JP6346853B2 - Neisseria gonorrhoeae mutant, transformant and method for producing saccharifying enzyme - Google Patents
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Description
本発明は、固体培養に好適であり、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株、該麹菌変異株から得られた形質転換体、及び、該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法に関する。 The present invention is suitable for solid culture and suitable as a genetic recombination host, a koji mold mutant, a transformant obtained from the koji mold mutant, and a method for producing a saccharifying enzyme using the transformant About.
稲わら、コーンストーバ等のリグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖を微生物（アルコール発酵菌）により発酵させてエタノール等のアルコールを製造する方法が知られている。 Known is a method for producing alcohol such as ethanol by liquoring cellulose biomass such as rice straw and corn stover as a substrate, saccharifying the substrate with a saccharifying enzyme, and fermenting the obtained sugar with a microorganism (alcohol fermenter). Yes.
前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロース又はヘミセルロースにリグニンが強固に結合した構成を備えている。そこで前記糖化に当たっては、まず、前記リグノセルロース系バイオマスを前処理し、該リグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンが解離され、又は該リグノセルロース系バイオマスが膨潤された前処理物を得る。 The lignocellulosic biomass has a structure in which lignin is firmly bound to cellulose or hemicellulose. Therefore, in the saccharification, first, the lignocellulosic biomass is pretreated to obtain a pretreated product in which the lignin contained in the lignocellulosic biomass is dissociated or the lignocellulosic biomass is swollen.
尚、本願では、「解離」との用語は、セルロース又はヘミセルロースとリグニンとの結合の少なくとも一部を切断することを意味する。また、「膨潤」との用語は、液体の浸入によって結晶性セルロースを構成するセルロース若しくはヘミセルロースに空隙を生じ、又はセルロース繊維の内部に空隙を生じて、該結晶性セルロースを膨張させることを意味する。 In the present application, the term “dissociation” means that at least a part of the bond between cellulose or hemicellulose and lignin is broken. Further, the term “swelling” means that a void is formed in cellulose or hemicellulose constituting the crystalline cellulose by intrusion of liquid, or a void is formed inside the cellulose fiber to expand the crystalline cellulose. .
前記リグノセルロース系バイオマスの前処理は、例えば基質としての粉末状の前記リグノセルロース系バイオマスに希硫酸を添加して加水分解することにより行うことができ、前記前処理により湿粉体からなる前処理物が生成される。 The pretreatment of the lignocellulosic biomass can be performed, for example, by adding dilute sulfuric acid to the powdered lignocellulosic biomass as a substrate and hydrolyzing it, and the pretreatment comprising wet powder by the pretreatment Things are generated.
次に、前記前処理物において細菌を固体培養し、該細菌から産生される糖化酵素によって該前処理物を糖化処理することにより、基質糖化酵素混合物を得る。このとき、前記細菌に代えて、該細菌により糖化能の高い糖化酵素の遺伝子を導入した形質転換体を用いることにより、糖化処理効率を向上させることができる。 Next, the bacterium is solid-cultured in the pretreated product, and the pretreated product is saccharified with a saccharifying enzyme produced from the bacterium to obtain a substrate saccharifying enzyme mixture. At this time, the saccharification efficiency can be improved by using a transformant in which a saccharifying enzyme gene having a high saccharifying ability is introduced by the bacterium instead of the bacterium.
次に、基質糖化酵素混合物を固液分離した糖化溶液を、微生物によって発酵させてエタノールを生成させた後、蒸留することにより、バイオエタノールを製造する。 Next, the saccharified solution obtained by solid-liquid separation of the substrate saccharifying enzyme mixture is fermented by microorganisms to produce ethanol, and then distilled to produce bioethanol.
しかしながら、リグノセルロース系バイオマスを酸性下で処理した前処理物には多量のフルフラールが含まれることから、該フルフラールによって前記細菌又は前記形質転換体の生育が阻害され、産生される糖化酵素が減少して前記糖化処理効率が低下するという問題がある。 However, since the pretreated product obtained by treating lignocellulosic biomass under an acidic condition contains a large amount of furfural, the growth of the bacteria or the transformant is inhibited by the furfural, and the produced saccharifying enzyme is reduced. Thus, there is a problem that the saccharification treatment efficiency is lowered.
一方、リグノセルロース系バイオマスを糖化処理する際に用いられる細菌として、フルフラールに対する耐性を備える大腸菌や酵母が提案されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。しかし、大腸菌や酵母は、麹菌よりも糖化酵素を産生する能力が劣るという問題がある。 On the other hand, Escherichia coli and yeast having resistance to furfural have been proposed as bacteria used when saccharifying lignocellulosic biomass (see, for example, Patent Document 1 and Patent Document 2). However, Escherichia coli and yeast have a problem that their ability to produce saccharifying enzymes is inferior to that of koji molds.
そこで、麹菌がフルフラールに対する耐性を備えることが望まれる。 Therefore, it is desired that the koji mold has resistance to furfural.
本発明は、フルフラールに対する耐性を備える麹菌変異株を提供することを目的とする。さらには、前記麹菌変異株から得られた形質転換体、及び該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法を提供することも目的とする。 An object of the present invention is to provide a koji mold mutant having resistance to furfural. Furthermore, it is another object to provide a transformant obtained from the gonococcal mutant and a method for producing a saccharifying enzyme using the transformant.
前記目的を達成するために、本発明の麹菌変異株は、フルフラール含有培地でアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＡＯＫ２７Ｌ株を培養して変異させ、前記培地で生育する菌を選択し、フルフラール耐性を備えることを特徴とする。前記ＡＯＫ２７Ｌ株は、固体培養した際の糖化酵素の生産効率が、他のアスペルギルス・オリゼよりも優れている。 In order to achieve the above object, the gonococcal mutant of the present invention is cultivated by mutating the Aspergillus oryzae AOK27L strain in a furfural-containing medium, selecting a bacterium that grows in the medium, and having furfural resistance. It is characterized by that. The AOK27L strain is superior to other Aspergillus oryzae in the production efficiency of saccharifying enzyme when solid-cultured.
本発明の麹菌変異株によれば、フルフラール耐性を備えることにより、リグノセルロース系バイオマスを前処理したフルフラールを含む前処理物において、前記麹菌変異株を培養し糖化酵素を産生させて前記バイオマスを糖化処理するとき、フルフラールによって該麹菌変異株の生育が阻害されない。この結果、前記麹菌変異株から産生される糖化酵素を増大させ、糖化処理効率を向上させることができる。 According to the gonococcal mutant of the present invention, by providing furfural resistance, in the pretreated product containing furfural prepared by pretreatment of lignocellulosic biomass, the gonococcal mutant is cultured to produce a saccharifying enzyme to saccharify the biomass. When treated, the growth of the gonococcal mutant is not inhibited by furfural. As a result, it is possible to increase the saccharification enzyme produced from the gonococcal mutant and improve the saccharification treatment efficiency.
前記麹菌変異株として、例えば、アスペルギルス・オリゼＨＯ−ＦＲ株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５３）を挙げることができる。 As the Neisseria gonorrhoeae mutant, for example, Aspergillus oryzae HO-FR strain (Accession number: NITE BP-01953) can be mentioned.
また、本発明の麹菌変異株は、糖化酵素遺伝子が導入されることにより形質転換体とすることができる。前記形質転換体は、前記前処理物を糖化処理するとき、糖化酵素遺伝子が導入されていない麹菌変異株と比較して、糖化酵素の産生量を増大させることができる。 Moreover, the koji mold mutant of the present invention can be made into a transformant by introducing a saccharifying enzyme gene. When the pretreated product is subjected to saccharification treatment, the transformant can increase the amount of saccharification enzyme produced as compared to a koji mold mutant into which a saccharifying enzyme gene has not been introduced.
前記糖化酵素遺伝子として、例えば、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子を用いることができる。 As the saccharifying enzyme gene, for example, one or more genes selected from the group consisting of cellobiohydrolase gene, β-glucosidase gene, endoxylanase gene, arabinofuranosidase gene, glucuronidase gene, endoglucanase gene are used. Can do.
ここで、例えば、前記セロビオハイドロラーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来であり、前記β−グルコシダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であり、前記エンドキシラナーゼ遺伝子は、サーモアスカス（Thermoascus）属菌由来であり、前記アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であり、前記グルクロニダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であり、前記エンドグルカナーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来である。 Here, for example, the cellobiohydrolase gene is derived from Acremonium cellulolyticus, the β-glucosidase gene is derived from Acremonium cellulolyticus, and the endoxylanase gene is It is derived from a Thermoscus genus, the arabinofuranosidase gene is derived from Acremonium cellulolyticus, the glucuronidase gene is derived from Acremonium cellulolyticus, and the endoglucanase gene is , Derived from Acremonium cellulolyticus.
前記形質転換体は、前記糖化酵素遺伝子が、麹菌変異株の染色体外の染色体外遺伝子として保持されていてもよいが、糖化酵素の発現安定性の点から、麹菌変異株の染色体中に組み込まれていることがより好ましい。 In the transformant, the saccharification enzyme gene may be retained as an extrachromosomal gene outside the chromosome of the Neisseria gonorrhoeae mutant, but is incorporated into the chromosome of the Neisseria gonorrhoeae mutant from the viewpoint of glycation enzyme expression stability. More preferably.
また、本発明の麹菌変異株又は形質転換体は、例えば、固体培養によって糖化酵素を生成させることができ、前記固体培養には、例えば稲わら又はコーンストーバを酸性下で処理した前処理物を用いることができる。 In addition, the gonococcal mutant or transformant of the present invention can produce a saccharifying enzyme by, for example, solid culture. For the solid culture, for example, a pretreated product obtained by treating rice straw or corn stover under an acidic condition is used. be able to.
次に、本発明の実施形態についてさらに詳しく説明する。 Next, embodiments of the present invention will be described in more detail.
〔１．麹菌変異株〕
本実施形態の麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＡＯＫ２７Ｌ株（株式会社秋田今野商店より入手可能）を変異させたものであり、フルフラール耐性を備えている。前記ＡＯＫ２７Ｌ株は、固体培養した際の糖化酵素の生産効率が、他のアスペルギルス・オリゼよりも優れている。
[1. Neisseria gonorrhoeae mutant
The Neisseria gonorrhoeae mutant of this embodiment is a mutant of Aspergillus oryzae AOK27L strain (available from Akita Imano Co., Ltd.) and has furfural resistance. The AOK27L strain is superior to other Aspergillus oryzae in the production efficiency of saccharifying enzyme when solid-cultured.
本実施形態の麹菌変異株は、ＡＯＫ２７Ｌ株を、フルフラールを０．０５〜０．５質量／体積％の濃度で含む培地で培養し、前記培地で生育したコロニーを選択してさらに前記培地で培養することを１回以上行うことにより得ることができる。前記麹菌変異株として、例えば、アスペルギルス・オリゼＨＯ−ＦＲ株（寄託日：平成２６年１０月２４日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５３）を挙げることができる。 As for the gonococcal mutant of this embodiment, the AOK27L strain is cultured in a medium containing furfural at a concentration of 0.05 to 0.5 mass / volume%, colonies grown on the medium are selected, and further cultured on the medium. It can be obtained by performing it once or more. Examples of the Neisseria gonorrhoeae mutant include Aspergillus oryzae HO-FR strain (Deposit date: October 24, 2014, Deposit number: NITE BP-01953).
また、本実施形態の麹菌変異株は、糖化酵素遺伝子を導入した形質転換体とすることにより、糖化酵素をさらに効率よく産生することができる。 Moreover, the gonococcal mutant of this embodiment can produce a saccharifying enzyme more efficiently by using the transformant which introduce | transduced the saccharifying enzyme gene.
〔２．形質転換体〕
本実施形態の形質転換体は、前記糖化酵素遺伝子が、麹菌変異株の染色体外の染色体外遺伝子として保持されていてもよいが、糖化酵素の発現安定性の点から、麹菌変異株の染色体中に組み込まれていることがより好ましい。
[2. Transformant)
In the transformant of the present embodiment, the saccharifying enzyme gene may be retained as an extrachromosomal gene outside the chromosome of the Neisseria gonorrhoeae mutant, but from the viewpoint of glycation enzyme expression stability, More preferably, it is incorporated in
麹菌変異株へ糖化遺伝子を導入する形質転換方法は、特に限定されるものではなく、アスペルギルス・オリゼをはじめとする麹菌に対する遺伝子導入を行う際に使用される各種方法により行うことができる。形質転換方法としては、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、ＰＥＧ−カルシウム法（Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99〜104（1989））、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等を挙げることができる。 The transformation method for introducing a glycated gene into a Neisseria gonorrhoeae mutant is not particularly limited, and can be carried out by various methods used for gene introduction into Aspergillus oryzae and other Neisseria gonorrhoeae. Examples of transformation methods include protoplast-PEG method, PEG-calcium method (Mol. Gen. Genet., Vol. 218, p. 99 to 104 (1989)), electroporation method, Agrobacterium method and the like. Can be mentioned.
前記麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、一般的に植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスの糖化処理に使用される糖化酵素であることが好ましい。当該糖化酵素としては、例えば、グルコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）、ヘミセルラーゼであるエンドキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５５）、グルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３１）等が挙げられる。本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせて導入させてもよい。 The saccharifying enzyme gene to be introduced into the gonococcal mutant is preferably a saccharifying enzyme which is generally used for saccharification treatment of cellulose biomass such as plant biomass and lignocellulose. Examples of the saccharifying enzyme include glucoside hydrolase endoglucanase (cellulase or endo-1,4-β-D-glucanase, EC 3.2.1.4), exo-type cellobiohydrolase (1, 4-β-cellobiosidase or cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), hemicellulase, endoxylanase (endo-1,4-β-) Xylanase, EC 3.2.1.8), arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), glucuronidase (EC 3.2.1.31) and the like. Only one type of saccharifying enzyme gene may be introduced into the koji mold mutant according to the present invention, or two or more types may be introduced in combination.
また、前記麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、糖化力の強い糖化酵素をコードする遺伝子であることが好ましい。例えば、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス（Thermoascus）属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される１種、又は２種以上を組み合わせて導入させることが好ましい。 The saccharifying enzyme gene to be introduced into the gonococcal mutant is preferably a gene encoding a saccharifying enzyme having a strong saccharifying power. For example, the cellobiohydrolase gene derived from Acremonium cellulolyticus, the β-glucosidase gene derived from Acremonium cellulolyticus, the endoxylanase gene derived from the genus Thermoascus, One selected from the group consisting of an arabinofuranosidase gene derived from cellulolyticus, a glucuronidase gene derived from Acremonium cellulolyticus, and an endoglucanase gene derived from Acremonium cellulolyticus, or a combination of two or more Is preferably introduced.
また、前記麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、耐熱性の高い糖化酵素であることも好ましい。リグノセルロース系バイオマスに対する糖化処理は、比較的高温で行うことにより、糖化効率をより高められるためである。 The saccharifying enzyme gene to be introduced into the gonococcal mutant is preferably a saccharifying enzyme having high heat resistance. This is because the saccharification treatment for lignocellulosic biomass can be performed at a relatively high temperature to further increase the saccharification efficiency.
〔３．糖化酵素の生産方法〕
本実施形態の麹菌変異株又は形質転換体は、リグノセルロース系バイオマスを用いた固体培養による糖化酵素の生産に用いることができる。
[3. (Production method of saccharification enzyme)
The Neisseria gonorrhoeae mutant or transformant of this embodiment can be used for the production of saccharifying enzymes by solid culture using lignocellulose-based biomass.
前記麹菌変異株は、フルフラール耐性に優れるとともに、親株のＡＯＫ２７Ｌ株自体が固体培養した際の糖化酵素の生産効率が優れている。このため、本実施形態の麹菌変異株又は形質転換体は、稲わら、コーンストーバ等のリグノセルロース系バイオマスを希硫酸等の酸性下で処理した前処理物を基質として固体培養するときに、前記前処理物に含まれるフルフラールによって麹菌変異株又は形質転換体の生育が阻害されることがなく、糖化酵素を高収率で生産することができる。また、本実施形態の麹菌変異株又は形質転換体を用いて前記前処理物を糖化処理するとき、糖化処理効率を向上させることができる。 The gonococcal mutant is excellent in furfural resistance and is excellent in production efficiency of saccharifying enzyme when the parent strain AOK27L itself is cultured in solid. For this reason, the gonococcal mutant or transformant of the present embodiment, when solid-cultured using a pretreated product obtained by treating lignocellulosic biomass such as rice straw or corn stover under acidic conditions such as dilute sulfuric acid, as a substrate, The furfural contained in the treated product does not inhibit the growth of the Neisseria gonorrhoeae mutant or transformant, and can produce a saccharifying enzyme in high yield. Further, when the pretreated product is saccharified using the gonococcal mutant or transformant of the present embodiment, the saccharification efficiency can be improved.
〔１．麹菌変異株の作成〕
まず、固体培地としてのＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地（デキストリン３質量／体積％、リン酸２水素カリウム０．１質量／体積％、塩化カリウム０．２質量／体積％、硫酸マグネシウム０．０５質量／体積％、硫酸鉄０．００１質量／体積％、硝酸ナトリウム０．３質量／体積％、寒天１．５質量／体積％を含む）に、終濃度０．０５質量／体積％となるようにフルフラールを添加した第１プレートを作製した。
[1. (Creation of gonococcal mutant)
First, Czapek-Dox (CD) medium as a solid medium (dextrin 3 mass / volume%, potassium dihydrogen phosphate 0.1 mass / volume%, potassium chloride 0.2 mass / volume%, magnesium sulfate 0.05 mass / Volume%, iron sulfate 0.001 mass / volume%, sodium nitrate 0.3 mass / volume%, agar 1.5 mass / volume%) A first plate to which furfural was added was prepared.
次に、第１プレートの中央部に、ＡＯＫ２７Ｌ株（野生株）の胞子懸濁液（１×１０７／ｍＬ）を１０μＬ添加し、温度３０℃で１０日間、静置培養を行うことにより、第１コロニーを得た。 Next, 10 μL of spore suspension (1 × 10 7 / mL) of AOK27L strain (wild strain) is added to the center of the first plate, and static culture is performed at a temperature of 30 ° C. for 10 days. A first colony was obtained.
次に、得られた第１コロニーの端の菌体を第１プレートごと打ち抜いた後、ＣＤ培地に終濃度０．０５質量／体積％となるようにフルフラールを添加した第２プレートの中央部に接種し、温度３０℃で１０日間、静置培養を行うことにより、第２コロニーを得た。 Next, the cells at the end of the first colony obtained were punched out together with the first plate, and then added to the center of the second plate to which furfural was added to the CD medium so that the final concentration was 0.05 mass / volume%. A second colony was obtained by inoculation and static culture at a temperature of 30 ° C. for 10 days.
次に、得られた第２コロニーの端の菌体を第２プレートごと打ち抜いた後、ＣＤ培地に終濃度０．０５質量／体積％となるようにフルフラールを添加した第３プレートの中央部に接種し、温度３０℃で１０日間、静置培養を行うことにより、第３コロニーを得た。 Next, the cells at the end of the obtained second colony were punched out together with the second plate, and then added to the center of the third plate to which furfural was added to the CD medium to a final concentration of 0.05 mass / volume%. A third colony was obtained by inoculation and stationary culture at a temperature of 30 ° C. for 10 days.
次に、得られた第３コロニーの端の菌体を第３プレートごと打ち抜いた後、ＣＤ培地に終濃度０．１質量／体積％となるようにフルフラールを添加した第４プレートの中央部に接種し、温度３０℃で１０日間、静置培養を行うことにより、第４コロニーとしての麹菌変異株を得た。 Next, the cells at the end of the third colony obtained were punched out together with the third plate, and then added to the center of the fourth plate to which furfural was added to the CD medium so that the final concentration was 0.1 mass / volume%. Inoculation was carried out for 10 days at a temperature of 30 ° C. to obtain a koji mold mutant as a fourth colony.
〔２．麹菌変異株の固体培養〕
ＣＤ培地に終濃度０．１質量／体積％となるようにフルフラールを添加したプレートを作製し、プレートの中央部に、得られた麹菌変異株の胞子懸濁液（１×１０７／ｍＬ）を１０μＬ添加し、温度３０℃で７日間、静置培養を行った後、プレートを写真撮影した。
[2. Solid culture of Neisseria gonorrhoeae mutants
A plate in which furfural was added to a CD medium to a final concentration of 0.1 mass / volume% was prepared, and a spore suspension (1 × 10 7 / mL) of the obtained koji mold mutant was obtained at the center of the plate. 10 μL was added, static culture was performed at a temperature of 30 ° C. for 7 days, and then the plate was photographed.
一方、ＡＯＫ２７Ｌ株（野生株）の胞子懸濁液についても、同様にして静置培養を行った後、ＣＤ培地を写真撮影した。 On the other hand, the spore suspension of the AOK27L strain (wild strain) was statically cultured in the same manner, and then the CD medium was photographed.
図１に、培養後のＣＤ培地の状態の写真を示す。右側が麹菌変異株を静置培養したものであり、左側がＡＯＫ２７Ｌ株を静置培養したものである。麹菌変異株は、０．１質量／体積％のフルフラールを含有するＣＤ培地で増殖することができたが、ＡＯＫ２７Ｌ株はＣＤ培地で増殖することができなかった。 FIG. 1 shows a photograph of the state of the CD medium after culture. The right side is a stationary culture of the Neisseria gonorrhoeae mutant, and the left side is a static culture of the AOK27L strain. The Neisseria gonorrhoeae mutant strain was able to grow on CD medium containing 0.1 mass / volume% furfural, whereas the AOK27L strain could not grow on CD medium.
〔３．麹菌変異株の液体培養〕
ＰＤ液体培地（デキストリン２質量／体積％、ポリペプトン１質量／体積％、カザミノ酸０．１質量／体積％、リン酸２水素カリウム０．５質量／体積％、硫酸マグネシウム０．０５質量／体積％、硝酸ナトリウム０．１質量／体積％）に、終濃度０．０５質量／体積％となるようにフルフラールを添加したもの５０ｍＬを、２００ｍＬ容三角フラスコに量り取った。そして、前記三角フラスコに、得られた麹菌変異株の胞子懸濁液を最終胞子濃度１×１０４／ｍＬとなるように添加し、温度３０℃で１０８時間、培養を行った後、ＰＤ液体培地を写真撮影した。
[3. Liquid culture of Neisseria gonorrhoeae mutants
PD liquid medium (dextrin 2 mass / volume%, polypeptone 1 mass / volume%, casamino acid 0.1 mass / volume%, potassium dihydrogen phosphate 0.5 mass / volume%, magnesium sulfate 0.05 mass / volume% 50 mL of sodium nitrate (0.1 mass / volume%) added with furfural to a final concentration of 0.05 mass / volume% was weighed into a 200 mL Erlenmeyer flask. Then, the spore suspension of the obtained Neisseria gonorrhoeae mutant was added to the Erlenmeyer flask so as to have a final spore concentration of 1 × 10 4 / mL, and cultured at a temperature of 30 ° C. for 108 hours. The medium was photographed.
一方、ＡＯＫ２７Ｌ株（野生株）の胞子懸濁液についても、同様にして培養を行った後、ＰＤ液体培地を写真撮影した。 On the other hand, the spore suspension of the AOK27L strain (wild strain) was cultured in the same manner, and a PD liquid medium was photographed.
図２に、培養後のＰＤ液体培地の状態の写真を示す。右側が麹菌変異株を培養したものであり、左側がＡＯＫ２７Ｌ株を培養したものである。麹菌変異株は、０．０５質量／体積％のフルフラールを含有するＰＤ液体培地で増殖することができたが、ＡＯＫ２７Ｌ株は前記液体培地で増殖することができなかった。 FIG. 2 shows a photograph of the state of the PD liquid medium after culture. The right side is a cultivated gonococcal mutant and the left side is a cultivated AOK27L strain. The Neisseria gonorrhoeae mutant strain was able to grow on PD liquid medium containing 0.05 mass / volume% furfural, but the AOK27L strain could not grow on the liquid medium.
〔４．結果〕
本実施例の麹菌変異株は、０．１質量／体積％のフルフラールを含有するＣＤ培地で増殖させることができることから、ＡＯＫ２７Ｌ株と比較して、優れたフルフラール耐性を備えていることが明らかである。
[4. result〕
Since the gonococcal mutant of this example can be grown on a CD medium containing 0.1 mass / volume% furfural, it is clear that it has superior furfural resistance compared to the AOK27L strain. is there.
このことから、本実施例の麹菌変異株は、粉末状の稲わら又はコーンストーバ等のリグノセルロース系バイオマスに希硫酸を添加して加水分解して得られる、フルフラールを含有する湿粉体からなる前処理物を培地として培養したとき、麹菌変異株の生育が阻害されることなく、十分に増殖することができるものと考えられる。その結果、前記麹菌変異株を前記前処理物にて固体培養して前記バイオマスを糖化処理するとき、前記麹菌変異株から産生される糖化酵素を増大させ、糖化処理効率を向上することができるものと考えられる。 From this fact, the Aspergillus mutant strain of this example is a wet powder containing furfural obtained by adding dilute sulfuric acid to lignocellulosic biomass such as powdered rice straw or corn stover and hydrolyzing it. It is considered that when the treated product is cultured as a medium, it can be sufficiently proliferated without inhibiting the growth of the Neisseria gonorrhoeae mutant. As a result, when the gonococcal mutant is solid-cultured with the pretreated product and the biomass is saccharified, the saccharification enzyme produced from the gonococcal mutant can be increased and the saccharification efficiency can be improved. it is conceivable that.
〔５．形質転換体の構築〕
また、本実施例の麹菌変異株に、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から選択される１種以上の糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体は、前記麹菌変異株と比較して、さらに優れたフルフラール耐性を備えるものと考えられる。
[5. Construction of transformant)
In addition, the gonococcal mutant of this example is one or more saccharifications selected from the group consisting of cellobiohydrolase gene, β-glucosidase gene, endoxylanase gene, arabinofuranosidase gene, glucuronidase gene, endoglucanase gene. The transformant into which the enzyme gene has been introduced is considered to have further superior furfural resistance compared to the gonococcal mutant.
例えば、前記麹菌変異株にセロビオハイドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子が導入された形質転換体は、次のようにして構築することができる。 For example, a transformant in which the cellobiohydrolase (cbh1) gene is introduced into the gonococcal mutant can be constructed as follows.
まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７５０）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１、２にてｐｙｒＧ遺伝子の上流配列、プライマー３、４にて下流領域、プライマー５、６にてｔｅｆｌプロモーター遺伝子、プライマー７、８にてａｇｄＡターミネーター遺伝子、アクレモニウム・セルロリィティカスＨ１株（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０８）のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー９、１０にてセロビオハイドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１１、１２にてｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD -plus- neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、各遺伝子断片を取得する。 First, using the genomic DNA gene of Aspergillus oryzae HO2 strain (Accession number: NITE BP-01750) as a template, the upstream sequence of the pyrG gene with primers 1 and 2, the downstream region with primers 3 and 4, and the primers 5 and 6 Tefl promoter gene, primers 7 and 8, agdA terminator gene, Acremonium cellulolyticus H1 strain (accession number: FERM BP-11508) as a template, and primers 9, 10 cellobiohydrolase (Cbh1) gene, genomic DNA gene of Aspergillus awamori HA1 strain (Accession number: NITE BP-01751) as a template, and the pyrG gene expression cassette with primers 11 and 12, respectively, DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd., product) Name: KOD -plus- ne PCR amplification is performed in o), and purification is performed using a purification kit (trade name: QIAquick PCR purification kit, manufactured by QIAGEN) to obtain each gene fragment.
次に、プラスミドｐＭＤ２０（タカラバイオ株式会社製）を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ株式会社製）にて３０℃で処理し、前記精製キットにて精製してプラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得する。 Next, plasmid pMD20 (manufactured by Takara Bio Inc.) is treated with restriction enzyme SmaI (manufactured by Takara Bio Inc.) at 30 ° C. and purified with the purification kit to obtain a plasmid restriction product (gene fragment). To do.
前述のようにして得られた各遺伝子断片を、順次クローニングキット（タカラバイオ株式会社製、商品名：In-Fusion（登録商標） HD Cloning kit）にて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８株（タカラバイオ株式会社製）に形質転換し、プラスミドｐＰＰＴ１−ＣＢＨ１を取得する。 Each gene fragment obtained as described above was sequentially treated with a cloning kit (trade name: In-Fusion (registered trademark) HD Cloning kit, manufactured by Takara Bio Inc.). E. coli HST08 strain (manufactured by Takara Bio Inc.) is transformed to obtain plasmid pPPT1-CBH1.
次に、得られたプラスミドｐＰＰT１−ＣＢＨ１を鋳型として、プライマー１３、１４にて、前記ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、前記精製キットにて精製して麹菌形質転換用の遺伝子断片（ｐｙｒＧ−ＣＢＨ１断片）を取得する。 Next, using the obtained plasmid pPPT1-CBH1 as a template, PCR amplification was performed with primers 13 and 14, using the DNA polymerase, and purification with the purification kit, followed by gene fragment (pyrG-CBH1 fragment for gonococcal transformation) ) To get.
次に、ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、前記麹菌形質転換用の遺伝子断片（ｐｙｒＧ−ＣＢＨ１断片）を用い、本実施例で得られた麹菌変異株を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。 Next, according to the standard method of the PEG-calcium method, a transformant is obtained by transforming the gonococcal mutant obtained in this example using the gene fragment for gonococcal transformation (pyrG-CBH1 fragment). be able to.
プライマー１〜１２の塩基配列を表１に示す。 Table 1 shows the base sequences of the primers 1 to 12.
上記のようにして得られた形質転換体は、前記前処理物にて固体培養して前記バイオマスを糖化処理するとき、前記麹菌変異株と比較して、産生される糖化酵素をさらに増大させ、糖化処理効率をさらに向上することができるものと考えられる。 The transformant obtained as described above, when solid-cultured in the pretreated product and saccharifying the biomass, further increases the saccharifying enzyme produced compared to the koji mold mutant, It is considered that the saccharification treatment efficiency can be further improved.
符号なし Unsigned
Claims (8)
前記β−グルコシダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であり、
前記エンドキシラナーゼ遺伝子は、サーモアスカス（Thermoascus）属菌由来であり、
前記アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であり、
前記グルクロニダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であり、
前記エンドグルカナーゼ遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカス由来であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。 The cellobiohydrolase gene is derived from Acremonium cellulolyticus,
The β-glucosidase gene is derived from Acremonium cellulolyticus,
The endoxylanase gene is derived from a genus Thermoascus,
The arabinofuranosidase gene is derived from Acremonium cellulolyticus,
The glucuronidase gene is derived from Acremonium cellulolyticus,
The transformant according to claim 4, wherein the endoglucanase gene is derived from Acremonium cellulolyticus.
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