JP6348218B2 - 涙滴を用いたウイルス感染診断方法及び機器 - Google Patents
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Description
本発明は、基板上に準備された乾燥涙試料のラマンスペクトルを測定して、それから複数のガウスピークを抽出し、特定の２つの波長の強度比を確認することにより、ウイルス感染の有無に関する情報を提供する方法及びこれを利用するウイルス感染診断機器に関する。
現在、感染性疾患の診断に使用される方法は、細胞を採取して培養し、それから得られた遺伝子をＰＣＲ（polymerase chain reaction）により増幅させて確認する複数の段階で構成される方法を利用している。このような方法は、多くの時間と労力を必要とするのに対し、前記感染性疾患は感染性を有する場合が多いため迅速に診断して処置することが重要であり、迅速かつ簡単に感染性疾患を診断する方法が要求される。
感染性眼表面疾患の研究のためにラマン分光法に基づいた涙分析法が最近研究されている。例えば、韓国登録特許第１０−１３３６４７８号（特許文献１）では、ＳＥＲＳ（Surface-enhanced Raman spectroscopy）を用いた涙フィルム中のウイルス粒子の検出を開示している。
しかし、先行技術のラマン分光法に基づいた涙分析法の場合は、全般的なＳＥＲＳスペクトルパターンの差異を分析して試料中のウイルスの有無を診断する、全体のスペクトルパターンを比較することであるため、差異の分析が困難であり、感染の有無を明確に診断する境界が明らかではないという問題がある。
Podstawka, E. et al., Biopolymers, 2006, 83: 193-203
Musumeci, A.W. et al., Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc., 2007, 67: 649-661
本発明は、上述した技術的な背景から導出されたものであり、迅速かつ簡単に感染性疾患を診断するウイルス感染診断方法及び機器を提供することをその課題とする。
本発明の他の課題は、臨床現場で感染性疾患の診断の際に使用することができる独立型（stand-alone）ウイルス感染診断機器、及びそれを用いたウイルス感染診断方法を提供することにある。
本発明の他の課題は、臨床現場で感染性疾患の診断の際に使用することができる独立型（stand-alone）ウイルス感染診断機器、及びそれを用いたウイルス感染診断方法を提供することにある。
本発明のもう一つの課題は、ラマン分光法に基づいた涙分析法において、ウイルス感染の有無を明確に診断することができるウイルス感染診断方法及び機器を提供することにある。
本発明は、基板上に乾燥涙試料を準備する第１段階；前記乾燥涙試料からラマンスペクトルを測定する第２段階；前記測定されたラマンスペクトルを分解してガウスサブピークを抽出する第３段階；下記数式１によりアミドＩＩＩβ−シートに相応するピーク及びＣ−Ｈ変形に相応するピークの相対的な強度の比率に対するログ値を導出する第４段階；及び前記導出された値が正である場合は、正常と判断し、負である場合は、ウイルス感染と判断する第５段階を含む、ウイルス感染の有無に関する情報提供方法を提供する：
また、本発明は、涙滴を加えて乾燥涙試料を提供する検出基材；前記投入された検出基材からラマン信号を測定する信号測定部；前記測定されたラマンピークをガウスサブピークに分離するピーク分解部；前記分離されたガウスサブピークの中、特定の波長で表される２つのピークの相対的な比率のログ値を導出するデータ処理部；及び導出された値を表示するディスプレイ部を含む、ウイルス感染診断機器を提供する。
本発明によると、表面増強ラマン散乱とドロップ−コーティング蒸着法とを融合させたＤＣＤ−ＳＥＲＳ方法を使用して得られたスペクトルから１２００〜１５００ｃｍ−１の範囲の１０個余りの重なって表されるピークを、単一のガウスピークに分離し、そのうち特定の２つのピーク、特に、１３４２ｃｍ−１及び１２４２ｃｍ−１で表されるピークの相対的な強度比を確認してアデノウイルス感染の有無を確認することができる。
本発明のウイルス感染診断方法は、従来のＰＣＲ方法に比べて高速でウイルス感染を診断することができ、臨床現場で感染性疾患を診断する際に使用することができる独立型（stand-alone）診断機器を提供することができる。
本発明は、基板上に乾燥涙試料を準備する第１段階；前記乾燥涙試料からラマンスペクトルを測定する第２段階；前記測定されたラマンスペクトルを分解してガウスサブピークを抽出する第３段階；下記数式１によりアミドＩＩＩβ−シートに相応するピーク及びＣ−Ｈ変形に相応するピークの相対的な強度の比率に対するログ値を導出する第４段階；及び前記導出された値が正である場合は、正常と判断し、負である場合は、ウイルス感染と判断する第５段階を含む、ウイルス感染の有無に関する情報提供方法を提供する。
本発明は、１０個余りのガウスピークが重畳されて表される乾燥涙試料のラマンスペクトルを個別ガウスピークに分離し、特定の２つの波長におけるピーク強度比を確認することにより、ウイルス感染の有無を診断することができることを最初に確認したことに基づく。例えば、アデノウイルス感染により結膜炎が発生した患者の場合、１３４２ｃｍ−１におけるピーク強度に対する１２４２ｃｍ−１におけるピーク強度の相対的な比率のログ値が正から負に転換されることを確認し、前記２つのピークがアデノウイルス感染の診断に有用な変数であることを同定し、これを利用して感染の有無を診断する方法を提示した。
好ましくは、前記第１段階はドロップ−コーティング蒸着法（drop-coating deposition; DCD）により行うことができる。
好ましくは、第２段階は表面増強ラマン散乱測定法により行うことができる。
好ましくは、第２段階は表面増強ラマン散乱測定法により行うことができる。
好ましくは、前記基板は、ナノ粒子がコーティングされた基材を用いることができる。ナノ粒子がコーティングされた基材を利用することにより表面増強ラマン散乱を誘発して測定の敏感度を向上させることができる。一般に、ラマン散乱は選択性は優れるが、吸収または蛍光など他の光学的検出方法に比べて、信号強度が弱いため検出が容易ではないという欠点がある。したがって、これを克服するために敏感度が高い検出器を用いたり、または信号を増強させる方法を必要とする。従って、ナノ粒子がコーティングされた基材を使用すると、ナノ粒子による表面増強効果により発生されるラマン信号が増強される効果を示すため、特別な検出器がなくても測定が可能である。
好ましくは、前記測定は、乾燥涙試料のＣ領域、Ｍ領域またはＴ領域で行うことができる。
本発明の具体的な実施例において、乾燥涙試料の４領域、即ち、Ｃ、Ｍ、Ｔ及びＲ領域でそれぞれラマンスペクトルを測定して分析した結果、Ｃ、Ｍ及びＴ領域では、選択された２つの波長における相対的な信号強度の顕著な変化が観察されたが、Ｒ領域では、その変化量が微々たるものであった（図６）。したがって、Ｃ、ＭまたはＴ領域で測定することにより、より敏感でかつ正確な診断が可能であり得る。
本発明の具体的な実施例において、乾燥涙試料の４領域、即ち、Ｃ、Ｍ、Ｔ及びＲ領域でそれぞれラマンスペクトルを測定して分析した結果、Ｃ、Ｍ及びＴ領域では、選択された２つの波長における相対的な信号強度の顕著な変化が観察されたが、Ｒ領域では、その変化量が微々たるものであった（図６）。したがって、Ｃ、ＭまたはＴ領域で測定することにより、より敏感でかつ正確な診断が可能であり得る。
好ましくは、前記アミドＩＩＩβ−シートに相応するピークは１２４２±１０ｃｍ−１の範囲で、Ｃ−Ｈ変形に相応するピークは１３４２±１０ｃｍ−１の範囲でそれぞれ示されるピークであることができる。
好ましくは、本発明の情報提供方法は、アデノウイルス感染の有無に関する情報を提供することができる。
本発明の具体的な実施例では、アデノウイルス結膜炎が確定された患者及び非感染グループの涙試料を比較した。その結果、非感染グループの試料のラマンスペクトルは、Ｃ−Ｈ変形に相応する１３４２ｃｍ−１のピークに対するアミドＩＩＩβ−シートに相応する１２４２ｃｍ−１のピークの強度比をログ値で表した場合、常に正の値を示した。一方、アデノウイルス結膜炎が確定された患者試料のスペクトルでは、その比率が顕著に減少して、負のログ値を示すことを確認した。即ち、１２００〜１５００ｃｍ−１の範囲の１０個余りの重なって表されるピークを単一のガウスピークに分離して、そのうち特定の２つのピーク、特に、１３４２ｃｍ−１及び１２４２ｃｍ−１で表示されるピークの相対的な強度比を確認してアデノウイルス感染の有無を確認することができることを発見した。
本発明の具体的な実施例では、アデノウイルス結膜炎が確定された患者及び非感染グループの涙試料を比較した。その結果、非感染グループの試料のラマンスペクトルは、Ｃ−Ｈ変形に相応する１３４２ｃｍ−１のピークに対するアミドＩＩＩβ−シートに相応する１２４２ｃｍ−１のピークの強度比をログ値で表した場合、常に正の値を示した。一方、アデノウイルス結膜炎が確定された患者試料のスペクトルでは、その比率が顕著に減少して、負のログ値を示すことを確認した。即ち、１２００〜１５００ｃｍ−１の範囲の１０個余りの重なって表されるピークを単一のガウスピークに分離して、そのうち特定の２つのピーク、特に、１３４２ｃｍ−１及び１２４２ｃｍ−１で表示されるピークの相対的な強度比を確認してアデノウイルス感染の有無を確認することができることを発見した。
また、本発明は、涙滴を加えて乾燥涙試料を提供することができる検出基材；前記投入された検出基材からラマン信号を測定する信号測定部；前記測定されたラマンピークをガウスサブピークに分離するピーク分解部；前記分離されたガウスサブピークのうち、特定の波長で示される２つのピークの相対的な比率のログ値を導出するデータ処理部；及び導出された値を表示するディスプレイ部を含む、ウイルス感染診断機器を提供する。
好ましくは、本発明の診断機器は、前記検出基材を投入する投入部をさらに備えることができる。
好ましくは、本発明の診断機器において、前記信号測定部は、光源及び光子検出器を備え、必要に応じてミラー、レンズ及びフィルタをさらに備えることができる。
好ましくは、本発明の診断機器において、前記信号測定部は、光源及び光子検出器を備え、必要に応じてミラー、レンズ及びフィルタをさらに備えることができる。
［発明を実施するための具体的な内容］
以下、実施例を通じて本発明の構成及び効果をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。
以下、実施例を通じて本発明の構成及び効果をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１：試料の収集及び測定
慶煕大学病院を来院した患者中、患者の同意を得てアデノウイルス結膜炎が確定された患者８人（３６±１４ｙｒ）及び健常者８人（３３±８ｙｒ）を対象に涙試料を採取した。本研究では、慶熙大ＩＲＢ ＫＭＣＩＲＮ１４０１−０２を通過した。
慶煕大学病院を来院した患者中、患者の同意を得てアデノウイルス結膜炎が確定された患者８人（３６±１４ｙｒ）及び健常者８人（３３±８ｙｒ）を対象に涙試料を採取した。本研究では、慶熙大ＩＲＢ ＫＭＣＩＲＮ１４０１−０２を通過した。
涙のコレクションは外部の刺激なしに直径４ｍｍ、長さ１０ｍｍのポリエステル−ファイバーロッド（polyester-fiber rod、Transorb Wick、USA）を用いて、鼻下結膜嚢（nasoinferior conjunctival sac）で５分間実施した。眼から削除したロッドをエッペンドルフチューブに入れ、１５分間８，０００ｒｐｍで遠心分離してロッドを削除した後、パラフィルム（Pechiney、Plastic Packing Company、USA）で封じて−７０℃で２４時間以内で保管した。本発明による測定を実行するまでは２４時間を超えなかった。
前記採取した涙試料からラマンスペクトルを得るために、表面増強ラマン散乱（surface enhanced Raman scattering; SERS）及びドロップ−コーティング蒸着法（drop-coating deposition; DCD）を融合させたＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトル法を使用した。具体的には、５０ｎｍ Ａｕでコーティングされた陽極酸化された酸化アルミニウム（anodized aluminum oxide; AAO）ナノドットアレイ基板（nanodot array substrate）と、市販の２．５ｎｍ Ｔｉ及び５０ｎｍ ＡｕでコーティングされたＡｕ．０５００．ＡＬＳＩ（Platypus technologies、USA）基板を使用した。涙の約２μｌをきれいな基板に落として乾燥させることで、測定するための試料を準備した。２００ｍＷ出力の７８５ｎｍダイオードレーザー源を備えたＳＥＮＴＥＲＲＡ ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ ｓｙｓｔｅｍ（Bruker Optics Inc., USA）を使用した。それ以外に、携帯用ラマンでも測定可能であった。公知となった方法により、４つの領域（中心からそれぞれＣ、Ｍ、Ｔ及びＲ領域）に区分した乾燥された涙にレーザーを照射し、３０秒間の検査を行った。測定されたスペクトルは、４１７〜１７８２ｃｍ−１の範囲を有し、中心スペクトルは１２００ｃｍ−１であった。
実施例２：診断
２．１．診断マーカー１：ＡＣ
下記数式のようにＣ−Ｈ変形（deformation）に相応する１３４２ｃｍ−１波長におけるラマン強度に対するアミドＩＩＩβ−シートに相応する１２４２ｃｍ−１の波長におけるラマン強度の比率に対するログ値をＡＣバイオマーカーとして定義した（下記数式を参照）。感染されていない正常の涙では１２４２ｃｍ−１の波長におけるアミドＩＩＩβ−シートが１３４２ｃｍ−１の波長におけるＣ−Ｈ変形よりも常に大きい値を有するため、ＡＣ診断マーカーは常に正の値を示すのに対し、アデノウイルスに感染された結膜炎患者の場合は１３４２ｃｍ−１のピークの相対的な強度が増加し、ＡＣマーカーが負の値を示した。
２．１．診断マーカー１：ＡＣ
下記数式のようにＣ−Ｈ変形（deformation）に相応する１３４２ｃｍ−１波長におけるラマン強度に対するアミドＩＩＩβ−シートに相応する１２４２ｃｍ−１の波長におけるラマン強度の比率に対するログ値をＡＣバイオマーカーとして定義した（下記数式を参照）。感染されていない正常の涙では１２４２ｃｍ−１の波長におけるアミドＩＩＩβ−シートが１３４２ｃｍ−１の波長におけるＣ−Ｈ変形よりも常に大きい値を有するため、ＡＣ診断マーカーは常に正の値を示すのに対し、アデノウイルスに感染された結膜炎患者の場合は１３４２ｃｍ−１のピークの相対的な強度が増加し、ＡＣマーカーが負の値を示した。
前記式において、Ｉ１２４２及びＩ１３４２は、それぞれ１２４２ｃｍ−１及び１３４２ｃｍ−１の波長におけるラマン強度である。前記計算は、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを用いて行った。
２．２．診断マーカー２：主成分分析（principal component analysis; PCA）アルゴリズム
主成分分析法は、高次元の特徴ベクターを低次元の特徴ベクターに縮小する特徴ベクターの次元縮小だけでなく、データの視覚化及び特徴抽出にも有用に使用されるデータ処理技法の一つである。それぞれ１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１及び１４４８ｃｍ−１で定義された３つのＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルをアデノウイルス感染の有無を検出するための伝達関数の入力として使用した。具体的には、Ｚ−スコア法により一般化された３つのベクターである［１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１］、［１２４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］及び［１３４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］を提案された伝達関数の入力として使用した。主成分分析法の性能を受信動作特性曲線（receiver operating characteristic curve; ROC curve）分析法で評価し、そのためのアルゴリズムは、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアで具現された。
主成分分析法は、高次元の特徴ベクターを低次元の特徴ベクターに縮小する特徴ベクターの次元縮小だけでなく、データの視覚化及び特徴抽出にも有用に使用されるデータ処理技法の一つである。それぞれ１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１及び１４４８ｃｍ−１で定義された３つのＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルをアデノウイルス感染の有無を検出するための伝達関数の入力として使用した。具体的には、Ｚ−スコア法により一般化された３つのベクターである［１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１］、［１２４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］及び［１３４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］を提案された伝達関数の入力として使用した。主成分分析法の性能を受信動作特性曲線（receiver operating characteristic curve; ROC curve）分析法で評価し、そのためのアルゴリズムは、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアで具現された。
２．３．診断マーカー３：複数のガウス特性ピーク（multiple Gaussian peaks; MGPs）分離法
正常とアデノウイルス感染による結膜炎の間の差異を区別するためにＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルから複数の特性ピークを分離する方法を使用した。即ち、単一のガウス関数の離散バージョンは、下記数式で定義することができる：
正常とアデノウイルス感染による結膜炎の間の差異を区別するためにＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルから複数の特性ピークを分離する方法を使用した。即ち、単一のガウス関数の離散バージョンは、下記数式で定義することができる：
前記式において、Ｈｋは、単一のガウス関数の振幅（amplitude）、ｆｋは、単一のガウス関数の最大周波数位置、ｗｋは、単一のガウス関数の半幅（half-width）である。
前記数式を利用して最適化したスペクトルのガウス曲線は、下記数式で示されるガウス関数の和として表現することができる：
前記数式を利用して最適化したスペクトルのガウス曲線は、下記数式で示されるガウス関数の和として表現することができる：
前記式において、ｍは全体ガウス関数の個数である。
１２００〜１５００ｃｍ−１の範囲のＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを前記数式を用いた特性ピークの抽出のための複数のガウスモデルの入力として使用した。測定されたスペクトルから、複数のガウスピーク（multiple Gaussian peaks; MGPs）を抽出するために、前記範囲内で、３０ｃｍ−１の波長間隔を有するようにｍ＝１０、即ち、１０個のガウスピークを選択した。乾燥された涙滴の４つの領域からガウスピークの波長移動（ラマン移動；Raman shift）、振幅（ラマン強度）、半幅及び面積を抽出して評価した。ガウス分解を用いた複数のガウス特性ピークの抽出アルゴリズムも、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを用いて具現した。
１２００〜１５００ｃｍ−１の範囲のＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを前記数式を用いた特性ピークの抽出のための複数のガウスモデルの入力として使用した。測定されたスペクトルから、複数のガウスピーク（multiple Gaussian peaks; MGPs）を抽出するために、前記範囲内で、３０ｃｍ−１の波長間隔を有するようにｍ＝１０、即ち、１０個のガウスピークを選択した。乾燥された涙滴の４つの領域からガウスピークの波長移動（ラマン移動；Raman shift）、振幅（ラマン強度）、半幅及び面積を抽出して評価した。ガウス分解を用いた複数のガウス特性ピークの抽出アルゴリズムも、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを用いて具現した。
平均と標準偏差の基本的な表現を有する統計分析は、２グループ間の平均値の差を比較するために両側スチューデントｔ−テスト（two-tailed Student’s t-test）の方法を使用し、乾燥された涙滴の形態学的ＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルの強度は、一元変量分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。事後検証（post-hoc comparison）には、ＳＮＫ（Student-Newman-Keuls）テストを使用した。ＡＣバイオマーカーの分析学的効率を評価するために敏感度（sensitivity）、特異度（specificity）、正確度（accuracy）、出現率（prevalence）及び誤差率（error rate）のような臨床的分析を使用し、主成分分析バイオマーカーの効率及びそれぞれの変数の最適限界点を評価するためにＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下の面積）のようなＲＯＣ分析法を使用した。ｐの値が０．０５未満の場合を統計的に有意なものと判断した。
＜結果＞
まず、本発明に使用された２つの基板、即ち、５０ｎｍ Ａｕがコーティングされた陽極酸化された酸化アルミニウムナノドットアレイ基板と２．５ｎｍ Ｔｉ及び５０ｎｍ ＡｕでコーティングされたＡｕ．０５００．ＡＬＳＩ基板の表面特性をＡＦＭを利用して観察し、その結果を図１に示した。
まず、本発明に使用された２つの基板、即ち、５０ｎｍ Ａｕがコーティングされた陽極酸化された酸化アルミニウムナノドットアレイ基板と２．５ｎｍ Ｔｉ及び５０ｎｍ ＡｕでコーティングされたＡｕ．０５００．ＡＬＳＩ基板の表面特性をＡＦＭを利用して観察し、その結果を図１に示した。
前記表面特性の分析のためにタッピングモードＡＦＭ装置であるＮＡＮＯＳ Ｎ８ ＮＥＯＳ（Bruker、Germany）を使用し、使用された２種のＳＥＲＳ基板の表面粗度分析の結果、２．５ｎｍ Ｔｉ及び５０ｎｍ ＡｕでコーティングされたＡｕ．０５００．ＡＬＳＩ基板が５０ｎｍ Ａｕでコーティングされた陽極処理された酸化アルミニウムナノドットアレイ基板に比べて１０倍程度減少された表面粗度特性を示すことを確認した。
臨床において洗眼用として使用される平衡塩類溶液（balanced salt solution; BSS）を用いて、前記２種の基板自体のＳＥＲＳ活性を観察した。その結果、図２で示されたように、８３９ｃｍ−１（プロリン環の対称Ｃ‐Ｃ‐Ｃ伸縮振動）、９４５及び９６９ｃｍ−１（酢酸アニオンの対称Ｃ‐Ｃ伸縮振動）、１０６０〜１０７８ｃｍ−１（対称Ｃ‐Ｎ伸縮振動）、１３５６ｃｍ−１（メチルＣＨ３グループの対称曲げ振動）、及び１４３８及び１４６２ｃｍ−１（メチルＣＨ３グループの非対称変形またはメチレンＣＨ２グループの対称変形）の波長帯域で７つの顕著なラマンバンドが存在することが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
前記２種のＳＥＲＳ基板は、類似のスペクトルパターンを示したが、ＡＡＯナノドットアレイ基板で約２倍強い強度を示し、全般的に前記ＡＡＯナノドットアレイ基板が市販されるＡｕ．０５００．ＡＬＳＩ基板に比べて優れたナノ構造及びＤＣＤ−ＳＥＲＳ活性を示した。
様々な条件でデータを収集し、データ間の偏差を減らすためにＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルに前−工程処理を行った。まず、非感染グループ及びアデノウイルス結膜炎確定患者グループから収集した涙試料の代表的なＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを図３に示した。図３で示されたように、それぞれのＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルは、涙試料固有の振動特性を示した。基本信号を除去したＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトル（ｂ）は、基本信号が含まれたスペクトル（ａ）に比べて、より明確なラマンピーク情報を提供した。しかし、ラマン強度の差による基本信号が除去されたＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルでも非感染グループ（図３Ａ）及び結膜炎患者グループ（図３Ｂ）からの信号を定量的に比較することは不可能であった。しかし、正常化されたＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトル場合、初めて定性及び定量的な比較が可能であった。
陰性対照群としてＢＳＳを利用して測定したＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを図４に示した。図４からＢＳＳに対するＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルの場合、以前の２つの試料に対して測定されたスペクトルに比べて低い基本信号を示すことを確認した。実験群と同様に、基本信号と正常化されたＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルは、明確なラマンピーク情報を提供し、上部図面から非感染グループ及びアデノウイルス結膜炎患者グループ試料の定性または定量比較が可能であることを確認した。
すべての実験において、２μｌの涙を使用し、全体乾燥時間は２０分が所要され、それから約４ｍｍ直径の乾燥涙試料を得た。ハードウェア上での具現において、より信頼性の高いＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを得るために、乾燥された涙の各領域によるＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを測定して比較した。図５で示されたように、乾燥涙試料を大きく３つの領域、即ち、Ｒ、Ｍ及びＣ領域に区分し、最外殻に位置したリング部分をさらにＲとＴの２つの領域に細分化して観察した。図５には、各領域のＬＭ（光学顕微鏡；light microscope）写真を示した。
さらに、前記各領域から使用した涙の量に応じたＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルの特性を確認し、その結果を図６に示した。まず、約１μｌの涙滴を使用した場合、Ｃ及びＴの領域ではＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルは非常に低い強度を示したのに対し、Ｒ及びＭの領域では強い強度を示した。ＡＮＯＶＡテスト（ｐ＜０．００１、Ｆ−比＝２３３．３２）及び事後検証（ＳＮＫ ｔｅｓｔ；ｐ＜０．０５）の結果、４つの領域でのＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトル強度は有意な差を示すことを確認した。より増加した量（４μｌ及び８μｌ）の涙を使用した場合でも類似のパターンを示した。即ち、Ｒ領域からＣ領域の方に行くほど信号の強度は線形的に減少した。
前記涙の量による信号強度の変化は、図７で示されたように、蒸発プロセッサキャピラリー流速（evaporation processor capillary flow rate）の変化によるものであることが確認できた。図７は、任意の時間変化に対する粒子の中央からリング部分への移動を有限要素解析技術を用いて解析した結果を示す。
図６をより具体的に比較すると、全般的にＲ領域で高い強度を示すが、前述したように正常化過程を行うと、このような差は除去された。スペクトルにおいて矢印で示した部分は、それぞれ１２４２ｃｍ−１及び１３４２ｃｍ−１に該当するものであり、前記スペクトルは、アデノウイルス結膜炎確定患者から採取した試料に対して測定されたものであるにもかかわらず、Ｒ領域でのスペクトルパターン、特に、前記２つの波長における相対的なピーク強度は、他の領域で示されるパターンとは異なることを確認した。
同一な試料の同一な領域内のそれぞれ異なる１０個の地点で測定したＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを重畳させて図８に示した。ＭＡＴＬＡＢソフトウェアのＣＯＲＲ関数を使用して導出した１０個のＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルの平均ペア線形相関係数（mean pairwise linear correlation coefficient）は、９９．２９±０．０４％を示した。特に、関心領域である１２４２ｃｍ−１及び１３４２ｃｍ−１でのＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルの強度変異（intensity variation）は、それぞれ３４０±２６．４７及び２７５．８８±２０．２で、ＣＶ（coefficients of variation、RSD）は、それぞれ７．７７％及び７．３７％で示された。このような結果は、本発明で提案された試料の製造方法が非常に一貫性のあるＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを提供することを示すことである。提案された方法で準備した試料に対し、１４週後に測定したラマンスペクトルでのピーク移動や強度に有意な差を示していなかった。
図９は、非感染グループ及びアデノウイルス結膜炎患者グループから採取した試料のＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを示したものであり、獲得したスペクトルを比較してラマンピーク別に整理し、各ピークの特性をアサインした。具体的には、６２１ｃｍ−１のピークは５員環の変形と、６４３ｃｍ−１のピークはチミン環の角曲げと、７５８ｃｍ−１のピークはトリプトファン環ブレス（breath）と、８５３ｃｍ−１のピークはチロシン環ブレスと、８７７ｃｍ−１のピークは脂質での対称Ｃ‐Ｃ伸縮と、９３６ｃｍ−１のピークはタンパク質でのＣ‐Ｃ骨格と、１００３ｃｍ−１のピークはフェニルアラニン対称環ブレスと、１０３１ｃｍ−１のピークはフェニルアラニンと、１０９７ｃｍ−１のピークはＯ‐Ｐ‐Ｏ伸縮と、１１２７ｃｍ−１のピークはタンパク質のＣ‐Ｎ及びＣ‐Ｃ伸縮と、１２４２ｃｍ−１のピークはアミドＩＩＩβ−シートと、１２７５ｃｍ−１のピークはアミドＩＩＩα−へリックスと、１３４２ｃｍ−１のピークはタンパク質でのＣ−Ｈ変形と、１４４８ｃｍ−１のピークはＤＮＡ／ＲＮＡ、タンパク質、脂質及び炭水化物でのＣ−Ｈ変形と、１６６０ｃｍ−１のピークはアミドＩα−へリックスと関連があることを確認した。
非感染グループ及びアデノウイルス結膜炎患グループから採取した涙試料に対するログ形態のＡＣバイオマーカーのパフォーマンスを下記表２に、臨床試験の結果（それぞれｎ＝１００）を表３に示した。
提案された４つの領域から測定した２００個のＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルを評価した。まず、非感染グループの涙のＡＣバイオマーカーは、領域に関係なく１００％の敏感度（sensitivity）及び約９７％の正確度（accuracy）を示した。非感染グループは、Ｃ領域で偽陽性（false positive）のスペクトルは観察されなかったが、他の領域では、若干の偽陽性スペクトルが存在した。一方、アデノウイルス結膜炎患グループの場合、偽陽性のスペクトルなしに、すべての領域で１００％の特異性（specificity）を示し、Ｃ領域で１００％、Ｒ領域で６０％の正確度を示した。Ｔ領域での誤差率（error rate）は、Ｒ領域に対する値の半分ぐらいであった。ＡＣバイオマーカーは、Ｃ及びＭ領域では約９９％の高い正確度を、Ｔ及びＲ領域では約７０％の正確度を示した。
また、アデノウイルス結膜炎グループの重症度（severity）によるＡＣバイオマーカーを確認した。アデノウイルス結膜炎重症度によるログ形態のＡＣバイオマーカーのパフォーマンスを表４に、重症度により分離した臨床試験の結果を表５に示した。具体的には、Ｒ領域においてマイルドなアデノウイルス結膜炎グループの場合、２７％の正確度を示したのに対し、重症アデノウイルス結膜炎グループの場合、８６％の正確度を示し、それ以外の領域では、約８０％以上の高い正確度を示して、特に、Ｃ領域では１００％の正確度を示した。このような結果は、最外殻環領域（Ｒ領域）を除いた領域がアデノウイルス感染の有無を診断するための良いラマンスペクトルスクリーニング領域であり、これら領域でのＡＣマーカーは、早期診断のための優れたパラメータであることを示すことである。
また、３つのＰＣロードプロファイル（ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３）を非感染グループの涙、アデノウイルス結膜炎患グループの涙及びこれら２つの差による情報から抽出した。これは、４つの領域で３つのＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルベクター、［１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１］、［１２４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］及び［１３４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］で行い、その結果を図１０に示した。
図１０は、Ｃ領域での非感染グループ及びアデノウイルス結膜炎患グループの３つのＰＣプロファイルのロードプロットを示す。図１０Ａで示されたように、スペクトルベクター［１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１］でＰＣ１対ＰＣ２、ＰＣ１対ＰＣ３、及び［１３４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］でＰＣ１対ＰＣ３の場合、少ない変異を示す一方、［１２４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］でＰＣ１対ＰＣ２のアデノウイルス結膜炎グループのロードプロファイルは広く分布した。このような分布は領域に関係なく、［１２４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］に比べて［１２４２ｃｍ−１、１３４２ｃｍ−１］及び［１３４２ｃｍ−１、１４４８ｃｍ−１］で高いＡＵＣを示すことが分かった（表６）。
即ち、ＰＣＡバイオマーカーはＣ領域で０．９４５３、Ｒ領域で０．８１８２のＡＵＣ値を示し、すべてのＰＣＡのバイオマーカーは、Ｒ領域で９３％以上の高い敏感度と９８％の非感染涙試料の検出能力を示した（表７）。ＰＣＡバイオマーカーの特異性は、Ｃ領域で９５％、Ｍ領域で９１％、Ｔ領域で８６％、Ｒ領域で７６％で示された。このような結果は、Ｒ領域よりはＣ領域での測定がアデノウイルス結膜炎に対する優れた診断機能を有することを示すものである。ＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルにおいてＰＣ１及びＰＣ２のロードプロファイルは、全体の９８％を占めた。受動的に設定した図１０の境界線（separating line；点線）により非感染グループとアデノウイルス結膜炎患グループとの差を区分することができた。このような主成分分析に基づくデータベースの分類システムは、アデノウイルス結膜炎の早期診断に有用に使用することができる。
Ｃ領域及びＲ領域に対して１２００〜１５００ｃｍ−１の波長で測定されたＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトル、及びこれから抽出された各１０個のガウスサブピークを図１１に示した。１０個のガウス関数から再構成した曲線の当てはめられた（curve-fitted）ＤＣＤ−ＳＥＲＳスペクトルは、測定されたスペクトル自体とほとんど一致した。非感染グループの涙（図１１ａ及び図１１ｃ）の場合は、各領域でアミドＩＩＩβ−シートの振動に該当する１２４２ｃｍ−１の波長における強度がＣ−Ｈ変形振動に該当する１３４２ｃｍ−１の波長における強度より、さらに強く示された。一方、アデノウイルス結膜炎患者の涙の場合、Ｃ領域で反対のパターン、即ち、１３４２ｃｍ−１の波長における強度がより強く示されたのに対し、Ｒ領域ではその差がわずかであり、正常と類似のパターンを示した。それぞれの抽出されたガウス関数は、生化学的特性をよく反映して、それぞれのガウス関数から面積、強度、ラマン移動及び半幅の４つの特性パラメータを導出した（表８）。
低周波数から２番目のガウス関数（１２４２ｃｍ−１のアミドＩＩＩβ−シート）、３番目の関数（１２７５ｃｍ−１のアミドＩＩＩα−へリックス）、５番目の関数（１３４２ｃｍ−１のＣ−Ｈ変形）及び１０番目の関数（１４４８ｃｍ−１のＣ−Ｈ変形）の４つのガウス関数を涙試料中のタンパク質の分析のためのピークとして選択した。
選択されたガウス関数からなるＭＧＰバイオマーカーの特性を下記表９にまとめた。非感染グループの涙の場合は、Ｃ領域からＲ領域に進むにつれて、アミドＩＩＩβ−シート及びＣ−Ｈ変形が２倍程度増加したが、アデノウイルス結膜炎患グループの涙の場合、反対のパターンを示した。このような変化は、非感染グループでアミドＩＩＩα−へリックスの有意な減少（ｐ＜０．００１）とアデノウイルス結膜炎患者グループで有意な増加（ｐ＜０．０１）を示したが、１４４８ｃｍ−１でＣ−Ｈ変形は２つの群で有意な差を示してなかった。
最終的に、複数のガウスモデルから分離されたそれぞれのガウス関数は、非感染グループ及びアデノウイルス結膜炎患グループから採取した試料の差を明確に示し、これは、ガウス細分化（segmentation）技術により決定されたＭＧＰマーカーがアデノウイルス感染の有無を定性及び定量的にモニタリングするのに使用することができることを示すことである。したがって、本発明のウイルス感染の検出方法及びシステムは、涙試料を用いてウイルス感染による眼科的疾患を診断するだけでなく、唾液、汗など、他の体液試料を用いたウイルス感染の診断にも活用することができるだろう。
Claims (9)
- 基板上に乾燥涙試料を準備する第１段階；
前記乾燥涙試料からラマンスペクトルを測定する第２段階；
前記測定されたラマンスペクトルを分離してガウスサブピークを抽出する第３段階；
下記数式１によりアミドＩＩＩβ−シートに相応するピーク及びＣ−Ｈ変形に相応するピークの相対的な強度の比率に対するログ値を導出する第４段階；及び
前記導出された値が正である場合は正常であり、負である場合は、ウイルス感染であるという基準と、前記導出された値とを比較する第５段階を含む、ウイルス感染の有無に関する情報提供をするために、乾燥涙試料のラマンスペクトルを測定する方法。
- 前記第１段階が、ドロップ−コーティング蒸着法（drop-coating deposition; DCD）により行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記第２段階が、表面増強ラマン散乱測定法により行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記基板が、ナノ粒子でコーティングされた基材である、請求項１に記載の方法。
- 前記測定が、乾燥涙試料のＣ領域、Ｍ領域またはＴ領域で行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記アミドＩＩＩβ−シートに相応するピークは１２４２±１０ｃｍ−１の範囲で、Ｃ−Ｈ変形に相応するピークは１３４２±１０ｃｍ−１の範囲で、それぞれ表されるピークである、請求項１に記載の方法。
- アデノウイルス感染の有無に関する情報を提供する、請求項６に記載の方法。
- 涙滴を加えて乾燥涙試料を提供することができる検出基材；
前記検出基材を投入する投入部；
前記投入された検出基材からラマン信号を測定する信号測定部；
前記測定されたラマンピークをガウスサブピークに分離するピーク分解部；
前記分離されたガウスサブピークの中、下記数式１によりアミドＩＩＩβ−シートに相応するピーク及びＣ−Ｈ変形に相応するピークの相対的な強度の比率のログ値を導出するデータ処理部；及び
導出された値を表示するディスプレイ部を含む、ウイルス感染診断機器。
- 前記信号測定部は、光源及び光子検出器を備え、ミラー、レンズ及びフィルタをさらに備えたものである、請求項８に記載の診断機器。
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