及びコンピュータ２２と２２ａは、一実施形態における補正のためのデータ処理に関しては同じ機能を果たすので、以下ではまとめて説明する。

制御部２０、２０ａは、図３に示されるように、ピーク面積算出部３０と補正部３２を備えている。ピーク面積算出部３０は検出器１４、１４ａが検出した電気泳動信号からピーク面積を求めるように構成されている。ピーク面積はその試料成分の注入量に対応する。補正部３２はピーク面積算出部３０が算出したピーク面積を試料成分ごとの注入速度に基づいて補正するように構成されている。

補正部３２は相対移動度によるピーク面積補正部３６を備えており、相対移動度によるピーク面積補正部３６はピーク面積算出部３０が算出した各試料成分のピーク面積を、各試料成分の相対移動度に基づいて補正する。

電気泳動流路２，２４がインターカレータ色素を含む分離媒体が充填されたものである場合にも適用できるように、補正部３２は注入時線速度によるピーク面積補正部４０を備えていることが好ましい。注入時線速度によるピーク面積補正部４０は、試料成分ごとの試料注入時の線速度に基づいてピーク面積を補正する。

注入時線速度によるピーク面積補正部４０を備えている場合は、制御部２０は線速度換算表を保持した線速度換算表保持部３８をさらに備えていることが好ましい。その場合、注入時線速度によるピーク面積補正部４０は線速度換算表保持部４２に保持されている線速度換算表を用いてピーク面積を補正する。

試料注入時の電流値が変化する場合にも適用できるように、制御部２０、２０ａが電流積分値算出部４２を備え、補正部３２が電流積分値によるピーク面積補正部４４を備えていることが好ましい。電流積分値算出部４２は高圧電源８から試料注入時の電流値を取り込み、その電流積分値を求める。電流積分値によるピーク面積補正部４４は、電流積分値算出部４２により求められた電流積分値に基づいてピーク面積を補正する。

補正部３２は、相対移動度によるピーク面積補正部３６は必須の要素として備えている。注入時線速度によるピーク面積補正部４０と電流積分値によるピーク面積補正部４４は、それらの一方又は両方を備えている。その結果、補正されたピーク面積出力値として、相対移動度によるピーク面積補正部３６による補正に加えて注入時線速度によるピーク面積補正部４０による補正と電流積分値によるピーク面積補正部４４による補正のいずれか一方又は両方が施されたピーク面積出力値を得ることができる。そのことが図３中の出力に至る実線、破線及び一点鎖線で示されている。二点鎖線で示されている経路は、比較例であり、注入時線速度によるピーク面積補正部４０と電流積分値によるピーク面積補正部４４を備えていない場合を示しており、補正されたピーク面積出力値として相対移動度によるピーク面積補正部３６による補正のみが施されたピーク面積出力値が得られる。

図４は一実施例の電気泳動方法を示すフローチャートである。ここでは電気泳動流路がキャピラリ２の場合について説明するが、電気泳動流路がプレートの電気泳動流路２４の場合も補正に関する動作は同じである。キャピラリ２又は電気泳動流路２４への試料注入動作と分離のための電気泳動動作に違いはあるが、その違いはすでに上で説明した。

まず、分析パラメータ（試料注入電圧、注入時間、泳動電圧）を設定する。試料に２種類の内部標準物質Ａ，Ｂを混合する。内部標準物質Ａはどの試料成分よりも移動度が小さい内部標準物質、内部標準物質Ｂはどの試料成分よりも移動度が大きい内部標準物質である。

キャピラリ２の注入端を試料容器１２の試料に浸し、キャピラリ２の他端をバッファ溶液６に浸し、キャピラリ２の両端間に電圧を印加して試料をキャピラリ２に電気的に注入する。試料容器１２に収容される試料の量は、注入時間の間にキャピラリ２に注入される量よりも多くなるように設定する。

試料注入後、キャピラリ２注入端を試料から出して、バッファ溶液４に浸し、キャピラリ２の両端間に電圧を印加して試料をキャピラリ２により電気泳動させて分離する。

分離された試料成分を検出器１４により検出し、試料成分ごとのピーク面積を求める。

内部標準物質Ａ，Ｂのピーク検出時間と各試料成分のピーク検出時間とから、各試料成分の移動度補間係数Ｆｉを算出する。移動度補間係数Ｆｉについては後で図５を参照して説明する。

注入時に試料成分注入の線速度が一定の場合、すなわち分離媒体にインターカレータ色素が混入されていない場合は、移動度補間係数Ｆｉを相対移動度として各試料成分のピーク面積、すなわち注入量を補正する。補正の方法も後述する。

注入時に試料成分注入の線速度が一定でない場合、すなわち分離媒体にインターカレータ色素が混入されている場合は、予め用意した線速度換算表を参照して試料成分ごとの試料注入時の線速度を求める。

次に、注入時の電流値が一定の場合、例えば試料注入時間で電流値の変化が５％以下に場合は、相対移動度によるピーク面積の補正に加えて、さらに注入時線速度によるピーク面積、すなわち注入量の補正を行う。

また、注入時の電流値が一定でない場合は、高圧電源８の電流計による電流値を注入時間にわたって積分する。この場合は、相対移動度によるピーク面積の補正に加えて、又は相対移動度によるピーク面積の補正及び注入時線速度によるピーク面積の補正に加えて、電流積分値によるピーク面積の補正を行う。

次に補正方法を詳細に説明する。

（１）２種類の内部標準物質を用いる補正

一般に、キャピラリへの電気的な試料注入方法において、試料中の各イオン成分の有効注入体積（Ｖ_i）は、
Ｖ_i＝ｔ_injν_i（πｒ²）
で示すことができる。ここで、
ｔ_inj：注入時間、
ν_i：各イオンがキャピラリ端から注入されるときの線速度、
ｒ：キャピラリ半径
である。

キャピラリ両端間に水頭差（圧力差）により生じる水力学的移動速度成分がなく、キャピラリ内壁−溶液間のゼータ電位が無視小で電気浸透流により発生する速度成分がないものとして、
ν_i＝μ_iＥ_inj
（Ｅ_injは注入時の電場強度、μ_iは各イオン成分の移動度）であるので、注入体積Ｖ_iは
Ｖ_i＝ｔ_injＥ_inj（πｒ²）・μ_i
となり、μ_iに比例する。それを図示すると図５のようになり、その傾き（比例定数）はπｒ²ｔ_injＥ_injである。

内部標準物質として、どの試料成分よりも移動度が小さい内部標準物質Ａ（注入体積Ｖ_A）と、どの試料成分よりも移動度が大きい内部標準物質Ｂ（注入体積Ｖ_B）の２種類を試料に添加すると、図５に示されるように、任意の成分ｉに対する相対移動度を補間係数Ｆとして求めることができる。補間係数Ｆは内部標準物質Ａの移動度μ_Aが０、内部標準物質Ｂの移動度μ_Bが１となるように規格化したものである。任意の成分ｉに対する補間係数Ｆ_iは以下の式（１）、（２）により得られる。
Ｖ_i＝Ｆ_iＶ_B＋（１−Ｆ_i）Ｖ_A （１）
Ｆ_i＝（Ｖ_i−Ｖ_A）／（Ｖ_B−Ｖ_A）
＝（ν_i−ν_A）／（ν_B−ν_A）
＝（μ_i−μ_A）／（μ_B−μ_A） （２）

イオンがキャピラリの試料注入端から注入されるときの線速度νのままで検出部まで移動するものと近似する。キャピラリの試料注入端から検出部までの分離長さをＬ、検出部でのピーク検出時間をｔとすると、線速度νは、ν＝Ｌ／ｔとなる。移動度μは
μ＝ν／Ｅ_inj＝Ｌ／Ｅ_injｔ
として求めることができる。後述の実施例では、注入時の電場強度Ｅ_injを２００Ｖ／ｃｍ、試料注入端から検出部までの分離長さを８．５ｃｍとして、移動度μ（μ_i，μ_A，μ_B）を実験的に得られたピーク検出時間ｔから［ｃｍ²／Ｖ秒］単位で求めた。このようにして求めた移動度μ（μ_i，μ_A，μ_B）を（２）式に当てはめて任意の成分ｉに対する補間係数Ｆ_iを算出することができる。

任意の成分ｉのピーク面積の補正は次の手順で行うことが好ましい。
１）横軸が時間軸の泳動パターンについてピーク面積を求める。
２）泳動パターンの横軸を時間軸から移動度軸に変換した上でピーク面積を求める。
（ピーク面積）＝Σ_nｈ_n×Δμ_n
＝Σ_nｈ_n×（μ_n+1−μ_n）
となる。ここで、ｈ_nはピーク高さ、μ_nは移動度である。
３）移動度軸について求めた任意の成分のピーク面積を、補間係数Ｆ_iを用いて補正する。内部標準物質Ｂのピーク面積と濃度をそれぞれＡ_BおよびＣ_Bとすると、任意の成分の補正前濃度Ｃ_iは、Ｃ_i＝（Ａ_i／Ａ_B）×Ｃ_Bであり、補正後の濃度Ｃ_iｃは、
Ｃ_iｃ＝Ｆ_i×Ｃ_iである。

（２）インターカレータ色素を含む系における補正

ＤＮＡフラグメント分析において、インターカレータ色素を含む分離バッファ液を分離媒体としてキャピラリ中にあらかじめ充填した後、キャピラリ注入端から試料を電気的注入法で注入するキャピラリ電気泳動分析方法がある。この方法では試料は予め蛍光色素で標識化しておく必要がなく、キャピラリ注入端から注入された試料ＤＮＡがインターカレータ色素と複合体を形成することにより検出部で蛍光検出できるようになる。

インターカレータ色素を用いるこの電気泳動分析方法では、試料ＤＮＡとインターカレータ色素が複合体を形成する過程で電荷が変化するため、試料成分の注入速度は一定ではない。

例えば、キャピラリ中の任意の位置で複合体の蛍光を検出できる装置を用い、注入端からの距離と泳動波形を測定する。図６Ａ−６Ｅは注入端からの距離がそれぞれ１ｍｍ，２ｍｍ，５ｍｍ，１０ｍｍ，２３ｍｍの位置での泳動波形を示したものである。それらの測定結果に基づき、注入端からの距離と移動速度の関係を示したものが図７である。

ただし、図６、図７の測定結果を得た測定では、ＥＫＩ自体による移動度変化の影響を排除するために、実施例とは異なり、クロス流路を用いた全量注入方式を採用した。試料はφＸ１７４ ＤＮＡのＨａｅIII消化物（プロメガ株式会社の製品）である。分離媒体は、分離バッファ液（ＤＮＡ−１０００：株式会社島津製作所の製品）にインターカレータ色素としてＧｅｌｓｔａｒ（登録商標）を２０,０００倍希釈で含有したものである。

図７から明らかなように、注入端からの距離に応じてキャピラリ中を泳動する速度が徐々に低下している。これは、負電荷をもつＤＮＡが正電荷をもつインターカレータ色素と複合体を作りながら泳動することにより正味の電荷が変化するためである。注入端近傍では、試料成分による注入量の差異は軽微であると思われるが、注入時間とともにＤＮＡ−色素複合体の電荷に応じて移動度が変化し、それに伴い導入量が変化する。

そこで、一実施形態として、所定の条件下において注入時間に応じたＤＮＡサイズ毎の線速度換算表を用意し、サイズ既知の成分に対する注入量を補正する。

線速度換算表を作成する上で特定すべき条件は、分離媒体の組成、インターカレータ色素の種類及び濃度、注入パラメータ等である。図８は、図７に示した同じ実験データからＤＮＡフラグメントサイズに対する線速度の関係を示したものである。インターカレータによる試料注入時の「ブレーキ効果」は短鎖ＤＮＡほど大きいことがわかる。

図８における（初期状態）／（定常状態）の比が「線速度換算係数」である。ここで得られた線速度換算表換算表の例を表１として示す。

線速度換算係数は試料成分ごとの注入量に乗じて注入量補正値とする。その注入量は移動度による補正を施した後の注入量であることが好ましい。

（３）注入時のモニタ電流が変化する場合の補正

分離媒体として分離バッファ液を使用した場合、試料の塩濃度が分離バッファ液の塩濃度と同一であり、電圧の印加による温度変化がないときは、電流値は電圧に比例する。試料成分の移動速度は、電流値に比例するので、印加した電圧にも正しく比例する。その場合は、時間的に一定した泳動電圧の下では注入時の電流値も時間的に一定であり、試料成分の電気泳動波形は矩形になる。

注入時の電流値が一定かどうかは、実際に電流計の指示から変動幅が例えば５％以内（温度変化に相当する分）であれば一定と判断することができる。

しかし、一般に、試料の塩濃度が分離バッファ液と一致していない場合や温度変化が生じると、印加電圧が時間的に一定であっても電流値は時間的に一定ではなくなる。

試料注入時の移動速度ν_injは次式で与えられる。
ν_inj＝Ｋ_a／πｒ²
ここで、Ｋ_aは分離バッファ液のｐＨ、誘電率、イオン強度、粘度、ＤＮＡ鎖長、キャピラリ内壁−泳動溶液間の電位差（ゼータ電位）などで決まる定数である。

注入端からの距離ｘ、注入時間ｔにおける注入量ｎ_a、電流Ｉ(ｔ)及び濃度ｃ_a(ｘ,ｔ)は次式で定義できる。
ｄｎ_a(ｘ,ｔ)＝Ｋ_aｃ_a(ｘ,ｔ)×Ｉ(ｔ)ｄｔ

注入時間ｔ_injは短く、ｃ_a(ｘ,ｔ)は定数ｃ_aとみることができるので、注入時間ｔ_injが経過したときの注入量は、
となる。

試料導入時の電流波形の一例を図９に示す。これは試料注入開始から２０秒間までの立上がり時の電流値を示している。試料注入開始直後から電流値が上昇し、１０秒付近から定常状態になっていることを示しており、試料注入開始から１０秒間は試料注入量が時間とともに変化しているといえる。

試料成分の移動速度は電流値に比例するので試料注入量は試料注入時の電流積分値に比例する。そのため、試料注入時の電流積分値を検知し、試料注入量は電流積分値に比例しているものとして補正する。

試料注入時の電流はキャピラリ中の全成分の動きを表しているので、分析間の併行精度を監視する上でも有用である。

（実施例）
一実施形態の方法によりキャピラリ電気泳動分離された試料成分を定量分析した結果を以下に示す。

分析条件は以下のとおりである。
キャピラリ：内径５０μｍ×有効長８５ｍｍ、ＬＰＡ（リニアポリアクリルアミド）コーティングキャピラリ
分離バッファ液：ＤＮＡ−１０００（株式会社島津製作所の製品）、
インターカレータ：ＧｅｌＳｔａｒ（登録商標） ２０,０００倍希釈
試料：φＸ１７４−ＨａｅIII消化物（１ｎｇ／μＬ）（プロメガ株式会社の製品）
注入条件：２００Ｖ／ｃｍ×３秒
分離条件：２００Ｖ／ｃｍ

得られた電気泳動パターンは図１０に示されたものである。ＤＮＡとは無関係の蛍光色素（５−ＦＡＭ）を試料に混合させて泳動し、どの試料よりも移動度の大きいマーカとして使用する。また、２７２０ｂｐのＤＮＡ断片試料を最も移動度の小さい内部標準物質とする。

図１０の電気泳動波形のデータに基づいて、２７２０ｂｐを除くＤＮＡ断片試料の１１個のピークについて、それぞれの理論濃度（ｎｇ／μＬ）とピーク面積値をプロットした結果を図１１に示す。決定係数Ｒ²は０.９０１１であった。理論濃度は酵素消化前の既知濃度とトータルのＤＮＡ鎖長から求められる各ＤＮＡ断片試料の濃度である。

次に、その電気泳動パターンの時間軸を移動度軸に変換し、移動度軸基準のピーク面積を求めると、図１２に示されるように決定係数Ｒ²が０.９５０９に改善された。

さらに、移動度軸について求めた各成分のピーク面積を、補間係数Ｆ_iを用いて補正した結果、図１３に示されるように決定係数Ｒ²が０.９８９に改善された。このように、試料成分の相対移動度に基づいて試料成分ごとの注入量を補正することにより検出されるピーク面積、すなわち検出されるピーク面積に対応する量の定量精度が向上することがわかる。

次に、図１３に示したデータに対して、表１に示した線速度換算係数を用いてインターカレータ色素による注入時線速度による補正を行った結果が、図１４に示されるものである。表１に示されていないＤＮＡサイズの線速度換算係数は表１に示されているＤＮＡサイズの線速度換算係数に基づいて線形補間により求めた。図１４に示されるデータでは、決定係数Ｒ²が０.９９３３に改善された。このように、さらに、試料成分ごとの試料注入時の線速度に基づいて試料成分ごとの注入量を補正することにより、検出されるピーク面積に対応する量の定量精度がさらに向上することがわかる。

２ キャピラリ
４，６ バッファ溶液
８ 高圧電源
１０ シリンジポンプ
１２ 試料容器
１４、１４ａ 検出部
２０、２０ａ 制御部
２４ 電気泳動流路
３０ ピーク面積算出部
３２ 補正部
３６ 相対移動度によるピーク面積補正部
３８ 線速度換算表保持部
４０ 注入時線速度によるピーク面積補正部
４２ 面積積分値算出部
４４ 面積積分値によるピーク面積補正部

Claims (6)

1. （Ａ）ゲルが充填された電気泳動流路にその一端から互いにサイズの異なる複数の試料成分を含む試料を電気的に注入するステップ、（Ｂ）注入された前記試料を前記電気泳動流路の両端間に電圧を印加して電気泳動させて前記試料成分をそのサイズによって分離するステップ、（Ｃ）分離された前記試料成分を前記電気泳動流路の検出位置で検出するステップ、（Ｄ）検出された前記試料成分のピーク面積を求めるステップ、及び（Ｅ）求められたピーク面積を前記試料成分ごとの注入速度に基づいて補正するステップを含み、
   前記ステップ（Ｅ）における注入速度に基づく補正は、試料成分ごとのサイズに応じた相対移動度に基づく補正（Ｅ１）のほかに、
   （Ｅ２）前記電気泳動流路中のインターカレータによる各試料成分の試料注入時の線速度へのブレーキ効果に基づく補正、及び
   （Ｅ３）試料注入時の電流積分値に基づく補正、
   のうちの少なくとも一方を含んで電気泳動分離された試料成分を定量分析する電気泳動方法。
2. 前記ステップ（Ａ）では、どの試料成分よりも移動度が小さい内部標準物質Ａと、どの試料成分よりも移動度が大きい内部標準物質Ｂの２種類を試料とともに前記電気泳動流路に注入し、
   前記補正（Ｅ１）では、前記相対移動度として試料成分ごとの補間係数Ｆ_ｉを用いる請求項１に記載の電気泳動方法。
   ここで、補間係数Ｆは、内部標準物質Ａの移動度μ_Ａが０、内部標準物質Ｂの移動度μ_Ｂが１となるように規格化した係数である。
3. 前記補正（Ｅ２）として、特定の条件下においてあらかじめ求められた、試料成分のフラグメントサイズを前記ブレーキ効果の大きさを示す係数に換算するための線速度換算表を用いる請求項１又は２に記載の電気泳動方法。
4. ゲルが充填された電気泳動流路、前記電気泳動流路の一端への互いにサイズの異なる複数の試料成分を含む試料の注入及び前記電気泳動流路での電気泳動のための電圧を前記電気泳動流路の両端間に印加する電源装置、並びに前記電気泳動流路によりサイズによって分離された前記試料成分を検出する検出器を備えた電気泳動部と、
   前記検出器からの電気泳動信号を取り込み前記試料成分ごとの定量分析を行う制御部と、を備え、
   前記制御部は、前記電気泳動信号からピーク面積を求めるピーク面積算出部と、
   前記ピーク面積算出部により求められたピーク面積を、前記試料成分ごとの注入速度に基づいて補正する補正部と、を備え、
   前記補正部は注入速度に基づく補正を試料成分のサイズに応じた相対移動度に基づいて行う相対移動度によるピーク面積補正部を備え、
   前記補正部はさらに、注入速度に基づく補正を前記電気泳動流路中のインターカレータによる各試料成分の試料注入時の線速度へのブレーキ効果に基づいて行う注入時線速度によるピーク面積補正部、及び注入速度に基づく補正を電流積分値に基づいて行う電流積分値によるピーク面積補正部のうちの少なくとも一方を備えている電気泳動装置。
5. 該電気泳動装置は、特定の条件下においてあらかじめ求められた、試料成分のフラグメントサイズを前記ブレーキ効果の大きさを示す係数に換算するための線速度換算表を保持した線速度換算表保持部をさらに備え、
   前記注入時線速度によるピーク面積補正部は前記線速度換算表保持部に保持されている線速度換算表を用いるように構成されている請求項４に記載の電気泳動装置。
6. 該電気泳動装置は前記電源装置から試料注入時の電流値を取り込み、その電流積分値を求める電流積分値算出部を備え、
   前記ピーク面積補正部は注入速度に基づく補正を前記電流積分値算出部により求められた電流積分値に基づいて行うように構成されている請求項４又は５に記載の電気泳動装置。