JP6332800B2 - Prevention and treatment of pancreatic fistula - Google Patents
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Description
本発明は膵液瘻の予防及び治療に関する。詳しくは、膵液瘻の予防又は治療に有効な組成物及びその用途等に関する。 The present invention relates to the prevention and treatment of pancreatic fistula. Specifically, the present invention relates to a composition effective for the prevention or treatment of pancreatic fistula and its use.
膵液瘻は、膵臓に瘻孔が生じ、膵液が持続的ないし断続的に漏出する状態である。膵液瘻は、最も頻度の高い膵臓手術後合併症の一つである。膵炎（急性又は慢性）、外傷によって膵液瘻が発生することもある。膵液瘻は重篤な場合には死に至る難治性の疾患であるが、治療法として確立されたものはなく、新たな治療法が切望されている。 Pancreatic fistula is a state in which a fistula occurs in the pancreas and the pancreatic juice leaks continuously or intermittently. Pancreatic fistula is one of the most frequent complications after pancreatic surgery. Pancreatic fistula may occur due to pancreatitis (acute or chronic) and trauma. Pancreatic fistula is an intractable disease that can lead to death in severe cases, but no treatment has been established, and a new treatment is eagerly desired.
ところで、再生医療を目的とした幹細胞のソースとして脂肪組織が有望視されている。実際、脂肪組織由来間葉系幹細胞（Adipose-derived stem cells: ASCs, ADSCs、Adipose-derived regeneration cells: ADRCs、Adipose-derived mesenchymal stem cells: AT-MSCs, AD-MSCsなどと呼ばれる。以下、脂肪組織由来間葉系幹細胞を「ASCs」と略称することがある）の臨床応用を目指し、各種疾患を治療標的とした研究が進められている（例えば特許文献１〜５を参照）。また、特許文献６には、脂肪由来間質幹細胞を瘻孔治療に適用する試みが提案されている。
By the way, adipose tissue is considered promising as a source of stem cells for the purpose of regenerative medicine. Actually, it is called adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Adipose-derived stem cells: ASCs, ADSCs, Adipose-derived regeneration cells: ADRCs, Adipose-derived mesenchymal stem cells: AT-MSCs, AD-MSCs, etc.) Aiming at the clinical application of derived mesenchymal stem cells (sometimes abbreviated as “ASCs”), researches on various diseases as therapeutic targets are underway (see, for example, Patent Documents 1 to 5).
上記の通り、現在のこところ、確立された膵液瘻の治療法はない。そこで本発明は、優れた効果を期待できる、膵液瘻に対する新たな予防又は治療手段を提供することを課題とする。 As mentioned above, there is currently no established treatment for pancreatic fistula. Then, this invention makes it a subject to provide the new prevention or treatment means with respect to a pancreatic fistula which can anticipate the outstanding effect.
上記課題を解決すべく研究を進める中で本発明者らは、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASCs）の潜在能力に注目するとともに、（１）細胞単独では目的の部位に留めていくことが困難であり、所望の治療効果を発揮できない可能性があること（組織への接着が不十分なため生体内で移動し、十分な効果をあげることができないと予想される）、及び（２）多くの細胞は外部からの刺激により様々な機能が誘導されることから、高い治療効果を発揮させるためにはASCsの活性を高めることが望まれること、に着眼した。この着眼点に基づき検討を重ね、（１）に対してはASCsをシート化することで対処し、（２）に対してはマンノースを利用するという、新たな戦略を考えた。ASCsをシート化すれば、細胞の移動が制限され、持続的な作用を期待できる。また、面として作用することによる効率的且つ高い作用の発揮も期待できる。動物モデルを用いて当該戦略の有効性を検証したところ、期待を超える優れた効果が認められた。以下に示す発明は主として上記成果ないし知見に基づく。
［１］マンノースによって活性が高められた脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、膵液瘻治療用細胞シート。
［２］脂肪組織由来間葉系幹細胞シートをマンノースで処理することによって得られたものである、［１］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［３］前記処理が、マンノースを含有する溶液への前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートの浸漬である、［２］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［４］前記処理が、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートに対する、マンノースを含有する溶液の塗布である、［２］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［５］前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートが、以下のステップ(1)〜(4)によって作製される、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート：
(1)磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞を用意するステップ；
(2)I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分として含むゲル材料と前記脂肪組織由来間葉系幹細胞との混合物を培養容器に播種するステップ；
(3)磁力を作用させることによって、前記混合物中の前記脂肪組織由来間葉系幹細胞を前記培養容器の培養面に引き寄せ、多層の細胞層を形成させるステップ；
(4)前記ゲル材料をゲル化させるステップ。
［６］ステップ(2)における前記混合物が、I型コラーゲンを有効成分とした第１ゲル要素と、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分とした第２ゲル要素と、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞とを混合することによって得られる、［５］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［７］ステップ(2)における前記培養容器の培養面上には、着脱可能な仕切りによる、上方が開放された区画が形成されており、該区画内に前記混合物が播種される、［５］又は［６］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［８］ステップ(3)と(4)の間に以下のステップ(3')を行う、［５］〜［７］のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート：
(3')前記細胞層の上方に存在する余分なゲル材料を除去するステップ。
［９］マンノースを含有している、［１］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［１０］マンノースで処理された脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、［１］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［１１］脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その使用時に、マンノース含有組成物がシート面に貼付又は塗布される、膵液瘻治療用細胞シート。
［１２］前記マンノースが低濃度である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［１３］低濃度が、0.8%(w/v)以下の濃度である、［１２］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
［１４］低濃度が、0.2%(w/v)〜0.8(w/v)である、［１２］に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
While pursuing research to solve the above problems, the present inventors pay attention to the potential of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs), and (1) the cells alone can remain at the target site. It may be difficult and may not be able to exert the desired therapeutic effect (it is expected that it will not move sufficiently in the body due to insufficient adhesion to the tissue and cannot achieve a sufficient effect), and (2) Since many cells induce various functions by external stimuli, we focused on increasing the activity of ASCs in order to exert a high therapeutic effect. Based on this point of view, we considered a new strategy to deal with (1) by making ASCs into a sheet, and (2) to use mannose. If ASCs are made into a sheet, cell migration is limited, and a sustained action can be expected. Further, it can be expected to exhibit an efficient and high effect by acting as a surface. When the effectiveness of the strategy was verified using an animal model, an excellent effect exceeding expectations was observed. The following invention is mainly based on the above-mentioned results or knowledge.
[1] A cell sheet for treating pancreatic fistula containing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells whose activity is enhanced by mannose.
[2] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [1], which is obtained by treating an adipose tissue-derived mesenchymal stem cell sheet with mannose.
[3] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [2], wherein the treatment is immersion of the adipose tissue-derived mesenchymal stem cell sheet in a solution containing mannose.
[4] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [2], wherein the treatment is application of a solution containing mannose to the adipose tissue-derived mesenchymal stem cell sheet.
[5] The cell sheet for pancreatic fistula treatment according to any one of [2] to [4], wherein the adipose tissue-derived mesenchymal stem cell sheet is produced by the following steps (1) to (4): :
(1) preparing a magnetically labeled adipose tissue-derived mesenchymal stem cell;
(2) a step of seeding a culture container with a mixture of a gel material containing type I collagen, laminin, type IV collagen and entactin as active ingredients and the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells;
(3) a step of attracting the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in the mixture to the culture surface of the culture vessel by applying a magnetic force to form a multilayer cell layer;
(4) A step of gelling the gel material.
[6] The mixture in step (2) is a first gel element containing type I collagen as an active ingredient, a second gel element containing laminin, type IV collagen and entactin as active ingredients, and the adipose tissue-derived mesenchyme The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [5], obtained by mixing with a stem cell.
[7] On the culture surface of the culture vessel in step (2), a section with an open top is formed by a removable partition, and the mixture is seeded in the section [5] Or the cell sheet for pancreatic fistula treatment as described in [6].
[8] The cell sheet for treatment of pancreatic fistula according to any one of [5] to [7], wherein the following step (3 ′) is performed between steps (3) and (4):
(3 ′) a step of removing excess gel material existing above the cell layer.
[9] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [1], containing mannose.
[10] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [1], comprising adipose tissue-derived mesenchymal stem cells treated with mannose.
[11] A cell sheet for treating pancreatic fistula, comprising adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, and, when used, a mannose-containing composition applied or applied to the sheet surface.
[12] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to any one of [1] to [11], wherein the mannose is at a low concentration.
[13] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [12], wherein the low concentration is 0.8% (w / v) or less.
[14] The cell sheet for treating pancreatic fistula according to [12], wherein the low concentration is 0.2% (w / v) to 0.8 (w / v).
本発明は膵液瘻の予防又は治療に用いられる細胞シート（膵液瘻治療用細胞シート）及びその用途に関する。本発明の細胞シートは、マンノースによって活性が高められた脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASCs）を含有する。本発明において「脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASCs）」とは、脂肪組織に含まれる体性幹細胞のことをいうが、多分化能を維持している限りにおいて、当該体性幹細胞の培養（継代培養を含む）により得られる細胞も「脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASCs）」に該当するものとする。通常、ASCsは、生体から分離された脂肪組織を出発材料とし、細胞集団（脂肪組織に由来する、ASCs以外の細胞を含む）を構成する細胞として「単離された状態」に調製される。ここでの「単離された状態」とは、その本来の環境（即ち生体の一部を構成した状態）から取り出された状態、即ち人為的操作によって本来の存在状態と異なる状態で存在していることを意味する。尚、脂肪組織由来間葉系幹細胞はADSCs、ADRCs、AT-MSCs、AD-MSCs等とも呼ばれる。本明細書では以下の用語、即ち、脂肪組織由来間葉系幹細胞、ASCs、ADSCs、ADRCs、AT-MSCs、AD-MSCsを相互に置換可能に使用する。 The present invention relates to a cell sheet (cell sheet for pancreatic fistula treatment) used for prevention or treatment of pancreatic fistula and its use. The cell sheet of the present invention contains adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs) whose activity is enhanced by mannose. In the present invention, “adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs)” refers to somatic stem cells contained in adipose tissue. As long as pluripotency is maintained, the somatic stem cells are cultured ( Cells obtained by subculture) also correspond to “adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs)”. Normally, ASCs are prepared in an “isolated state” as cells constituting a cell population (including cells other than ASCs derived from adipose tissue) using adipose tissue separated from a living body as a starting material. The “isolated state” as used herein means a state extracted from its original environment (that is, a state constituting a part of a living body), that is, a state different from the original existence state by an artificial operation. Means that Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are also called ADSCs, ADRCs, AT-MSCs, AD-MSCs, and the like. In the present specification, the following terms, that is, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ASCs, ADSCs, ADRCs, AT-MSCs, and AD-MSCs are used interchangeably.
（ASCsの調製法）
ASCsは、脂肪基質からの幹細胞の分離、洗浄、濃縮、培養等の工程を経て調製される。ASCsの調製法は特に限定されない。例えば公知の方法（Fraser JK et al. (2006), Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in Biotechnology; Apr;24(4):150-4. Epub 2006 Feb 20. Review.; Zuk PA et al. (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell; Dec;13(12):4279-95.; Zuk PA et al. (2001), Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering; Apr;7(2):211-28.等が参考になる）に従ってASCsを調製することができる。また、脂肪組織からASCsを調製するための装置（例えば、Celution（登録商標）装置（サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ））も市販されており、当該装置を利用してASCsを調製することにしてもよい。当該装置を利用すると、脂肪組織より、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性の細胞を分離できる。以下、ASCsの調製法の具体例を示す。
(Method for preparing ASCs)
ASCs are prepared through steps such as separation, washing, concentration, and culture of stem cells from adipose matrix. A method for preparing ASCs is not particularly limited. For example, a known method (Fraser JK et al. (2006), Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in Biotechnology; Apr; 24 (4): 150-4. Epub 2006 Feb 20. Review .; Zuk PA et al. (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.Molecular Biology of the Cell; Dec; 13 (12): 4279-95 .; Zuk PA et al. (2001), Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering; Apr; 7 (2): 211-28. An apparatus for preparing ASCs from adipose tissue (for example, Celution (registered trademark) apparatus (Cytory Therapeutics, Inc., San Diego, USA)) is also commercially available, and ASCs are prepared using the apparatus. You may decide. By using this apparatus, cells positive for cell surface markers CD29 and CD44 can be separated from adipose tissue. Hereinafter, specific examples of methods for preparing ASCs will be shown.
（１）脂肪組織からの細胞集団の調製
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）を含む。免疫拒絶の問題を回避するため、本発明の細胞シートを適用する対象（患者）と同一の個体から脂肪組織（自己脂肪組織）を採取することが好ましい。但し、同一の個体からの採取が困難な場合や好ましくない場合（例えば、採取の際の過度の侵襲が想定される場合など）には、同種の個体（他家）から脂肪組織を採取するとよい。尚、異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
(1) Preparation of cell population from adipose tissue Adipose tissue is collected from animals by means such as excision and suction. The term “animal” herein includes humans and non-human mammals (pet animals, domestic animals, laboratory animals. Specifically, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, monkeys, cows, pigs, goats, sheep, Dogs, cats, etc.). In order to avoid the problem of immune rejection, it is preferable to collect adipose tissue (self-adipose tissue) from the same individual as the subject (patient) to which the cell sheet of the present invention is applied. However, if collection from the same individual is difficult or undesirable (for example, when excessive invasion is assumed during collection), adipose tissue may be collected from the same type of individual (other family). . In addition, use of the adipose tissue of a different animal is not prevented.
脂肪組織として皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪を例示できる。この中でも皮下脂肪は局所麻酔下で非常に簡単に採取できるため、採取の際の患者への負担が少なく、好ましい細胞源といえる。通常は一種類の脂肪組織を用いるが、二種類以上の脂肪組織を併用することも可能である。また、複数回に分けて採取した脂肪組織（同種の脂肪組織でなくてもよい）を混合し、以降の操作に使用してもよい。脂肪組織の採取量は、ドナーの種類や組織の種類、或いは必要とされるASCsの量を考慮して定めることができ、例えば0.5〜500g程度である。ヒトをドナーとする場合にはドナーへの負担を考慮して一度に採取する量を約10〜20g以下にすることが好ましい。採取した脂肪組織は、必要に応じてそれに付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、以下の酵素処理に供される。尚、脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分を除去することができる。 Examples of adipose tissue include subcutaneous fat, visceral fat, intramuscular fat, and intermuscular fat. Among these, subcutaneous fat can be collected very easily under local anesthesia, so that the burden on the patient at the time of collection is small and it can be said that it is a preferable cell source. Usually, one type of adipose tissue is used, but two or more types of adipose tissue can be used in combination. In addition, adipose tissue collected in multiple times (not necessarily the same type of adipose tissue) may be mixed and used for subsequent operations. The amount of adipose tissue collected can be determined in consideration of the type of donor, the type of tissue, or the amount of ASCs required, for example, about 0.5 to 500 g. When humans are used as donors, the amount collected at a time is preferably about 10 to 20 g or less in consideration of the burden on the donor. The collected adipose tissue is subjected to the following enzyme treatment after removal of blood components adhering to it and fragmentation as necessary. The blood component can be removed by washing the adipose tissue in an appropriate buffer or culture solution.
酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素によって消化することにより行う。このような酵素処理は当業者に既知の手法及び条件により実施すればよい（例えば、R.I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, A John Wiley & Sones Inc., Publication参照）。以上の酵素処理によって得られた細胞集団は、多分化能幹細胞、内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、及び／又はこれらの前駆細胞等を含む。細胞集団を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類に依存する。 Enzymatic treatment is performed by digesting adipose tissue with enzymes such as collagenase, trypsin, dispase and the like. Such enzyme treatment may be performed by techniques and conditions known to those skilled in the art (see, for example, RI Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, A John Wiley & Sones Inc., Publication). . The cell population obtained by the above enzyme treatment includes multipotent stem cells, endothelial cells, stromal cells, blood cells, and / or precursor cells thereof. The type and ratio of the cells constituting the cell population depend on the origin and type of the adipose tissue used.
（２）沈降細胞集団（SVF画分：stromal vascular fractions）の取得
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団（本明細書では「SVF画分」ともいう）として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1〜10分間、800〜1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
(2) Acquisition of sedimented cell population (SVF fraction: stroma vascular fractions) The cell population is subsequently subjected to centrifugation. The sediment by centrifugation is collected as a sedimented cell population (also referred to herein as “SVF fraction”). The conditions for the centrifugation process vary depending on the type and amount of cells, but are, for example, 1 to 10 minutes and 800 to 1500 rpm. Prior to centrifugation, the cell population after the enzyme treatment is preferably subjected to filtration or the like, and the enzyme undigested tissue contained therein is preferably removed.
ここで得られた「SVF画分」はASCsを含む。従って、SVF画分を用いて本発明の細胞シートを調製することができる。つまり、本発明の細胞シートの一態様では、活性化されたSVF画分が含有されることになる。尚、SVF画分を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類、酵素処理の条件などに依存する。また、SVF画分は、CD34陽性且つCD45陰性の細胞集団と、CD34陰性且つCD45陽性の細胞集団を含む点によって特徴付けられる（国際公開第２００６／００６６９２Ａ１号パンフレット）。 The “SVF fraction” obtained here contains ASCs. Therefore, the cell sheet of the present invention can be prepared using the SVF fraction. That is, in one embodiment of the cell sheet of the present invention, the activated SVF fraction is contained. The type and ratio of cells constituting the SVF fraction depend on the origin and type of the adipose tissue used, the conditions for enzyme treatment, and the like. In addition, the SVF fraction is characterized by including a CD34-positive and CD45-negative cell population and a CD34-negative and CD45-positive cell population (WO 2006 / 006692A1 pamphlet).
（３）接着性細胞（ASCs）の選択培養及び細胞の回収
SVF画分にはASCsの他、他の細胞成分（内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等）が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞を本発明の細胞シートに用いる。
(3) Selective culture of adherent cells (ASCs) and cell recovery
In addition to ASCs, the SVF fraction contains other cell components (endothelial cells, stromal cells, blood cells, progenitor cells thereof, etc.). Therefore, in one embodiment of the present invention, the following selective culture is performed to remove unnecessary cell components from the SVF fraction. And the cell obtained as a result is used for the cell sheet of this invention.
まず、SVF画分を適当な培地に懸濁した後、培養皿に播種し、一晩培養する。培地交換によって浮遊細胞（非接着性細胞）を除去する。その後、適宜培地交換（例えば３日に一度）をしながら培養を継続する。必要に応じて継代培養を行う。継代数は特に限定されない。尚、培養用の培地には、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)（日水製薬株式会社等）、α-MEM(大日本製薬株式会社等)、DMEM:Ham's F12混合培地(1:1)(大日本製薬株式会社等)、Ham's F12 medium(大日本製薬株式会社等)、MCDB201培地(機能性ペプチド研究所)等を使用することができる。血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など）又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加した培地を使用することにしてもよい。血清又は血清代替物の添加量は例えば5%(v/v)〜30%(v/v)の範囲内で設定可能である。 First, the SVF fraction is suspended in an appropriate medium, seeded on a culture dish, and cultured overnight. Suspension cells (non-adherent cells) are removed by medium exchange. Thereafter, the culture is continued while appropriately changing the medium (for example, once every 3 days). Subculture as necessary. The passage number is not particularly limited. As the culture medium, a normal animal cell culture medium can be used. For example, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), α-MEM (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), DMEM: Ham's F12 mixed medium (1: 1) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Ham's F12 medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), MCDB201 medium (Functional Peptide Research Institute), etc. can be used. A medium supplemented with serum (fetal calf serum, human serum, sheep serum, etc.) or a serum substitute (Knockout serum replacement (KSR), etc.) may be used. The addition amount of serum or serum replacement can be set, for example, within a range of 5% (v / v) to 30% (v / v).
以上の操作によって接着性細胞が選択的に生存・増殖する。続いて、増殖した細胞を回収する。回収操作は常法に従えばよく、例えば酵素処理（トリプシンやディスパーゼ処理）後の細胞をセルスクレイパーやピペットなどで剥離することによって容易に回収することができる。また、市販の温度感受性培養皿などを用いてシート培養した場合は、酵素処理をせずにそのままシート状に細胞を回収することも可能である。このようにして回収した細胞（ASCs）を用いることにより、ASCsを高純度で含有する細胞シートを調製することができる。 By the above operation, adherent cells selectively survive and proliferate. Subsequently, the proliferated cells are collected. The collection operation may be carried out in accordance with a conventional method. For example, the cells after enzyme treatment (trypsin or dispase treatment) can be easily collected by detaching them with a cell scraper or pipette. In addition, when sheet culture is performed using a commercially available temperature-sensitive culture dish or the like, it is also possible to recover the cells as they are without performing enzyme treatment. By using the cells (ASCs) collected in this manner, a cell sheet containing ASCs with high purity can be prepared.
（４）低血清培養（低血清培地での選択的培養）及び細胞の回収
本発明の一態様では、上記（３）の操作の代わりに又は上記（３）の操作の後に以下の低血清培養を行う。その結果得られた細胞をASCsとして本発明の細胞シートに用いることもできる。
(4) Low-serum culture (selective culture in low-serum medium) and cell recovery In one embodiment of the present invention, the following low-serum culture is performed instead of or after the operation of (3) above. I do. The resulting cells can be used as ASCs in the cell sheet of the present invention.
低血清培養では、SVF画分（（３）の後にこの工程を実施する場合には（３）で回収した細胞を用いる）を低血清条件下で培養し、目的の多分化能幹細胞（即ちASCs）を選択的に増殖させる。低血清培養法では用いる血清が少量で済むことから、本発明の細胞シートを適用する対象（患者）自身の血清を使用することが可能となる。即ち、自己血清を用いた培養が可能となる。自己血清を使用することによって、製造工程中から異種動物材料を排斥し、安全性が高く且つ高い治療効果を期待できる細胞シートが提供される。ここでの「低血清条件下」とは5%以下の血清を培地中に含む条件である。好ましくは2%(V/V)以下の血清を含む培養液中で細胞培養する。更に好ましくは、2%(V/V)以下の血清と1〜100ng/mlの線維芽細胞増殖因子-2（bFGF）を含有する培養液中で細胞培養する。 In low serum culture, the SVF fraction (if this step is carried out after (3), the cells collected in (3) are used) are cultured under low serum conditions and the desired multipotent stem cells (ie ASCs) ) Selectively. Since a small amount of serum is used in the low serum culture method, the subject's (patient) 's own serum to which the cell sheet of the present invention is applied can be used. That is, culture using autoserum becomes possible. By using autologous serum, a cell sheet can be provided that can eliminate the material of different animals from the manufacturing process, and can be expected to have high safety and high therapeutic effect. Here, “under low serum conditions” is a condition containing 5% or less of serum in the medium. The cells are preferably cultured in a culture solution containing 2% (V / V) or less of serum. More preferably, the cells are cultured in a culture solution containing 2% (V / V) or less of serum and 1 to 100 ng / ml of fibroblast growth factor-2 (bFGF).
血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることができる。好ましくはヒト血清、更に好ましくは本発明の細胞シートを適用する対象の血清（即ち自己血清）を用いる。 Serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum and the like can be used. Preferably used is human serum, more preferably serum of a subject to which the cell sheet of the present invention is applied (that is, autoserum).
培地は、使用の際に含有する血清量が低いことを条件として、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)（日水製薬株式会社等）、α-MEM(大日本製薬株式会社等)、DMEM:Ham's F12混合培地(1:1)(大日本製薬株式会社等)、Ham's F12 medium(大日本製薬株式会社等)、MCDB201培地(機能性ペプチド研究所)等を使用することができる。 As a medium, a normal medium for animal cell culture can be used on the condition that the amount of serum contained in use is low. For example, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), α-MEM (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), DMEM: Ham's F12 mixed medium (1: 1) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Ham's F12 medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), MCDB201 medium (Functional Peptide Research Institute), etc. can be used.
以上の方法で培養することによって、ASCsを選択的に増殖させることができる。また、上記の培養条件で増殖するASCsは高い増殖活性を持つので、継代培養によって、本発明の細胞シートに必要とされる数の細胞を容易に調製することができる。尚、SVF画分を低血清培養することによって選択的に増殖する細胞はCD13、CD90及びCD105陽性であり、CD31、CD34、CD45、CD106及びCD117陰性である（国際公開第２００６／００６６９２Ａ１号パンフレット）。 By culturing by the above method, ASCs can be selectively proliferated. In addition, since ASCs proliferating under the above culture conditions have high proliferative activity, the number of cells required for the cell sheet of the present invention can be easily prepared by subculture. Cells selectively proliferating by low serum culture of the SVF fraction are CD13, CD90 and CD105 positive and CD31, CD34, CD45, CD106 and CD117 negative (International Publication No. 2006 / 006692A1 pamphlet). .
続いて、上記の低血清培養によって選択的に増殖した細胞を回収する。回収操作は上記（３）の場合と同様に行えばよい。回収した細胞（ASCs）を用いることにより、ASCsを高純度で含有する細胞シートを調製することができる。 Subsequently, the cells selectively proliferated by the low serum culture are collected. The collection operation may be performed in the same manner as in the above (3). By using the collected cells (ASCs), a cell sheet containing ASCs with high purity can be prepared.
以上の方法で得られる細胞、即ち、SVF画分を低血清培養して増殖した細胞ではなく、脂肪組織から得た細胞集団を直接（SVF画分を得るための遠心処理を介することなく）低血清培養することによって増殖した細胞をASCsとして用いることにしてもよい。即ち本発明の一態様では、脂肪組織から得た細胞集団を低血清培養したときに増殖した細胞をASCsとして用いる。また、選択的培養（上記（３）及び（４））によって得られるASCsではなく、SVF画分（脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する）をそのまま用いることにしてもよい。この態様の細胞シートは、（ａ）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理に供し、次いで濾液を遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団（SVF画分）、又は（ｂ）脂肪組織をプロテアーゼ処理した後、濾過処理を経ることなく遠心処理することによって沈渣として回収される沈降細胞集団（SVF画分）を含有することになる。尚、ここでの「そのまま用いて」とは、選択的培養を経ることなく細胞シートの有効成分として用いることを意味する。 The cells obtained by the above method, that is, not the cells grown by culturing the SVF fraction in low serum but directly the cell population obtained from the adipose tissue (without going through the centrifugation to obtain the SVF fraction) Cells grown by serum culture may be used as ASCs. That is, in one embodiment of the present invention, cells that proliferate when a cell population obtained from adipose tissue is cultured in low serum are used as ASCs. Further, instead of ASCs obtained by selective culture (above (3) and (4)), an SVF fraction (containing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells) may be used as it is. The cell sheet of this embodiment is prepared by (a) precipitating a fat tissue with a protease, then subjecting it to filtration, and then centrifuging the filtrate to collect a sedimented cell population (SVF fraction) recovered as a sediment, or (b) fat After the tissue is treated with protease, it contains a sedimented cell population (SVF fraction) that is collected as a sediment by centrifuging without filtration. Here, “use as it is” means to use it as an active ingredient of a cell sheet without undergoing selective culture.
典型的には、ASCs又はASCsを含む細胞集団（SVF画分の細胞、上記選択培養（３）の結果得られた細胞、上記低血清培養（４）の結果得られた細胞、或いは市販の装置（例えば、Celution（登録商標）装置）等によって得られた細胞）を用いてシート状構造物（本発明の細胞シートと区別するために、当該構造物のことを「ASCsシート」と呼ぶ）を作製する。マンノースによって活性が高められたASCsを含有する本発明の細胞シートは、例えば、ASCsシートをマンノースで処理することによって得られる。ここでの処理は、マンノースを含有する溶液へのASCsシートの浸漬や、マンノースを含有する溶液のASCsシートへの塗布などによって行うことができる。浸漬の条件は例えば、35℃〜42℃の温度で1時間〜3週間である。好ましくは、より確実且つ効率的にASCsを活性化するために、低濃度のマンノースを用いて処理を行う。本発明において「低濃度」とは0.8(w/v)以下の濃度である。濃度の下限値は、本発明に特徴的な効果、即ち、ASCsの活性を高めるという効果を発揮できる限り特に限定されない。例えば、マンノースの濃度を0.2%(w/v)〜0.8(w/v)とする。マンノースは、木材、こんにゃく等に含まれるグルコマンナンやグアーガム等に含まれるガラクトマンナンを加水分解（酸分解、酵素分解など）することにより製造することができる。また、ヤシ油抽出残渣からも製造することができる（特開平１１−１３７２８８、特開２０１０−２２２６７）。一方、モリブデン酸塩を触媒としてグルコースから製造する方法や、微生物由来の酵素を利用した製造方法も報告されている（特開２００１−２３１５９２）。 Typically, ASCs or a cell population containing ASCs (SVF fraction cells, cells obtained as a result of the selective culture (3), cells obtained as a result of the low serum culture (4), or commercially available devices. (For example, cells obtained by a Celution (registered trademark) device) or the like) to form a sheet-like structure (in order to distinguish it from the cell sheet of the present invention, the structure is referred to as an “ASCs sheet”). Make it. The cell sheet of the present invention containing ASCs whose activity is enhanced by mannose can be obtained, for example, by treating the ASCs sheet with mannose. The treatment here can be performed by immersing the ASCs sheet in a solution containing mannose, or applying the solution containing mannose to the ASCs sheet. The immersion conditions are, for example, 1 hour to 3 weeks at a temperature of 35 ° C. to 42 ° C. Preferably, the treatment is performed with a low concentration of mannose in order to activate ASCs more reliably and efficiently. In the present invention, “low concentration” means a concentration of 0.8 (w / v) or less. The lower limit of the concentration is not particularly limited as long as the effect characteristic of the present invention, that is, the effect of enhancing the activity of ASCs can be exhibited. For example, the concentration of mannose is set to 0.2% (w / v) to 0.8 (w / v). Mannose can be produced by hydrolyzing (acid degradation, enzymatic degradation, etc.) galactomannan contained in glucomannan, guar gum and the like contained in wood, konjac and the like. Moreover, it can also manufacture from coconut oil extraction residue (Unexamined-Japanese-Patent No. 11-137288, Unexamined-Japanese-Patent No. 2010-22267). On the other hand, a method for producing from glucose using a molybdate as a catalyst and a production method using an enzyme derived from a microorganism have also been reported (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-231592).
ASCsシートの作製方法は特に限定されない。好ましい作製方法の一例を以下に示す。この作製方法では、以下のステップ(1)〜(4)を行う。
(1)磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞を用意するステップ；
(2)I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分として含むゲル材料と前記脂肪組織由来間葉系幹細胞との混合物を培養容器に播種するステップ；
(3)磁力を作用させることによって、前記混合物中の前記脂肪組織由来間葉系幹細胞を前記培養容器の培養面に引き寄せ、多層の細胞層を形成させるステップ；
(4)前記ゲル材料をゲル化させるステップ。
The method for producing the ASCs sheet is not particularly limited. An example of a preferable manufacturing method is shown below. In this manufacturing method, the following steps (1) to (4) are performed.
(1) preparing a magnetically labeled adipose tissue-derived mesenchymal stem cell;
(2) a step of seeding a culture container with a mixture of a gel material containing type I collagen, laminin, type IV collagen and entactin as active ingredients and the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells;
(3) a step of attracting the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in the mixture to the culture surface of the culture vessel by applying a magnetic force to form a multilayer cell layer;
(4) A step of gelling the gel material.
＜ステップ(1)：磁気ラベルした細胞の調製＞
ステップ(1)では、磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASCs）を用意する。「磁気ラベル」とは「磁性化」と同義であり、細胞に磁性粒子を導入したり、付着したりすること等によって、細胞を磁力で操作可能な状態にすることをいう。細胞の磁気ラベルは、好ましくは磁性粒子の導入又は付着によって行う。磁性粒子は、細胞が保持可能であり且つ細胞が保持した際に細胞に磁性を付加するものであればどのようなものでもよい。例えば、フェライトやマグネタイトなどの酸化鉄、酸化クロム、コバルトなどの磁性材料の粒子を磁性粒子として用いることができる。二種類以上の磁性粒子を組み合わせて用いてもよい。磁性粒子の粒径は特に限定しないが、例えば粒径が5nm〜100μmの磁性粒子を用いることができる。後述するリポソーム封入型の磁性粒子の場合は特に粒径が5nm〜25nmの磁性粒子を用いることが好ましい。この範囲の粒径の磁性粒子を用いることにより、リポソームの分散安定性を高めることができる。
<Step (1): Preparation of magnetically labeled cells>
In step (1), magnetically labeled adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs) are prepared. “Magnetic label” is synonymous with “magnetization” and refers to making a cell operable by magnetic force by introducing or adhering magnetic particles to the cell. Cell magnetic labeling is preferably done by introduction or attachment of magnetic particles. The magnetic particles may be any particles as long as they can be held by the cell and add magnetism to the cell when held by the cell. For example, particles of a magnetic material such as iron oxide such as ferrite and magnetite, chromium oxide, and cobalt can be used as the magnetic particles. Two or more kinds of magnetic particles may be used in combination. The particle size of the magnetic particles is not particularly limited. For example, magnetic particles having a particle size of 5 nm to 100 μm can be used. In the case of liposome-encapsulated magnetic particles described later, it is particularly preferable to use magnetic particles having a particle size of 5 nm to 25 nm. By using magnetic particles with a particle size in this range, the dispersion stability of the liposome can be enhanced.
磁性粒子の導入により細胞を磁気ラベルする場合は、細胞への導入に適した形態に調製した磁性粒子を使用する。このような形態の磁性粒子の具体例は、リポソーム等の脂質膜に封入（内包）された磁性粒子である。例えば、磁性粒子をリポソームに封入した磁性粒子封入リポソーム（ML: MagnetoliposomeあるいはMagnetite liposome）や磁性粒子を正電荷リポソームに封入した磁性粒子封入正電荷リポソーム（MCL: Magnetite cationic liposome）を用いることができる。これらのリポソーム封入型の磁性粒子では、リポソームの有する細胞親和性によって、細胞への付着及び取り込みが可能となる。特に、磁性粒子封入正電荷リポソームは、細胞表面との疎水性相互作用や電気的相互作用によって効率的に細胞内へと取り込まれる。尚、細胞に磁性粒子を取り込ませることによって、より確実に細胞を磁気ラベルすることができ、また多くの磁性粒子を細胞に保持させることができるため磁力の作用による細胞のコントロールが容易になる。 When magnetically labeling cells by introducing magnetic particles, magnetic particles prepared in a form suitable for introduction into cells are used. A specific example of such a magnetic particle is a magnetic particle encapsulated (encapsulated) in a lipid membrane such as a liposome. For example, magnetic particle-encapsulated liposomes (ML: Magnetoliposome or Magnetite liposome) in which magnetic particles are encapsulated in liposomes or magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes (MCL: Magnetite immobilized liposomes) in which magnetic particles are encapsulated in positively charged liposomes can be used. These liposome-encapsulated magnetic particles can be attached to and taken up by cells due to the cell affinity of the liposome. In particular, magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes are efficiently taken into cells by hydrophobic interaction and electrical interaction with the cell surface. In addition, by incorporating magnetic particles into the cells, the cells can be more reliably magnetically labeled, and many magnetic particles can be retained in the cells, so that the cells can be easily controlled by the action of magnetic force.
MCLの具体例として、マグネタイト等の磁性粒子が、正電荷脂質を含有するリポソームに封入された構造を備えるものを挙げることができる。当該MCLは表面に正電荷を帯びているために細胞への接着性に優れるとともに、リポソームを構成成分とするために細胞内へと取り込まれやすい。このような特性を備えるMCLは様々な細胞の磁気ラベルに適する。MCLは、例えばJpn.J. Cancer Res.第87巻第1179〜1183頁（1996年）に記載された磁性粒子封入正電荷リポソームの製造方法を参照して調製することができる。 Specific examples of MCL include those having a structure in which magnetic particles such as magnetite are encapsulated in liposomes containing positively charged lipids. Since the MCL has a positive charge on the surface, it has excellent adhesion to cells and is easily taken into cells because liposomes are used as constituent components. MCL with such characteristics is suitable for magnetic labeling of various cells. MCL can be prepared with reference to the method for producing magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes described in, for example, Jpn. J. Cancer Res. Vol. 87, pages 1179 to 1183 (1996).
一方、磁性粒子を付着することで細胞を磁気ラベルする場合には、細胞接着性物質と複合体を形成した磁性粒子を使用するとよい。例えば、細胞接着性物質が直接又は間接的に磁性粒子に結合して構成される複合体や、細胞接着性物質を含有する材料（多糖類や脂質など）で磁性粒子を被覆ないし封入して構成される複合体を使用することによって細胞に磁性粒子を付着することができる。尚、上記のリポソーム封入型の磁性粒子も細胞接着性であり、これを磁性粒子の付着による磁気ラベルに使用することもできる。 On the other hand, when magnetically labeling cells by adhering magnetic particles, magnetic particles formed in a complex with a cell adhesive substance may be used. For example, a structure in which a cell adhesive substance is directly or indirectly bonded to a magnetic particle, or a structure in which magnetic particles are coated or enclosed with a material (polysaccharide, lipid, etc.) containing a cell adhesive substance. The magnetic particles can be attached to the cells by using the complex. The liposome-encapsulated magnetic particles are also cell-adhesive, and can be used for magnetic labels by attaching magnetic particles.
細胞接着性物質は、幅広い細胞に対して接着性を有する物質と、特定の細胞に対して選択的な接着性を示す物質とに分類することができる。前者の例として細胞膜の構成成分に結合性又は接着性を有する化合物を挙げることができる。このような化合物として、フィブロネクチン、フィブロネクチンの一部であって例えばアミノ酸配列RGD（Arg-Gly-Asp、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）、KQAGDV（Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、リシン−グルタミン−アラニン−グリシン−アスパラギン酸−バリン）（配列番号１）、若しくはREDV（Arg-Glu-Asp-Val、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン）（配列番号２）を含むペプチド、同じく細胞接着性タンパク質であるラミニン、又はラミニンの一部であって例えばアミノ酸配列YIGSR（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）（配列番号３）、若しくはIKVAV（Ile-Lys-Val-Ala-Val、イソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン）（配列番号４）を含むペプチドなどを例示することができる。このような細胞接着性ペプチドの長さは、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸数個〜10数個程度、さらに好ましくは10個以下程度である。例えば、アミノ酸配列RGDを有するペプチドあるいはアミノ酸配列YIGSR（配列番号３）を有するペプチドであってアミノ酸残基数が10個以下のペプチドを好適に用いることができる。このような細胞接着性ペプチドは、好ましくは、ペプチドの末端側にこれらの特定アミノ酸配列を有し、より好ましくはそのN末端側にこれらのアミノ酸配列を有する状態でそのC末端で磁性粒子等の表面に結合されており、さらに好ましくは、そのN末端にこれらのアミノ酸配列のN末端残基が位置する。 Cell adhesive substances can be classified into substances having adhesion to a wide range of cells and substances exhibiting selective adhesion to specific cells. As an example of the former, a compound having a binding property or adhesiveness to a constituent component of a cell membrane can be mentioned. Examples of such compounds include fibronectin, a part of fibronectin, such as the amino acid sequence RGD (Arg-Gly-Asp, arginine-glycine-aspartic acid), KQAGDV (Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, lysine- A peptide containing glutamine-alanine-glycine-aspartic acid-valine (SEQ ID NO: 1) or RESV (Arg-Glu-Asp-Val, arginine-glutamic acid-aspartic acid-valine) (SEQ ID NO: 2), also cell adhesive Laminin, which is a protein, or a part of laminin, for example, the amino acid sequence YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, tyrosine-isoleucine-glycine-serine-arginine) (SEQ ID NO: 3) or IKVAV (Ile-Lys) Examples include peptides containing -Val-Ala-Val, isoleucine-lysine-valine-alanine-valine (SEQ ID NO: 4). The length of such a cell adhesion peptide is not particularly limited, but is preferably about several amino acids to several tens of amino acids, more preferably about 10 or less. For example, a peptide having the amino acid sequence RGD or a peptide having the amino acid sequence YIGSR (SEQ ID NO: 3) and having 10 or less amino acid residues can be preferably used. Such a cell adhesion peptide preferably has these specific amino acid sequences on the terminal side of the peptide, and more preferably has such amino acid sequences on the N-terminal side, such as magnetic particles at the C-terminal. More preferably, the N-terminal residue of these amino acid sequences is located at the N-terminus thereof.
一方、特定の細胞に対して選択的な接着性を示す物質の例として、特定の細胞がその表面に発現する分子（マーカー分子）に対する抗体を挙げることができる。ここでの抗体としてFab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFvなどの抗体断片を用いることもできる。低分子化合物やタンパク質、標識物質などを融合又は結合させて構成される融合抗体又は標識化抗体を使用してもよい。標識物質としては125I等の放射性物質、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチンなどを用いることができる。 On the other hand, as an example of a substance exhibiting selective adhesion to a specific cell, an antibody against a molecule (marker molecule) expressed on the surface of the specific cell can be mentioned. Antibody fragments such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, and dsFv can also be used as the antibody here. A fusion antibody or a labeled antibody constituted by fusing or binding a low molecular weight compound, protein, labeling substance or the like may be used. As the labeling substance, radioactive substances such as 125 I, peroxidase, β-D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, etc. are used. be able to.
細胞接着性物質を直接又は間接的に磁性粒子に結合することによって、細胞接着性磁性粒子を構築することができる。例えば、市販の磁性粒子Dynabeads（登録商標）に対して、ビオチンとストレプトアビジンの結合反応を利用して抗体を結合することによって、細胞接着性磁性粒子を得ることができる。その他、市販の磁性粒子リゾビスト（登録商標）、フェリデックス等をアミノシランカップリングして、細胞接着性物質が結合した磁性粒子を調製することができる。また、表面に細胞接着性物質を有するリポソーム（即ち、細胞接着性物質を含有したリポソーム又は細胞接着性物質が表面に付着ないし結合したリポソーム）に磁性粒子を封入することによっても細胞接着性磁性粒子を構築することができる。細胞接着性物質の種類に応じた各種の結合形成反応を利用することによって、このような磁性粒子封入リポソームを作製することが可能である。必要に応じて適切なリンカーを用いることもできる。例えば、リポソームへRGDペプチドを結合させるためには、ジスルフィド結合の形成による方法が好適である。この方法では、RGD配列のC末端側にシステインが付加されたRGDC配列（配列番号５）からなるペプチドを用いることが好ましい。かかるペプチドを使用することによって、SH基を有するリポソーム側との間に容易にジスルフィド結合を形成させることができる。尚、細胞接着性ペプチドをリポソームに結合させるためのリンカーはシステインに限られるものではなく、他のアミノ酸やペプチドを用いてもよい。 Cell-adhesive magnetic particles can be constructed by binding cell-adhesive substances directly or indirectly to magnetic particles. For example, cell-adhesive magnetic particles can be obtained by binding an antibody to commercially available magnetic particles Dynabeads (registered trademark) using a binding reaction between biotin and streptavidin. In addition, commercially available magnetic particle Rhizovist (registered trademark), ferridex and the like can be aminosilane coupled to prepare a magnetic particle to which a cell adhesive substance is bound. Cell-adhesive magnetic particles can also be obtained by encapsulating magnetic particles in liposomes having cell-adhesive substances on their surfaces (that is, liposomes containing cell-adhesive substances or liposomes having cell-adhesive substances attached or bound to the surface). Can be built. Such magnetic particle-encapsulated liposomes can be prepared by utilizing various bond forming reactions depending on the type of cell adhesive substance. An appropriate linker can also be used as necessary. For example, in order to bind the RGD peptide to the liposome, a method by forming a disulfide bond is suitable. In this method, it is preferable to use a peptide consisting of an RGDC sequence (SEQ ID NO: 5) in which cysteine is added to the C-terminal side of the RGD sequence. By using such a peptide, a disulfide bond can be easily formed between the liposome side having an SH group. The linker for binding the cell adhesive peptide to the liposome is not limited to cysteine, and other amino acids and peptides may be used.
細胞接着性物質との複合体を形成した磁性粒子（細胞接着性磁性粒子）の具体例として、MCLのリポソーム表面にアミノ酸配列RGDC（配列番号５）からなるペプチドを結合した磁性粒子封入リポソームを挙げることができる。細胞接着性磁性粒子の他の具体例として、MCLのリポソーム表面に抗体を結合して得られる抗体固定化磁性粒子封入リポソーム（AML: Antibody-immobilized magnetite liposome）を挙げることができる。AMLは、マグネタイト等の磁性粒子がリポソームで封入されるとともに、リポソームに抗体が固定化された構造を備える。抗体としては磁性ラベルの対象の細胞に特異的に結合するものが選択される。これによって、細胞特異的に磁気ラベルすることが可能となる。AMLは、例えばJ. Chem. Eng. Jpn.第34巻第66〜72頁（2001年）に記載された方法を参照して調製すればよい。 Specific examples of magnetic particles (cell-adhesive magnetic particles) formed with a complex with a cell-adhesive substance include magnetic particle-encapsulated liposomes in which a peptide consisting of the amino acid sequence RGDC (SEQ ID NO: 5) is bound to the MCL liposome surface. be able to. Other specific examples of cell-adhesive magnetic particles include antibody-immobilized magnetite liposomes (AML) obtained by binding an antibody to the MCL liposome surface. AML has a structure in which magnetic particles such as magnetite are encapsulated in liposomes, and an antibody is immobilized on the liposomes. An antibody that specifically binds to the target cell of the magnetic label is selected. This makes it possible to perform magnetic labeling in a cell-specific manner. AML may be prepared with reference to the method described in, for example, J. Chem. Eng. Jpn. 34, 66-72 (2001).
磁気ラベルしたASCsは、用意したASCsを磁気ラベルに供することによって調製することができる。 Magnetically labeled ASCs can be prepared by subjecting the prepared ASCs to a magnetic label.
＜ステップ(2)：細胞とゲル材料との混合＞
ステップ(1)に続くステップ(2)では、ゲル材料とASCsとの混合物を培養容器に播種する。ゲル材料として、間質の主成分であるI型コラーゲンと、基底膜を構成する成分であるラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを用いることができる。ゲル材料を構成する各有効成分（I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン、エンタクチン）の由来としてはウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、チンパンジー、及びヒトを例示できる。また、遺伝子組換え技術で調製した（リコンビナント）ものを使用してもよい。
<Step (2): Mixing cells and gel material>
In step (2) following step (1), a mixture of gel material and ASCs is seeded in a culture vessel. As the gel material, type I collagen which is a main component of stroma and laminin, type IV collagen and entactin which are components constituting the basement membrane can be used. Examples of the origin of each active ingredient (type I collagen, laminin, type IV collagen, entactin) constituting the gel material include horses, cows, pigs, sheep, monkeys, chimpanzees, and humans. Moreover, you may use what was prepared by the gene recombination technique (recombinant).
ゲル材料を構成する各有効成分の含有比率は特に限定されない。各有効成分の含有比率（重量比）を例示すれば、コラーゲンI：ラミニン：コラーゲンIV：エンタクチン＝１：１０〜２００：５〜１００：１〜５０である。好ましくは、コラーゲンI：ラミニン：コラーゲンIV：エンタクチン＝１：２０〜１００：１０〜５０：２〜２５とする。 The content ratio of each active ingredient constituting the gel material is not particularly limited. For example, the content ratio (weight ratio) of each active ingredient is collagen I: laminin: collagen IV: entactin = 1: 10 to 200: 5 to 100: 1 to 50. Preferably, collagen I: laminin: collagen IV: entactin = 1: 20 to 100: 10 to 50: 2 to 25.
ゲル材料は細胞の生存、維持に必要な培地成分を含有する。培地の例を挙げると、ダルベッコ変法イーグル（DMEM）培地（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、RPMI 1640培地（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、SmGM培地（CAMBREX社）である。培地成分の他、他のゲル化成分（III型コラーゲン、VIII型コラーゲンなど）、細胞接着因子（フィブロネクチンなど）、血清（FBS、ヒト血清等）、細胞増殖因子（EGF、PDGF、IGF-1、TGF-βなど）、分化誘導因子、無機塩類、ビタミン類、保存剤、防腐剤等がゲル材料に添加されていてもよい。 The gel material contains medium components necessary for cell survival and maintenance. Examples of the medium include Dulbecco's modified Eagle (DMEM) medium (Nacalai Tesque, Sigma, Gibco, etc.), RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque, Sigma, Gibco, etc.), SmGM medium (CAMBREX Company). In addition to medium components, other gelling components (type III collagen, type VIII collagen, etc.), cell adhesion factors (fibronectin, etc.), serum (FBS, human serum, etc.), cell growth factors (EGF, PDGF, IGF-1, TGF-β, etc.), differentiation-inducing factors, inorganic salts, vitamins, preservatives, preservatives and the like may be added to the gel material.
好ましい一態様では、I型コラーゲンを有効成分とした第１ゲル要素と、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分とした第２ゲル要素を予め用意しておき、これらのゲル要素とASCsとを混合することによって、ゲル材料とASCsとの混合物を得る。例えば、第１ゲル要素はI型コラーゲンを培地や緩衝液（例えばリン酸緩衝液）、或いは生理食塩水等に溶解・希釈することによって調製すればよい。第２ゲル要素についても同様の方法で調製することができるが、上記有効成分（ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチン）を含む市販の試薬（例えば、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社が販売するBDマトリゲルTM基底膜マトリックス等）を用いることにしてもよい。尚、第２ゲル中の有効成分の含有比率は特に限定されないが、好ましくは含有比率（重量比）をラミニン：IV型コラーゲン：エンタクチン＝３〜１５：２〜８：１とする。 In a preferred embodiment, a first gel element containing type I collagen as an active ingredient and a second gel element containing laminin, type IV collagen and entactin as active ingredients are prepared in advance, and these gel elements and ASCs are prepared. By mixing, a mixture of gel material and ASCs is obtained. For example, the first gel element may be prepared by dissolving and diluting type I collagen in a medium, a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution), physiological saline or the like. The second gel element can be prepared in the same manner, but a commercially available reagent containing the above active ingredients (laminin, type IV collagen and entactin) (for example, BD Matrigel ™ base sold by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) A membrane matrix or the like may be used. The content ratio of the active ingredient in the second gel is not particularly limited, but the content ratio (weight ratio) is preferably laminin: type IV collagen: entactin = 3-15: 2-8: 1.
ゲル成分による適度な間隔が細胞間に形成されるようにASCsの密度を設定することによって、移植効率や生着率の高いASCsシートを得ることが可能となる。そこで、混合物における細胞密度が例えば1.0×105細胞/cm3〜1.0×107細胞/cm3、好ましくは1.0x106細胞/cm3〜5.0×106細胞/cm3となるように、使用するASCsの数を設定するとよい。 By setting the density of ASCs so that an appropriate interval due to the gel component is formed between the cells, it is possible to obtain an ASCs sheet with high transplantation efficiency and engraftment rate. Therefore, the cell density in the mixture is, for example, 1.0 × 10 5 cells / cm 3 to 1.0 × 10 7 cells / cm 3 , preferably 1.0 × 10 6 cells / cm 3 to 5.0 × 10 6 cells / cm 3 Set the number of ASCs to be used.
ゲル材料とASCsとの混合物が播種される培養容器は特に限定されない。即ち、各種培養容器を使用可能である。好ましくは、培養皿（ペトリ皿、マルチウェルプレートなど）のように、上方が開放した培養容器を用いる。一方、形成されるASCsシートの回収を容易にすべく、低接着性の培養面を備える培養容器を採用することが好ましい。「低接着性の培養面」とは、細胞の接着性を高めるためにポリリジン等で表面処理（コート）された培養面とは対照的に、表面無処理（ノンコート）或いは非接着性又は低接着性材料による表面処理（コート）等によって細胞が接着し難い培養面をいう。低接着性の培養面を備える培養容器は各種市販されており、例えば、超低接着性細胞培養皿であるUltra Low Attachment Culture Dish（コーニング社）、アガロースゲルやアルギン酸ゲルをコートした培養皿、浮遊細胞を培養する培養皿を用いることができる。 The culture vessel in which the mixture of gel material and ASCs is seeded is not particularly limited. That is, various culture vessels can be used. Preferably, a culture container having an open top is used, such as a culture dish (such as a Petri dish or a multiwell plate). On the other hand, in order to facilitate recovery of the formed ASCs sheet, it is preferable to employ a culture vessel having a low adhesion culture surface. In contrast to a culture surface that has been surface-treated (coated) with polylysine or the like to improve cell adhesion, the “low-adhesive culture surface” is a surface-untreated (non-coated) or non-adhesive or low-adhesive surface. It refers to a culture surface where cells are difficult to adhere by surface treatment (coating) with a functional material. Various types of culture vessels with a low-adhesion culture surface are commercially available, such as Ultra Low Attachment Culture Dish (Corning), a culture dish coated with agarose gel or alginate gel, floating A culture dish for culturing cells can be used.
本発明の一態様では、着脱可能な仕切りによる、上方が開放された区画が培養面上に形成されており、当該区画内にゲル材料とASCsとの混合物が播種される。この態様の場合、限定された領域内に細胞が封じ込められることになり、最終的に得られるASCsシートのサイズが培養面のサイズに依存しなくなる。従って、培養面のサイズの如何に拘わらず、自由にASCsシートのサイズを設計可能になる。また、ASCsシートの形状は区画（例えばリング状）の形状に依存し、様々な形状でASCsシートを提供可能となる。即ち、ASCsシートの形状についても、その設計自由度が飛躍的に高まる。更には、区画の使用によれば、ASCsシートを構成する細胞層の細胞密度も調整可能である。 In one embodiment of the present invention, a compartment having an open top is formed on the culture surface by a removable partition, and a mixture of the gel material and ASCs is seeded in the compartment. In this embodiment, the cells are confined within a limited area, and the size of the finally obtained ASCs sheet does not depend on the size of the culture surface. Therefore, it becomes possible to freely design the size of the ASCs sheet regardless of the size of the culture surface. Further, the shape of the ASCs sheet depends on the shape of the section (for example, a ring shape), and the ASCs sheet can be provided in various shapes. In other words, the degree of freedom in designing the shape of the ASCs sheet is greatly increased. Furthermore, according to the use of the compartment, the cell density of the cell layer constituting the ASCs sheet can be adjusted.
＜ステップ(3)：磁力による細胞層の形成＞
ゲル材料とASCsとの混合物を培養容器に播種した後、例えば、培養面の後方（即ち培養面の裏面側）から磁力を作用させ、混合物中のASCsを培養面に引き寄せる。具体的には例えば、培養面の後方に磁石を配置して当該操作を行う。培養容器として培養皿を使用する場合、典型的には、磁石の上に培養皿を設置することになる。培養皿の場合は通常、内底面が培養面となるが、容器の種類や形態の如何によっては容器の内底面以外の内壁面が培養面に設定される場合がある。
<Step (3): Formation of cell layer by magnetic force>
After the mixture of the gel material and ASCs is seeded in the culture vessel, for example, a magnetic force is applied from the rear of the culture surface (that is, the back side of the culture surface), and the ASCs in the mixture are attracted to the culture surface. Specifically, for example, a magnet is disposed behind the culture surface to perform the operation. When using a culture dish as a culture container, the culture dish is typically installed on a magnet. In the case of a culture dish, the inner bottom surface is usually the culture surface, but depending on the type and form of the container, the inner wall surface other than the inner bottom surface may be set as the culture surface.
使用する磁石の種類は特に限定されない。例えば、永久磁石又は電磁石を用いることができる。電磁石を使用すれば、通電状態の操作によって磁力を制御可能である。永久磁石として、鋳造磁石（アルニコ磁石、鉄・クロム・コバルト磁石を含む）、塑性加工磁石（Fe-Mn系、Fe-Cr-Co系を含む）、フェライト磁石（Ba系、Sr系を含む）、希土類磁石（Sm-Co系、Nd-Fe-B系を含む）、ボンド磁石（Sm-Co系、Nd-Fe-B系、Sm-Fe-N系を含む）などを使用することができる。 The kind of magnet to be used is not particularly limited. For example, a permanent magnet or an electromagnet can be used. If an electromagnet is used, the magnetic force can be controlled by an operation in an energized state. Permanent magnets include cast magnets (including Alnico magnets, iron / chromium / cobalt magnets), plastic working magnets (including Fe-Mn and Fe-Cr-Co systems), ferrite magnets (including Ba and Sr systems) , Rare earth magnets (including Sm-Co system, Nd-Fe-B system), bond magnets (including Sm-Co system, Nd-Fe-B system, Sm-Fe-N system), etc. can be used .
磁力を作用させる時間は、多層の細胞層が形成される限りにおいて特に限定されない。使用する磁石の種類、磁気ラベルに使用する磁性粒子の種類、磁気ラベルされた細胞の量や密度などを考慮して作用時間を設定すればよいが、例えば30分〜2時間にわたって磁力を作用させる。最適な作用時間は予備実験を通して設定可能である。尚、磁力の強さ及び作用時間を調節することによって、所望の厚さ及び／又は所望の細胞密度の細胞層を形成することが可能である。 The time for applying the magnetic force is not particularly limited as long as a multilayer cell layer is formed. The action time may be set considering the type of magnet used, the type of magnetic particles used for the magnetic label, the amount and density of the magnetically labeled cells, etc., but for example, the magnetic force is applied for 30 minutes to 2 hours . The optimal working time can be set through preliminary experiments. It is possible to form a cell layer having a desired thickness and / or a desired cell density by adjusting the strength of the magnetic force and the operation time.
磁石から放出される磁力を直接利用するのではなく、磁石から放出される磁力を他の部材に伝搬させた後に利用することにしてもよい。例えば、Fe、Co、Ni、Fe-C、Fe-Ni、Fe-Co、Fe-Ni-Co-Al、Fe-Ni-Cr、SmCo5、Nd2Fe14B、Fe3O4、γ-Fe2O3、BaFe12O19等のように磁力を伝搬する特性の部材を磁石に接触又は近接させることにすれば、当該部材の表面（端面など）から磁力を放出させることが可能である。 The magnetic force emitted from the magnet may not be used directly, but may be used after propagating the magnetic force emitted from the magnet to another member. For example, Fe, Co, Ni, Fe-C, Fe-Ni, Fe-Co, Fe-Ni-Co-Al, Fe-Ni-Cr, SmCo 5 , Nd 2 Fe 14 B, Fe 3 O 4 , γ- If a member having the property of propagating magnetic force such as Fe 2 O 3 or BaFe 12 O 19 is brought into contact with or close to the magnet, it is possible to release the magnetic force from the surface (end face, etc.) of the member. .
本発明の一態様では、形成された細胞層の上方に存在する余分なゲル材料（即ち上澄み液）を除去する（ステップ(3')）。当該操作を行った場合には、細胞層の上に余分なゲル層のないASCsシートが得られることになる。当該細胞シートは取り扱いの面はもとより、治療効果の点でも有利である。尚、ゲル材料の除去は、例えば、スポイトなどの吸引器を用いて行うことができる。 In one embodiment of the present invention, excess gel material (ie, supernatant) existing above the formed cell layer is removed (step (3 ′)). When this operation is performed, an ASC sheet without an excess gel layer on the cell layer is obtained. The cell sheet is advantageous not only in terms of handling but also in terms of therapeutic effect. The gel material can be removed using, for example, an aspirator such as a dropper.
＜ステップ(4)：ゲル化＞
次に、ゲル材料をゲル化させる。典型的には、培養容器ごと、ゲル化に必要な温度（例えば37℃）でインキュベートする。ゲル化に必要な時間はゲル材料の組成や実施スケール等によって変動し得るが、例えば30分〜1時間である。
<Step (4): Gelation>
Next, the gel material is gelled. Typically, each culture vessel is incubated at a temperature required for gelation (eg, 37 ° C.). The time required for gelation may vary depending on the composition of the gel material, the implementation scale, etc., but is, for example, 30 minutes to 1 hour.
ゲル化によって形成されたシート状構造物を直ちに回収することにしてもよいが、培養容器に培地を添加し、シート状構造物を培地中に維持することが好ましい。当該操作（ステップ(5)）を加えることによって、シート状構造物、即ちASCsシートの品質劣化を防止できる。ここでの培地は、シート状構造物内の細胞の維持に適したものが好ましく、例えばMEM培地等が使用できる。この操作の後、更に、ASCsが増殖可能な温度条件下で培養することにしてもよい（ステップ(6)）。この操作はシート状構造物（細胞シート）内のASCsの維持、増殖に有効であり、品質劣化を防止する。ここでの温度条件の例として35℃〜38℃を挙げることができる。好ましくは37℃で培養する。尚、培養容器から回収されたシート状構造物（ASCsシート）は、通常、必要に応じて別容器に移された後、使用直前まで保存される。保存は低温（例えば4℃〜15℃）で行うとよい。このような保存を経ることなく使用に供する（即ち用時調製）ことにしてもよい。 Although the sheet-like structure formed by gelation may be immediately recovered, it is preferable to add a medium to the culture vessel and maintain the sheet-like structure in the medium. By adding the operation (step (5)), quality deterioration of the sheet-like structure, that is, the ASCs sheet can be prevented. The medium here is preferably a medium suitable for maintaining cells in the sheet-like structure, and for example, a MEM medium or the like can be used. After this operation, ASCs may be further cultured under temperature conditions that allow growth (step (6)). This operation is effective for maintaining and proliferating ASCs in the sheet-like structure (cell sheet), and prevents quality deterioration. Examples of temperature conditions here include 35 ° C to 38 ° C. It is preferably cultured at 37 ° C. In addition, the sheet-like structure (ASCs sheet) collected from the culture container is usually stored until just before use after being transferred to another container as necessary. Storage is preferably performed at a low temperature (eg, 4 ° C. to 15 ° C.). It may be used (that is, prepared at the time of use) without undergoing such storage.
以上の作製方法によれば、I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを含むゲルに包埋された状態でASCsが多層を形成したシートが得られる。特に特徴的な構造として、細胞層を構成する細胞間に上記ゲルが存在する。即ち、基本的には、細胞同士が接着ないし接しておらず、間にゲルが介在した状態で細胞が配列している。典型的には、このような特徴的な構造が細胞層の少なくとも50%以上、好ましくは70%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上において認められる。また、細胞層を形成する細胞は磁気ラベルされている。但し、培養操作を含む作製方法を適用し、細胞の増殖が生じた場合には、磁気ラベルされていない細胞も存在することになる。 According to the above production method, a sheet in which ASCs are formed in multiple layers in a state of being embedded in a gel containing type I collagen, laminin, type IV collagen and entactin can be obtained. As a particularly characteristic structure, the gel exists between cells constituting the cell layer. That is, basically, the cells are not adhered or in contact with each other, and the cells are arranged with a gel interposed therebetween. Typically, such characteristic structures are found in at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of the cell layer. The cells forming the cell layer are magnetically labeled. However, when a production method including a culture operation is applied and cell proliferation occurs, cells that are not magnetically labeled are also present.
ここで、予めマンノースで処理したASCsを用いてシート状構造物を作製すれば、その後にマンノース処理を行うことなく、本発明の細胞シートが得られる。予めマンノースで処理されたASCsは、例えば、マンノースを含有する培地を用いてASCsを培養することによって得ることができる。好ましくは、低濃度でマンノースを含有する培地を用いる。 Here, if a sheet-like structure is prepared using ASCs previously treated with mannose, the cell sheet of the present invention can be obtained without subsequent mannose treatment. ASCs previously treated with mannose can be obtained, for example, by culturing ASCs using a medium containing mannose. Preferably, a medium containing mannose at a low concentration is used.
本発明の別の態様（第２態様）では、細胞シートにマンノースを含有させ、シート内でマンノースによるASCsの活性化が生ずるようにする。好ましくは、低濃度でマンノースを含有させる。この態様の細胞シートは、例えば、上記の手順でASCsシートを作製する際のゲル化材料にマンノースを添加しておくことによって作製することができる。 In another embodiment (second embodiment) of the present invention, mannose is contained in the cell sheet so that ASCs are activated by mannose in the sheet. Preferably, mannose is contained at a low concentration. The cell sheet of this embodiment can be produced, for example, by adding mannose to the gelling material used when producing the ASCs sheet by the above procedure.
本発明の更に別の一態様（第３態様）の細胞シートは、それ自体にマンノースを含むのではなく、その使用時に、マンノース含有組成物がシート面に貼付又は塗布されるという特徴を有する。例えば、マンノースを含有する溶液ないしゲルを用意しておき、ASCsシート（この態様では、本発明の細胞シートに該当することになる）の移植の前又は後に、シート面にこれを塗布する。或いは、マンノースを含有するシート（例えばコラーゲンシート）を用意し、ASCsシートを移植した後、その上に当該シートを載置ないし貼付する。この態様においても、好ましくは低濃度のマンノースが用いられる。また、ここでのゲルを調製するための材料として、生体親和性が高いもの（例えばヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリン糊）を用いることが好ましい。 The cell sheet according to yet another aspect (third aspect) of the present invention does not contain mannose per se, but has a feature that the mannose-containing composition is applied or applied to the sheet surface when used. For example, a solution or gel containing mannose is prepared, and this is applied to the sheet surface before or after transplantation of an ASCs sheet (in this embodiment, which corresponds to the cell sheet of the present invention). Or after preparing the sheet | seat (for example, collagen sheet) containing a mannose and transplanting an ASCs sheet | seat, the said sheet | seat is mounted or stuck on it. Also in this embodiment, a low concentration of mannose is preferably used. Moreover, it is preferable to use a material with high biocompatibility (for example, hyaluronic acid, collagen, fibrin glue) as a material for preparing the gel here.
本発明の細胞シートは、膵液瘻の予防又は治療に用いられる。膵液瘻の成因は特に限定されない。成因の例を挙げれば、膵・消化管吻合の縫合不全、膵臓に対する各種手術（膵体尾部切除、ネクロゼクトミー、ドレナージ手術）、脾臓摘出時の膵尾部損傷、胃切除術、大腸手術時の膵損傷、外傷による膵損傷である。本発明を適用するにあたっては、膵臓の切除部位（切除面）、外傷部位、患部（瘻孔及びその周囲）等に本発明の細胞シートを載置ないし貼付する。シート状構造物であるため通常は良好な接着性が得られるが、接着性ないし保持性を更に高めるため、フィブリン糊など、既存の接着材を併用することにしてもよい。また、複数枚の細胞シートを用意し、一部又は全部が重なるように適用してもよい。上記第３態様の場合には、細胞シート(ASCsシート）の移植の際、必要な処置（マンノース含有溶液／ゲルの塗布、マンノース含有シートの載置／貼付など）を行う。 The cell sheet of the present invention is used for prevention or treatment of pancreatic fistula. The origin of pancreatic fistula is not particularly limited. Examples of possible causes include failure of pancreatic / gastrointestinal anastomosis, various operations on the pancreas (pancreas tail excision, necrozectomy, drainage surgery), pancreatic tail injury during splenectomy, gastrectomy, colon surgery Pancreatic damage, pancreatic damage due to trauma. In applying the present invention, the cell sheet of the present invention is placed or affixed on the excision site (excision surface), trauma site, affected area (fistula and its surroundings) of the pancreas, and the like. Since it is a sheet-like structure, usually good adhesiveness can be obtained, but in order to further improve the adhesiveness or retention, an existing adhesive such as fibrin glue may be used in combination. Alternatively, a plurality of cell sheets may be prepared and applied so that part or all of them overlap. In the case of the third aspect, necessary treatments (application of a mannose-containing solution / gel, placement / sticking of a mannose-containing sheet, etc.) are performed at the time of transplantation of a cell sheet (ASCs sheet).
１．活性化されたASCs含有シート（細胞シート）の作製
以下の(1)〜(5)によってASCsシートを作製した。
1. Production of activated ASCs-containing sheet (cell sheet) ASCs sheets were produced by the following (1) to (5).
(1)磁気ラベル
マイクロチューブにマウスASCs（コラゲナーゼ処理（1〜3%コラゲナーゼ、37℃、60〜90分）および遠心処理（1200rpm、5分間）で調製）を懸濁させて浮遊状態にし、磁性ナノ微粒子(MCL)を添加した。37℃で2時間インキュベートし、MCLを細胞に取り込ませた。
(1) Magnetic label Suspend mouse ASCs (collagenase treatment (1 to 3% collagenase, 37 ° C, 60 to 90 minutes) and centrifugation treatment (1200 rpm, 5 minutes)) in a microtube to make it float and magnetic Nanoparticles (MCL) were added. The cells were incubated at 37 ° C. for 2 hours, and MCL was taken up into the cells.
(2)ゲル材料の用意
I型コラーゲン（3mg/ml）、10xMEM、緩衝液（NaHCO3)及びFBSを7:1:1:1の比率（重量比）で混合し、コラーゲンゲル（1ml中にI型コラーゲンを2.1mg含有する）とした。一方、ラミニン（560mg/ml）、IV型コラーゲン（310mg/ml）及びエンタクチン（80mg/ml）を含む基底膜ゲルを用意した。尚、以下の実験では基底膜ゲルとしてBDマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）（組成比率はラミニン56%、IV型コラーゲン31%、エンタクチン8%であり、bFGFを0〜0.1 pg/ml、EGFを0.5〜1.3 ng/ml、IGF-1を15.6 ng/ml、PDGFを12 pg/ml、NGFを0.2 ng/ml未満、TGF-βを2.3 ng/ml含有する）を使用した。
(2) Preparation of gel material
Type I collagen (3mg / ml), 10xMEM, buffer solution (NaHCO 3 ) and FBS are mixed at a ratio (weight ratio) of 7: 1: 1: 1 and collagen gel (containing 2.1mg of type I collagen in 1ml) ). On the other hand, a basement membrane gel containing laminin (560 mg / ml), type IV collagen (310 mg / ml) and entactin (80 mg / ml) was prepared. In the following experiment, BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) (composition ratio is laminin 56%, type IV collagen 31%, entactin 8%, bFGF 0-0.1 pg / ml, EGF 0.5-1.3 ng / ml, IGF-1 15.6 ng / ml, PDGF 12 pg / ml, NGF less than 0.2 ng / ml and TGF-β 2.3 ng / ml).
(3)細胞とゲル材料の混合及び播種
磁気ラベルした細胞（細胞数1.7x106(100μl)）、コラーゲンゲル（170μl）及び基底膜ゲル（30μl）を混和し、低接着性ディッシュ（Ultra Low Attachment Culture Dish：コーニング社）に播種した。
(3) Mixing and seeding of cells and gel material Mix magnetically labeled cells (cell number 1.7x10 6 (100 µl)), collagen gel (170 µl) and basement membrane gel (30 µl), and mix with a low adhesion dish (Ultra Low Attachment). Culture Dish: Corning).
(4)磁力による細胞層の形成
ディッシュの底面に磁石を配置して磁力を印加し、細胞を培養面に引き寄せた。細胞層が形成された段階で余分な上澄み液を除いた。
(4) Formation of cell layer by magnetic force A magnet was placed on the bottom of the dish and magnetic force was applied to draw the cells to the culture surface. When the cell layer was formed, excess supernatant was removed.
(5)ゲル化
37℃で1時間インキュベートし、ゲルを固める。その後、培地を添加した。
(5) Gelation
Incubate at 37 ° C for 1 hour to solidify the gel. Thereafter, the medium was added.
上記方法で作製したASCsシートをマンノース溶液で処理した。具体的には、0.4%(w/v)マンノース（椰子の実由来、純度99.7%）を添加した培地にASCsシートを１時間（37℃）、浸漬した（マンノース処理ASCsシート）。比較のために、マンノース溶液で処理しないASCsシートも用意した。 The ASCs sheet produced by the above method was treated with a mannose solution. Specifically, the ASCs sheet was immersed for 1 hour (37 ° C.) in a medium supplemented with 0.4% (w / v) mannose (derived from palm fruit, purity 99.7%) (mannose-treated ASCs sheet). For comparison, ASCs sheets not treated with mannose solution were also prepared.
２．膵液瘻モデルを用いた移植実験
（１）方法
（１−１）使用動物
7〜8週齢Wistar/STラット：体重は255g〜314g（試験開始の少なくとも4日前に日本SLC社より購入した）
飼育環境：12時間ごとに明暗が切り替わり、室内温度23±2℃、湿度55±10%を維持
飼料：日本クレア社のCE-2
2. Transplantation experiment using pancreatic fistula model (1) Method (1-1) Animal used
7-8 week old Wistar / ST rats: body weight 255g-314g (purchased from Japan SLC at least 4 days before the start of the study)
Breeding environment: Light and dark change every 12 hours, maintain indoor temperature 23 ± 2 ℃, humidity 55 ± 10% Feed: Japan Claire's CE-2
（１−２）手術前処置
絶飲食は行わず、摂食、飲水は自由とした。
(1-2) Pre-operative treatment No food or drink was performed, and eating and drinking were free.
（１−３）膵液瘻モデルの手術手技（図１）
体位：ラットを仰臥位とし約20×30cmのコルク板にガムテープなどを用いて四肢を固定した。
麻酔方法：マスクを用いた吸入麻酔にて、イソフルレン（商品名：エスカイン、ファイザー株式会社）を流量1L/分で、麻酔導入時に濃度5%、維持麻酔は濃度1.5〜2.0%にて行う。呼吸状態、覚醒状態に応じて麻酔の濃度を変更して行う。
手術：ラット腹部には体毛を認めるが剃毛は行わず、消毒用アルコールにて腹部の表皮の消毒を行う。皮切は腹部正中切開にて行う。消毒後、腹部正中の表皮に剣状突起から尾側にメスを用いて約3.5cmの切開を加えた。表皮の切開による出血は圧迫止血を行う。表皮を切開したのち腹直筋の白線、腹膜を切開し腹腔内に到達する。開創器をかけ胃を牽引し、大網及び脾臓を確認する。大網および脾臓を体外へ引出し、胃大網動静脈を温存するように、胃大網動静脈の尾側に沿って大網を切開する。これだけでは脾臓が短胃動静脈に固定されたままであり、このあとの膵臓の切離や細胞シートの貼付が行いにくいので、短胃動静脈も切離し脾臓および膵臓の可動性を良好にする。切離した血管より出血を認める場合もあるが、これらは圧迫による止血が可能であった。ラットの膵臓は大網と連続しており明確な境界がないため、脾動静脈を基準としてこの動静脈の約0.5mm手前まで膵臓に切れ込みをいれる。その後膵断端をセッシで挫滅を行う。これはヒトの膵臓においても膵断端を強く把持すると術後の膵液瘻の発生が上昇するため、膵液瘻の発生をより起こりやすくするために行う。次に、外に引っ張り出しておいた大網および脾臓などの臓器を一旦腹腔内の所定の位置に戻す。続いて、開創器を外し、生食20ｍｌ（大塚生食注（登録商標）、大塚製薬株式会社）を湿らせたキムワイプ（登録商標）（日本製紙クレシア株式会社）で開腹部を覆い、腹腔内の乾燥を防止しながら30分放置する。30分後再び胃を牽引し膵断端を直視下に確認し、止血が完全であることを確認した上で各種シート（ASCsシート、マンノース処理ASCsシート）を貼付した。また、コントロール群ではシートは貼付しなかった。そのまま1分ほどシートが定着するのを待ってシートがずれないように胃をもとの位置に戻す。腹膜、腹直筋及び表皮を1-0ナイロン（株式会社ベアーメディック）で連続縫合する。ラットは手術終了後速やかにケージに戻し手術終了とする。
(1-3) Surgical technique of pancreatic fistula model (Fig. 1)
Body position: Rats were placed in a supine position, and the extremities were fixed to a cork plate of about 20 × 30 cm using gum tape or the like.
Anesthesia method: Inhalation anesthesia using a mask, isoflurane (trade name: Escaine, Pfizer Inc.) at a flow rate of 1 L / min, concentration 5% at the time of induction of anesthesia, and maintenance anesthesia at a concentration of 1.5-2.0%. This is done by changing the concentration of anesthesia according to the respiratory state and arousal state.
Surgery: The rat abdomen has body hair but is not shaved, and the abdominal epidermis is disinfected with rubbing alcohol. Skin incision is performed by midline abdominal incision. After disinfection, an incision of about 3.5 cm was made on the epidermis in the midline of the abdomen using a knife from the xiphoid process to the caudal side. Hemorrhage due to incision of the epidermis is compressed and stopped. After incising the epidermis, the white line of the rectus abdominis muscle and the peritoneum are incised to reach the abdominal cavity. Pull the stomach with a retractor and check the greater omentum and spleen. The omentum and spleen are withdrawn out of the body, and the omentum is incised along the caudal side of the gastric omental artery and vein so as to preserve the gastric omentum artery and vein. With this alone, the spleen remains fixed to the short gastric artery and vein, and the subsequent excision of the pancreas and the application of the cell sheet are difficult to perform. Therefore, the short gastric artery and vein are also separated to improve the mobility of the spleen and pancreas. Although bleeding may be observed from the dissected blood vessels, these were capable of hemostasis by compression. Since the rat pancreas is continuous with the greater omentum and does not have a clear boundary, the pancreas is cut into the splenic artery and vein about 0.5 mm before this artery and vein. After that, the pancreatic stump is crushed with a pestle. This is performed in order to make the generation of pancreatic fistula more likely to occur since the generation of pancreatic fistula after the operation increases when the pancreatic stump is firmly held in the human pancreas. Next, organs such as omentum and spleen that have been pulled out are once returned to a predetermined position in the abdominal cavity. Next, remove the retractor, cover the laparotomy with Kimwipe (registered trademark) (Nippon Paper Crecia Co., Ltd.) moistened with 20 ml of raw food (Otsuka raw food injection (registered trademark), Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), and dry the abdominal cavity Leave for 30 minutes while preventing. Thirty minutes later, the stomach was pulled again, and the pancreatic stump was confirmed under direct vision. After confirming that hemostasis was complete, various sheets (ASCs sheet, mannose-treated ASCs sheet) were attached. In the control group, no sheet was attached. Wait for the sheet to settle for about 1 minute, and return the stomach to its original position so that the sheet does not slip. The peritoneum, rectus abdominis and epidermis are continuously sutured with 1-0 nylon (Bearmedic Inc.). Rats are returned to their cages immediately after the surgery and the surgery is complete.
（１−４）検体採取方法
第2病日に腹部正中創の抜糸をクーパーにて行い再開腹する。開腹時に腹水の有無、腹腔内の鹸化の程度を確認する。その後、5mLのシリンジで腹水をできるだけ回収し生化学スピッツに移し替える。腹水は全量でおよそ0.2mL〜0.5mLほどであり、この量ではアミラーゼの測定は困難であるため、5mLのシリンジで生食2mlを吸引し、先ほど腹水を入れた生化学スピッツに追加で加える。次に腸管を体外へ出し大動脈を確認し左右総腸骨動脈の分岐部より10mLシリンジに22G針を用いて採血を行う。この後、手術にて膵切離した部位で脾動静脈を切離し膵臓と脾臓を摘出する。膵臓と脾臓は7.4%ホルマリン（マスクドホルム2A（登録商標）、日本ターナー株式会社）内にいれ固定する。
(1-4) Specimen Collection Method The abdominal midline wound is removed with a cooper on the second disease day and restarted. At the time of laparotomy, check for ascites and the degree of saponification in the abdominal cavity. Then collect ascites as much as possible with a 5 mL syringe and transfer it to Biochemical Spitz. Ascitic fluid is approximately 0.2 mL to 0.5 mL in total volume, and it is difficult to measure amylase at this amount, so aspirate 2 ml of raw food with a 5 mL syringe and add it to the biochemical spitz containing the ascites. Next, the intestinal tract is taken out of the body, the aorta is confirmed, and blood is collected from the bifurcation of the left and right common iliac arteries using a 22G needle in a 10 mL syringe. Thereafter, the splenic artery and vein are cut off at the site where the pancreas is removed by surgery, and the pancreas and spleen are removed. The pancreas and spleen are fixed in 7.4% formalin (Masked Form 2A (registered trademark), Nippon Turner Co., Ltd.).
（１−５）採取検体の処理
（血液、腹水）
回収後、可及的速やかに遠心分離機（KUBOTA5920（登録商標）、久保田商事株式会社）で2500回転10分間の遠心を行い血液は血漿と血球成分に、腹水は液体成分と細胞成分に分離する。分離後上澄みを5mL サンプルチューブ（ワトソン株式会社）に回収し、使用直前まで-80℃で保管する。この検体をアミラーゼ及びリパーゼの検出に供した。
（臓器）
摘出後、可及的速やかに7.4％ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し薄切切片を作製する。H.E.染色を行い、プレパラートを作製する。
(1-5) Processing of collected specimen (blood, ascites)
After collection, centrifuge (KUBOTA5920 (registered trademark), Kubota Shoji Co., Ltd.) and centrifuge at 2500 rpm for 10 minutes to separate blood into plasma and blood cell components and ascites into liquid and cell components as soon as possible. . After separation, collect the supernatant in a 5 mL sample tube (Watson) and store it at -80 ° C until just before use. This specimen was subjected to detection of amylase and lipase.
(Organ)
After excision, fix with 7.4% formalin as soon as possible, and then embed it in paraffin to prepare sliced sections. Perform HE staining and prepare a slide.
（２）結果
第2病日に再開腹したときの各群の腹腔内の状態を図２に示す。未治療群（左）及びASCsシート群（中央）では膵液瘻による白色に変性した著明な鹸化を認めた。対照的に、マンノース処理ASCsシート群（右）では鹸化の範囲は縮小した。
(2) Results FIG. 2 shows the intraperitoneal state of each group when the stomach was restarted on the second disease day. In the untreated group (left) and the ASCs sheet group (middle), significant saponification that was denatured white by pancreatic fistula was observed. In contrast, the saponification range was reduced in the mannose-treated ASCs sheet group (right).
各群について腹水アミラーゼ量を比較した（図３）。アミラーゼは膵液瘻の指標として用いられている。ASCsシート群は未治療群（膵液瘻群）よりアミラーゼ値が低下していた。マンノースで処理したASCsシートを移植すると（マンノース処理ASCsシート群）アミラーゼ値はさらに低下した。腹水リパーゼについても同様の傾向が見られ、未治療群とマンノース処理ASCsシート群の間には高い有意差（p=0.018）を認めた（図４）。 The amount of ascites amylase was compared for each group (FIG. 3). Amylase is used as an indicator of pancreatic fistula. The ASCs sheet group had lower amylase levels than the untreated group (pancreatic fistula group). When an ASCs sheet treated with mannose was transplanted (mannose-treated ASCs sheet group), the amylase value further decreased. The same tendency was observed for ascites lipase, and a highly significant difference (p = 0.018) was observed between the untreated group and the mannose-treated ASCs sheet group (FIG. 4).
膵液瘻に対するASCsの有効性を調べるために、コラーゲンシートと、マンノースで処理したコラーゲンシートを用意し（いずれのシートもASCsを含有しない）、上記手順（１−３〜１−５）に準じて移植実験を行った。各群で腹水アミラーゼ量を比較したところ、有意差がなく、ASCsを含まない場合には膵液瘻に対する治療効果が認められなかった。この結果は、シートという形態的特徴に起因した物理的効果だけでは足らず、ASCsを含有したシートであることが治療効果の発揮に重要であることを示す。 In order to examine the effectiveness of ASCs against pancreatic fistula, a collagen sheet and a collagen sheet treated with mannose are prepared (both sheets do not contain ASCs), and according to the above procedure (1-3 to 1-5) A transplant experiment was conducted. When the amount of ascites amylase was compared in each group, there was no significant difference, and when ASCs were not included, there was no therapeutic effect on pancreatic fistula. This result shows that a sheet containing ASCs is important for exerting a therapeutic effect, as well as a physical effect due to the morphological characteristics of the sheet.
（３）まとめ
マンノース処理ASCsシートはラット膵液瘻モデルにおいて優れた治療効果を発揮した。マンノースで活性化されたASCsを含有した細胞シートは、膵液瘻に対する新たな治療手段として極めて有望といえる。
(3) Summary Mannose-treated ASCs sheets exhibited excellent therapeutic effects in a rat pancreatic fistula model. Cell sheets containing mannose-activated ASCs are extremely promising as a new treatment for pancreatic fistula.
本発明の細胞シートは膵液瘻の予防又は治療に利用される。本発明の細胞シートによれば、マンノースで活性化されたASCsが目的の部位に長期間留まり、高い治療効果を発揮する。 The cell sheet of the present invention is used for prevention or treatment of pancreatic fistula. According to the cell sheet of the present invention, ASCs activated with mannose remain in a target site for a long period of time and exhibit a high therapeutic effect.
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims. The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.
配列番号１〜５：人工配列の説明：接着性ペプチド SEQ ID NOs: 1-5: Description of artificial sequence: Adhesive peptide
Claims (12)
(1)磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞を用意するステップ；
(2)I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分として含むゲル材料と前記脂肪組織由来間葉系幹細胞との混合物を培養容器に播種するステップ；
(3)磁力を作用させることによって、前記混合物中の前記脂肪組織由来間葉系幹細胞を前記培養容器の培養面に引き寄せ、多層の細胞層を形成させるステップ；
(4)前記ゲル材料をゲル化させるステップ。 The cell sheet for pancreatic fistula treatment according to any one of claims 1 to 3 , wherein the adipose tissue-derived mesenchymal stem cell sheet is produced by the following steps (1) to (4):
(1) preparing a magnetically labeled adipose tissue-derived mesenchymal stem cell;
(2) a step of seeding a culture container with a mixture of a gel material containing type I collagen, laminin, type IV collagen and entactin as active ingredients and the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells;
(3) a step of attracting the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in the mixture to the culture surface of the culture vessel by applying a magnetic force to form a multilayer cell layer;
(4) A step of gelling the gel material.
(3')前記細胞層の上方に存在する余分なゲル材料を除去するステップ。 The cell sheet for treatment of pancreatic fistula according to any one of claims 4 to 6 , wherein the following step (3 ') is performed between steps (3) and (4):
(3 ′) a step of removing excess gel material existing above the cell layer.
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