CN103930137A - 卟啉-磷脂结合物微泡及其作为造影剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含卟啉-磷脂结合物单层的微泡，所述微泡封装在其中，并且涉及所述微泡在受试者目标区域的超声成像的用途。

Description

卟啉-磷脂结合物微泡及其作为造影剂的用途
技术领域
本发明涉及微泡领域，并且更具体地，涉及由结合至磷脂侧链的卟啉形成的微泡。
背景技术
微泡是充气微球体，其为超声成像提供声学造影剂(acousticcontrast)。目前，微泡通常用于临床用于采用超声心动图进行心脏诊断[1]以及用于诊断癌症和引导治疗[2]，[3]。超声是最经济实惠和方便成像的模式之一，因此任何新的能够使用的超声造影技术对于对现有临床基础设施具有迅速而广泛影响的潜力。微泡研究领域不断拓展，超出了诊断应用。临床前期研究正在使用靶向微泡进行分子成像以评价病理学[4]，以及进行超声触发药物和基因递送[5]，[6]用于治疗各种疾病和通过血脑屏障[7]，[8]。
临床上使用的微泡通常是由结合到自组装磷脂壳中的氟化气体形成。这样，荧光团能够很容易结合到微泡外壳中以证实所述微泡与所述目标区域结合[9]或用于证明当用超声破裂时所述微泡破碎[10]。然而，这些分子的存在对微泡壳稳定性的影响还没有得到广泛研究并且相对于所述外壳其余部分荧光团的总分数依然最小。此前，我们介绍了用于形成完全由卟啉结合的磷脂形成的磷脂双层样结构的新范例[11]。由于较高的卟啉特性，这些结构展示出独特的物理特性，以及适合于荧光、光声、MR和PET的强劲的内在多模成像性能。
发明内容
在一个方面，提供了包含其中封装气体的单层的微泡，所述单层包含卟啉-磷脂结合物，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
在另一方面，提供了制备微泡的方法，包括将气体，卟啉-磷脂结合物和其他磷脂混合，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
在另一方面，提供了在受试者的目标区域上进行超声成像的方法，包括提供本文中所述的微泡；将所述微泡给予所述受试者；和采用超声对所述目标区域进行成像。
在另一方面，提供了对受试者的目标区域进行成像的方法，包括：提供本文所述的微泡；将所述微泡给予所述受试者；和在目标区域测定和/或检测光声信号。优选地，所述方法进一步包括在测定和/或检测光声信号增加之前在所述目标区域破裂所述微泡。
在另一方面，提供了本文所描述的微泡用于进行成像的用途。
在另一方面，提供了本文所述的微泡用于进行成像。
附图说明
可以通过参照下面的描述和附图来更好地理解本发明的实施方式。在附图中：
图1显示了卟啉-外壳(“porshe”)微泡能够很容易形成。A)卟啉-脂质(顶部)和由它们封装气体形成的porshe微泡(底部)的示意图。B)用15mol％卟啉-脂质(焦脱镁叶绿酸-脂质)形成的微泡的图像。C)使用标准微泡方法直接一锅法合成以产生porshe微泡。
图2显示了结合卟啉-脂质改善了使用DSPC，PEG40S和0.01M PBS缓冲液形成微泡的产率。微泡的数目，作为所述制剂中包含的卟啉-脂质量的函数进行计数。微泡由三种常用的氟化气体形成：全氟丙烷(PFP)、全氟丁烷(PFB)和六氟化硫(SF6)。包含5％～15％的卟啉-脂质，对于磷脂、表面活性剂和缓冲液的这种特定混合物会导致最佳微泡形成。
图3显示了所述porshe微泡在血清中具有改善的稳定性。微泡采用或不采用15mol％卟啉-脂质形成并且在37℃下在牛血清中孵育。吸光度表示基于光散射的剩余微泡数量。卟啉微泡在血清中更稳定，半衰期是不使用卟啉-脂质形成的微泡的两倍。
图4显示了卟啉-脂质微泡相比于不采用卟啉-脂质形成的微泡具有约2～3μm的更优异的尺寸分布。微泡采用Coulter计数器进行测定。注意，采用卟啉-脂质形成的微泡具有2～4μm尺寸的较大的且独特的群体。常规的脂质微泡经常表现出多分散的粒径分布。
图5显示了对于porshe微泡而言，作为频率函数的声衰减。灰色：1.5-8.5MHz换能器。黑色：7-27.5MHz换能器。Porshe微泡展示出9～10MHz的共振频率。
图6显示了porshe和商用脂质微泡(文献值)的微泡参数和壳性质的表格。包含卟啉-脂质，会导致微泡壳刚度增加。
图7显示了使用porshe微泡来增强小鼠颈静脉标准和超声造影成像。Porshe微泡通过尾静脉注射注入小鼠中并获得B-模式和对比度模式两种图像。使用18MHz的换能器频率进行成像。
图8显示了使用porshe微泡来增强小鼠中皮下乳腺癌(MDA-MB-231)肿瘤异种移植物的造影超声成像。Porshe微泡经尾静脉注射注入小鼠中并获得B-模式和对比度模式两种图像。使用了5～12MHz的换能器频率。所显示的是1cm比例尺。
图9显示了由5ns脉冲激光和10MHz单元素换能器获得的来自porshe微泡溶液的porshe微泡的光声谱(3次测量平均值+/-SD)。
图10显示了在圆柱形孔中成像的porshe微泡的光声特性和超声特性。不采用卟啉-脂质形成的微泡(MB)的PA(顶部)和US(底部)的图像，porshe MB和不采用卟啉-脂质的MB在塑料模型中在直径9mm孔中与等摩尔的焦脱镁叶绿酸-α(pyro)一起孵育。使用700nm的5ns脉冲激光和10MHz单元素换能器获得PA图像。
具体实施方式
本文中我们描述了“porshe”微泡，是一种新型微泡，由封装气体，优选氟化气体的卟啉-磷脂外壳构成。
在一个方面，提供了包含其中封装气体的单层的微泡，所述单层包含卟啉-磷脂结合物，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
用于形成本应用的微泡的卟啉-磷脂结合物的实例描述于本申请人的WO11/044671中。
在一个方面，提供了包含其中封装气体的单层的微泡，所述单层包含卟啉-磷脂结合物，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
在不同的实施方式中，所述卟啉-磷脂结合物可以按照最高达100mol％的不同mol％而存在，包括5mol％，10mol％，15mol％，20mol％，30mol％，40mol％，50mol％，60mol％，70mol％，80mol％和90mol％。
在一些实施方式中，在所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由以下组成的组：血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟苯基二氢卟吩、紫红素、苯并二氢卟吩、萘并二氢卟吩、维尔丁(verdin)、罗丁(rhodin)、酮二氢卟吩、氮杂二氢卟吩、细菌二氢卟吩、甲苯基卟啉、苯并细菌二氢卟吩、扩展卟啉和卟啉异构体。优选地，所述扩展卟啉是德克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(sapphyrin)或六元卟啉(hexaphyrin)并且所述卟啉异构体是卟啉烯(porphycene)、倒置卟啉、酞菁或萘酞菁。
在一些实施方式中，在所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂包含磷脂酰胆碱、磷脂酰基乙醇胺、磷脂酰基丝氨酸或磷脂酰基肌醇。优选地，所述磷脂包含12～22个碳的酰基侧链。
在一些实施方式中，在所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉是焦脱镁叶绿酸-a。
在一些实施方式中，在所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉是细菌叶绿素衍生物。
在一些实施方式中，在所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂是1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱或1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
在一些实施方式中，所述卟啉-磷脂结合物是焦-脂质(pyro-lipid)。
在一些实施方式中，所述卟啉-磷脂结合物是氧-细菌叶绿素-脂质(oxy-bacteriochlorophyll-lipid)。
在一些实施方式中，所述卟啉通过0～20个碳的碳链连接基团结合至所述磷脂上的甘油基团。
在一些实施方式中，所述微泡进一步包含聚乙二醇化的乳化剂，优选具有的分子量范围为约1000～约5000。在优选的实施方式中，所述聚乙二醇化的乳化剂选自由以下组成的组：N-(甲氧基聚乙二醇5000氨甲酰基)-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基乙醇胺(MPEG5000-DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(DMPE-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)、聚氧乙烯40硬脂酸酯(PEG40S)以及它们的组合。在某些实施方式中，所述PEG或PEG-脂质按照约10mol％的量存在。
在一些实施方式中，所述微泡基本呈球形并且直径为约0.8～18μm，优选直径为约1μm-9μm，且进一步优选直径为约2μm-4μm。
在一些实施方式中，所述卟啉-磷脂结合物包含其中螯合的金属，可选地是金属的放射性同位素。优选地，所述金属选自由Zn、Cu、Mn、Fe和Pd组成的组。
在一些实施方式中，所述封装的气体是生物惰性气体。
适用于微泡的气体包括：空气、O2、N2、H2、CO2、N2O、稀有气体、烃气体、全氟碳、其他氟化气体以及它们的组合。氟化气体是优选的，因为它们在水中并不溶解，这导致所述微泡在体内和体外具有更高的稳定性。可以使用的不溶性气体的实例包括六氟化硫、全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷以及它们的组合。
微泡制剂中所用的优选磷脂包含12～24个碳的碳链长度以及包括磷脂酰胆碱、磷脂酰基乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰基甘油的头部基团。在进一步的实施方式中，所述磷脂选自由以下组成的组：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(DPPA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DAPC)、1,2-二二十四酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DLgPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-[磷-rac-(1-甘油)](DPPG)以及它们的组合。
所述微泡能够形成于具有pH缓冲液和不同类型和浓度的盐的溶液中。添加剂可以包括于缓冲液中，用于增加存储和操作稳定性。在一些实施方式中，所述微泡形成于包含选自由以下组成的组的至少一种添加剂的溶液中：氯化钠、磷酸钠、丙二醇、甘油和聚乙二醇(优选分子量范围为1000～6000)。
在一些实施方式中，所述微泡进一步包含靶向分子。
在另一方面，提供了制备微泡的方法，包括将气体、卟啉-磷脂结合物和其他磷脂进行混合，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
优选地，在与气体混合之前，将所述卟啉-磷脂结合物与其他磷脂混合以形成脂质膜并随后在缓冲液中水化。
在另一方面，提供了在受试者的目标区域上进行超声成像的方法，包括：提供本文所述的微泡；将微泡给予所述受试者；和使用超声对所述目标区域进行成像。
在另一方面，提供了对受试者的目标区域进行成像的方法，包括：提供本文所述的微泡；将微泡给予受试者；和在目标区域测定和/或检测光声信号。优选地，所述方法进一步包括在测量和/或检测光声信号之前在所述目标区域破裂所述微泡。
在另一方面，提供了本文所描述的微泡用于进行成像的用途。
在另一方面，提供了本文所述的微泡用于进行成像。
在一些实施方案中，所述成像是胸部成像、肿瘤成像、颈动脉新血管生成成像、或内窥镜成像。
下面实施例用于举例说明本发明的各个方面，而并非限制本文所公开的本发明的广泛方面。
实施例
方法
卟啉-脂质微泡的形成
在12mm×35mm的透明玻璃螺盖小瓶(Fisher Scientific)中通过将溶解于氯仿中的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC，AvantiPolar Lipids)与卟啉-脂质(焦脱镁叶绿酸-脂质)结合来制备脂质膜。这些膜在氮气流下干燥并进一步在真空下干燥30分钟。脂质膜在-20℃下在氩气之下保存直至用0.01M磷酸盐缓冲盐水(150mM NaCl，10mM磷酸盐，pH7.4)和溶解于去离子水中的聚氧乙烯-40硬脂酸酯(PEG40S，Sigma-Aldrich)进行水化。在0.5mL体积中总脂质浓度为0.5mg/mL或1mg/mL。每个小瓶的顶空充满气体。将每个小瓶置于65℃加热的水浴中，以将溶液温度升高超过所结合的脂质的转变温度。将所述加热的小瓶超声处理10秒(Bransonic，型号2510)以便将脂质膜分散到溶液中并再次向顶空中添加气体。通过在Vial-MixTM(Bristol-Myers Squibb)中振荡45s来形成微泡。
微泡浓度和粒径分布的表征
卟啉-脂质和常规微泡用指定mol％的卟啉-脂质，10mol％PEG40S和余量的DSPC进行配制。所述小瓶的顶空充满了六氟化硫(SF6，Sigma-Aldrich)、全氟丁烷(PFB，Fluoromed L.P)或全氟丙烷(PFP，Fluoromed L.P)气体。在经由振荡活化所述微泡后，微泡在6小时内使用。每种微泡制剂的尺寸分布和浓度(泡的数量/mL)，使用Coulter计数器系统(Multisizer III；Beckman Coulter Inc)测定。将不同体积的微泡加入到10ml Isoton-II电解质溶液(Beckman Coulter Inc)中以获得范围为100,000～300,000个微泡的微泡计数；在微泡浓度的计算中考虑了稀释度。数目和尺寸分布使用30μm孔径进行测定，所述孔径检测出直径范围0.8～18μm的微泡。对于每种微泡制剂，测定三个样品。
血清中体外微泡稳定性
在37℃下在胎牛血清(FBS)中比较使用和不使用15mol％卟啉-脂质形成的微泡之间的微泡稳定性。微泡与FBS一起以4.7×108个微泡/mL的浓度孵育在96-孔板中。采用SpectraMax Plus384酶标仪(MolecularDevices)在580nm下在37℃下孵育开始之后以0min，1min，5min，10min，15min的间隔和随后以15min的间隔记录吸光度，最高达4h。在每次测定前将所述孔板混合5s。所述吸光度代表微泡浓度。对每种制剂测定三个样品的稳定性。
微泡的声学表征
对由具有PFP气体的0.5mg/mL总脂质浓度的15mol％卟啉-脂质、10mol％PEG40S、75mol％DSPC构成的体积为a1mL体积的porshe微泡进行声学表征。1分钟倾析后，用18号针头从每个小瓶的底部提取的总体积为0.5mL。提取后，将所述试剂放置于1.5mL的新小瓶内，用PFP气体封顶并用parafilm(Fisher Scientific)松散地密封。随后将小瓶轻轻地用手混合10秒钟，之后进行库尔特(Coulter)计数器测定和衰减测定。所有测定均在室温下进行。使用由de Jong等人(de Jong et al.Ultrasonics1992，30，95-103)首次描述的方法进行频率依赖性的衰减测定以评价所述声学响应。为此，使用了窄带脉冲回波方法，类似于Goertz等人(Goertzet al.Ultrasound Med Biol2007，33，1376-1388)报道的配置。使用两个换能器(型号#595396，5MHz，76mm焦距，12.7mm直径，Olympus NDTCanada Inc.；型号#ISO2002HR，20MHz，38mm焦距，6.35mm直径Valpey-Fisher)覆盖1.5～27MHz的频率范围。所述换能器位于水浴内并且其波束通过聚酯薄膜窗口穿过包含稀释剂的样品室，并在铝反射器上聚焦(参考图2)。使用任意波形发生器(型号AWG5002C，Tektronix)产生中心频率间隔为0.5MHz的脉冲。输入波形随后放大53dB(型号A-150，ENI)，并随后传送至所述两个换能器之一。一旦接收，所述回波就放大35dB(型号AU1583，Miteq)，带通滤波，并随后数字化(400MHz采样频率，Agilent Technologies Inc.)进行离线分析。对于所有波形在焦点处的峰值负压使用直径0.075mm的针尖水听器(型号1544，PrecisionAcoustics)校准至25kPa。实验采用在盐水(0.9％NaCl)中稀释(1:7500)的试剂进行而声学测量在稀释之后1min时开始。对总共3个样品每个样品进行一次实验。尺寸测定在从小瓶中提取试剂之后立即进行，而衰减实验使用来自同一小瓶提取物的样品在库尔特(Coulter)计数器测量之后进行。微泡外壳性能采用de Jong等人(N.de Jong，L.Hoff，T.Skotland，N.Bom，Ultrasonics1992，30，95-103.)首次描述的一般性方法进行估计。本文中采用的方法的具体细节在其他地方(D.E.Goertz，N.de Jong，A.F.van der Steen，Ultrasound Med Biol2007，33，1376-1388.)进行讨论。
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微泡在模型中的光声和超声成像
使用通过用于提供宽度5ns以及重复率10Hz的激光脉冲的Q-切换的Nd:YAG激光器泵送的波长可调光学参量振荡器(OPO)激光器(SureliteOPO PLUS；Continuum；波长可调性：650～1060nm)完成光声表征。当准直的激光脉冲经过自制展像透镜(axicon lens，锥透镜)时，形成一个环形光束。这通过光学聚光器聚焦并在水箱中用超声波聚焦区同轴对齐。产生的声光波通过单元件10MHz换能器(V315；V315；Panametrics-NDT)进行检测，轴向和横向分辨率分别为125μm和140μm。样品容器放置于水箱下部，光学和声学透明窗覆盖一层与超声凝胶偶联的较薄的透明膜。水性样品充满直径9mm深度3mm的孔。所检测的PA信号首先由低噪声放大器(5072PR，Panametrics-NDT)放大并通过数字示波器(TDS5054，Tektronix)记录。对于超声成像，我们使用与用于光声成像相同的换能器和光栅扫描系统。在超声模式下，低噪声放大器用作超声波脉冲发射器和接收器。测定光声和超声发生并对三个样品进行成像：标准微泡(0％卟啉-脂质)，porshe微泡(15％卟啉-脂质)以及用与在15％卟啉-脂质微泡中存在的相同摩尔浓度的焦酸(pyro acid)共孵育的标准微泡。
结论
本文中我们描述了由封装气体，优选氟化气体的卟啉-磷脂壳构成的新类型的微泡。这些卟啉壳微泡“porshe微泡”能够很容易地使用标准振荡方法(图1)合成并具有各种独特的物理性能。
当卟啉-磷脂按照一定浓度(5mol％～20mol％卟啉-磷脂产生最多的泡)替换到标准微泡制剂中时，发现所产生的微泡能够以更高的产率生成(图2)。不受任何理论束缚，我们推测这种卟啉组分稳定了所述外壳并进一步防止气体溶解，导致收率更高；然而，需要一些常规磷脂来维持高产率。选取封装全氟丙烷气体的15mol％卟啉-脂质制剂进行进一步的研究，因为这些MB采用相对大量的结合的卟啉-脂质以高收率形成。
porsheMB的性质与在PBS中仅使用DSPC和PEG40S而无卟啉-脂质形成的PB相比较。为了评价卟啉-脂质对所述MB稳定性的影响，在无卟啉-脂质的情况下形成的MB和porshe MB在37℃下在胎牛血清中孵育。由于光散射导致的光学吸光度用作MB浓度的量度并监测4个小时的一段时间。Porshe MB比无卟啉-脂质的MB显示出高得多的稳定性，在血清中维持接近两倍长的时间(图3)，进一步证明，卟啉-脂质不仅结合到MB外壳内，而且产生了更稳定的MB。目前临床上使用的微泡通常在血清中体内持续仅几分钟。porshe微泡在血清中比常规微泡更长的生存期(近2×)进一步表明，卟啉-脂质稳定了微泡壳。循环次数的任何延长都是高度希望的。
应该认识到，单分散微泡相比于多分散微泡群体会产生更优异的超声信号[12]。我们的卟啉壳微泡已经显示具有优异的单分散性(图4)。高单分散性是微泡的特性，该特性是高度希望的但难以获得。当将卟啉-脂质结合到所述外壳中时才观察到这种水平的单分散性。值得注意的是，这种单分散的大小群体采用简单的制作方法就能实现，而无需进一步的纯化步骤。
porshe MB的较窄的体积尺寸分布随着频率升高产生了US衰减的急剧上升，这在9～10MHz处显示出峰值并且逐步收窄27.5MHz(图5)。由于porshe MB比某些商业脂质类MB具有更高的共振频率(f res)，porsheMB可以非常适合于开发5-15MHz频率范围的成像应用，包括胸部成像、颈动脉血管形成、浅表性肿瘤和内窥镜成像。
porshe微泡的机械性质使用由de Jong等人[13]介绍的声学理论模型和来自所述声衰减的输入数据(图5)和尺寸分布(图4)进行测定。先前已经对几种商业脂质MB报道了外壳刚度的估计，并且发现所述porsheMB比这些试剂硬3～5倍(图6)，这表明由于气体渗透性降低和塌缩耐受性更大，较硬的外壳导致更稳定的微泡。
所述卟啉外壳微泡内在地还适合于多模成像。将大量的卟啉结合到卟啉外壳(对于典型15mol％微泡组成超过100万卟啉)中。这使得它们适合用于光声成像方法、混合的PET或MR成像方法、或新的超声引导光学成像技术。
Porshe MB保持了与脂质MB相关的非线性特性并提供了超声造影。Porshe微泡能够区分健康小鼠的颈静脉(图7)并在静脉注射之后对携带人乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植物的小鼠皮下肿瘤进行成像(图8)。
卟啉-脂质的存在使porshe MB能够产生700nm处出峰的光声信号(图9)。在无卟啉-脂质的情况下形成的MB，porshe MB和与等摩尔游离卟啉(脱焦镁叶绿酸)共孵育的无卟啉-脂质MB使用700nm，5ns脉冲激光和10MHz单元件US换能器在样品孔中进行光声成像(图10a顶部)。所述porshe MB产生了比在无卟啉-脂质情况下形成的MB高10倍的PA信号和比与游离卟啉混合的无卟啉-脂质MB高6倍的PA信号(图10b)。这不仅表明所述卟啉必须存在才能使所述MB产生PA信号，而且还表明所述卟啉必须结合至所述脂质并存在于所述MB壳内。所有MB群体会产生强US信号(图10a底部，图10b)，证实porshe MB具有用作双模态US/PA造影剂的能力。
卟啉-脂质微泡的破裂能够使用高功率超声波或超声处理完成。一旦微泡破裂，较小的卟啉-脂质组件(纳米级)将会形成，其可以或不可以维持卟啉-脂质的紧密堆积密度。卟啉-脂质微泡的破裂能够通过外部触发较小卟啉-脂质组件向软组织递送而适用于与医疗成像和药物递送相关的应用。
这些独立但互补的有利特征使得porshe微泡非常适合于成为现有超声成像，以及新兴多模态成像方法(例如，光声成像)的改进成像剂。
虽然本发明的优选实施方式已在本文中进行了描述，但本领域的技术人员将会理解到，可以对其作出各种改变，而不会偏离本发明的精神或所附权利要求的范围。本文提及的所有参考文献，包括下面参考文献列表，都以其全文结合于本文中作为参考。
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Claims (44)

1.一种微泡，包含其中封装气体的单层，所述单层包含卟啉-磷脂结合物，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
2.根据权利要求1所述的微泡，包含最高达100mol%的卟啉-磷脂结合物。
3.根据权利要求1所述的微泡，包含最高达40mol%的卟啉-磷脂结合物。
4.根据权利要求1所述的微泡，包含最高达30mol%的卟啉-磷脂结合物。
5.根据权利要求1所述的微泡，包含最高达20mol%的卟啉-磷脂结合物。
6.根据权利要求1所述的微泡，包含5mol%-20mol%的卟啉-磷脂结合物。
7.根据权利要求1所述的微泡，包含5mol%-15mol%的卟啉-磷脂结合物。
8.根据权利要求1所述的微泡，包含10mol%-15mol%的卟啉-磷脂结合物。
9.根据权利要求1所述的微泡，包含约15mol%的卟啉-磷脂结合物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物中的所述卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由以下组成的组：血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟苯基二氢卟吩、紫红素、苯并二氢卟吩、萘并二氢卟吩、维尔丁、罗丁、酮二氢卟吩、氮杂二氢卟吩、细菌二氢卟吩、甲苯基卟啉、苯并细菌二氢卟吩、扩展卟啉和卟啉异构体。
11.根据权利要求10所述的微泡，其中所述扩展卟啉是德克萨卟啉、噻啉或六元卟啉，而所述卟啉异构体是卟啉烯、倒置卟啉、酞菁或萘酞菁。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。
13.根据权利要求12所述的微泡，其中所述磷脂包含12～22个碳的酰基侧链。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉是焦脱镁叶绿酸-a。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉是细菌叶绿素衍生物。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂是1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱或1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
17.根据权利要求1-9中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物是焦-脂质。
18.根据权利要求1-9中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物是氧-细菌叶绿素-脂质。
19.根据权利要求1-13中任一项所述的微泡，其中所述卟啉通过0-20个碳的碳链连接基团结合至所述磷脂上的甘油基团。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的微泡，进一步包含聚乙二醇化的乳化剂。
21.根据权利要求19所述的微泡，其中所述聚乙二醇化的乳化剂具有的分子量范围为约1000-约5000。
22.根据权利要求19所述的微泡，其中所述聚乙二醇化的乳化剂选自由以下组成的组：N-(甲氧基聚乙二醇5000氨甲酰基)-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基乙醇胺（MPEG5000-DPPE）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000（DMPE-PEG2000）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000（DSPE-PEG2000）、聚氧乙烯40硬脂酸酯（PEG40S）以及它们的组合。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的微泡，其中所述PEG或PEG-脂质按照约10mol%的量存在。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的微泡，其中所述微泡基本呈球形并且直径为约0.8μm-18μm。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的微泡，其中所述微泡基本呈球形并且直径为约1μm-9μm。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的微泡，其中所述微泡基本呈球形并且直径为约2μm-4μm。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的微泡，其中所述卟啉-磷脂结合物包含螯合在其中的金属，可选地是金属的放射性同位素。
28.根据权利要求27所述的微泡，其中所述金属选自由以下组成的组：Zn、Cu、Mn、Fe和Pd。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的微泡，其中所述气体是生物惰性气体。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的微泡，其中所述气体是氟化气体。
31.根据权利要求1-28中任一项所述的微泡，其中所述气体选自由以下组成的组：空气、O2、N2、H2、CO2、N2O、稀有气体、烃气体、全氟碳、六氟化硫、全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷以及它们的组合。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的微泡，其中所述单层的其余部分基本上由其他磷脂，优选阴离子磷脂构成。
33.根据权利要求32所述的微泡，其中所述磷脂选自由选自由以下组成的组：磷脂酰胆碱、磷脂酰基乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰基甘油以及它们的组合。
34.根据权利要求32所述的微泡，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸（DPPA）、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（DPPC）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）、1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DBPC）、1,2-二花生酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱（DAPC）、1,2-二二十四酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DLgPC）、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-[磷-rac-(1-甘油基)]（DPPG）以及它们的组合。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的微泡，其中所述微泡形成于包含选自由以下组成的组中的至少一种添加剂的溶液中：氯化钠、磷酸钠、丙二醇、甘油、聚乙二醇（优选分子量范围1000～6000）以及它们的组合。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的微泡，进一步包含靶向分子。
37.一种制备微泡的方法，包括将气体，卟啉-磷脂结合物和其他磷脂混合，其中所述卟啉-磷脂结合物包含优选在一种磷脂的sn-1或sn-2位置处共价连接至脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在与所述气体混合之前，将所述卟啉-磷脂结合物与所述其他磷脂混合从而形成脂质膜并且随后在缓冲液中水化。
39.一种在受试者的目标区域上进行超声成像的方法，包括：
a.提供根据权利要求1-36中任一项所述的微泡；
b.将所述微泡给予所述受试者；以及
c.采用超声对所述目标区域进行成像。
40.一种对受试者的目标区域成像的方法，包括：
a.提供根据权利要求1-36中任一项所述的微泡；
b.将所述微泡给予所述受试者；以及
c.在所述目标区域测定和/或检测光声信号。
41.根据权利要求40所述的方法，进一步包括在步骤c之前在所述目标区域破裂所述微泡。
42.根据权利要求1-36中任一项所述的微泡用于进行成像的用途。
43.根据权利要求42所述的用途，用于胸部成像、肿瘤成像、颈动脉新血管形成成像或内窥镜成像。
44.根据权利要求1-36中任一项所述的微泡，用于进行成像。
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