JP6358933B2

JP6358933B2 - Particles containing polysaccharide-peptidoglycan complex

Info

Publication number: JP6358933B2
Application number: JP2014234585A
Authority: JP
Inventors: 辻　浩和; 浩和辻; 薫森山; 寛志田; 勝由千葉; 康二野本; 甲元　一也; 一也甲元; 宏治長濱; 松井　淳; 淳松井
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd; KONAN GAKUEN
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd; KONAN GAKUEN
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2018-07-18
Anticipated expiration: 2034-11-19
Also published as: JP2015129114A

Description

本発明は、多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子及びその用途に関する。 The present invention relates to a polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle and use thereof.

多糖−ペプチドグリカン複合体（ＰＳ−ＰＧ）は、乳酸菌等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌の細胞壁に存在する成分であり、近年、炎症性腸疾患や腸炎随伴性ガンの予防効果を有することが明らかになっている（特許文献１、非特許文献１）。ＰＳ−ＰＧは、その構造及び性質の点から、グラム陰性菌の細胞壁成分であり、エンドトキシンであるリポ多糖（ＬＰＳ）とは明確に相違する。また、ＰＳ−ＰＧには、分子量の異なるＰＳ−ＰＧ１及びＰＳ−ＰＧ２の２種類あることが知られ、このうちＰＳ−ＰＧ１は、分子量約１００万kDa以上、ＰＳ−ＰＧ２は分子量約３０万kDaと推定されており、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９におけるこれらの含量の比率はＰＳ−ＰＧ１：ＰＳ−ＰＧ２＝約１：８である（非特許文献２）。 Polysaccharide-peptidoglycan complex (PS-PG) is a component present in the cell walls of gram-positive bacteria such as lactic acid bacteria and gram-negative bacteria such as Escherichia coli, and has recently been effective in preventing inflammatory bowel disease and enteritis-associated cancer. (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). PS-PG is a cell wall component of Gram-negative bacteria and has a distinct difference from lipopolysaccharide (LPS), which is an endotoxin, in terms of its structure and properties. PS-PG is known to have two types, PS-PG1 and PS-PG2, having different molecular weights. Among them, PS-PG1 has a molecular weight of about 1 million kDa or more, and PS-PG2 has a molecular weight of about 300,000 kDa. The ratio of these contents in Lactobacillus casei YIT9029 is PS-PG1: PS-PG2 = about 1: 8 (Non-patent Document 2).

特開２０１１−１９３７３０号公報JP 2011-193730 A

Immunology, Vol.128, 1 Suppl, e170-e180(2009)Immunology, Vol.128, 1 Suppl, e170-e180 (2009) 「ラクトバチルスカゼイシロタ株−腸内フローラおよび健康とのかかわり−」、第２６−３３頁（ヤクルト本社中央研究所、1999年1月1日発行）"Lactobacillus casei Shirota strain-Relationship with intestinal flora and health-" pp. 26-33 (Yakult Central Research Institute, issued January 1, 1999)

しかし、ＰＳ−ＰＧは、エンドトキシンであるリポ多糖とは大きく異なり、ＰＳ−ＰＧを有する生菌で発現する自然免疫賦活能が、細胞壁から分離し可溶化されたＰＳ−ＰＧでは全く生じない。従って、ＰＳ−ＰＧにおいては、生菌を用いることなくＰＳ−ＰＧの特性の変化、構造と生理活性の関係等の研究ができなかった。
従って、本発明の課題は、ＰＳ−ＰＧの生理機能を保持したモデル細胞壁系を提供することにある。 However, PS-PG is significantly different from lipopolysaccharide, which is an endotoxin, and the innate immune stimulating ability expressed in live bacteria having PS-PG does not occur at all in PS-PG separated and solubilized from the cell wall. Therefore, in PS-PG, it was not possible to study changes in the characteristics of PS-PG, the relationship between structure and physiological activity, etc. without using live bacteria.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a model cell wall system that retains the physiological function of PS-PG.

そこで本発明者らは、生理活性を生じるＰＳ−ＰＧのモデル系を構築すべく種々検討した結果、粒子状担体を用いその表面にＰＳ−ＰＧを担持せしめれば、ＰＳ−ＰＧ含有粒子が得られ、当該粒子はＩＬ−１２産生促進効果を有し、免疫賦活能を有することを見出し、本発明を完成した。 Thus, as a result of various studies to construct a PS-PG model system that generates physiological activity, the present inventors obtained PS-PG-containing particles by using a particulate carrier and supporting PS-PG on the surface thereof. As a result, it was found that the particles had an IL-12 production promoting effect and an immunostimulatory ability, thereby completing the present invention.

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕粒子状担体表面上に多糖−ペプチドグリカン複合体（ＰＳ−ＰＧ）を担持してなるＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔２〕ＰＳ−ＰＧが、細菌由来である〔１〕記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔３〕ＰＳ−ＰＧが、乳酸菌由来である〔１〕又は〔２〕記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔４〕多糖−ペプチドグリカン複合体が、ラクトバチルス属に属する乳酸菌由来である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。
〔５〕ＰＳ−ＰＧが、ラクトバチルス・カゼイ及び／又はラクトバチルス・ジョンソニー由来である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔６〕粒子状担体が、ナノ粒子である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔７〕粒子状担体が、ラテックスナノ粒子又はシリカナノ粒子である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔８〕粒子状担体の平均粒子径が、２０nm〜３１００nmである〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔９〕粒子状担体の平均粒子径が、３００nm〜２０００nmである〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。
〔10〕１個の粒子状担体へのＰＳ−ＰＧの結合量が０．１〜５０amolである〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔11〕〔１〕〜〔10〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子を含有する医薬。
〔12〕〔１〕〜〔10〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子を有効成分とする免疫賦活剤。
〔13〕〔１〕〜〔10〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。 That is, the present invention provides the following [1] to [13].
[1] PS-PG-containing particles obtained by supporting a polysaccharide-peptidoglycan complex (PS-PG) on the surface of a particulate carrier.
[2] PS-PG-containing particles according to [1], wherein PS-PG is derived from bacteria.
[3] PS-PG-containing particles according to [1] or [2], wherein PS-PG is derived from lactic acid bacteria.
[4] The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of [1] to [3], wherein the polysaccharide-peptidoglycan complex is derived from a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus.
[5] The PS-PG-containing particles according to any one of [1] to [4], wherein PS-PG is derived from Lactobacillus casei and / or Lactobacillus johnsonii.
[6] The PS-PG-containing particle according to any one of [1] to [5], wherein the particulate carrier is a nanoparticle.
[7] The PS-PG-containing particles according to any one of [1] to [6], wherein the particulate carrier is latex nanoparticles or silica nanoparticles.
[8] The PS-PG-containing particles according to any one of [1] to [7], wherein the average particle diameter of the particulate carrier is 20 nm to 3100 nm.
[9] The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of [1] to [8], wherein the average particle size of the particulate carrier is 300 nm to 2000 nm.
[10] The PS-PG-containing particle according to any one of [1] to [9], wherein the amount of PS-PG bound to one particulate carrier is 0.1 to 50 amol.
[11] A medicament containing the PS-PG-containing particles according to any one of [1] to [10].
[12] An immunostimulant comprising the PS-PG-containing particles according to any one of [1] to [10] as an active ingredient.
[13] An interleukin 12 production promoter comprising the PS-PG-containing particles according to any one of [1] to [10] as an active ingredient.

本発明によれば、生菌の状態でなければ生理活性を示さなかったＰＳ−ＰＧの生理活性を有する人工粒子が提供できる。本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子を用いれば、生菌を用いることなく、ＰＳ−ＰＧが免疫賦活能を生じるメカニズムの研究等が可能となる。また、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は免疫賦活剤及びＩＬ−１２産生促進剤等の医薬、それらの作用を有する食品等としても有用である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the artificial particle which has the bioactivity of PS-PG which did not show bioactivity unless it was the state of a living microbe can be provided. By using the PS-PG-containing particles of the present invention, it becomes possible to study the mechanism by which PS-PG produces immunostimulatory ability without using viable bacteria. The PS-PG-containing particles of the present invention are also useful as pharmaceuticals such as immunostimulants and IL-12 production promoters, foods having these functions, and the like.

ラクトバチルス・カゼイ由来ＰＳ−ＰＧ含有粒子の粒子状担体の平均粒子径とＩＬ−１２産生誘導能との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the average particle diameter of the particulate support | carrier of Lactobacillus casei origin PS-PG containing particle | grains, and IL-12 production induction ability.

本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、粒子状担体表面上にＰＳ−ＰＧを担持してなる。 The PS-PG-containing particles of the present invention are formed by supporting PS-PG on the surface of a particulate carrier.

ＰＳ−ＰＧは、細菌の細胞壁由来のもの及び人工的に作製されたものが含まれる。このうち、生理活性の点で細菌の細胞壁由来のものが好ましい。ここで、細菌としては、乳酸菌、ビフィズス菌、クロストリジウム等のグラム陽性菌、大腸菌、バクテロイデス等のグラム陰性菌が挙げられるが、取り扱い性、安全性、生理活性の点から乳酸菌、ビフィズス菌が好ましく、乳酸菌がより好ましい。乳酸菌としては、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属等に属する乳酸菌が好ましく、より具体的には、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ユーグルティ、ラクトバチルス・デルブルッキーサブスピシーズ．ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．ラクチス、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．クレモリス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ペディオコッカス・ペントサセウス等が挙げられる。このうち、ラクトバチルス属に属する乳酸菌が好ましく、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ジョンソニーがより好ましく、特にラクトバチルス・カゼイが好ましい。ラクトバチルス・カゼイとしては、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６）が好ましく、ラクトバチルス・ジョンソニーとしては、ラクトバチルス・ジョンソニー YIT 0219^T（ＪＣＭ２０１２^T）が好ましい。 PS-PG includes those derived from bacterial cell walls and artificially produced. Of these, those derived from bacterial cell walls are preferred in terms of physiological activity. Here, the bacteria include gram-positive bacteria such as lactic acid bacteria, bifidobacteria and Clostridium, and gram-negative bacteria such as Escherichia coli and bacteroides, but lactic acid bacteria and bifidobacteria are preferable from the viewpoint of handleability, safety and physiological activity. Lactic acid bacteria are more preferred. As the lactic acid bacteria, lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, etc. are preferred, and more specifically, Lactobacillus casei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus salivaius, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus euglety, Lactobacillus delbruecki Subspices. Bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis Subspecies. Lactis, Lactococcus lactis Subspecies. Cremoris, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus and the like. Of these, lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus are preferred, Lactobacillus casei and Lactobacillus johnsonii are more preferred, and Lactobacillus casei is particularly preferred. As Lactobacillus casei, Lactobacillus casei YIT 9029 (FERM BP-1366) is preferable, and as Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus johnsonii YIT 0219 ^T (JCM 2012 ^T ) is preferable.

これらの細菌から、ＰＳ−ＰＧを分離するには、例えば特許文献１及び非特許文献２の記載に従えばよい。
ＰＳ−ＰＧとしては、ＰＳ−ＰＧ１及び／又はＰＳ−ＰＧ２を含有するもの（細菌の細胞壁由来のもの、人工的に作製されたもの等）であれば特に限定されず、さらには、例えば各種クロマトグラフィーによる分離や密度勾配遠心法などの分離・精製処理をさらに行ったものも含まれる。 To separate PS-PG from these bacteria, for example, the description in Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 may be followed.
PS-PG is not particularly limited as long as it contains PS-PG1 and / or PS-PG2 (derived from a bacterial cell wall, artificially produced, etc.). It includes those that have been further subjected to separation / purification such as separation by chromatography and density gradient centrifugation.

粒子状担体としては、ナノ粒子であることが生理活性を発揮させる点から好ましい。その具体的な平均粒子径としては、１nm〜３１００nmが好ましく、２０nm〜３１００nmがより好ましく、１００nm〜３１００nmがさらに好ましく、３００nm〜２０００nmがさらに好ましく、５００nm〜２０００nmがさらに好ましく、１０００nmが特に好ましい。 As the particulate carrier, nanoparticles are preferable from the viewpoint of exerting physiological activity. The specific average particle diameter is preferably 1 nm to 3100 nm, more preferably 20 nm to 3100 nm, further preferably 100 nm to 3100 nm, further preferably 300 nm to 2000 nm, further preferably 500 nm to 2000 nm, and particularly preferably 1000 nm.

粒子状担体の形状は、特に限定されないが、球状又は略球状であることが、ＰＳ−ＰＧの結合量、担持率、生理活性の点で好ましい。 The shape of the particulate carrier is not particularly limited, but a spherical or substantially spherical shape is preferable from the viewpoint of the amount of PS-PG bound, the loading rate, and physiological activity.

粒子状担体としては、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体ビーズ等のポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、デンドリマー、シリカビーズや酸化チタンビーズ、アルミナビーズのような無機ナノビーズ、カーボンナノ材料、金ナノ粒子や銀ナノ粒子のような金属ナノ粒子（ナノロッドも含む）、セレン化カドミウムのような半導体ナノ粒子、リポソームやミセルなどの自己組織化会合体粒子等が挙げられるが、粒子径の小さく安定なナノ粒子が得られる点から、ラテックスナノ粒子、シリカナノ粒子が好ましい。ラテックスナノ粒子としては、ポリスチレン系ラテックスナノ粒子が好ましい。
また、これらの粒子状担体表面は、ＰＳ−ＰＧを担持するため、アミノ基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、カルボニル基、α，β−不飽和カルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、アルキニル基等で修飾されているのが好ましい。これらの修飾基としては、脂肪族又は芳香族等の修飾基が挙げられ、例えば、脂肪族アミノ基、芳香族アミノ基等が挙げられる。また、ヒスチジンオリゴマー、ビピリジン、ジピコリルアミン、イミノ二酢酸等のような金属イオンと配位結合を形成する配位子で修飾されていてもよい。 Examples of particulate carriers include polystyrene beads such as styrene / divinylbenzene copolymer beads, latex beads, dendrimers, silica beads, titanium oxide beads, inorganic nano beads such as alumina beads, carbon nano materials, gold nanoparticles, and silver nanoparticles. Metal nanoparticles (including nanorods), semiconductor nanoparticles such as cadmium selenide, self-assembled aggregate particles such as liposomes and micelles, etc., but stable nanoparticles with small particle diameters can be obtained From the viewpoint, latex nanoparticles and silica nanoparticles are preferable. As the latex nanoparticles, polystyrene latex nanoparticles are preferable.
Moreover, since these particulate carrier surfaces carry PS-PG, they are amino groups, aminooxy groups, hydrazide groups, azide groups, carbonyl groups, α, β-unsaturated carbonyl groups, formyl groups, carboxyl groups, sulfones. It is preferably modified with an acid group, a thiol group, a disulfide group, an alkynyl group or the like. Examples of these modifying groups include aliphatic and aromatic modifying groups such as aliphatic amino groups and aromatic amino groups. Further, it may be modified with a ligand that forms a coordinate bond with a metal ion such as histidine oligomer, bipyridine, dipicolylamine, iminodiacetic acid and the like.

粒子状担体表面上へのＰＳ−ＰＧの担持形態は、吸着、イオン結合、共有結合、金属結合、ファンデルワールス結合等のいずれでもよいが、ＰＳ−ＰＧ含有粒子の安定性、生理活性等の点から共有結合が好ましい。より好ましくは、ＰＳ−ＰＧと粒子状担体表面上に修飾されたホルミル基又はアミノ基とがシッフ塩基形成、還元アミノ化を経て共有結合している形態である。 The support form of PS-PG on the surface of the particulate carrier may be any of adsorption, ionic bond, covalent bond, metal bond, van der Waals bond, etc., but stability of PS-PG-containing particles, physiological activity, etc. From the viewpoint, a covalent bond is preferable. More preferably, PS-PG and the formyl group or amino group modified on the surface of the particulate carrier are covalently bonded through Schiff base formation and reductive amination.

粒子状担体へのＰＳ−ＰＧの結合量は、特に制限されないが、１個の粒子状担体表面に結合したＰＳ−ＰＧ量（モル数）として、０．１〜２５０amolが好ましく、０．１〜５０amolがより好ましく、１〜５０amolがさらに好ましく、１０〜５０amolが特に好ましい。ここで、結合量は後記実施例に示すように、１個の粒子状担体表面に結合したＰＳ−ＰＧ重量をＸ（pg）、ＰＳ−ＰＧの重量平均分子量をＹ（ｇ／mol）として、Ｘ／Ｙ（amol）によって算出することができる。 The amount of PS-PG bound to the particulate carrier is not particularly limited, but the amount of PS-PG bound to the surface of one particulate carrier (number of moles) is preferably 0.1 to 250 amol, 0.1 to 50 amol is more preferable, 1 to 50 amol is more preferable, and 10 to 50 amol is particularly preferable. Here, as shown in the examples described later, the amount of PS-PG bound to one particulate carrier surface is X (pg), and the weight average molecular weight of PS-PG is Y (g / mol). It can be calculated by X / Y (amol).

粒子状担体へのＰＳ−ＰＧの担持率は、特に制限されないが、粒子状担体表面のアミノ基モル数に対して０．１〜１００％が好ましく、０．１〜２０％がより好ましく、１〜２０％がさらに好ましく、１０〜２０％が特に好ましい。ここで、担持率は、後記実施例に示すように、１個の粒子状担体表面のアミノ基モル数をＺ（amol）として、（Ｘ／Ｙ）／Ｚ×１００（％）によって算出することができる。 The support rate of PS-PG on the particulate carrier is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100%, more preferably 0.1 to 20%, more preferably 1 to 20%, based on the number of moles of amino groups on the surface of the particulate carrier. -20% is more preferable, and 10-20% is particularly preferable. Here, the loading ratio is calculated by (X / Y) / Z × 100 (%), where Z (amol) is the number of moles of amino groups on the surface of one particulate carrier, as shown in the Examples below. Can do.

粒子状担体表面へのＰＳ−ＰＧの担持方法としては、前述の如く吸着、イオン結合、共有結合、金属結合、ファンデルワールス結合等の形成方法が挙げられるが、アミノ基修飾された粒子状担体表面にＰＳ−ＰＧの糖鎖を還元条件下で反応させる還元アミノ化反応を用いるのが好ましい。より具体的には、ＰＳ−ＰＧのアミノ酸に含まれるアミノ基をアセチル化等により保護し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下に、アミノ基又は脂肪族アミノ基修飾粒子状担体を反応させるのが好ましい。 Examples of the method for supporting PS-PG on the surface of the particulate carrier include formation methods such as adsorption, ionic bond, covalent bond, metal bond and van der Waals bond as described above. It is preferable to use a reductive amination reaction in which the sugar chain of PS-PG is reacted on the surface under reducing conditions. More specifically, the amino group contained in the amino acid of PS-PG is protected by acetylation or the like, and in the presence of a reducing agent such as sodium cyanoborohydride, the amino group or aliphatic amino group modified particulate carrier is used. It is preferable to react.

本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、後記実施例に示すように、マクロファージにおける強いＩＬ−１２産生作用を有し、免疫賦活剤として有用である。また、従来、ＰＳ−ＰＧは菌体から分離した状態では生理活性を示さなかったが、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、人工粒子であるにもかかわらず、生理活性を示すことから、ＰＳ−ＰＧの生理活性の作用機序等の研究試薬としても有用である。
従って、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、ＩＬ−１２産生促進剤、免疫賦活剤等として医薬、食品、化粧品、試薬等の分野で使用可能である。 The PS-PG-containing particles of the present invention have a strong IL-12 production action in macrophages and are useful as an immunostimulant, as shown in Examples below. Conventionally, PS-PG did not show physiological activity in a state separated from cells, but the PS-PG-containing particles of the present invention show physiological activity despite being artificial particles. -It is also useful as a research reagent for the mechanism of action of physiological activity of PG.
Therefore, the PS-PG-containing particles of the present invention can be used in the fields of pharmaceuticals, foods, cosmetics, reagents and the like as IL-12 production promoters, immunostimulators and the like.

本発明の医薬は経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が望ましい。投与に関しては、有効成分であるＰＳ−ＰＧ含有粒子を投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。 The pharmaceutical of the present invention can be used either orally or parenterally, but oral administration is desirable. Regarding administration, PS-PG-containing particles as an active ingredient can be mixed with a solid or liquid nontoxic pharmaceutical carrier suitable for the administration method and administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation.

本発明の有効成分であるＰＳ−ＰＧ含有粒子を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量はＰＳ−ＰＧ含有粒子として１回あたり１×１０⁷個以上が好ましく、１×１０⁷個〜１×１０¹³個がより好ましく、１×１０⁹個〜１×１０¹³個がさらに好ましく、１×１０¹¹個〜１×１０¹³個が特に好ましい。 There is no strict limitation on the dosage when using PS-PG-containing particles which are the active ingredients of the present invention. Since the effect obtained varies depending on various use modes such as the subject and applicable disease, it is desirable to set the dose as appropriate, but the preferred dose is 1 × 10 ⁷ particles per time as PS-PG-containing particles. The above is preferable, 1 × 10 ⁷ to 1 × 10 ¹³ is more preferable, 1 × 10 ⁹ to 1 × 10 ¹³ is further preferable, and 1 × 10 ¹¹ to 1 × 10 ¹³ is particularly preferable.

医薬品とする場合の製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。 Examples of the preparation in the case of a pharmaceutical product include solid agents such as tablets, granules, powders and capsules, solutions such as solutions, suspensions and emulsions, and freeze-dried agents. These preparations can be prepared by conventional means on the preparation. Examples of the non-toxic pharmaceutical carrier include starch, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino acid, gelatin, albumin, water, and physiological saline. It is done. If necessary, conventional additives such as a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a binder, an isotonic agent, and an excipient can be appropriately added.

また、本発明の免疫賦活剤及びＩＬ−１２産生促進剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、免疫能の改善、ＩＬ−１２の産生不足による疾患、例えば感染症、腫瘍、アレルギー等の予防・治療等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明の免疫賦活剤又はＩＬ−１２産生促進剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
これらの医薬品、食品等に使用する場合の、本発明ＰＳ−ＰＧ含有粒子の濃度は１×１０⁷個／ｇ以上が好ましく、１×１０⁷個／ｇ〜１×１０¹³個／ｇがより好ましく、１×１０⁹個／ｇ〜１×１０¹³個／ｇがさらに好ましく、１×１０¹¹個／ｇ〜１×１０¹³個／ｇが特に好ましい。 Moreover, the immunostimulant and IL-12 production promoter of the present invention can be used not only as a pharmaceutical preparation as described above but also as a food or drink. In this case, the PS-PG-containing particles of the present invention may be contained in food or drink as they are or with various nutritional components added. This food and drink can be used as a health food or food material useful for the prevention and treatment of immunity improvement, diseases caused by insufficient production of IL-12, such as infections, tumors, and allergies. The container may be marked with the effect described above. Specifically, when the immunostimulant or IL-12 production promoter of the present invention is blended in a food or drink, an additive that can be used as a food or drink is appropriately used, and a form suitable for food using conventional means, For example, it may be formed into granules, granules, tablets, capsules, pastes, etc., and various foods such as processed meat products such as ham and sausage, processed fishery products such as kamaboko and chikuwa, bread, confectionery and butter In addition, it may be used by adding to milk powder, fermented food or drink, or may be used by adding to beverages such as water, fruit juice, milk, soft drinks and tea drinks. The food and drink includes animal feed.
These drugs, when used in foods, etc., the concentration of the present invention PS-PG-containing particles is preferably not less than 1 × 10 ⁷ cells / g, 1 × 10 ⁷ cells / g to 1 × 10 ¹³ cells / g Gayori Preferably, 1 × 10 ⁹ pieces / g to 1 × 10 ¹³ pieces / g are more preferable, and 1 × 10 ¹¹ pieces / g to 1 × 10 ¹³ pieces / g are particularly preferable.

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to this.

実施例１
（１）ＰＳ−ＰＧの分離
Lactobacillus casei ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６）の培養菌体を９０℃にて３０分間加熱し、凍結乾燥を行った。この加熱死菌体凍結乾燥物５００mgを５mM Tris-maleate buffer（pH６．４）３０mLに懸濁し、Mutanolysin（ＳＩＧＭＡ）を添加して３７℃、２４時間、反応させた。反応液を遠心分離して得られた上清について、１０mM リン酸buffer（pH６．０）／０．２５ＭＮａＣｌを外液として、２０時間、４℃にて透析した。透析内液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を終濃度５mg／mLとなるように注射用蒸留水（扶桑薬品）に溶解した。これをセファクリルＳ−２００ＨＲ（ＧＥヘルスケア、カラムサイズ：５×６０cm）にアプライし、ゲル濾過を行った（流速：１mL／min、温度：４℃）。得られたフラクションについて、フェノール・硫酸法にてＰＳ−ＰＧ画分を検出した。ＰＳ−ＰＧ画分を回収し、注射用蒸留水を外液として、２０時間、４℃にて透析した。これを凍結乾燥し、７３mgの精製ＰＳ−ＰＧを得た。 Example 1
(1) Separation of PS-PG
The cultured cells of Lactobacillus casei YIT 9029 (FERM BP-1366) were heated at 90 ° C. for 30 minutes and freeze-dried. 500 mg of this freeze-dried microbial cell freeze-dried product was suspended in 30 mL of 5 mM Tris-maleate buffer (pH 6.4), Mutanolysin (SIGMA) was added and reacted at 37 ° C. for 24 hours. The supernatant obtained by centrifuging the reaction solution was dialyzed at 4 ° C. for 20 hours using 10 mM phosphate buffer (pH 6.0) /0.25 M NaCl as an external solution. The dialysis internal solution was freeze-dried, and the freeze-dried product was dissolved in distilled water for injection (Fuso Yakuhin) to a final concentration of 5 mg / mL. This was applied to Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare, column size: 5 × 60 cm), and gel filtration was performed (flow rate: 1 mL / min, temperature: 4 ° C.). About the obtained fraction, PS-PG fraction was detected by the phenol-sulfuric acid method. The PS-PG fraction was collected and dialyzed at 4 ° C. for 20 hours using distilled water for injection as an external solution. This was freeze-dried to obtain 73 mg of purified PS-PG.

（２）ＰＳ−ＰＧのアミノ基の保護
１．５mLのマイクロチューブに、ＰＳ−ＰＧ３mgを加え、ミリＱ水５００μＬに溶解させた。調製したＰＳ−ＰＧ水溶液に、アミノ基の脱プロトン化が起こるよう、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）５０μＬと無水酢酸２０μＬを加え、アセチル化反応を開始した。反応溶液は室温で静置し、１５分おきにボルテックスで攪拌した。また、すべてのアミノ基をブロックするために反応開始後１時間毎に、無水酢酸を２０μＬずつ追加した。この操作を５時間続けた。５時間後、反応溶液を透析膜（フナコシ製（スペクトロポア）、分画分子量３５００）に入れ、蒸留水で１日透析した。透析によって若干白濁した溶液を２００mLナス型フラスコに移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後のアセチル化ＰＳ−ＰＧの収量は１．６mg（回収率５３％）であった。 (2) Protection of the amino group of PS-PG 3 mg of PS-PG was added to a 1.5 mL microtube and dissolved in 500 μL of milli-Q water. To the prepared PS-PG aqueous solution, 50 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5) and 20 μL of acetic anhydride were added so that deprotonation of the amino group occurred, and acetylation reaction was started. The reaction solution was allowed to stand at room temperature and vortexed every 15 minutes. Further, 20 μL of acetic anhydride was added every hour after the start of the reaction in order to block all amino groups. This operation was continued for 5 hours. After 5 hours, the reaction solution was put into a dialysis membrane (manufactured by Funakoshi (Spectropore), molecular weight cut off 3500), and dialyzed against distilled water for 1 day. The solution slightly turbid by dialysis was transferred to a 200 mL eggplant-shaped flask and lyophilized. The yield of acetylated PS-PG after lyophilization was 1.6 mg (53% recovery).

（３）反応用糖鎖ストック溶液の調製
ｉ）デキストランストック溶液の調製
０．５mLのマイクロチューブに、デキストラン５mgを加え、ミリＱ水５０μＬに溶解させた（０．１mg／μＬ）。デキストランの修飾率を変化させるために、先に調製した０．１mg／μＬを１０倍ずつ希釈したストック溶液系列（最大１０²⁵倍希釈：１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ）を調製した。調製法は、ストック溶液を１０μＬとり、０．５mLのマイクロチューブに加え、ミリＱ水９０μＬを加え、混合することで希釈溶液を調製した。 (3) Preparation of sugar chain stock solution for reaction i) Preparation of dextran stock solution To a 0.5 mL microtube, 5 mg of dextran was added and dissolved in 50 μL of milli-Q water (0.1 mg / μL). In order to change the modification rate of dextran, a stock solution series in which 0.1 mg / μL prepared previously was diluted 10-fold (maximum 10 ^25- fold dilution: 1 × 10 ⁻¹ to 1 × 10 ⁻²⁶ mg / μL) Was prepared. In the preparation method, 10 μL of the stock solution was taken, added to a 0.5 mL microtube, 90 μL of milli-Q water was added and mixed to prepare a diluted solution.

ii）ＰＳ−ＰＧストック溶液の調製
０．５mLのマイクロチューブにアセチル化したＰＳ−ＰＧ０．８mgを加え、ミリＱ水４０μＬに溶解させた（０．０２mg／μＬ）。ＰＳ−ＰＧの修飾率を変化させるために、先に調製した０．０２mg／μＬを１０倍ずつ希釈したストック溶液系列（最大１０¹⁰倍希釈：２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ）を調製した。調製法は、ストック溶液を１０μＬとり、０．５mLのマイクロチューブに加え、ミリＱ水９０μＬを加え、混合することで希釈溶液を調製した。 ii) Preparation of PS-PG stock solution 0.8 mg of acetylated PS-PG was added to a 0.5 mL microtube and dissolved in 40 μL of milli-Q water (0.02 mg / μL). In order to change the modification rate of PS-PG, a stock solution series in which 0.02 mg / μL prepared previously was diluted 10-fold (maximum 10 ^10- fold dilution: 2 × 10 ⁻² to 2 × 10 ⁻¹² mg / μL) was prepared. In the preparation method, 10 μL of the stock solution was taken, added to a 0.5 mL microtube, 90 μL of milli-Q water was added and mixed to prepare a diluted solution.

実施例１において合成した糖鎖修飾ナノビーズを表１及び表２にまとめ、これら糖鎖修飾ナノビーズの合成法を以下に詳述する。 The sugar chain-modified nanobeads synthesized in Example 1 are summarized in Tables 1 and 2, and a method for synthesizing these sugar chain-modified nanobeads will be described in detail below.

iii)ナノビーズへの糖鎖の修飾
ナノビーズとして、脂肪族アミノ基修飾ラテックスナノビーズ（粒径２４±３nm：Molecular Probe社）（２０ＬＡ−ＮＨ₂）、脂肪族アミノ基修飾ラテックスナノビーズ（粒径１１０±５nm：Molecular Probe社）（１００ＬＡ−ＮＨ₂）、脂肪族アミノ基修飾ラテックスビーズ（粒径３．１μｍ：Molecular Probe社）（ＮＰ₃₀₀₀）、アミノ基修飾シリカナノビーズ（粒径１００nm：Micromod Partikeltechnologie GmbH社）（１００ＳＩ−ＮＨ₂）、アミノ基修飾シリカナノビーズ（粒径５００nm：Micromod Partikeltechnologie GmbH社）（５００ＳＩ−ＮＨ₂）を用いた。デキストランは、分子量４０，０００（和光純薬社）のものを用いた。
ア．シリカナノビーズへのデキストランの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、シリカナノビーズ（１００ＳＩ−ＮＨ₂、もしくは５００ＳＩ−ＮＨ₂）２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、デキストランストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で１日加熱した。反応溶液を遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）し、シリカナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を２回繰り返した。
ここで、１００ＳＩ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＳＤ−１乃至１００ＳＤ−２６とし、５００ＳＩ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、５００ＳＤ−１乃至５００ＳＤ−２６とした。
イ．シリカナノビーズへのＰＳ−ＰＧの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、シリカナノビーズ（１００ＳＩ−ＮＨ₂、もしくは５００ＳＩ−ＮＨ₂）２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、ＰＳ−ＰＧストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で３日加熱した。反応溶液を遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）し、シリカナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を４回繰り返した。
ここで、１００ＳＩ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＳＰ−２乃至１００ＳＰ−１２とし、５００ＳＩ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、５００ＳＰ−２乃至５００ＳＰ−１２とした。 iii) Modification of sugar chain to nanobeads As nanobeads, aliphatic amino group-modified latex nanobeads (particle size: 24 ± 3 nm: Molecular Probe) (20LA-NH ₂ ), aliphatic amino group-modified latex nanobeads (particle size: 110 ± 5 nm) : Molecular Probe) (100LA-NH ₂ ), aliphatic amino group modified latex beads (particle size 3.1 μm: Molecular Probe) (NP ₃₀₀₀ ), amino group modified silica nano beads (particle size 100 nm: Micromod Partikeltechnologie GmbH) (100SI-NH ₂ ) and amino group-modified silica nano beads (particle size 500 nm: Micromod Partikeltechnologie GmbH) (500SI-NH ₂ ) were used. Dextran having a molecular weight of 40,000 (Wako Pure Chemical Industries) was used.
A. Modification of dextran to silica nanobeads In a 0.5 mL microtube, 20 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5), 20 μL of silica nanobeads (100SI-NH ₂ or 500SI-NH ₂ ), 100 mM sodium cyanoborohydride aqueous solution 30 μL was added and 20 μL of dextran stock solution was added. The solution was vortexed and then heated at 45 ° C. for 1 day. The reaction solution was centrifuged (9,000 rpm, 5 min, 25 ° C.) to precipitate silica nanobeads. The supernatant was removed so as not to suck the beads, and 70 μL of milli-Q water was added to the microtube to wash the reaction solution from the nanobeads, and vortexed. After centrifugation again (9,000 rpm, 5 min, 25 ° C.), the supernatant was removed, 70 μL of milli-Q water was added, and the mixture was vortexed. This operation was repeated twice.
Here, the coated beads 100 SI-NH ₂ in the dextran used ^{^{1 × 10 -1 ~1 × 10 -26}} mg / μL, and 100SD-1 to 100SD-26, 1 × 10 dextran in 500SI-NH ₂ ⁻¹ to 1 × 10 ⁻²⁶ mg / μL coated beads were designated as 500SD-1 to 500SD-26.
A. Modification of PS-PG to silica nanobeads In a 0.5 mL microtube, 20 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5), 20 μL of silica nanobeads (100SI-NH ₂ or 500SI-NH ₂ ), 100 mM cyanoborohydride 30 μL of aqueous sodium solution was added, and 20 μL of PS-PG stock solution was added. The solution was vortexed and then heated at 45 ° C. for 3 days. The reaction solution was centrifuged (9,000 rpm, 5 min, 25 ° C.) to precipitate silica nanobeads. The supernatant was removed so as not to suck the beads, and 70 μL of milli-Q water was added to the microtube to wash the reaction solution from the nanobeads, and vortexed. After centrifugation again (9,000 rpm, 5 min, 25 ° C.), the supernatant was removed, 70 μL of milli-Q water was added, and the mixture was vortexed. This operation was repeated 4 times.
Here, the beads were coated with ^{PS-PG 2 × 10 -2 ~2} × 10 -12 mg / μL in 100 SI-NH _2, and 100SP-2 to 100SP-12, the 500SI-NH ₂ PS-PG The beads coated with 2 × 10 ^{−2 to} 2 × 10 ⁻¹² mg / μL were designated as 500SP-2 to 500SP-12.

ウ．ラテックスナノビーズへのデキストランの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、ラテックスナノビーズ２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、デキストランストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で１日加熱した。反応溶液を遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）し、ラテックスナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を２回繰り返した。
ここで、２０ＬＡ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、２０ＬＤ−１乃至２０ＬＤ−２６とし、１００ＬＡ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＬＤ−１乃至１００ＬＤ−２６とした。 C. Modification of dextran to latex nanobeads To a 0.5 mL microtube, 20 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5), 20 μL of latex nanobeads, 30 μL of 100 mM sodium cyanoborohydride aqueous solution were added, and 20 μL of dextran stock solution was added. The solution was vortexed and then heated at 45 ° C. for 1 day. The reaction solution was centrifuged (10,000 rpm, 15 min, 25 ° C.) to precipitate latex nanobeads. The supernatant was removed so as not to suck the beads, and 70 μL of milli-Q water was added to the microtube to wash the reaction solution from the nanobeads, and vortexed. After centrifugation again (10,000 rpm, 15 min, 25 ° C.), the supernatant was removed, 70 μL of milli-Q water was added, and the mixture was vortexed. This operation was repeated twice.
Here, beads coated with ₂₀ LA-NH ₂ using 1 × 10 ⁻¹ to 1 × 10 ⁻²⁶ mg / μL of dextran are designated as 20LD-1 to 20LD-26, and dextran is added to 100LA-NH ₂ with 1 × 10 ⁻¹ to 1 × 10 ⁻²⁶ mg / μL of beads were used as 100LD-1 to 100LD-26.

エ．ラテックスナノビーズへのＰＳ−ＰＧの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、ラテックスナノビーズ２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、ＰＳ−ＰＧストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で３日加熱した。反応溶液を遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）し、ラテックスナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を４回繰り返した。
ここで、２０ＬＡ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、２０ＬＰ−２乃至２０ＬＰ−１２とし、１００ＬＡ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＬＰ−２乃至１００ＬＰ−１２とした。
オ．ナノビーズ表面へのＰＳ−ＰＧ結合量の定量
ｉ）材料
ＮＰ ₃₀₀₀ について
脂肪族アミノ基修飾ラテックスナノビーズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社製）
粒子直径＝３．１μｍ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社公表データ）
粒子表面のアミノ基占有面積＝２１Å²＝０．２１×１０^-6μｍ²（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社公表データ）
粒子の表面積＝４×(×（３.１／２）²＝３０．２μｍ²
粒子表面のアミノ基数＝３０．２μｍ²／０．２１×１０^-6μｍ²＝１４３，６９２，３８０
粒子表面のアミノ基モル数＝１４３，６９２，３８０／６．０２×１０²³mol^-1＝２４．３×１０^-17mol＝２４３amol D. Modification of PS-PG to latex nanobeads To a 0.5 mL microtube, 20 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5), 20 μL of latex nanobeads, 30 μL of 100 mM sodium cyanoborohydride aqueous solution were added, and 20 μL of PS-PG stock solution was added. Was added. The solution was vortexed and then heated at 45 ° C. for 3 days. The reaction solution was centrifuged (10,000 rpm, 15 min, 25 ° C.) to precipitate latex nanobeads. The supernatant was removed so as not to suck the beads, and 70 μL of milli-Q water was added to the microtube to wash the reaction solution from the nanobeads, and vortexed. After centrifugation again (10,000 rpm, 15 min, 25 ° C.), the supernatant was removed, 70 μL of milli-Q water was added, and the mixture was vortexed. This operation was repeated 4 times.
Here, beads coated with ₂₀ LA-NH ₂ using 2 × 10 ⁻² to 2 × 10 ⁻¹² mg / μL of PS-PG are designated as 20LP-2 to 20LP-12, and 100LA-NH ₂ is treated with PS-PG. The beads coated with 2 × 10 ^{−2 to} 2 × 10 ⁻¹² mg / μL were designated as 100LP-2 to 100LP-12.
E. Determination of PS-PG binding amount to nanobead surface i) Material
About NP ₃₀₀₀ Aliphatic amino group-modified latex nanobeads (Molecular Probe)
Particle diameter = 3.1 μm (data published by Molecular Probe)
Amino-occupied area of particle surface = 21Å ² = 0.21 × 10 ⁻⁶ μm ² (Data published by Molecular Probe)
Particle surface area = 4 × (× (3.1 / 2) ² = 30.2 μm ²
Amino groups on the particle surface ^{^{^{= 30.2μm 2 /0.21×10 -6 μm 2 =}}} 143,692,380
Number of moles of amino groups on the particle surface = 143,692,380 / 6.02 × 10 ²³ mol ⁻¹ = 24.3 × 10 ^-17 mol = 243 amol

ii）ＮＰ ₃₀₀₀ −８ＰＳＰＧの合成
マイクロチューブに１５０μＬのＰＢＳ（５０mM，pH８．５）、７５μＬのアセチル化ＰＳ−ＰＧ水溶液（２．０mg／７５μＬ：ビーズ表面のアミノ基に対して８等量のアセチル化ＰＳ−ＰＧ（モル数））、２５μＬのＮＰ₃₀₀₀水溶液（３．７５×１０⁷個，０．２３０mg）、７５μＬのシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１００mM）を加えた。マイクロチューブを室温にて静置し、３０分ごとにボルテックスにより撹拌した。これを８回繰り返した後，２５０rpmで撹拌しながら４５℃にて７２時間インキュベートした。
反応溶液を遠心分離し（１１，０００rpm，１５min，４℃）、ＮＰ₃₀₀₀成分を沈殿させ、上清を除去した。２００μＬの超純水を用いた洗浄操作を７回繰り返し、ペレットとしてＰＳ−ＰＧ結合ＮＰ₃₀₀₀（ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧ）を得た。ビーズ表面のアミノ基に対して添加するアセチル化ＰＳ−ＰＧのモル数（１等量，２等量，４等量，６等量）を変化させたこと以外は、上記と同じ方法により、ＮＰ₃₀₀₀−ＰＳＰＧ、ＮＰ₃₀₀₀−２ＰＳＰＧ、ＮＰ₃₀₀₀−４ＰＳＰＧ、ＮＰ₃₀₀₀−６ＰＳＰＧを得た。 ii) Synthesis of NP ₃₀₀₀ -8 PSPG In a microtube, 150 μL of PBS (50 mM, pH 8.5), 75 μL of an acetylated PS-PG aqueous solution (2.0 mg / 75 μL: 8 equivalents of acetyl to the amino group on the bead surface) PS-PG (in moles)), 25 μL of NP ₃₀₀₀ aqueous solution (3.75 × 10 ⁷ , 0.230 mg), and 75 μL of sodium cyanoborohydride aqueous solution (100 mM) were added. The microtube was allowed to stand at room temperature and stirred by vortex every 30 minutes. This was repeated 8 times and then incubated at 45 ° C. for 72 hours with stirring at 250 rpm.
The reaction solution was centrifuged (11,000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to precipitate the NP ₃₀₀₀ component, and the supernatant was removed. The washing operation using 200 μL of ultrapure water was repeated 7 times to obtain PS-PG-bonded NP ₃₀₀₀ (NP ₃₀₀₀ -8PSPG) as a pellet. In the same way as above, except that the number of moles of acetylated PS-PG added to the amino group on the bead surface (1 equivalent, 2 equivalents, 4 equivalents, 6 equivalents) was changed, NP _{_{3000 -PSPG, NP 3000 -2PSPG, NP}} 3000 -4PSPG, to give the NP ₃₀₀₀ -6PSPG.

iii)１個のＮＰ ₃₀₀₀ に結合したＰＳ−ＰＧ量の算出方法
ペレットとして得られた各ＰＳ−ＰＧ結合ＮＰ₃₀₀₀を凍結乾燥し、精密電子天秤により各ＰＳ−ＰＧ結合ＮＰ₃₀₀₀の重量を測定した。各反応前後で増加した重量はナノビーズに結合したＰＳ−ＰＧによるものとし，１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧ量を算出した。以下はその一例として、ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの算出過程を示す。
反応前のＮＰ₃₀₀₀（３．７５×１０⁷個）の重量は０．２３０mgであった。ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの場合、反応、精製後の重量は０．２８４mgであった。これより、３．７５×１０⁷個のＮＰ₃₀₀₀に５４μｇのＰＳ−ＰＧが結合したことが分かった。また、１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧ重量は１．４４pgと算出され（５４μｇ／３．７５×１０⁷個）、ＰＳ−ＰＧの重量平均分子量３０，０００（ｇ／mol）を用いると、１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧのモル数は４８amolと算出された（１．４４pg／３０，０００ｇ・mol^-1）。ＮＰ₃₀₀₀表面のアミノ基モル数は２４３amolであることより、ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの場合、ＮＰ₃₀₀₀表面に提示されたアミノ基の１９．８％がＰＳ−ＰＧとの結合に用いられたことが分かった。 iii) Each PS-PG bond NP ₃₀₀₀ obtained as a single PS-PG amount calculation method pellets bound to NP ₃₀₀₀ of lyophilized to measure the weight of each PS-PG bond NP ₃₀₀₀ with a precision electronic balance . The weight increased before and after each reaction was attributed to PS-PG bound to nanobeads, and the amount of PS-PG bound to one NP ₃₀₀₀ was calculated. The following is an example of the calculation process of NP ₃₀₀₀ -8PSPG.
The weight of NP ₃₀₀₀ (3.75 × 10 ⁷ pieces) before the reaction was 0.230 mg. In the case of NP ₃₀₀₀ -8PSPG, the weight after reaction and purification was 0.284 mg. From this, it was found that 54 μg of PS-PG was bound to 3.75 × 10 ⁷ NP ₃₀₀₀ . Further, the weight of PS-PG bound to one NP ₃₀₀₀ is calculated as 1.44 pg (54 μg / 3.75 × 10 ⁷ ), and the weight average molecular weight of PS-PG is 30,000 (g / mol). The number of moles of PS-PG bound to one NP ₃₀₀₀ was calculated to be 48 amol (1.44 pg / 30,000 g · mol ⁻¹ ). From the fact that the number of moles of amino groups on the surface of NP ₃₀₀₀ is 243 amol, it can be seen that in the case of NP ₃₀₀₀ -8PSPG, 19.8% of the amino groups presented on the surface of NP ₃₀₀₀ were used for binding to PS-PG. It was.

iv）ＮＰ ₃₀₀₀ へのＰＳ−ＰＧ結合量の定量
１個のナノビーズ表面に結合したＰＳ−ＰＧ量（モル数）を表３にまとめる。ＰＳ−ＰＧ添加量の増加に伴い，ナノビーズ１個に結合したＰＳ−ＰＧ量は増加した。ＰＳ−ＰＧ添加量とＰＳ−ＰＧ結合量とは正比例の関係にはなく、ＰＳ−ＰＧ１モル等量と２モル等量で結合量は同程度であった。４モル等量では２モル等量の約２倍の結合量が得られた。６モル等量では２モル等量の約１４倍の結合量，８モル等量では２モル等量の約４３倍の結合量が得られた。 iv) Quantification of the amount of PS-PG bound to NP ₃₀₀₀ Table 3 summarizes the amount of PS-PG bound to the surface of one nanobead (number of moles). As the amount of PS-PG added increased, the amount of PS-PG bound to one nanobead increased. The amount of PS-PG added and the amount of PS-PG binding were not in direct proportion, and the amount of binding was the same at 1 mol equivalent of PS-PG and 2 mol equivalent. At 4 molar equivalents, a binding amount approximately twice that of 2 molar equivalents was obtained. With 6 molar equivalents, a binding amount of about 14 times the 2 molar equivalents was obtained, and with 8 molar equivalents, a binding amount of about 43 times the 2 molar equivalents was obtained.

試験例１
（マウス由来マクロファージ細胞を用いたサイトカイン産生評価）
（１）細胞の培養、継代
１０cmディッシュで培養したＪ７７４．１細胞（マウスマクロファージ様株化細胞）は、ピペッティングおよびトリプシン処理によりディッシュ底面からはがし、その細胞懸濁液を遠心分離（１０００rpm、３min）することにより、遠沈チューブ内に回収した。上清を吸引除去した後、そこに新鮮培地（１０％非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ／mLペニシリン、１００μｇ／mLストレプトマイシン、０．０５mM ２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）を加え、ピペッティングによりＪ７７４．１細胞を培地中に懸濁させた。得られたＪ７７４．１細胞懸濁液を新しい１０cmディッシュ内に注ぎ（２．０×１０⁵cells／mL、８mL）、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で培養した。これらの操作を３日毎に繰り返し、継代を行った。 Test example 1
(Evaluation of cytokine production using mouse-derived macrophage cells)
(1) Cell culture and passage J774.1 cells (mouse macrophage-like cell line) cultured in a 10 cm dish are peeled off from the bottom of the dish by pipetting and trypsin treatment, and the cell suspension is centrifuged (1000 rpm, 3 min), the sample was collected in a centrifuge tube. After removing the supernatant by aspiration, a fresh medium (10% inactivated fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin, 0.05 mM 2-mercaptoethanol-containing RPMI-1640 medium) was added thereto, and pipetting was performed. J774.1 cells were suspended in the medium. The obtained J774.1 cell suspension was poured into a new 10 cm dish (2.0 × 10 ⁵ cells / mL, 8 mL) and cultured in a 37 ° C., 5% CO ₂ incubator. These operations were repeated every 3 days to perform subculture.

（２）細胞毒性試験
Ｊ７７４．１細胞懸濁液を細胞培養用９６wellプレートに１００μＬ／wellずつ分注し（１．０×１０⁵cells／well）、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２時間インキュベートした。その後、使用培地に懸濁した各種ＰＳ−ＰＧ結合ナノビーズおよびコントロール（２０ＬＤ−１、１００ＬＤ−１、５００ＳＤ−１、２０ＬＡ−ＮＨ₂、１００ＬＡ−ＮＨ₂、５００ＳＩ−ＮＨ₂）を１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２４時間培養した。その後、各wellにＷＳＴ−１アッセイ溶液（ＷＳＴ−１／１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳの９／１混合水溶液）を１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２時間呈色反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。 (2) Cytotoxicity test J774.1 cell suspension was dispensed into a 96-well plate for cell culture at 100 μL / well (1.0 × 10 ⁵ cells / well), and 2 in a 37 ° C., 5% CO ₂ incubator. Incubated for hours. Thereafter, various PS-PG bound nano-beads were suspended in use media and control (20LD-1,100LD-1,500SD-1,20LA -NH 2, 100LA-NH 2, 500SI-NH 2) was added in 100 [mu] L, The cells were cultured for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO ₂ incubator. Thereafter, WST-1 assay solution to each well (the 9/1 mixed aqueous solution of WST-1/1-methoxy PMS ) was added 10 [mu] L, 37 ° C., was 2 hours color reaction in a 5% CO ₂ incubator. Thereafter, absorbance at 450 nm and 620 nm was measured with a microplate reader.

（３）ＩＬ−１２産生誘導実験
Ｊ７７４．１細胞懸濁液を細胞培養用９６wellプレートに１００μＬ／wellずつ分注し（１．０×１０⁵cells／well）、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２時間インキュベートした。その後、使用培地にて懸濁した各種ＰＳ−ＰＧ結合ナノビーズおよびコントロール（２０ＬＤ−１、１００ＬＤ−１、５００ＳＤ−１、２０ＬＡ−ＮＨ₂、１００ＬＡ−ＮＨ₂、５００ＳＩ−ＮＨ₂）を１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２４時間培養した。その後、培養上清を０．２２μｍフィルターでろ過し、得られたろ液を−３０℃で保存した。Ｐｕｒｉｆｉｅｄｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０をＮａ₂ＣＯ₃緩衝液（pH９．６）で希釈し、ＥＬＩＳＡ用９６wellプレートに５０μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。各wellを０．０５％Tween２０を含むＰＢＳ（pH７．４）で洗浄後、１％ＢＳＡを含むＮａ₂ＣＯ₃緩衝液を１００μＬずつ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。各wellをＰＢＳで洗浄後、サンプルおよび０．０３％ＮａＮ₃を含むＰＢＳで所定の濃度になるよう希釈したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ７０を５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。各wellをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈したｂｉｏｔｉｎｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０を５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。各wellをＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを５０μＬずつ添加し、暗中室温で３０分間反応させた。各wellをＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン）基質溶液を５０μＬずつ添加し、暗中室温で２０分間反応させた。各wellに１ＭＨ₂ＳＯ₄を５０μＬずつ添加して発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。 (3) IL-12 production induction experiment The J774.1 cell suspension was dispensed into a 96-well plate for cell culture at 100 μL / well (1.0 × 10 ⁵ cells / well), 37 ° C., 5% CO ₂ incubator. Incubated for 2 hours. Thereafter, various PS-PG binding nanobeads and controls were suspended in spent medium (20LD-1,100LD-1,500SD-1,20LA -NH 2, 100LA-NH 2, 500SI-NH 2) was added in 100μL The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator for 24 hours. Thereafter, the culture supernatant was filtered with a 0.22 μm filter, and the obtained filtrate was stored at −30 ° C. Purified rat anti-mouse IL-12 p40 / p70 was diluted with Na ₂ CO ₃ buffer (pH 9.6), 50 μL was added to a 96-well plate for ELISA, and incubated at 4 ° C. overnight. After washing each well with PBS (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20, 100 μL of Na ₂ CO ₃ buffer containing 1% BSA was added and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. After washing each well with PBS, 50 μL of the sample and recombinant mouse IL-12 p70 diluted to a predetermined concentration with PBS containing 0.03% NaN ₃ were added and reacted at room temperature for 90 minutes. After washing each well with PBS, 50 μL of biotin rat anti-mouse IL-12 p40 / p70 diluted with PBS containing 1% BSA was added and reacted at room temperature for 90 minutes. After washing each well with PBS, 50 μL of peroxidase-labeled streptavidin diluted 20000 times with PBS containing 1% BSA was added and reacted at room temperature in the dark for 30 minutes. After washing each well with PBS, 50 μL of TMB (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) substrate solution was added and reacted at room temperature in the dark for 20 minutes. The coloring reaction was stopped by adding 50 μL of 1 MH ₂ SO ₄ to each well, and the absorbance at 450 nm and 620 nm was measured with a microplate reader.

（４）細胞毒性
ナノビーズ表面をＰＳ−ＰＧで修飾すると、ナノビーズのＪ７７４．１細胞に対するサイズ依存的な毒性は軽減されることが分かった。 (4) Cytotoxicity It was found that modification of the nanobead surface with PS-PG reduces the size-dependent toxicity of nanobeads to J774.1 cells.

（５）ＩＬ−１２産生誘導効果
ｉ）ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズ（２０ＬＰ−２）について
２０ＬＰ−２を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度１．０×１０¹³個／mLで、ＩＬ−１２発現量は２８，８７８pg／mLに達した。 (5) IL-12 production induction effect i) When an IL-12 production induction experiment was conducted using PS-PG modified latex nanobeads (20LP-2) using 20LP-2, a particle concentration of 1.0 × 10 ¹³ particles / In mL, the expression level of IL-12 reached 28,878 pg / mL.

ii）ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズ（１００ＬＰ−２）について
１００ＬＰ−２を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度が１．０×１０¹〜１．０×１０⁹個／mLでは、ＩＬ−１２発現量は濃度上昇に伴い２５１pg／mL〜５１２pg／mLの濃度範囲で変化していた。しかし、粒子濃度が１．０×１０¹¹個／mLに達するとＩＬ−１２の生産量が５，０２６pg／mLまで急激に上昇した。 ii) When an experiment of inducing IL-12 production using 100LP-2 was performed on the PS-PG modified latex nanobeads (100LP-2) , the particle concentration was 1.0 × 10 ^{1 to} 1.0 × 10 ⁹ particles / mL. In this case, the expression level of IL-12 was changed in the concentration range of 251 pg / mL to 512 pg / mL as the concentration increased. However, when the particle concentration reached 1.0 × 10 ¹¹ particles / mL, IL-12 production increased rapidly to 5,026 pg / mL.

iii)ＰＳ−ＰＧ修飾シリカナノビーズ（５００ＳＰ−２）について
５００ＳＰ−２を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度が１．０×１０¹〜１．０×１０⁷個／mLでは、ＩＬ−１２発現量は濃度上昇に伴い２５７pg／mL〜７５１pg／mLの濃度範囲で変化していたが、粒子濃度が１．０×１０⁹個／mLに達するとＩＬ−１２の産生量が８９２pg／mLまで急激に上昇した。 iii) When the IL-12 production induction experiment was conducted using 500SP-2 for the PS-PG modified silica nanobeads (500SP-2) , the particle concentration was 1.0 × 10 ^{1 to} 1.0 × 10 ⁷ particles / mL. Then, the expression level of IL-12 was changed in the concentration range of 257 pg / mL to 751 pg / mL as the concentration increased, but when the particle concentration reached 1.0 × 10 ⁹ particles / mL, the production amount of IL-12 Increased rapidly to 892 pg / mL.

iv)ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズ（ＮＰ ₃₀₀₀ −８ＰＳＰＧ）について
ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧを用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度が１．０×１０⁷個／mLで、ＩＬ−１２産生量が９２１pg／mLまで急激に上昇した。約２０nmのナノビーズでは１．０×１０¹³個／mL、約１００nmのナノビーズでは１．０×１０¹¹個／mL、約５００nmのナノビーズでは１．０×１０⁹個／mLという粒子濃度に閾値（ＩＬ−１２産生量が急激に上昇する粒子濃度）があったことから考えると、粒子径が大きくなるほど閾値となる粒子濃度が低下することが明らかとなった。
なお、前記ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧに相当する量の可溶化ＰＳ−ＰＧ（細胞壁から分離し可溶化されたＰＳ−ＰＧをビーズに被覆しない状態で添加）を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、前記ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの粒子濃度に相当する濃度域においてＩＬ−１２の産生は誘導されず、ＩＬ−１２の発現量に顕著な差はなかった。 iv) When an IL-12 production induction experiment was conducted using NP ₃₀₀₀ -8PSPG for PS-PG modified latex nanobeads (NP ₃₀₀₀ -8PSPG) , the particle concentration was 1.0 × 10 ⁷ particles / mL, and IL-12 The production increased rapidly to 921 pg / mL. Threshold values (1.0 × 10 ¹³ particles / mL for nanobeads of about 20 nm, 1.0 × 10 ¹¹ particles / mL for nanobeads of about 100 nm, and 1.0 × 10 ⁹ particles / mL for nanobeads of about 500 nm) Considering that there was a particle concentration at which the amount of IL-12 production increased rapidly), it became clear that the particle concentration serving as the threshold decreased as the particle diameter increased.
In addition, IL-12 production induction experiments were performed using solubilized PS-PG in an amount corresponding to the NP ₃₀₀₀ -8PSPG (added in a state where the solubilized PS-PG separated from the cell wall was not coated on the beads). However, IL-12 production was not induced in the concentration range corresponding to the particle concentration of NP ₃₀₀₀ -8PSPG, and there was no significant difference in the expression level of IL-12.

v）デキストラン修飾ラテックスナノビーズ（２０ＬＤ−１）について
２０ＬＤ−１を用いたものに関しては、粒子濃度が１．０×１０¹〜１．０×１０¹³個／mLの範囲でＩＬ−１２の産生は誘導されず、ＩＬ−１２の発現量に顕著な差はなかった。 v) Regarding the dextran modified latex nanobeads (20LD-1) using 20LD-1, the production of IL-12 is not observed when the particle concentration is in the range of 1.0 × 10 ^{1 to} 1.0 × 10 ¹³ particles / mL. There was no significant difference in the expression level of IL-12.

実施例２
（ＰＳ−ＰＧ修飾ナノビーズの粒径とIL-12産生量の相関）
（ｉ）ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズの合成
０．５μＬのマイクロチューブに５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０．０μＬ、各サイズ（直径：２００、３００、１０００、２０００、３０００nm）のＮＰ（ラテックスナノビーズ）懸濁液２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０．０μＬ、各サイズのＮＰ表面に存在するアミノ基に対して８モル当量になるようにミリＱ水で濃度調整したラクトバチルス・カゼイ由来ＰＳ−ＰＧ溶液を２０μＬ加えた。その後、溶液をボルテックスにて撹拌し、４５℃で７２時間加熱した。その後、反応溶液を遠心し（１１，０００rpm、１５min、４℃）ナノビーズを沈殿させた。ナノビーズ反応溶液の上清を取り除き、ミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。再度、遠心分離（１１，０００rpm １５min ４℃）した後に上清を取り除き、ナノビーズにミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。この操作を７回繰り返した。 Example 2
(Correlation between particle size of PS-PG modified nanobeads and IL-12 production)
(I) Synthesis of PS-PG-modified latex nanobeads In a 0.5 μL microtube, 20.0 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5), NP (diameter: 200, 300, 1000, 2000, 3000 nm) Latex nanobeads) Suspension 20 μL, 100 mM sodium cyanoborohydride aqueous solution 30.0 μL, Lactobacillus casei adjusted with MilliQ water to 8 molar equivalents with respect to amino groups present on the surface of each NP 20 μL of the derived PS-PG solution was added. The solution was then vortexed and heated at 45 ° C. for 72 hours. Thereafter, the reaction solution was centrifuged (11,000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to precipitate nanobeads. The supernatant of the nanobead reaction solution was removed, Milli-Q water was added, and the mixture was vortexed. Again, after centrifugation (11,000 rpm, 15 min, 4 ° C.), the supernatant was removed, milliQ water was added to the nanobeads, and the mixture was vortexed. This operation was repeated 7 times.

（ii）ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２濃度の定量
Ｊ７７４．１細胞（マウスマクロファージ様株化細胞）を９６wellプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／wellで分注し（１００μＬ）、３７℃５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。その後、濃度調整した（１．０×１０^９個／mL）各サイズのＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスビーズ溶液を各wellに１００μＬずつ添加し、３７℃５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。２４時間後、培養上清を０．４５μｍフィルターにて濾過回収後、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ用９６wellプレートにｐｕｒｉｆｉｅｄｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０（pH９．６のＮａ_２ＣＯ_３緩衝液で１０μｇ／mLに希釈）を５０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートしプレートへ固層化した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて５回洗浄し、１％ＢＳＡ−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液を１００μＬ添加し４℃下で２４時間インキュベートした。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、サンプルおよび１％ＢＳＡ−ＰＢＳで（４０００pg／mL、２０００pg／mL、１０００pg／mL、５００pg／mL、２５０pg／mL、１２５pg／mL、６２．５pg／mL、０pg／mL）となるよう希釈したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ７０を５０μＬ添加し、室温で９０分間反応した。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したｂｉｏｔｉｎｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ１２ｐ４０／ｐ７０（１．０μｇ／mL）を５０μＬ添加し室温で９０分間反応した。ＰＢＳにて４回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００００倍希釈したペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で３０分間反応させた。ＰＢＳにて４回洗浄し、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン）基質溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で２０分反応させマイクロプレートリーダーにて６２０nmの吸光度を測定した。その後、１ＭＨ_２ＳＯ_４を５０μＬ添加し反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。 (Ii) Determination of IL-12 concentration by ELISA J774.1 cells (mouse macrophage-like cell line) were dispensed at 1 × 10 ⁵ cells / well in a 96-well plate (100 μL), and ₂ at 37 ° C. with 5% CO ₂ . Incubated for hours. Thereafter, 100 μL each of PS-PG modified latex bead solution of each size adjusted (1.0 × 10 ⁹ cells / mL) was added to each well and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours. After 24 hours, the culture supernatant was collected by filtration through a 0.45 μm filter and stored at −20 ° C. as a sample for ELISA. 50 μL of purified rat anti-mouse IL-12 p40 / p70 (diluted to 10 μg / mL with Na ₂ CO ₃ buffer at pH 9.6) was added to the 96-well plate for ELISA, and the plate was incubated overnight at 4 ° C. Turned into. Thereafter, the plate was washed 5 times with 0.05% Tween20-PBS, 100 μL of 1% BSA-Na ₂ CO ₃ buffer was added and incubated at 4 ° C. for 24 hours. Each well was washed 4 times with PBS, and the sample and 1% BSA-PBS (4000 pg / mL, 2000 pg / mL, 1000 pg / mL, 500 pg / mL, 250 pg / mL, 125 pg / mL, 62.5 pg / mL, 50 μL of recombinant mouse IL-12 p70 diluted to 0 pg / mL) was added and reacted at room temperature for 90 minutes. Each well was washed 4 times with PBS, 50 μL of biotin rat anti-mouse IL12 p40 / p70 (1.0 μg / mL) diluted with 1% BSA-PBS was added and reacted at room temperature for 90 minutes. After washing 4 times with PBS, 50 μL of a peroxidase-labeled streptavidin solution diluted 20000 times with 1% BSA-PBS was added and allowed to react for 30 minutes at room temperature in the dark. The plate was washed 4 times with PBS, 50 μL of TMB (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) substrate solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 20 minutes in the dark. The absorbance at 620 nm was measured with a microplate reader. . Thereafter, 50 μL of 1 MH ₂ SO ₄ was added to stop the reaction, and absorbance at 450 nm and 620 nm was measured with a microplate reader.

（iii）結果
ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズの担体の粒子径（２００nm〜３０００nm）とＩＬ−１２産生作用との関係を図１に示す。
図１から明らかなように、粒子状担体の平均粒子径が３００nm〜２０００nmであるＰＳ−ＰＧ含有粒子のＩＬ−１２産生誘導能が特に優れていることがわかる。 (Iii) Results FIG. 1 shows the relationship between the particle size (200 nm to 3000 nm) of the PS-PG modified latex nanobead carrier and the IL-12 producing action.
As is apparent from FIG. 1, it can be seen that the ability to induce IL-12 production of PS-PG-containing particles having an average particle diameter of the particulate carrier of 300 nm to 2000 nm is particularly excellent.

実施例３
（ラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ含有粒子のＩＬ−１２産生誘導能）
（ｉ）ラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズの合成
ラクトバチルス・ジョンソニーＹＩＴ０２１９^T（ＪＣＭ２０１２^T）由来ＰＳ−ＰＧ溶液の調製は、実施例１のラクトバチルス・カゼイ由来由来ＰＳ−ＰＧ溶液の調製方法と同様の方法により行った。
０．５μＬのマイクロチューブに５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０．０μＬ、直径：１μｍのＮＰ（ラテックスナノビーズ）懸濁液２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０．０μＬ、ＮＰ表面に存在するアミノ基に対して８モル当量になるようにミリＱ水で濃度調整したラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ溶液を２０μＬ加えた。その後、溶液をボルテックスにて撹拌し、４５℃で７２時間加熱した。その後、反応溶液を遠心し（１１，０００rpm、１５min、４℃）ナノビーズを沈殿させた。ナノビーズ反応溶液の上清を取り除き、ミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。再度、遠心分離（１１，０００rpm、１５min、４℃）した後に上清を取り除き、ナノビーズにミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。この操作を７回繰り返した。
（ii）ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２濃度の定量
Ｊ７７４．１細胞を９６wellプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／wellで分注し（１００μＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。その後、濃度調整した各サイズのＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスビーズ溶液を各wellに１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。２４時間後、培養上清を０．４５μｍフィルターにて濾過回収後、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ用９６wellプレートにｐｕｒｉｆｉｅｄｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０（pH９．６のＮａ_２ＣＯ_３緩衝液で１０μｇ／mLに希釈）を５０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートしプレートへ固層化した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて５回洗浄し、１％ＢＳＡ−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液を１００μＬ添加し４℃下で２４時間インキュベートした。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、サンプルおよび１％ＢＳＡ−ＰＢＳで（４０００pg／mL、２０００pg／mL、１０００pg／mL、５００pg／mL、２５０pg／mL、１２５pg／mL、６２．５pg／mL、０pg／mL）となるよう希釈したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ７０を５０μＬ添加し、室温で９０分間反応した。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したｂｉｏｔｉｎｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＬ１２ｐ４０／ｐ７０（１．０μｇ／mL）を５０μＬ添加し室温で９０分間反応した。ＰＢＳにて４回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００００倍希釈したペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で３０分間反応させた。ＰＢＳにて４回洗浄し、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン）基質溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で２０分反応させマイクロプレートリーダーにて６２０nmの吸光度を測定した。その後、１ＭＨ_２ＳＯ_４を５０μＬ添加し反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。 Example 3
(IL-12 production inducing ability of PS-PG-containing particles derived from Lactobacillus johnsonii )
(I) Synthesis of Lactobacillus johnsonii -derived PS-PG-modified latex nanobeads Lactobacillus johnsonii YIT 0219 ^T (JCM 2012 ^T ) -derived PS-PG solution was prepared from Lactobacillus casei-derived PS of Example 1. -Performed by the same method as the method for preparing the PG solution.
In a 0.5 μL microtube, 20.0 μL of 50 mM phosphate buffer (pH 8.5), 20 μL of a 1 μm diameter NP (latex nanobead) suspension, 30.0 μL of 100 mM sodium cyanoborohydride aqueous solution, present on the NP surface 20 μL of a Lactobacillus johnsonii- derived PS-PG solution whose concentration was adjusted with milli-Q water so as to be 8 molar equivalents relative to the amino group to be added. The solution was then vortexed and heated at 45 ° C. for 72 hours. Thereafter, the reaction solution was centrifuged (11,000 rpm, 15 min, 4 ° C.) to precipitate nanobeads. The supernatant of the nanobead reaction solution was removed, Milli-Q water was added, and the mixture was vortexed. Again, after centrifugation (11,000 rpm, 15 min, 4 ° C.), the supernatant was removed, milliQ water was added to the nanobeads, and the mixture was vortexed. This operation was repeated 7 times.
(Ii) Determination of IL-12 concentration by ELISA J774.1 cells were dispensed into 96-well plates at 1 × 10 ⁵ cells / well (100 μL) and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 2 hours. Thereafter, 100 μL of each size-adjusted PS-PG modified latex bead solution was added to each well and incubated at 37 ° C., 5% CO ₂ for 24 hours. After 24 hours, the culture supernatant was collected by filtration through a 0.45 μm filter and stored at −20 ° C. as a sample for ELISA. 50 μL of purified rat anti-mouse IL-12 p40 / p70 (diluted to 10 μg / mL with Na ₂ CO ₃ buffer at pH 9.6) was added to the 96-well plate for ELISA, and the plate was incubated overnight at 4 ° C. Turned into. Thereafter, the plate was washed 5 times with 0.05% Tween20-PBS, 100 μL of 1% BSA-Na ₂ CO ₃ buffer was added and incubated at 4 ° C. for 24 hours. Each well was washed 4 times with PBS, and the sample and 1% BSA-PBS (4000 pg / mL, 2000 pg / mL, 1000 pg / mL, 500 pg / mL, 250 pg / mL, 125 pg / mL, 62.5 pg / mL, 50 μL of recombinant mouse IL-12 p70 diluted to 0 pg / mL) was added and reacted at room temperature for 90 minutes. Each well was washed 4 times with PBS, 50 μL of biotin rat anti-mouse IL12 p40 / p70 (1.0 μg / mL) diluted with 1% BSA-PBS was added and reacted at room temperature for 90 minutes. After washing 4 times with PBS, 50 μL of a peroxidase-labeled streptavidin solution diluted 20000 times with 1% BSA-PBS was added and allowed to react for 30 minutes at room temperature in the dark. The plate was washed 4 times with PBS, 50 μL of TMB (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) substrate solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 20 minutes in the dark. The absorbance at 620 nm was measured with a microplate reader. . Thereafter, 50 μL of 1 MH ₂ SO ₄ was added to stop the reaction, and absorbance at 450 nm and 620 nm was measured with a microplate reader.

（iii）結果
ラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ修飾ナノ粒子のＪ７７４．１細胞に対するＩＬ−１２産生誘導能は、粒子濃度１×１０⁸粒子／mLで８７０，０００pq／mLに達した。Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来ＰＳ−ＰＧは菌体レベルでＩＬ−１２産生誘導能を示さないことが知られていることから、この実験結果は、ＩＬ−１２産生誘導を示さない乳酸菌由来のＰＳ−ＰＧでも、本発明のように粒子化（粒子状担体表面上に担持）することにより、ＩＬ−１２産生誘導能を示すようになることを示唆している。 (Iii) Results
The ability to induce IL-12 production for J774.1 cells of PS-PG modified nanoparticles derived from Lactobacillus johnsonii reached 870,000 pq / mL at a particle concentration of 1 × 10 ⁸ particles / mL. L. Since it is known that Johnson-derived PS-PG does not show IL-12 production-inducing ability at the bacterial cell level, this experimental result shows that even PS-PG derived from lactic acid bacteria that do not show IL-12 production induction This suggests that the ability to induce IL-12 production is exhibited by granulating (supporting on the surface of the particulate carrier) as in the invention.

Claims

A polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle obtained by supporting a polysaccharide-peptidoglycan complex on the surface of a particulate carrier.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to claim 1, wherein the polysaccharide-peptidoglycan complex is derived from bacteria.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particles according to claim 1 or 2, wherein the polysaccharide-peptidoglycan complex is derived from lactic acid bacteria.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of claims 1 to 3, wherein the polysaccharide-peptidoglycan complex is derived from a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of claims 1 to 4, wherein the polysaccharide-peptidoglycan complex is derived from Lactobacillus casei and / or Lactobacillus johnsonii.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of claims 1 to 5, wherein the particulate carrier is a nanoparticle.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particles according to any one of claims 1 to 6, wherein the particulate carrier is latex nanoparticles or silica nanoparticles.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of claims 1 to 7, wherein the average particle diameter of the particulate carrier is 20 nm to 3100 nm.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particles according to any one of claims 1 to 8, wherein the average particle diameter of the particulate carrier is 300 nm to 2000 nm.

The polysaccharide-peptidoglycan complex-containing particle according to any one of claims 1 to 9, wherein the binding amount of the polysaccharide-peptidoglycan complex to one particulate carrier is 0.1 to 50 amol.

The pharmaceutical containing the polysaccharide-peptidoglycan complex containing particle | grains in any one of Claims 1-10.

The immunostimulant which uses the polysaccharide-peptidoglycan complex containing particle | grains in any one of Claims 1-10 as an active ingredient.

The interleukin 12 production promoter which uses the polysaccharide-peptidoglycan complex containing particle | grains in any one of Claims 1-10 as an active ingredient.