JP6325115B2 - 流体中の細胞を分離する装置 - Google Patents

Description

本発明は、流体中の細胞を分離する分野に関し、具体的には、細胞懸濁液における目的細胞を膜により濾過分離する装置に関する。

従来において、生体動物（ヒトを含む）の血液中のがん細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＣＴＣ）を分離および検出する必要がある場合、いずれも一定量の血液を抽出して、さらに密度勾配遠心法などの方法により細胞の選別および計数を行っている。密度勾配遠心法では、一定のメディアにより遠心管内で連続又は不連続の密度勾配を形成し、細胞懸濁液又はホモジネートをメディアの頂部に置いて、重力又は遠心力場の作用により細胞を選別する。そのデメリットは、以下の点にある。すなわち、１、遠心分離機の制限で、同時に大バッチ量の細胞懸濁液を遠心して細胞を分離することができず、効率が低い。２、入れられたメディアは細胞の活性及び溶液の性質に影響を及ぼし、メディアを取り除く作業には手間がかかる。３、操作が複雑で、メディアの配置に対する要求が高い。したがって、当分野では、生体動物の血液中のがん細胞を分離してその数を検出するための新たな装置及び方法が必要とされる。近年、当分野ではトラックエッチ膜を用いて血液中のがん細胞を分離する方法が提案され、例えば崔浣華、王世成らが発表した「ポリカーボネートトラック精密濾過膜（ｔｒａｃｋ ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の調製と応用」には、トラック精密濾過膜を用いて血液中のがん細胞を診断し、具体的には、トラック精密濾過膜により濾取されたがん細胞を顕微鏡下で観察することが開示された。本発明の発明者も、該膜を用いて数種類の生体動物（例えば、コウサギ）の血液中のがん細胞を分離し、該がん細胞に対して診断および計数を行った。しかし、このような方法に適用される装置は、一回の分離において、生体動物における大部分又は全部の血液中のがん細胞を効果的に分離することはできず、生体動物における極めて少ない一部の血液中のがん細胞しか分離できない。この短所は、特に体が比較的大きい生体動物（例えばヒト）にとってさらに顕著となる。その理由としては、動物の正常の生存状態を維持するためには、生体動物の全身の血液を取り切ってその中のがん細胞を分離するようなことは不可能であり、そのようなことをしたらその個体は死亡してしまうからである。また、血液中の腫瘍細胞（ＣＴＣ）の数は極めて少ないので、生体動物の血液を少量だけ抽出して分離および検出を行うと、その分離および検出の感度は大きく低下してしまう（検出結果は不正確なものになりやすい）。一方、処理する血液の量を増加すると、生体動物の健康に対しても生命に対しても脅威となる。したがって、当分野では、生体動物（ヒトを含む）の血液中のがん細胞を分離および検出するための新たな装置及び方法が必要とされる。

本発明は、全く新たな発想により上述した技術の課題を解決した。本発明の発明者は、「トラックエッチ膜を含む分離カラム」と「一つの主循環管路」とを組み合わせた装置によって、上述の技術目的を実現した。本発明の装置のサンプル入口２０とサンプル出口２１を細胞液体容器の両端（生体動物の動脈と静脈）に接続し、血液が装置の主循環管路で循環流動することにより、がん細胞の循環濾過分離を実現しているので、さらに該がん細胞を収集すれば、生体動物の血液中にがん細胞が含まれているかどうかを正確かつ高感度に検出することと、生体動物体内の血液中の全てのがん細胞を正確に計数することと、を便利に実現することができる。本発明の装置を使用することで、更に下記二つの付加効果をもたらした。一つ目の効果としては、装置に流された血液をすべて該生体動物体内に戻せることができ、生体動物の血液は一滴も無駄にならないことである。二つ目の効果としては、血液中にがん細胞が含まれていた生体動物は、本発明の循環装置を使用した後、血液中のがん細胞がほぼすべて濾過除去されるので、がん細胞の初発病巣から体内のその他の器官への転移を遮断することができることである。したがって、本発明の装置は、莫大の経済的利益と社会的利益をもたらし得るものである。

本発明は、流体中の細胞を分離する装置であって、サンプル入口に連通される第１の駆動ポンプと、分離カラムと、検出カラムと、分離カラムで分離された細胞を検出カラムに入れ込むように駆動するための第２の駆動ポンプと、複数の三方弁およびサブ駆動ポンプと、を備え、前記分離カラムは、一端が第１の三方弁を介して第１の駆動ポンプに接続され、他端が第２の三方弁を介して第２の駆動ポンプに接続され、前記検出カラムは、第１の三方弁の３番目のチャンネルポートに接続され、前記第２の三方弁の３番目のチャンネルポートは、サンプル出口に接続され、細胞液体容器は、本発明の装置とともに循環通路を形成できるように、前記サンプル入口とサンプル出口との間に着脱可能に接続され、前記装置は、サンプル入口と、第１の駆動ポンプと、第１の三方弁と、分離カラムと、サンプル出口と、細胞液体容器と、サンプル入口と、を順次に連通させる主循環管路をさらに備え、主循環管路に抗凝固生理食塩水を注入するための第３の三方弁は、主循環管路に接続されるとともに、サンプル入口と分離カラムとの間に位置し、主循環通路に抗凝固拮抗剤を注入するための第４の三方弁は、主循環管路に接続されるとともに、サンプル出口と分離カラムとの間に位置し、前記分離カラムは、並列する少なくとも５本のサブ濾過カラムを含み、前記サブ濾過カラムは、固定ブラケットと、固定ブラケットのボトム及び側面周りに付けられる、ポリカーボネートまたはポリエステル材で孔径が５−２５μｍであるトラックエッチ膜とを含み、前記検出カラムは、活動可能に接続される２部分を備え、２部分の自由端外側にはいずれも、管路に適応する液体チャンネルポートが設けられ、前記２部分の間には密閉中空キャビティが形成され、かつ、中空キャビティには、ポリカーボネートまたはポリエステル材で孔径が５−２５μｍであるトラックエッチ膜が一つまたは複数の層設けられている装置を提供するものである。

本発明が提供しているトラックエッチ膜７は、孔径が分離対象のがん細胞の大きさとマッチしているので、血液中の正常の赤血球、白血球および血小板、ならびにその他の小分子はいずれも正常に通過する一方、がん細胞はトラックエッチ膜７の上流側に濾取される。

本発明の装置は、生体動物の血液中にがん細胞があるか否かを正確に判断するための新たな方法や、生体動物の血液中のがん細胞の選別および計数のための新たな方法だけでなく、がん転移の治療と体内のがん細胞の除去のための先駆的な新方法および新装置を提供し、極めて高い経済的価値と社会的価値を有する。

本発明において、前記「抗凝固生理食塩水」とは、抗凝固剤含有の生理食塩水を指し、前記抗凝固剤は、例えばＥＤＴＡ塩又はクエン酸（レモン酸）塩などである。流体（がん細胞含有の血液）が分離カラム３に入って前記トラックエッチ膜７と接触する過程において血液の凝固が発生しないように、「抗凝固生理食塩水」を主循環管路に注入する。前記「抗凝固拮抗剤」とは、抗凝固剤の拮抗剤含有の生理食塩水を指し、前記「抗凝固剤の拮抗剤」はカルシウム塩であり、例えば塩化カルシウムである。がん細胞が濾過除去された血液を生体動物（ヒトを含む）の体内に戻せる前に、分離カラム３の下流の主循環管路に前記「抗凝固拮抗剤」を注入する必要がある。このようにして、抗凝固剤を添加した血液が生体動物に直接導入することで生体動物へ毒性作用を生じることがないようにすることができる。

本発明において、前記トラックエッチ膜７は、固定ブラケットの外側、内側に設けられるか、あるいはブラケットに嵌着されてもよく、これについて限定しない。本発明において、前記分離カラム３および検出カラム４は、いずれも自由に水平または鉛直に置かれるか、あるいは他の態様で置かれてもよく、いずれにしても本発明の実施に影響しない。本発明において、前記検出カラム４は、観察や検出のために目的細胞を濃化する役割を果たし、前記検出カラムにおける膜は、取り出して検出装置に置いて検出することができる（例えば、染色した後に顕微鏡下で観察して判断したり、目的細胞を計数したりする）。このため、前記検出カラム４は、より正確に定義すると、細胞濃化カラムである。本発明において、前記分離カラム３におけるトラックエッチ膜７は、一層の膜でなければならず、２層を重ねて用いてはならない。前記固定ブラケットの内側および外側にそれぞれ１層のトラックエッチ膜７が設けられる形態は、主循環管路における流体の流れに影響するため、好ましくない。前記検出カラム４におけるトラックエッチ膜７も、一層の膜にする方がよく、さもなければ流体の流速に大きく影響する。ただし、検出カラム４には、合計２層以上のトラックエッチ膜７が設けられてもよく、この場合、膜間に一定の間隔をおけばよい。前記検出カラム４にトラックエッチ膜７が一層のみ設けられることがさらに好ましいが、細胞の濃化のために、直列する二つ以上の検出カラム４を使用することが好ましく、こうして得られる目的細胞の数は理論的により正確なものになる。

具体的な一実施形態において、第１のサブポンプは、前記第３の三方弁の３番目のチャンネルポートに接続され、第２のサブポンプは、前記第４の三方弁の３番目のチャンネルポートに接続される。

具体的な一実施形態において、前記第３の三方弁は、サンプル入口と第１の駆動ポンプとの間、または、第１の駆動ポンプと分離カラムとの間に位置し、前記第４の三方弁は、サンプル出口と第２の三方弁との間、または、第２の三方弁と分離カラムとの間に位置する。

好ましくは、前記検出カラムにおけるトラックエッチ膜の孔径は、前記分離カラムにおけるトラックエッチ膜の孔径以下である。

具体的な一実施形態において、前記分離カラムは、サンプル入口に近接する端に位置する液体分散エリアと、中央に位置するサブ濾過カラムとを含む。好ましくは、前記液体分散エリアは、一端面が、液体チャンネルポートが開口しているポートカバープレートであり、他端面が、すべての前記サブ濾過カラムの端面に対応するスルーホールが開口している支持プレートである。上記した好ましい形態の構造は図３に示されている。なお、本発明の図５に示すサブ濾過カラム１９はいずれも細長い円柱状であるが、前記サブ濾過カラム１９は細長い円柱状に限らず、その他の形状、例えば断面が三角形や矩形である細い長尺状、または、断面が細長い矩形である長いシート状であってもよい。

具体的な一実施形態において、前記駆動ポンプは、蠕動ポンプである。駆動ポンプとして蠕動ポンプを選択することで、流体の流れをよりスムーズにすることができる。好ましくは、前記第１のサブポンプまたは第２のサブポンプは、蠕動ポンプまたはプッシュ式輸液ポンプである。

本発明に記載の装置は、前記主循環管路に設けられるとともに第１の駆動ポンプと分離カラムとの間に位置する圧力センサと、管路ヒータとをさらに備えることが好ましい。

好ましくは、前記分離カラムおよび検出カラムにおけるトラックエッチ膜は、いずれも孔径が８−１０μｍである。

具体的な一実施形態において、前記検出カラムは、可塑化ポリ塩化ビニルからなる。

本発明において、「立体式トラックエッチ膜を含む分離カラム」と「循環式の膜分離構造」とを組み合わせて前記装置が得られ、以下の有益な効果を有する。

１、生体動物の血液中の細胞を分離する。図８を参照すると、本発明は循環方式で濾過を行う。すなわち、該システムの入口から入った液体は、濾過が終了後、システムの出口から元の溶液中に戻り、こうして一つの循環回路を形成し、無中断の循環過程において細胞懸濁液中の特定の大体積の細胞を濾取し、小体積の細胞は濾過膜を通過して溶液中に戻る。そのメリットは、本システム（装置）外の細胞懸濁液の総体積が変わらず、その中の小体積の細胞の数が変わらないことである。

したがって、本装置のサンプル入口を動物の動脈に接続し、サンプル出口を動物の静脈端に接続し、動力ポンプを介して動脈から血液サンプルを引き出すことができ、分離カラムにおける適宜な孔径の膜を経て、関心のある目的細胞が分離され、その他の成分は静脈によって戻される。このようにして、動物の生存を維持しながら（さらに、主循環管路における分離カラムの上流端に抗凝固剤を注入し、その下流端に抗凝固剤の拮抗剤を注入する必要がある）、可能な限り多くの血液サンプルを処理することができ、より数多くの関心のある細胞を分離することができる。従来の方法に比べて、分離効率と分離感度を大幅に高められると共に動物の生存が確保される。このようにして、同一の動物に対して、細胞分離を複数回および複数タイミングで行うことができる。これは、これまでの細胞選別方式では実現できないことである。

２、分離効率が高まる。径が６ｃｍ、長さが１１ｃｍのＣ−ＩＳＥＴ分離カラムを例として、その内側には、径が１ｃｍ、長さが１０ｃｍの円柱形のサブ濾過カラムが１１本並列に取り付けられる。この規格の分離カラムの有効濾過面積は３５４ｃｍ２である。通常の径６ｃｍの濾過装置（一層のトラックエッチ膜を含む円盤状の分離カラムであって、その中のトラックエッチ膜の形状は円形であり、その形状は本発明における検出カラム４の構造と類似する）は、その有効濾過面積がただ２８．２６ｃｍ２である。本発明の分離カラムの有効濾過面積は従来の濾過装置の濾過面積の１２５２％であり、元より１１．５２倍高まっている。これは、単位時間内でのサンプル処理能力が大幅に高まり、同一の体積のサンプルに対する処理時間が大幅に減少することを意味する。

３、立体式濾過は濾過膜の表面圧力を低下させる。細胞は、非常に柔らかくて変形性が強いものであるため、細胞選別、特に生体細胞選別においては、低圧濾過を採用して細胞の活性を維持することが非常に重要である。トラックエッチ膜で分離カラムのブラケットの下端と側面を被覆する立体式濾過方式を採用する場合、その膜上の圧力は通常の平面式のものより９〜１２倍減少しており、細胞（例えば、ヒトの血液中の赤血球）の完全性を効果的に保つことができる。

４、メディアを入れる必要がない。本装置は、物理方式で細胞の濾過を行い、細胞の活性と溶液の性質を影響する化学物質を入れる必要がない。このようにして、濾過後、目的細胞及び非目的細胞の形及び活性が破壊されることなく、且つ元の溶液の性質が破壊されない。

５、サンプル量が大きい。本発明の流体膜濾過装置の循環回路は、一回の操作において、５０００ｍＬ超（ほぼ人体内の血液総量に相当する）の細胞懸濁液を濾過することができ、大きいサンプル量の細胞懸濁液に対する濾過に特に好適である。

本発明は、以上に記載の目的、特徴及び利点に加えて、他の目的、特徴及び利点もある。以下、図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。

本出願の一部を構成する添付図面は、本発明をさらに理解するためのものであり、本発明の例示的な実施例およびその説明は、本発明を解釈するためのものであり、本発明を不当に限定するものではない。添付図面において、
図１は、本発明の好ましい実施例の分離通路の構造模式図である（図において矢印方向は流体の流れ方向である）。 図２は、本発明の好ましい実施例の検出通路の構造模式図である（図において矢印方向は流体の流れ方向である）。 図３は、本発明の好ましい実施例の分離カラムの一端の構造模式図である。 図４は、本発明の好ましい実施例の分離カラムの構造模式図である。 図５は、本発明の好ましい実施例の分離カラムの全体構造模式図である。 図６は、本発明の好ましい実施例の検出カラムの分解構造模式図である。 図７は、本発明の好ましい実施例の外観構造模式図である。 図８は、本発明の好ましい実施例の主循環の構造模式図である。 図９は、本発明の好ましい実施例と通常の装置による試験結果のデータ比較図である。 図１０は、従来技術や本発明の蠕動ポンプのポンプヘッドが並列される構造模式図である。

以下、添付図面を参照しながら本発明の実施例について詳しく説明するが、本発明は、特許請求の範囲により限定されカバーされる複数の異なる形態で実施することができる。

本発明は、血液中のがん細胞を分離する装置であって、サンプル入口に連通される第１の駆動ポンプと、分離カラムと、検出カラムと、分離カラムで分離された細胞を検出カラムに入れ込むように駆動するための第２の駆動ポンプと、複数の三方弁およびサブ駆動ポンプと、を備え、前記分離カラムは、一端が第１の三方弁を介して第１の駆動ポンプに接続され、他端が第２の三方弁を介して第２の駆動ポンプに接続され、前記検出カラムは、第１の三方弁の３番目のチャンネルポートに接続され、前記第２の三方弁の３番目のチャンネルポートは、サンプル出口に接続され、細胞液体容器（生体動物）は、本発明の装置とともに循環通路を形成できるように、前記サンプル入口とサンプル出口との間に着脱可能に接続され（その動脈と静脈とを連通し）、前記装置は、サンプル入口と、第１の駆動ポンプと、第１の三方弁と、分離カラムと、サンプル出口と、細胞液体容器と、サンプル入口と、を順次に連通させる主循環管路をさらに備え、主循環管路に抗凝固生理食塩水を注入するための第３の三方弁は、主循環管路に接続されるとともに、サンプル入口と分離カラムとの間に位置し、主循環通路に抗凝固拮抗剤を注入するための第４の三方弁は、主循環管路に接続されるとともに、サンプル出口と分離カラムとの間に位置し、前記分離カラムは、並列する少なくとも５本のサブ濾過カラムを含み、前記サブ濾過カラムは、固定ブラケットと、固定ブラケットのボトム及び側面周りに付けられる、ポリカーボネートまたはポリエステル材で孔径が５−２５μｍであるトラックエッチ膜とを含み、前記検出カラムは、活動可能に接続される２部分を備え、２部分の自由端外側にはいずれも、管路に適応する液体チャンネルポートが設けられ、前記２部分の間には密閉中空キャビティが形成され、かつ、中空キャビティには、ポリカーボネートまたはポリエステル材で孔径が５−２５μｍであるトラックエッチ膜が一つまたは複数の層設けられている装置を提供するものである。

第１の三方弁５が異なる位置に回転されると、分離カラム３は、それぞれ第１の駆動ポンプ１および検出カラム４のいずれか一つに連通することができる。

前記分離カラム３は、並列する少なくとも５本のサブ濾過カラムを含み、前記サブ濾過カラムは、固定ブラケット１３と、固定ブラケット１３のボトム及び側面周りに付けられるトラックエッチ膜７とを含み、立体式の被覆態様で死角無く細胞を選別し、効率がより良い。細胞懸濁液が分離カラム３を流れると、サイズが５−２５μｍよりも大きい細胞は、トラックエッチ膜７によって濾取されサブ分離カラムの内部に滞留し、小さな細胞は自由に通過する。トラックエッチ膜７は、好ましくは、孔径が８−１０μｍである。

トラックエッチ膜７はポリカーボネート又はポリエステル材からなってもよく、いずれにしても本実施例の実施に影響しない。トラックエッチ膜は、同位元素トラックエッチング技術を採用することで、膜の表面が滑らかで、孔の分布が均一で、孔径が非常に一致しスムーズであるので、生物細胞の分離にとって理想的な材料である。本発明にかかるトラックエッチ膜７は、従来の市販のトラックエッチ膜を採用すればよい。

図３、図４および図５を参照すると、分離カラムは、両端のポートカバープレート１５と、ポートカバープレート１５内の支持プレート１４と、サンプル入口の支持プレート１４とサンプル出口のポートカバープレート１５との間（サンプル出口に近接する端には支持プレートが設けられてもよく、支持プレートが設けられなくてもよい）に位置し、複数の固定ブラケット１３およびトラックエッチ膜からなるサブ濾過カラムと、をさらに含み得る。上記した各部品は、いずれも別々に分解可能で、柔軟に使用することができる。また、異なるニーズに応じて異なる数のサブ濾過カラム１９を設けてもよい。支持プレート１４には、固定ブラケット１３を構造的に安定化するように係止するための丸穴が複数設けられる。ポートカバープレート１５には、懸濁液が流れやすいように、管路に適応する液体チャンネルポート８が設けられる。図４および図５には、サブ濾過カラム毎に、トラックエッチ膜７の上方にシールリングおよびねじ継手が接続されていることが示されているが、これは、支持プレート１４とサブ濾過カラム１９との間の良好なシールを図るためのものである。

円柱形のサブ濾過カラムの底面径が８ｍｍ、長さが１０ｃｍであると、１０本のサブ濾過カラムが並列され、その外面がポリカーボネート材のハウジングで封止され取り囲まれ、濾過カラムの総濾過面積は２５６ｃｍ２になる。このような設計は、濾過面積を増加させる一方、濾過膜がより大きい圧力に耐えられるようにすることができる。

図６を参照すると、検出カラム４は、可塑化ポリ塩化ビニル材からなり、活動可能に接続される上下の２部分を備え、２部分の外側にはいずれも、管路に適応する液体チャンネルポート８が設けられ、封止された２部分間の中空箇所には、孔径が５−２５μｍ、好ましくは８−１０μｍであるトラックエッチ膜７が一層設けられる。細胞懸濁液が液体チャンネルポート８を介して検出カラム４に流れると、サイズが５−２５μｍよりも大きい細胞はトラックエッチ膜７によって濾取されて滞留することになる。

図１及び図２を参照すると、本発明の装置は、三方弁と分離カラムと検出カラムとにより二つの作動通路を構成している。１つ目の通路では、図１（図において矢印方向は液体の流れ方向を表す）に示すように、大きいサンプル量の細胞懸濁液は、細胞液体容器１８からサンプル入口２０、第１の駆動ポンプ１、第１の三方弁５を通じて分離カラム３に入って他端から流出し、濾過された後さらにサンプル出口２１を介して細胞液体容器１８に戻り、特定の大体積の細胞を効率的に分離する目的を達成する。細胞液体容器−ポンプ−分離カラムという無中断の循環により分離を行うので、分離過程において流体膜濾過システム外の細胞懸濁液の総体積が変わらず、その中の小体積の細胞の数が変わらないようにすることができる。図１にはさらに、管路１１ｂから主循環管路に抗凝固生理食塩水を注入すること、および管路１２ｂから主循環管路に抗凝固拮抗剤を注入することが含まれている。

例えば、生体動物（ヒトを含む）を特定の細胞液体容器とすると、血液を動脈からポンプにより引き出し、分離カラムで濾過した後静脈に輸血して、生体動物の健康に影響せずに特定の細胞を分離することができる。

２つ目の通路では、図２に示すように、三方弁を調節してサンプル入口２０と分離カラム３との接続チャンネルを閉じ、流体（例えば、生理食塩水）が第２の駆動ポンプ２から分離カラム３に逆流して（主循環管路における流体の流れ方向とは反対の方向で流れて）他端から流出し、検出カラム４に入る。この通路により、分離カラム３で濾取された特定の大体積の細胞をさらに濃化して（まず、第２の駆動ポンプ２の作用下で大体積の細胞を分離カラム３中の膜から離脱させ、そして、この大体積の細胞含有の生理食塩水が検出カラム４に入り）、検出カラム４の濾過膜（トラックエッチ膜）に集中させることで、膜上の細胞に対する下流での各操作検出を便利に行うことができる。廃液は、検出カラム４の他端から流出される。

実質的には、本発明の装置において少なくとも三つのステップがなされる。すなわち、ステップＡでは、循環濾過を行い、すなわち、循環濾過の条件で分離カラムにおけるトラックエッチ膜により第１の流体（例えば、血液）中の目的細胞を濾取する。ステップＢでは、離脱を行い、すなわち、濾取された目的細胞を膜から離脱させるために、第２の流体（例えば、生理食塩水）を第１の流体とは反対の方向で流す。ステップＣでは、細胞の受け取りまたは細胞の濃化を行い、前記細胞の受け取りとは、一つの容器を用いて目的細胞および第２の流体をすべて受け取ることであり、前記細胞の濃化とは、トラックエッチ膜を含む検出カラム４を用いて前記第２の流体を濾過させるとともに、前記目的細胞をトラックエッチ膜の上流側に濃化することである。ステップＣにおいて本発明の提供する濃化方式がより好ましいことは明らかであり、このようにすることで、受け取った溶液に対してさらに遠心機などの通常の手段を用いて細胞の濃化を行う必要がなくなる。なお、本発明の上記した「循環濾過を行うステップＡ」の前と後には、いずれも洗浄ステップ、具体的に生理食塩水を用いて装置における管路を洗浄するステップをさらに含むことができ、循環濾過を行うステップの後の洗浄ステップによって、細胞液体容器１８の体内からの血液をすべて細胞液体容器１８の体内に流し戻せることができ、管路装置には血液が一切残らない。

図７を参照すると、本発明の装置は、タッチスクリーン１６、主蠕動ポンプ、圧力センサ、副蠕動ポンプ、プッシュ式輸液ポンプ、濾過カラム固定ブラケット、空気排出装置、管路ヒータ、ベースブラケット、接続管路などの部品により一体的に構成される機器であり、コンパクトな構造、完全な機能、タイムリーな情報サンプリングという利点がある。ここで、タッチスクリーン１６は、各部品の作動状況を表示する端末であり、機器のマザーボードに接続され、圧力、流量、回転速度、温度、時間などの重要情報を表示し、タッチ機能を持つことから、スクリーン上で他の各部品の作動を制御することができる。主蠕動ポンプは、主な動力供給装置であり、ターンテーブルにおける鉄骨柱が管路の壁に接触して管路の壁を押圧することにより、動力を供給する。圧力センサは、管路における圧力変化状況を検出するためのものであり、システム全体がスムーズに作動しているか否かを検出する。プッシュ式輸液ポンプによって、流体がスムーズに流れ、かつ固体不純物が発生しないことを保証するために必要な薬物（抗凝固生理食塩水または抗凝固拮抗剤）を、接続管路へ供給し続けることができる。濾過カラム固定ブラケットは、膜濾過カラムを固定するためのものである。空気排出装置は、管路中の空気を排出し、空気の接続管路への入り込みを防止することができる。管路ヒータ１７は、管路中の流体を、３７℃という細胞生存に最適な温度を維持するように加熱することができる。管路ヒータ１７は、管路の任意の一箇所、例えばサンプル入口、第１の三方弁、第２の三方弁、細胞液体容器、サンプル出口などの箇所に接続してよい。

図９を参照して、本発明の装置と通常の分離装置による体外での試験の分離結果を比較する。

まず、Ａ５４９、ＬＬＣ、Ｈ５２０、Ｈ１２９９との四種類の肺がん細胞をそれぞれ１０００個配置して、生理食塩水とともに５Ｌの細胞懸濁液を形成する。

本発明の装置において、分離カラムは、径が６ｃｍ、長さが１１ｃｍであり、分離カラムには、径が１ｃｍ、長さが１０ｃｍの円柱形のサブ濾過カラムが１１本並列に取り付けられる。前記分離カラムの総有効濾過面積は３５４ｃｍ２である。細胞懸濁液は分離カラムで循環的に流れ、この分離カラム処理における細胞懸濁液は、総量が５Ｌで、流体の流速が２５０ｍＬ／ｍｉｎである。

通常の分離装置は、その分離カラムの形状および構造が本発明における検出カラム４に類似し、その６ｃｍ径のトラックエッチ膜の有効濾過面積は２８．２６ｃｍ２である。細胞懸濁液は、分離カラムで、循環的に流れるのではなく、一回だけ濾過され、この分離カラム処理における前記細胞懸濁液の総量は５ｍＬである。このため、理論的に、この細胞懸濁液には細胞が１個程度しか含まれない。

図９において、黒丸は本発明の装置による結果を示し、白抜き丸は通常の分離装置による結果を示す。図から分かるように、本発明の装置によって選別された完全で無破壊のＡ５４９、ＬＬＣ、Ｈ５２０、Ｈ１２９９との四種類の肺がん細胞の数は、それぞれ９８８．３３±１４８．１７個、８６２．６７±１０３．６５個、１０４８±７９．３個、８５５±９１．３９個である。細胞懸濁液に配置され用いられる１０００個の細胞および図９の結果データは、いずれもセルカウンターによって得られたので、若干の誤差を含み得る。一方、通常の分離装置による複数回の分離の結果は、理論値（１個のがん細胞）で上下変動し、このように得られたデータでは、生体動物（ヒトを含む）の体内の血液中にがん細胞が存在するか否か、あるいは血液中にどのぐらいのがん細胞が存在するかを正確に判断することができない。

がん細胞の大きさは正常な血液細胞の体積よりも大きい。本発明の装置において、血液が分離カラムを一回流れる過程において一部のがん細胞がその膜を透過するか、あるいは極一部の血液細胞が膜に濾取されるとしても、本発明の装置による分離ステップは循環的に行われるので、血液が分離カラムを複数回流れた後は、膜による正常な血液細胞とがん細胞との間の分離が非常に徹底的に行われることになる。

本発明の請求項（特に請求項１）の発明は、以下の点で等価的に置き換えられることは、当業者に容易に理解されるであろう。

まず、前記三方弁は、三方管と、管路にそれぞれ設けられた遮断弁（例えば、シャットオフバルブ、ボールバルブ、バタフライバルブ、ゲートバルブなどの態様）とのいずれの組み合わせによって等価的に置き換えられてもよい。

次に、複数台の蠕動ポンプも同様に、１台の蠕動ポンプと、それに設けられた並列する複数本の管路との組み合わせによって等価的に置き換えられてもよい（図１０の蠕動ポンプの写真は、１台の蠕動ポンプに、並列する複数のポンプヘッドが取り付けられたものを表示している）。例えば、管路１１ｂ（第１のサブポンプ１１が主循環管路に接続される管路）と管路１２ｂ（第２のサブポンプ１２が主循環管路に接続される管路）は、いずれも個別に第１の駆動ポンプ１に接続され、第１の駆動ポンプ１に接続される主循環管路１ａと並列してもよい。これにより、１台の蠕動ポンプ（すなわち、第１の駆動ポンプ１）で、本発明の合計３台の蠕動ポンプ１、１１および１２の機能を代替することができる。または、第１のサブポンプ１１と第２のサブポンプ１２とを並列するか、あるいは第１の駆動ポンプ１と第１のサブポンプ１１とを並列するなどの多種の並列態様がある。例えば、本発明の装置に合計三つの蠕動ポンプのポンプヘッド（もう一つのポンプはプッシュポンプである）を設ける場合、そのうちの二つを並列しもう一つを独立させてもよく、三つを並列してもよい。

さらに、本発明の図１および請求項１には、流体がサンプル入口２０から第１の駆動ポンプ１、第１の三方弁５、および分離カラム３に流れる順序が限定されている。しかし、当業者であれば、本発明を読んだ上、検出カラム４は、主循環管路中の流体の流れ方向における（分離カラム３の下流端ではなく）分離カラム３の上流端に接続されれば良いことが分かる。このため、前記第１の駆動ポンプ（１）と第１の三方弁（５）との位置を入れ替えたものは、本発明の等価的な置き換え形態である。つまり、主循環管路において、流体がサンプル入口２０から第１の三方弁５、第１の駆動ポンプ１、および分離カラム３という順序で流れる。

また、本発明において、第２の駆動ポンプ２および検出カラム４は、それぞれ離脱（分離カラム３で膜に濾取された細胞を膜から離脱させること）および濃化（目的細胞を検出カラム４の膜に濃化させること）の役割を果たす。事実上、検出カラム４は、一つの受け取り容器と遠心分離ステップとの組み合わせによって等価的に置き換えられてもよい。つまり、本発明において、検出カラム４の代わりにその箇所に一つの受け取り容器（例えば、メスフラスコ、ビーカーなど）を接続し、受け取り容器中の流体を一回または複数回にわたり遠心管に転送して遠心および濃化させて目的細胞を取得し、さらに、この濃化した目的細胞を検出装置に送出してその数を検出させば良い。

さらに、本発明の請求項１には、分離カラムにおけるサブ濾過カラム１９の並列本数が５本またはそれ以上であると限定されているが、当業者であれば、サブ濾過サブカラムの数を４本、３本、２本、ひいては１本としても良いことが分かる。たとえ分離カラムにサブ濾過カラムを１本しか設けていないとしても、その濾過の効果は、本発明の装置において円形の平面膜が一層しか付けられていない分離カラム（本発明の検出カラム４に似ている構造の分離カラム）を一つ接続したものによる効果より優れる。このようなサブ濾過カラムが５本より少ない形態も、本発明の等価的な置き換え形態（例えば、膜管の形状や大きさに対する通常の設計によりサブ濾過カラムの４本と５本との差を補う）に該当する。

なお、本発明の請求項１には、サブ濾過カラムの固定ブラケットのボトムおよび側面周りのポリカーボネートまたはポリエステル材のトラックエッチ膜について限定されているが、サブ濾過カラムの固定ブラケットのボトムの表面積が、その側面周りの表面積に比べてはるかに小さい（例えば、側面の表面積の和が、底面の面積の５倍以上である）場合、底面にはトラックエッチ膜を設けず（総面積に対して底面の面積はほぼ無視できる）、他の材（例えば、可塑化ポリ塩化ビニル）で封止してもよい。または、固定ブラケットの或る面の総面積が極めて小さくて、従来のプロセスではその上にトラックエッチ膜を設けることができない場合がある。この場合、当然ながら、底面、または、周りのいずれか一つまたは複数の側面には、膜を設けず、他の材で封止してもよい。このような形態も、本発明の請求項１の等価的な置き換え形態に含まれる。以上の記載は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。本発明が、種々改変や変化されうることは当業者に自明なことである。本発明の精神及び原則内で行われるすべての変更、等価的な置き換え、改善などは、いずれも本発明の技術的範囲に含まれるべきである。

１ 第１の駆動ポンプ
２ 第２の駆動ポンプ
３ 分離カラム
４ 検出カラム
５ 第１の三方弁
６ 第２の三方弁
７ トラックエッチ膜
８ 液体チャンネルポート
９ 第３の三方弁
１０ 第４の三方弁
１１ 第１のサブポンプ
１２ 第２のサブポンプ
１３ 固定ブラケット
１４ 支持プレート
１５ ポートカバープレート
１６ スクリーン
１７ 管路ヒータ
１８ 細胞液体容器
１９ サブ濾過カラム
２０ サンプル入口
２１ サンプル出口
１ａ 主循環管路
１１ｂ 第１のサブポンプ１１が主循環管路に接続される管路
１２ｂ 第２のサブポンプ１２が主循環管路に接続される管路
２ｃ 第２の駆動ポンプが主循環管路に接続される管路
２ｃ’ 検出カラムが主循環管路に接続される管路。

Claims (11)

1. 流体中の細胞を分離する装置であって、
   サンプル入口（２０）に連通される第１の駆動ポンプ（１）と、分離カラム（３）と、検出カラム（４）と、分離カラムで分離された細胞を検出カラムに入れ込むように駆動するための第２の駆動ポンプ（２）と、複数の三方弁およびサブ駆動ポンプと、を備え、
   前記分離カラム（３）は、一端が第１の三方弁（５）を介して第１の駆動ポンプ（１）に接続され、他端が第２の三方弁（６）を介して第２の駆動ポンプ（２）に接続され、前記検出カラムは、第１の三方弁（５）の３番目のチャンネルポートに接続され、前記第２の三方弁（６）の３番目のチャンネルポートは、サンプル出口（２１）に接続され、
   細胞液体容器（１８）は、前記装置とともに循環通路を形成できるように、前記サンプル入口（２０）とサンプル出口（２１）との間に着脱可能に接続され、
   前記装置は、サンプル入口（２０）と、第１の駆動ポンプ（１）と、第１の三方弁（５）と、分離カラム（３）と、サンプル出口（２１）と、細胞液体容器（１８）と、サンプル入口（２０）と、を順次に連通させる主循環管路（１ａ）をさらに備え、
   主循環管路に抗凝固生理食塩水を注入するための第３の三方弁（９）は、主循環管路に接続されるとともに、サンプル入口（２０）と分離カラム（３）との間に位置し、主循環通路に抗凝固拮抗剤を注入するための第４の三方弁（１０）は、主循環管路に接続されるとともに、サンプル出口（２１）と分離カラム（３）との間に位置し、前記サブ駆動ポンプは、第３の三方弁（９）の３番目のチャンネルポートおよび／または第４の三方弁（１０）の３番目のチャンネルポートに接続され、
   前記分離カラム（３）は、並列する少なくとも５本のサブ濾過カラム（１９）を含み、前記サブ濾過カラムは、固定ブラケット（１３）と、固定ブラケットのボトム及び側面周りに付けられる、ポリカーボネートまたはポリエステル材で孔径が５−２５μｍであるトラックエッチ膜（７）とを含み、
   前記検出カラム（４）は、活動可能に接続される２部分を備え、２部分の自由端外側にはいずれも、管路に適応する液体チャンネルポート（８）が設けられ、前記２部分の間には密閉中空キャビティが形成され、かつ、中空キャビティには、ポリカーボネートまたはポリエステル材で孔径が５−２５μｍであるトラックエッチ膜が一つまたは複数の層設けられている装置。
2. 前記サブ駆動ポンプは第１のサブポンプ（１１）と第２のサブポンプ（１２）とを含み、第１のサブポンプ（１１）は、前記第３の三方弁（９）の３番目のチャンネルポートに接続され、第２のサブポンプ（１２）は、前記第４の三方弁（１０）の３番目のチャンネルポートに接続される、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
3. 前記第３の三方弁（９）は、サンプル入口（２０）と第１の駆動ポンプ（１）との間、または、第１の駆動ポンプ（１）と分離カラム（３）との間に位置し、前記第４の三方弁（１０）は、サンプル出口（２１）と第２の三方弁（６）との間、または、第２の三方弁（６）と分離カラム（３）との間に位置する、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
4. 前記検出カラム（４）におけるトラックエッチ膜（７）の孔径は、前記分離カラム（３）におけるトラックエッチ膜（７）の孔径以下である、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の装置。
5. 前記分離カラム（３）は、サンプル入口（２０）に近接する端に位置する液体分散エリアと、中央に位置するサブ濾過カラム（１９）とを含む、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の装置。
6. 前記液体分散エリアは、一端面が、液体チャンネルポート（８）が開口しているポートカバープレート（１５）であり、他端面が、すべての前記サブ濾過カラムの端面に対応するスルーホールが開口している支持プレート（１４）である、ことを特徴とする請求項５に記載の装置。
7. 前記第１の駆動ポンプと前記第２の駆動ポンプは、蠕動ポンプである、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の装置。
8. 前記第１のサブポンプまたは第２のサブポンプは、蠕動ポンプまたはプッシュ式輸液ポンプである、ことを特徴とする請求項２に記載の装置。
9. 前記主循環管路に設けられるとともに第１の駆動ポンプ（１）と分離カラム（３）との間に位置する圧力センサと、管路ヒータとをさらに備える、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の装置。
10. 前記分離カラム（３）および検出カラム（４）におけるトラックエッチ膜は、いずれも孔径が８‐１０μｍである、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の装置。
11. 前記検出カラム（４）は、可塑化ポリ塩化ビニルからなる、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の装置。
    

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