JP6347850B2 - 薬物を含有したナノ粒子が結合された二重目的ｐａｔ／超音波造影剤およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、薬物を含有したナノ粒子が結合された二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）ＰＡＴ（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）造影剤およびその製造方法に関する。

生物学的なターゲットの正確なイメージングは、生物学的な現象を理解したり様々な疾患の誤りのない診断を行ったりするための重要な手段となっているため、現在の単一イメージング方式（ｓｉｎｇｌｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄａｌｉｔｙ）は好適ではない。よって、多方式イメージングが重要な手段として浮び上がっており、臨床においても標準方法となっている。二重および三重方式を組み合わせることによって、単一イメージング方式の多くの短所が克服できる。例えば、癌の早期診断のために、高敏感度の機能的イメージングをするＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）と明確な解剖情報を提供できるＣＴ（ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を同時に使う技法が提案された。互いに異なる方式のイメージング技術を組み合わせることができ、例えば、ＭＲ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）／光学、およびＰＡＴ／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）の組み合わせが可能である。

超音波映像装置は、リアルタイムで診断が可能であるために迅速な結果を導き出すことができる最も優れた長所を有しており、ＭＲＩ、ＣＴとは異なり、構造が簡単で、且つ、安価である。超音波造影剤を投与した後に超音波を加えれば、超音波が造影剤内の微小気泡によって反射され、内部臓器の映像をより鮮明に見せる。このような超音波造影剤は、１９６８年、ＧｒａｍｉａｋとＳｈａｈが血管内に微小気泡（ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ）を注入した後に超音波信号が増強するのを発見したことに基づいて発展した。今まで知られた造影剤としては、米国特許第４，２７６，８８５号のゼラチン外皮で囲んだ小型気泡、米国特許第４，２６５，２５１号の多糖類の固体の周辺部の壁を有する小型気体、ヨーロッパ特許公報第５２５７５号の固体結晶相化合物の微粒子（例えば、ガラクトース）を用いた小型気泡、ヨーロッパ特許公開第０１２２６２４号の脂肪酸を用いた小型気泡、および大韓民国特許第１９８９−２９８９号の脂肪酸および界面活性剤を用いて製造した小型気泡などがある。

光音響映像技術（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＰＡＴ）は超音波イメージングの高い分解能と光イメージングの高い対照比を結合する方式であって、生体組織のイメージングに好適な映像化技術である。この技術は、拡張性が非常に良いため、胸中の数センチメートルにある腫瘍を映像化するのに用いられることもできる。すなわち、レーザを生体組織に照射すれば、レーザの短い電磁気パルスが、生体組織に吸収されることによって組織内で初期超音波の発生源として作用する組織部位で音響圧力が発生し、このように形成された超音波は、生体組織の表面に到達し、それを映像化するのがＰＡＴ映像である。光音響映像技術は、レーザ光で細胞に刺激を与えて細胞が超音波を放出するようにし、該超音波を検出して３Ｄ映像を作る原理でもある。光学映像法と超音波映像法を結合した光音響映像技術は、非侵襲性、安価、携帯性、優れた明暗対照比および優れた空間分解能を全て備えているため、次世代の高分解能医療映像技術として多くの関心を集めている。現在、この技術は根本的に光を照らして照射する方式であるため、身体の映像化深さに制限があるという点で、今後のさらに多くの発展の可能性がある。しかし、現在の映像化深さによっても他の技術を補完することができるため、多くの活用が期待される。すなわち、上述した光音響映像技術は、ＰＥＴ、ＣＴ、ＭＲまたは超音波などと結合して診断の結果をより正確に導き出すことができるという長所がある。特に超音波診断の場合、光音響映像技術と同様に超音波を用いてイメージを実現するという点で、上述した光音響映像技術と超音波診断を共に利用する場合より正確な診断を可能にすると予想される。上述した光音響映像技術および超音波診断に同時に使用できる造影剤の開発は必須であるといえ、ここで、同一の造影剤の使用によって診断イメージの品質が落ちてはいけない。

一方、医療技術および治療技術の発達に伴い、現在の診断と治療を同時に行うためのセラグノシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）技術の開発が活発に研究されている。このような側面でＰＡＴ、ＣＴ、ＭＲまたは超音波造影剤を担体で薬物を伝達することによって診断と治療を同時に行うことができる造影剤の開発が試みられている。しかし、一般的にＰＡＴ、ＣＴ、ＭＲまたは超音波診断のために用いられる造影剤の構造は、薬物を入れる空間が非常に狭くて十分な薬物を積載するのが難しく、治療の効果を飛躍的に上昇させ難いという問題がある

本発明者らは、超音波診断および光音響映像診断に同時に使用することができ、且つ、ナノメディシンとの結合により診断と治療を同時に行うことができる診断および治療用の造影剤を開発するために研究を進めた。その結果、超音波診断に通常使用するリポソーム形態のマイクロバブルにポルフィリンを含み、前記マイクロバブルに薬物を含有するナノ粒子を結合する場合に超音波診断および光音響映像診断に同時に使用できるとともに、光音響映像の正確度を顕著に増加できるという事実を発見して本発明を完成するに至った。

よって、本発明の目的は、超音波診断および光音響映像診断に同時に使用できる造影剤を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、前記造影剤の製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的および利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲および図面によってさらに明らかになる。

本発明は、超音波診断および光音響映像診断用の造影剤を提供する。

本発明者らは、超音波診断および光音響映像診断に同時に使用することができ、且つ、ナノメディシンとの結合により診断と治療を同時に行うことができる診断および治療用の造影剤を開発するために研究を進めた。その結果、超音波診断に通常使用するリポソーム形態のマイクロバブルにポルフィリンを含み、前記マイクロバブルに薬物を含有するナノ粒子を結合する場合に超音波診断および光音響映像診断に同時に使用できるとともに、光音響映像の正確度を顕著に増加できるという事実を確認した。

本発明の一様態によれば、本発明は、次のものを含む二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）ＰＡＴ（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）造影剤を提供する：（ａ）内部にガスおよびポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を含むマイクロバブル、および（ｂ）前記マイクロバブルの表面に結合された薬物を含有するナノ粒子。

本明細書で用いられる用語「二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）」は、本発明の物質である造影剤が診断および治療に同時に使用できることは勿論、超音波診断および光音響映像診断に同時に使用できることを意味する。

本明細書で用いられる用語「ポルフィリン」は、血色素のヘモグロビン、葉緑素のクロロフィルおよびその関連物質の母核となる物質であって、下記化学式１の化合物またはそれと同一／類似する機能を行う物質を意味する。

本明細書で用いられる用語「癌」とは形質転換された細胞の抑制されない増殖と無秩序な成長結果として引き起こされる複合的な疾患をいい、本発明では固形癌を意味する。固形癌とは、血液癌を除いた、全ての塊からなる癌を意味する。固形癌の種類としては、肝臓癌（Ｈｅｐａｔｏｍａ）、脳腫瘍（Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ）、低悪性度星状細胞腫（Ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、高悪性度星状細胞腫（Ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、下垂体腺腫（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｏｍａ）、髄膜腫（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、乏突起膠腫（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、頭蓋咽頭腫（Ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｉｏｍａ）、上衣細胞腫（Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、脳幹部腫瘍（Ｂｒａｉｎ ｓｔｅｍ ｔｕｍｏｒ）、頭頸部腫瘍（Ｈｅａｄ ＆ Ｎｅｃｋ Ｔｕｍｏｒ）、喉頭癌（Ｌａｒｙｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌（Ｏｒｏｐｇａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、鼻腔／副鼻腔癌（Ｎａｓａｌ ｃａｖｉｔｙ／ＰＮＳ ｔｕｍｏｒ）、鼻咽頭腫瘍（Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｔｕｍｏｒ）、唾液腺腫瘍（Ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒ）、下咽頭癌（Ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、口腔腫瘍（Ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｔｕｍｏｒ）、胸部腫瘍（Ｃｈｅｓｔ Ｔｕｍｏｒ）、小細胞肺癌（Ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胸腺腫（Ｔｈｙｍｏｍａ）、縦隔腫瘍（Ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ ｔｕｍｏｒ）、食道癌（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、男性乳癌（Ｍａｌｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、腹部腫瘍（Ａｂｄｏｍｅｎ−ｐｅｌｖｉｓ Ｔｕｍｏｒ）、胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢癌（Ｇａｌｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、胆道癌（Ｂｉｌｌｉａｒｙ ｔｒａｃｔ ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、小腸癌（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｕｍｏｒ）、大腸癌（Ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｕｍｏｒ）、肛門癌（Ａｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（Ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎癌（Ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（Ｃｅｒｖｉｘ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、子宮肉腫（Ｕｔｅｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）、および皮膚癌（Ｓｋｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の好ましい様態によれば、本発明の前記薬物は、有機系難溶性薬物であってもよい。

前記「有機系」とは分子内炭素を含む物質に対して意味するものとして理解することができ、前記「難溶性」とは薬理学的な活性製剤が水性溶液（例えば、水、生理食塩水、注射可能なデキストロース溶液など）中に溶解されないことを意味する。

前記「難溶性」の意味を溶解度を基準により詳細に説明すれば次の通りである。ＵＳＰ／ＮＦにおいては、一般的に、１グラムの薬物を特定の温度で（例えば、１ｇのアスピリンを３００ｍｌのＨ_２Ｏ、５ｍｌのエタノール中に２５℃で）溶解させるのに必要な溶媒の容積として溶解度を表現する。他の参考文献においては、文献［参照：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ］に提示された、下記表１に与えられたもののような、より主観的な用語を用いて溶解度を記述することができる。

よって、本発明の用語「難溶性」は、水を溶媒として用いる場合、前記表１の下位の４個の溶解度の範疇、すなわち、「不充分な可溶性」、「低い可溶性」、「非常に低い可溶性」および「事実上に不溶性または不溶性」に属する薬理学的な活性製剤を含むことができる。

前記難溶性物質には薬剤学的な活性製剤、診断製剤、栄養製剤などが含まれることができ、薬理学的な活性製剤として難溶性物質は「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ」 ｏｆ Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１２ｔｈ Ｅｄ’ｎ、１９９６）に列挙された化合物が含まれることができる。

本発明の好ましい様態によれば、本発明の前記薬物は、有機系難溶性薬物のうちの抗癌剤であってもよく、例えば、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アムプリゲン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシナート、アサレイ、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ベイカーズアンチフォル、ベータ−２−デオキシチオグアノシン、ビサントレンＨＣＬ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ ７７３Ｕ８２、ＢＷ ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキノキサリン−スルフォナミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウムパヴム、ＣＰＴ−１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロフォスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレアート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、デアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジコン、ジブロモダルシトール、ジデムニンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エキノマイシン、エダトレキセート、エデルホシン、エフロミチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エタニダゾール、エチオホス、エトポシド、ファドラゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、酢酸フラボン、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５−フルオロウラシル、Ｆｌｕｏｓｏｌ（登録商標）、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ホモハリントニン、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロジウレア、イダルビシンＨＣｌ、イフォスファミド、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファおよびベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、４−イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミソール、リポソーマルダウノルビシン、リポソーム封入ドキソルビシン、ロマスチン、ロニダミン、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６−メルカプトプリン、メスナ、カルメットゲラン桿菌メタノール抽出残渣、メソトレキセート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシン−Ｃ、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、単球／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルジノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジン注射剤、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、塩酸トリフルオペラジン、トリフルリジン、トリメトレキセート、腫瘍壊死因子、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ ８６４、ゾルビシン、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

本発明の好ましい様態によれば、本発明の前記ナノ粒子はアルブミンを含み、自己会合体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を形成することができる。

前記ナノ粒子としては凝集性のあるタンパク質を用いることができ、好ましくは、血液内で長期間循環しつつも凝集構造が維持されて薬物を安定的に伝達することができ、癌標的性のある公知されたアルブミンを用いることができる。

本明細書で用いられる用語「自己会合体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）」は、外部の力によって会合されず、物質が含んでいる固有の分子間の引力または斥力によって会合体を形成する物質を意味する。

本発明の好ましい態様によれば、本発明において、ナノ粒子のサイズは重要である。なぜなら、癌組織によって形成された粗い血管組織を通して数十〜数百ナノメートル大きさのナノ粒子が癌組織の周囲に蓄積し、また、癌組織周辺の自らの役割をすることのできないリンパ管により浸透したナノ伝達体は排出されず、長期間癌組織に滞留することができ、このような現象はＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果といわれ、一般的に直径２００ｎｍ未満の粒子が最も良い効率を示すためである。

よって、本発明のナノ粒子のサイズは、好ましくは１０−５００ｎｍであってもよく、より好ましくは５０−４００ｎｍであってもよく、最も好ましくは１００−３００ｎｍであってもよい。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の前記ナノ粒子はリンカーまたはマイクロバブル表面の活性化した官能基によって前記マイクロバブルに結合されることができる。前記官能基としてはチオール基（ｔｈｉｏｌ）、アミン基（ａｍｉｎｅ）であり、リンカーとしては前記官能基を含む化合物であってもよい。

より具体的には、前記マイクロバブルと前記ナノ粒子はこれらの間にアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）することができる。前記結合は、マイクロバブル中のカルボキシル基と前記アルブミンに複数含まれたアミン基との間で発生するアミド結合として形成されることができる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の前記マイクロバブルは、好ましくは、ガス充填されたマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ガス充填されたリポソームまたはガスフォーミングエマルション（ｇａｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）であってもよく、最も好ましくは、ガス充填されたリポソームであってもよい。

前記リポソームは、リン脂質を含む両親媒性化合物によって形成される。このような両親媒性化合物は、典型的な水性媒質と本質的な水不溶性の有機溶媒との間の界面に配列され、乳化された溶媒の微小滴を安定化する。前記両親媒性化合物は、水性媒質と反応できる親水性極の頭部（例えば、極性またはイオン性基）、および、例えば有機溶媒と反応できる疏水性の有機の尾部（例えば、炭化水素鎖）を有した分子を備えた化合物を含む。両親媒性化合物は、非混和性である２種類の液体（例えば、水とオイル）の混合物、液体と気体の混合物（例えば、水中に気体マイクロバブル）または液体と不溶性粒子の混合物（例えば、水中に金属ナノ粒子）のように、他の方法では通常混合できない物質の混合物を安定化させる化合物である。特に、本発明においては、リン脂質薄膜に非活性気体と水を注入した後に超音波処理して内部に非活性気体が充填されたリポソームを形成する。

両親媒性リン脂質化合物は、少なくとも１つのリン酸塩グループを含有し、少なくとも１つの、好ましくは、２つの親油性の長鎖の炭化水素基を含有する。

前記両親媒性リン脂質としては公知された化合物を用いることができ、その例としては、ジフィタノイルホスファチジルコリン（Ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＰＰＣ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＨＰＣ（１，２−ｄｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＨＰＥ（１，２−ｄｉｈｅｘａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＭＰＣ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＩＯＤＰＣ（１，２−ＤｉＯＤｏｄｅｃｙｌ−ｓｎ−Ｇｌｙｃｅｒｏ−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＭＰＳ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、ＤＬＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｄｉｌａｕｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＭＰＥ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＭＰＧ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−［ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−（１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）］）、ＬｙｓｏＰＣ（１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｌｙｓｏ ＰＥ（１−ｏｌｅｏｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＤＰＣ（１，２−ｄｉｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＥＰＡ−ＮＡ（１，２−ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＥＰＣ（１，２−ｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＥＰＥ（１，２−ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＬＯＰＣ（１，２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＬＰＡ−ＮＡ（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＬＰＥ（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＬＰＳ−ＮＡ（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＭＰＡ−ＮＡ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＭＰＳ−ＮＡ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＯＰＡ−ＮＡ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＯＰＣ（１，２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＯＰＳ−ＮＡ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＰＰＡ−ＮＡ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＰＰＥ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＰＰＳ−ＮＡ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＳＰＡ−ＮＡ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））、ＤＳＰＣ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＳＰＥ（１，２−ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＭＳＰＣ（１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＰＭＰＣ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、２−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＰＯＰＥ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＳＰＣ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＳＭＰＣ（１−ｓｔｅａｒｏｙｌ、２−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＳＯＰＣ（１−ｓｔｅａｒｏｙｌ，２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）およびＳＰＰＣ（１−ｓｔｅａｒｏｙｌ、２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）を含むことができる。

また、前記両親媒性リン脂質化合物は、変形されたリン脂質化合物を用いることができる。変形されたリン脂質の例としては、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が添加された変形されたリン脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共に変形されたホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）またはホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）などが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いられる両親媒性リン脂質化合物は、アミド結合を形成するためのＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を含むことができる。

本発明においては前記両親媒性化合物の他に付加的な両親媒性物質をさらに含むことができ、その例としては、リソリピッド、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアレート、ポリオキシエチレン脂肪アルコールなどが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の前記リポソームの内部に充填されるガスは公知の気体を制限されることなく用いることができ、その例としては、二酸化炭素、ヘリウム、窒素、アルゴン、六フッ化硫黄、ペルフルオロ化気体を用いることができる。前記気体はフッ素ガスが含まれたフッ化物が好ましく、その例としては、ペルフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）、六フッ化硫黄（ＳＦ６）、ペルフルオロペンタン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｅｎｔａｎｅ）、デカフルオロブタン（ｄｅｃａｆｌｕｏｒｏｂｕｔａｎｅ）およびペルフルオロヘキサン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｈｅｘａｎｅ）が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の前記マイクロバブルは直径が好ましくは０．１−２０μｍであってもよく、最も好ましくは１−１０μｍであってもよい。

本発明の造影剤は、非経口で投与することができ、非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔内投与、経皮投与などによって投与することができる。

本発明の造影剤の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病状、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。一方、本発明の造影剤の投与量は、好ましくは０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよい。

本発明のまた他の態様によれば、本発明は、次のステップを含む二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）ＰＡＴ（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）造影剤の製造方法を提供する：（ａ）ポルフィリンを含むマイクロバブルと薬物を含有するナノ粒子を各々製造するステップ、および（ｂ）前記ナノ粒子と前記マイクロバブルを所定比率で水に混合して反応させるステップ。

前記マイクロバブルを製造する方法は、乳化剤、ポルフィリン−脂質、脂質、ＮＨＳを備える脂質を有機溶媒と混合して脂質薄膜を形成するステップ、前記脂質薄膜を水に入れて水和させ、それにガスを注入および高圧に維持しつつ超音波処理するステップを含むことができる。

前記脂質薄膜を形成するステップは、乳化剤：ポルフィリン−脂質：脂質：ＮＨＳを備える脂質のモル比を５−１０：１５−３０：６０−７５：１５−３０の範囲で混合することができる。

前記脂質薄膜を水に入れて水和させ、ガスを充電する方法は公知の方法を使用することができ、例えば、脂質薄膜が入っている容器に水、グリコール、グリセリン混合液を入れて５５−６０℃の温度を維持しつつ溶かし、それにガスを２００ｋＰａで入れて超音波処理することができ、または超音波とｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｇｉｔａｔｉｏｎ方法を併用して使用することができる。

薬物を含有するナノ粒子を製造するステップは、アルブミンを水に溶かした後、それに薬物を注入して混合物を製造するステップ、および前記混合物のｐＨを７−１０、好ましくはｐＨ８．０−８．５に調節した後にアルコール類を滴下するステップを含み、前記ステップによって前記アルブミンが自己会合体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を形成することができる。

本発明の特徴および利点を要約すれば次の通りである。

本発明は、次のものを含む二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）ＰＡＴ（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）造影剤を提供する：（ａ）内部にガスおよびポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を含むマイクロバブル、および（ｂ）前記マイクロバブルの表面に結合された薬物を含有するナノ粒子。

本発明の造影剤は、超音波診断および光音響映像診断に同時に使用できるとともに、光音響映像の正確度を顕著に増加できるという長所がある。

抗癌剤（パクリタキセル：ＰＴＸ）を含有するｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎナノ粒子（ＰＴＸ−ＮＰｓ）がｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ）に結合されたことを意味するデータを示す。 ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓの結合有無をＵＶ−ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙで分析した結果を示す。 本発明で開発されたｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓとｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓのｕｌｔｒａｓｏｕｎｄおよびｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像を検証した結果を示す。 下図はｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃの信号がｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅと比較してｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓにおいて信号が増幅されたというデータを示す。 本実験は、ａｃｏｕｓｔｉｃ信号を検出する時に用いられるトランスデューサの周波数帯域に応じて信号が検出される強さを分析した実験結果を示す。 製作されたａｇｅｎｔをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における浸透効果を分析したデータを示す。 細胞における坑癌効果を時間に応じて分析したデータを示す。 疾病動物モデルにおいて癌組織をｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像をしたデータを示す。

以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従い、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかである。

本明細書の全体において、特定物質の濃度を示すために用いられる「％」は、別途の言及がない場合、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。

＜製造例＞
製造例１：ポルフィリンを含有する脂質の製造
ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅのｓｕｂｕｎｉｔであるｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｌｉｐｉｄｓｍｓ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅとｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅのａｃｙｌａｔｉｏｎ反応により製造された。先ず、１００ｎｍｏｌの１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、５０ｎｍｏｌのｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ、５０ｎｍｏｌの１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、２５ｎｍｏｌの４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ、５０μＬのＮ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを１０ｍＬのａｎｈｙｄｒｏｕｓ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅに溶かした後、常温で遮光した状態で、アルゴン環境で４８時間反応させた。その後、全てのｓｏｌｖｅｎｔを蒸発させ、残った残余物をｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（２０×２０ｃｍ ｐｒｅ−ｃｏａｔｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ、１．５ｍｍ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）で精製し、この時、ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙのｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（Ｒｆ）が０．４を主要バンドにして抽出することによって精製した。精製方法は、ｄｉｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｌｉｃａを用いてクロマトグラフィをした後、２％と５％のメタノールが含まれたジクロロメタンで不純物を除去し、８％のメタノールが含まれたジクロロメタンで精製した。精製されたｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｒｏｂｉｄｅ−ｌｉｐｉｄは１μｍｏｌの濃度で分取し、窒素ガスを流すことによってドライさせ、アルゴン環境で−２０℃で保管した。抽出されたｐｏｒｐｙｒｉｎ−ｌｉｐｉｄ純度はｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙとｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（条件：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ｃｏｌｕｍｎ、０．４ｍＬ／ｍｉｎ ｆｌｏｗ ｆｒｏｍ ２５％ ｔｏ ９５％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｈｏｌｄ ０．１％ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｌｕｔｅｄ ａｔ ３２ｍｉｎ、ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｍａｓｓ：１０１３．１）で分析した。

製造例２：ポルフィリンを含むマイクロバブルの製造
脂質としては１，２−ｄｉｓｔｅｒａｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＳＰＣ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）］２０００−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ポルフィリンを含有する脂質（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ｌｉｐｉｄ）、乳化剤としてはＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ４０ ｓｔｅａｒａｔｅ（ＰＯＥ４０ｓ）を５０：１５：１５：１のｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏで混合してクロロホルムに溶かした後、ロータリーエバポレータを用いてクロロホルムを完全に蒸発させて脂質薄膜を形成した。その次に、蒸留水、プロピレングリコール、グリセリンを８：１：１で混合した後、それを脂質薄膜に添加した。温度を５５−６０℃に維持しつつ脂質を溶かした。ＳＦ６またはＣ３Ｆ８ガスを混合液が入った容器に入れて２００ｋＰａで充填した後、ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎおよびｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｇｉｔａｔｉｏｎによってマイクロバブル（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ）を製作した。

製造例３：ナノ粒子の製造（ＨＳＡ−ＮＰｓ）
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ）−４０ｍｇを１ｍＬの蒸留水に溶かした後、パクリタキセル（５ｍｇ／ｍＬ）−１００−２００μＬをＨＳＡが溶けられたバイアルに混合した。ＫＯＨまたはＮａＯＨを用いて混合液のｐＨを８．０−８．５に滴定した後、エタノール３−６ｍＬを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で前記混合液に滴定した。ＨＳＡが凝集して混合液が混濁する時、架橋剤の８％−グルタルアルデヒドを入れて反応させた。その次に、エタノールを完全に蒸発させた後、残った溶液を１２０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎの条件で遠心分離させた。沈んだｐｅｌｌｅｔを除いた残りのａｌｉｑｕｏｔを除去し、また、粒子化されていないＨＳＡおよびパクリタキセルを除去した後に蒸留水で洗浄した。３０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎの条件で遠心分離してマイクロレベルの大きさの粒子を除去して、１００−２００ｎｍ大きさのパクリタキセルが積載されたＨＳＡナノ粒子（ＨＳＡ−ＮＰｓ）を抽出した。

製造例４：マイクロバブルとナノ粒子の結合
ＨＳＡナノ粒子とポルフィリンを含むマイクロバブルを１：０．５−２の結合官能基のモル比で常温で２時間混合してアミド結合でナノ粒子をマイクロバブルに結合した。結合されていないＨＳＡナノ粒子は遠心分離で除去し、実施例１の造影剤（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓ）を完成した。参考に、マイクロバブルの製作過程中に失われたＮＨＳを補充させるために、事前にＥＤＣとＮＨＳを十分に追加して反応させ、遠心分離機で残余ＥＤＣ、ＮＨＳを洗浄すれば、さらに結合効率を高めることができる。

比較例１
前記製造例の方法により製造したポルフィリンを含むマイクロバブル（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ）を比較例１として用いた（ナノ粒子がマイクロバブルに結合されていない）。

＜実験例＞
＜実験方法＞
実験方法１：超音波の撮影
超音波映像は、製作された０．５ｍｇ／ｍＬのｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓを１／５０倍希釈させ、アガロースゲルで製作したｐｈａｎｔｏｍに入れた後、２−５ＭＨｚのトランスデューサを用いて商用化された超音波診断機器で映像を得た。この時に用いられた診断モードはｈａｒｍｏｎｉｃ ｍｏｄｅであって、超音波造影剤からの成分を検出し、放出された超音波の強さは０．１メカニカルインデックスのモードである。

実験方法２：Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像の撮影
Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像は、超音波映像実験と同一の濃度のｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓをチューブに入れ、７００ｎｍの波長のレーザを照射することによってデータを取得した後、ｍａｔｌａｂプログラムを用いて映像を復元した。

実験方法３：細胞における坑癌効果の分析方法
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞を約２００００個ｓｅｅｄｉｎｇした後、パクリタキセルを基準に同一量の４００ｎＭを添加した後、超音波を造影したグループとそうでないグループに分け、各々、何の処理もしていないｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＴＸ−ＮＰｓが結合していないｆｒｅｅ−ＭＢｓ、４００ｎＭのＰＴＸが含まれたナノ粒子（ＰＴＸ−ＮＰｓ）、４００ｎＭのＰＴＸが含まれたＰＴＸ−ＮＰｓが結合されているナノ粒子を用いて、各々に対して時間に応じた細胞死滅効果を検証した。細胞死滅程度はＭＴＴ ａｓｓａｙを用いて定量的に分析した。

実験方法４：癌細胞における浸透効果の分析方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をｘｅｎｏｇｒａｆｔしたＢａｌｂ／Ｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅを用いて前記ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像実験と同一の条件で行った。先ず、ｉｎｊｅｃｔｉｏｎする前のｔｕｍｏｒを映像にし、それにｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓをｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎによって０．５ｍｇ／ｍＬのｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓを２００μＬ注入した後に映像を取得した。

実験例１：マイクロバブルとナノ粒子の結合状態の確認
図１は、抗癌剤（パクリタキセル：ＰＴＸ）を含有しているｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎナノ粒子（ＰＴＸ−ＮＰｓ）がｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ）に結合されたことを意味するデータである。図１を参照すれば、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓにＰＴＸ−ＮＰｓが結合される以前と以後の大きさ変化を示すデータであり、１．１±１．２μｍの大きさ分布を示すｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓに１９０．１±５２．６ｎｍの大きさを示すＰＴＸ−ＮＰｓが結合された結果、１．６±２．５μｍの大きさ分布を示し、ピークが移動することを見ることができる。図２は、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓの結合有無をＵＶ−ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙで分析した結果であり、左側のデータは、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓとｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓを測定したものである。Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓの場合は、７００ｎｍの波長を示すｐｏｒｐｈｙｒｉｎのピークだけが検出されたが、ＰＴＸ−ＮＰｓが結合された場合は、２２７ｎｍの波長のＰＴＸ−ＮＰｓが共に検出され、治療のための抗癌剤が含まれたナノ粒子（ＰＴＸ−ＮＰｓ）が結合されていることが分かる。図２の右側のデータは、抗癌剤（パクリタキセル）のナノ粒子の内部に積載有無を検証したデータであり、ｐｕｒｅなパクリタキセルのｕｖ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ（２２７ｎｍ）がＰＴＸ−ＮＰｓから検出され、ナノ粒子への積載が効果的に行われたことが分かる。

実験例２：超音波およびＰＡＴ映像の検証
図３は、本発明で開発されたｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−ＭＢｓ−ＮＰｓとｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓのｕｌｔｒａｓｏｕｎｄおよびｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像を検証した結果であり、ＰＴＸ−ＮＰｓが結合によって映像の効果が減少しないことを発見した。図３の左側のｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ映像は、アガロースで製作されたｐｈａｎｔｏｍに１／５０倍（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｓｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓ ａｎｄ ｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅ：１０μｇ／ｍＬ）に希釈されたそれぞれのａｇｅｎｔを２−５ＭＨｚのトランスデューサを用いて、映像を商用化された超音波診断機器を用いてｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ映像を検出し、この時に用いられた診断モードはｈａｒｍｏｎｉｃ ｍｏｄｅであり、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓから出るｈａｒｍｏｎｉｃ成分を検出した結果である。図３の右側のｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像は、ｔｕｂｅに１／５０倍（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｓｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓ ａｎｄ ｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅ：１０μｇ／ｍＬ）に希釈されたそれぞれのａｇｅｎｔを注入した後、７００ｎｍのレーザを用いて映像を検出した。ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄとｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像に、対照群としてｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を用いて、ａｇｅｎｔなしでは映像が検出されないことを確認した。

実験例３：ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ信号の増幅状態の確認
図４は、ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃの信号がｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅと比較してｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓにおいて信号が増幅されたというデータである。各々、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００倍（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：０．５ｍｇ／ｍＬ）に希釈して映像を検出した時にｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓの信号がマイクロバブルの形態になることによって増加したことを示し、１／５０倍に希釈した時の映像において明確なｉｎｔｅｎｓｉｔｙの差が現れる。前記実験方法２のＰｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像を撮影する時と同様な方法により映像を取得した後、ｍａｔｌａｂプログラムを用いて映像のｉｎｔｅｎｓｉｔｙを検出した。

実験例４：周波数帯域に応じた信号強さの分析
図５は、ａｃｏｕｓｔｉｃ信号を検出する時に用いられるトランスデューサの周波数帯域に応じて信号が検出される強さを分析した実験であり、左側のグラフは、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓとｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅを比較したデータである。低い周波数においてｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓの信号のｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、ｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅの信号と比較した時に５−１２Ｍｈｚのトランスデューサでは約１００倍増加し、２−５ＭＨｚのトランスデューサでは約６０倍増加した。本実験は、前記実験方法２のｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像実験と同様に１／５０倍に希釈されたｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅ、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓおよびｆｒｅｅＭＢｓ（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎが含まれていないｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ）を用いてそれぞれの周波数帯域を有するトランスデューサを用いて信号を検出した。得られた信号をｍａｔｌａｂ ｐｒｏｇｒａｍを用いてそれぞれの得られたｉｎｔｅｎｓｉｔｙを検証した。

実験例５：造影剤の細胞浸透効果の分析
図６は、製作されたａｇｅｎｔをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における浸透効果を分析したデータであり、ＰＴＸ−ＮＰｓにはＦＩＴＣが結合されたｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎを用いて粒子を製造してｇｒｅｅｎ ｃｏｌｏｒの蛍光を検出し、ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅには親油性蛍光物質であるＤｉＩ−ｃ１８（ｒｅｄ）を積載して蛍光を検出した。ここで、ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄを造影したグループと比較してｕｌｔｒａｓｏｕｎｄを加えることによって、ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄとｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅの共鳴に応じたｃａｖｉｔａｔｉｏｎ効果により細胞内への浸透効果が増加した。細胞イメージ撮影はｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いてイメージ化した。

実験例６：坑癌効果の分析
図７は、細胞における坑癌効果を時間に応じて分析したデータであり、何の処理もしていないｃｏｎｔｒｏｌを対照群に、ｆｒｅｅ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ、ＰＴＸ−ＮＰｓ、ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓ（ＰＴＸ−ＮＰｓ−ＭＢｓ）をｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ（ＵＳ）を造影したグループと造影していないグループにして進行をした。７２時間後、ＰＴＸが含まれたグループであるＰＴＸ−ＮＰｓとＰＴＸ−ＮＰｓ−ＭＢｓは６０％以上の坑癌効果を示し、特にＵＳを造影したグループ（ＵＳ＋）はｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅが含まれたＰＴＸ−ＮＰｓ−ＭＢｓグループにおいてｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅとｕｌｔｒａｓｏｕｎｄとのｃａｖｉｔａｔｉｏｎ効果によって坑癌効果が増加したことを示した（前記実験方法３参照）。

本実験の結果は下記の通りである。
（６ｈ：ｃｏｎｔｒｏｌ；１００．００±１１．１１％、９７．１５±１２．４３％（ＵＳ＋）、ｆｒｅｅ−ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ；１０９．４０±１２．２８％、９４．６４±１５．１１％（ＵＳ＋）、ＰＴＸ−ＮＰｓ；９８．５１±９．６９％、９３．３１±７．１６％（ＵＳ＋）、ＰＴＸ−ＮＰｓ−ＭＢｓ；９６．９０±８．９３％、９２．３２±７．１６％（ＵＳ＋）

２４ｈ ｃｏｎｔｒｏｌ；１００±９．９９％、９７．８１±１０．０８％（ＵＳ＋）、ｆｒｅｅ−ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ；１１６．５１±１９．８２％、１０１．８０±３．５６（ＵＳ＋）、ＰＴＸ−ＮＰｓ；８５．０４±８．６０％、８３．８０±６．８３％（ＵＳ＋）、ＰＴＸ−ＮＰｓ−ＭＢｓ；８０．９９±２．３５％、７５．７０±１．６４％（ＵＳ＋）、

７２ｈ：ｃｏｎｔｒｏｌ；１００．００±１６．６６％、８０．７０±２．７５％（ＵＳ＋）、ｆｒｅｅ−ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ；６２．８９±３．１２％、９２．１０±６．０４％（ＵＳ＋）、ＰＴＸ−ＮＰｓ；３８．２７±７．８６％、３４．５７±２．９６％（ＵＳ＋）、ＰＴＸ−ＮＰｓ−ＭＢｓ；４１．４２±１２．２４％、２６．６９±０．６９％（ＵＳ＋）

実験例７：癌細胞における浸透効果の分析
図８は、疾病動物モデルにおいて癌組織をｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ映像をしたデータを示す。注入する以前と以後のｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＭＢｓ−ＮＰｓが血管に沿って循環することにより、血管においてｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙが増加することを確認した。

Claims (14)

1. 次のものを含む癌の診断及び治療を同時に目的とする二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）ＰＡＴ（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）造影剤：
   （ａ）内部にガスおよびポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を含むマイクロバブル、および
   （ｂ）前記マイクロバブルの表面に結合された抗癌剤を含有する直径１０〜５００ｎｍのナノ粒子であって、アルブミンを含み、自己会合体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を形成するナノ粒子。
2. 前記ナノ粒子は直径が１００−３００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
3. 前記アルブミンはヒト血清アルブミンまたはその断片であることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
4. 前記薬物は、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、アナステロゾール（Ａｎａｓｔｅｒｏｚｏｌｅ）、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ロイプロリド（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フルタミド（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ベロテカン（Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）系、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、メクロレタミン（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、プレドニゾン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、およびコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
5. 前記マイクロバブルはポルフィリンを含み、ガス充填されたマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ガス充填されたリポソームまたはガスフォーミングエマルション（ｇａｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
6. 前記ナノ粒子は、チオール基（ｔｈｉｏｌ）、アミン基（ａｍｉｎｅ）ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）−アビジン（ａｖｉｄｉｎ）によってマイクロバブルに結合されることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
7. 前記マイクロバブルと前記ナノ粒子の結合はナノ粒子と前記マイクロバブル表面におけるアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）であることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
8. 前記マイクロバブルの直径は０．１−１０μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の造影剤。
9. 次のステップを含む癌の診断及び治療を同時に目的とする二重目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）ＰＡＴ（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）／超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）造影剤の製造方法：
   （ａ）ポルフィリンを含むマイクロバブルと、抗癌剤を含有する直径１０〜５００ｎｍのナノ粒子であって、アルブミンを含み、自己会合体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を形成するナノ粒子とを各々製造するステップ、および
   （ｂ）前記ナノ粒子と前記マイクロバブルを所定の比率で水に混合して反応させるステップ。
10. 前記マイクロバブルを製造するステップは、乳化剤、ポルフィリン−脂質、脂質、ＮＨＳを備える脂質を有機溶媒と混合して脂質薄膜を形成するステップ、および
    前記脂質薄膜を水に入れて水和させ、それにガスを注入および高圧に維持しつつ超音波処理するステップ
    を含むことを特徴とする、請求項９に記載の造影剤の製造方法。
11. 前記脂質薄膜を形成するステップは、乳化剤：ポルフィリン−脂質：脂質：ＮＨＳを備える脂質のモル比を５−１０：１５−３０：６０−７５：１５−３０の範囲で添加することを特徴とする、請求項１０に記載の造影剤の製造方法。
12. 前記薬物を含有するナノ粒子を製造するステップは、
    アルブミンを水に溶かした後、それに薬物を注入して混合物を製造するステップ、および
    前記混合物のｐＨを７−９に調節した後にアルコール類を滴下するステップ
    を含み、
    前記ステップによって前記アルブミンが自己会合体（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を形成することを特徴とする、請求項９に記載の造影剤の製造方法。
13. 前記反応ステップは、前記マイクロバブル表面に存在するＮＨＳが水に加水分解され、マイクロバブル表面に残存するカルボキシル基と前記ナノ粒子に存在するアミン基がアミド結合するステップであることを特徴とする、請求項９に記載の造影剤の製造方法。
14. 前記ナノ粒子と前記マイクロバブルの混合比率は１：０．５−２の結合官能基のモル比であることを特徴とする、請求項９に記載の造影剤の製造方法。

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