JP6309209B2 - 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する血管内皮細胞の検出方法 - Google Patents
血管平滑筋細胞の増殖を抑制する血管内皮細胞の検出方法 Download PDFInfo
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Description
これらのうちPCIは、開胸手術が不要であり侵襲性は低く、かつ閉塞を最も迅速に解除できることから、現在、多くの医療機関で広く実施されている。
以上、ステント留置術は、血管内皮細胞を不可避的に剥脱することで、「ステント血栓症」と「術後再狭窄」を誘発するのである。
また、健常人ボランティアの末梢血や骨髄から血管内皮細胞前駆細胞を採取して血管内皮細胞を調製しても、調製した直後から悪玉化しているか(非特許文献2,3)、または調製直後は善玉であっても継代培養の過程で速やかに悪玉化することが示されている(特許文献1)。さらに、患者はすでに血管狭窄を発症しており、血管内皮細胞はすでに「悪玉化」していると考えられるため、患者自身から血管内皮細胞を取得して治療の使用することは有効な方法とはなりえない。
即ち、SeV-hiPS細胞を用いれば、「善玉」のヒト血管内皮細胞を大量製造することが可能となる。
具体的には本発明は、例えば虚血性疾患に対して、既存の血管再建術と組み合わせて実施することで、「術後再狭窄」および「ステント血栓症」の発症を防止する「血管内腔面への血管内皮細胞補充療法」に使用する血管内皮細胞の品質評価のための遺伝子マーカーを提供し、それにより従来よりも速やかな品質管理の遂行を可能とする。即ち、従来は4日間以上の期間を要していた血管内皮細胞の品質評価は、半日またはそれ以下の時間で遂行することが可能となる。
しかし、「善玉」と「悪玉」を区別する遺伝子マーカーが同定されれば、その発現レベルを測定するだけで血管内皮細胞の品質評価を行うことができる。即ち、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞の培養を一切行うことなく、半日またはそれ以下の試験時間において、血管内皮細胞の「善玉」「悪玉」について判定することができる。
即ち、RGS5は血管内皮細胞の品質管理における「最上位マーカー」であることが示された。
〔1〕 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する細胞を検出する方法であって、血管内皮細胞におけるRGS5(Regulator of G-protein signaling 5)の発現を検出する工程、および該発現を、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性の低下および/または血管平滑筋細胞の増殖を促進する活性の上昇の指標とする工程を含む方法。
〔2〕 RGS5 mRNAを検出する工程を含む、〔1〕に記載の方法。
〔3〕 RT-PCRまたはリアルタイムRT-PCRによりRGS5 mRNAを検出する工程を含む、〔2〕に記載の方法。
〔4〕 RGS5蛋白質を検出する工程を含む、〔1〕に記載の方法。
〔5〕 免疫染色、エライザ(ELISA)、またはウェスタンブロット法によりRGS5蛋白質を検出する工程を含む、〔4〕に記載の方法。
〔6〕 血管内皮細胞が誘導多能性幹細胞(iPS)から生成された細胞である、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕 誘導多能性幹細胞がセンダイウイルスベクターを用いて多能性が誘導された細胞である、〔6〕に記載の方法。
〔8〕 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、〔1〕から〔7〕のいずれかの方法により該細胞を検出する工程、および該細胞を回収する工程を含む方法。
〔9〕 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、血管内皮細胞を含む1または複数の細胞集団を製造する工程、該細胞集団において、〔1〕から〔7〕のいずれかの方法により血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する細胞を検出する工程、および、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する細胞が検出された細胞集団を選択する工程を含む方法。
〔10〕 RGS5の発現を検出するプライマーまたはプローブ、あるいはRGS5蛋白質に結合する抗体を含む、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を検出するための試薬。
〔11〕 RGS5 mRNAまたはRGS5蛋白質からなる、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を検出するためのマーカー。
〔12〕 RGS5蛋白質または該蛋白質を発現するベクターを含む、血管平滑筋細胞の増殖促進剤。
〔13〕 血管内皮細胞におけるRGS5遺伝子の発現を阻害する工程を含む、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を製造する方法。
〔14〕 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞または該細胞が包埋された基材を血管の外膜面上に置く工程を含む、vasa vasorum(血管の血管)を介して動脈内腔面へ血管内皮細胞を移植する方法。
〔15〕 血管内皮細胞の剥脱に対する血管内腔面への血管内皮細胞の補充のために用いられる、〔14〕に記載の方法。
〔16〕 動脈内腔面へ血管内皮細胞を移植するための薬剤であって、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞または該細胞が包埋された基材を含み、その使用に際し、該細胞または基材は血管の外膜面上に置かれることにより、vasa vasorum(血管の血管)を介して血管内皮細胞が動脈内腔面に移植されるものである、薬剤。
〔17〕 血管内皮細胞の剥脱に対する血管内腔面への血管内皮細胞の補充のために用いられる、〔16〕に記載の薬剤。
〔18〕 RGS5遺伝子のプロモータの下流にインディケータ遺伝子が挿入されたノックイン血管内皮細胞。
〔19〕 インディケータ遺伝子が蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、抗体断片、エピトープペプチド、タグペプチド、タグ蛋白質、薬剤耐性因子、および細胞死誘導因子からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、〔18〕に記載の細胞。
〔20〕 〔18〕または〔19〕の細胞の、血管内皮細胞の血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性のマーカーとしての使用。
〔21〕 血管内皮細胞および/または血管内皮前駆細胞(EPC)におけるRGS5の発現または〔18〕に記載の細胞におけるインディケータ遺伝子の発現を検出し、該発現を低下または上昇させる化合物または培養条件を選択する工程を含む、血管内皮細胞の血管平滑筋細胞増殖抑制活性をそれぞれ上昇または低下させる化合物または培養条件のスクリーニング方法。
(A) RGS5遺伝子発現測定に基づく血管内皮細胞の品質管理技術
(B) PVVTによる血管内腔面への血管内皮細胞移植技術
(C) RGS5遺伝子発現を指標にした血管狭窄治療薬のスクリーニング技術
(D) RGS5遺伝子発現制御系および蛋白機能に関する解析に基づいた血管学研究ツール
(E) RGS5遺伝子発現を指標にした血管狭窄のリスク診断技術
以上、血管内皮細胞におけるRGS5の役割と意義については、これまで有用な情報は全くない状況であった。
即ち、RGS5は血管内皮細胞の品質評価の鍵遺伝子であり、「悪玉」の血管内皮細胞では構成的に発現しているが、iPS樹立過程における「初期化」により発現はリセット(消去)され、そこから作製されるスーパー善玉血管内皮細胞においては発現が長期に抑制される。
[分化培地]
・イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、
・15重量% 牛胎児血清
・1mM β−メルカプトエタノール、
・2mM L−グルタミン、
・終濃度20ng/ml 血管内皮成長因子(VEGF)、
・終濃度20ng/ml 骨形成タンパク質-4(BMP-4)、
・終濃度20ng/ml 幹細胞因子(SCF)、
・終濃度10ng/ml Flt3-リガンド、
・終濃度20ng/ml インターロイキン-3(IL3)、
・終濃度10ng/ml インターロイキン-6(IL6)
即ち、本発明は、RGS5遺伝子という血管内皮細胞の善玉/悪玉制御の鍵遺伝子を提供することで、血管に関する生理学、病理学における未解明の問題に対する研究ツールを提供する。
本発明は、血管狭窄の治療のための広く施行されているPCI治療において問題となっている「血管内皮細胞の不可避的剥脱」という問題を解決するための手段として有用であるが、本発明の適応はPCI治療との併用に限定されず、血管内皮細胞欠損を伴うその他の血管障害においても適用できる。
(A) 多能性幹細胞を浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B) ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を接着培養して浮遊細胞と接着細胞とを含む特定前駆細胞を製造するステップ、
(C) ステップ(B)で得られた特定前駆細胞から浮遊細胞と接着細胞を分離するステップ、および
(D) 分離された接着細胞を接着培養で継代する方法を用いて血管内皮細胞を産生させるステップ
を含む方法により製造することができる。
(A) 多能性幹細胞を浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B) ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を接着培養して浮遊細胞と接着細胞とを含む特定前駆細胞を製造するステップ、
(C) ステップ(B)で得られた特定前駆細胞から浮遊細胞と接着細胞を分離するステップ、
(D) ステップ(C)で分離された接着細胞を接着培養で継代する方法を用いて血管内皮細胞を産生させるステップ
(E) ステップ(D)で作製された多能性幹由来血管内皮細胞の「善玉」「悪玉」に関する、RSG5 mRNAまたは蛋白質の発現検討による品質評価のステップ、
(F) ステップ(D)で作製された多能性幹由来血管内皮細胞を基材に包埋したうえで血管外膜面に載せる、PVVT移植のステップ
からなる、優れたPVVT移植を実現することが可能である。ステップ(A)〜(D)は上述したものと同様であって、ステップ(A)は、例えば、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含む培地または無血清培地で行い、ステップ(B)は、例えば血管内皮細胞に分化させるための少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する。ステップ(E)で善玉であることが確認された細胞についてステップ(F)が実施される。
(1) RGS5: regulator of G-protein signaling 5 [RGS5]
(2) VE-cadherin: cadherin 5, type 2 (vascular endothelium) [CDH5]
(3) PECAM1: platelet/endothelial cell adhesion molecule 1[PECAM1]
(4) NOS3: nitric oxide synthase 3 (endothelial cell) [NOS3]
(5) von Willebrand factor: von Willebrand factor [VWF]
(6) VEGFR1: fms-related tyrosine kinase 1 [FLT1]
(7) VEGFR2: kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase) [KDR]
(8) Tie2: TEK tyrosine kinase, endothelial [TEK]
(9) smooth muscle cell actin (ACTA2: actin, alpha 2, smooth muscle, aorta): actin, alpha 2, smooth muscle, aorta [ACTA2]
(10) platelet-derived growth factor receptor, beta polypeptide (PDGFRβ): platelet-derived growth factor receptor, beta polypeptide [PDGFRB]
(11) VEGF: vascular endothelial growth factor A [VEGFA]
(12) BMP4: bone morphogenetic protein 4 [BMP4]
(13) SCF: KIT ligand [KITLG]
(14) Flt3-リガンド:fms-related tyrosine kinase 3 ligand [FLT3LG]
(15) IL3: interleukin 3 (colony-stimulating factor, multiple) [IL3]
(16) IL6: interleukin 6 (interferon, beta 2) [IL6]
(17) Oct3/4: POU class 5 homeobox 1 [POU5F1]
(18) Sox2: SRY (sex determining region Y)-box 2 [SOX2]
(19) Nanog: Nanog homeobox [NONAG]
(20) Myc: v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) [MYC]
(21) Lin28: lin-28 homolog A (C. elegans) [LIN28A]
(22) FGF: fibroblast growth factor 2 (basic) [FGF2]
(23) G-CSF: colony stimulating factor 3 (granulocyte) [CSF3]
(24) GM-CSF: colony stimulating factor 2 (granulocyte-macrophage) [CSF2]
(25) M-CSF: colony stimulating factor 1 (macrophage) [CSF1]
(26) EPO: erythropoietin [EPO]
(27) トロンボポエチン(TPO): thrombopoietin [THPO]
まず、継代数11のヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ) (ATCC(www.atcc.org), CRL-2522) 5.0 x 105(個)を6穴プレート上で、 10 % FBS含有DMEM (Life Technologies, Inc.,Grand Island,NY,USA)を用いて、37℃、5% CO2インキュベータにて培養した。また、継代数4のHUVEC(Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland)2.5 x 105(個)を6穴プレート上で、EGM2ブレットキット培地(Lonza Group Ltd.)を用いて、37℃、5% CO2インキュベータにて培養した。また培養後に、MOI=3の濃度の下記(a)〜(d)のベクターを培養した細胞に感染させた(WO2010/008054)。
(a)SeV18+ OCT3/4/TSΔFベクター
(b)SeV18+ SOX2/TSΔFベクター
(c)SeV18+ KLF4/TSΔFベクター
(d)SeV(HNL)-c-rMyc/TS15ΔFベクター
フローサイトメーター(FACSCalibur(登録商標))(BD Biosciences)を用いて、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーであるSSEA4, OCT4の発現を調べた。
具体的には、SSEA4については、実施例1で得られたSeV-hiPS細胞を、多能性幹細胞用剥離液(0.25% trypsin (Life Technologies, Inc.), 1mg/ml collagenase IV(和光純薬工業株式会社製),20% KnockOut(登録商標)Serum Replacement(Life Technologies社製), 1mM CaCl2)で回収した後、Trypsin/EDTA液(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)を用いて分散させたうえで、FACS buffer(X1 PBS, 0.05% NaN3, 5% FBS)に浮遊させた。ここに2% Mouse BD Fc Block (BD Biosciences)を添加した後、抗ヒトSSEA4 phycoerythrin conjugated mouse IgG (R&D, Minneapolis, MN, USA)をX 1/10添加して氷上にて60分静置後、FACS bufferで洗浄し、フローサイトメーターにてSSEA4発現を解析した。
また、OCT4発現については、SeV-hiPS細胞を回収後、FIX&PERM CELL PERMEABILIZATION KIT (Caltag Laboratories, An-Der-Grub, Austria) を用いて細胞の固定・細胞膜透過処理を行ったうえで、2% Mouse BD Fc Block (BD Biosciences)と抗ヒトOCT3/4 phycoerythrin conjugated rat IgG (R&D, Minneapolis, MN) X 1/10を添加し、氷上にて60分静置後、FACS bufferで洗浄し、フローサイトメーターでOCT4発現を解析した。
その結果、実施例1で得られたSeV-hiPS細胞(SeV-hiPS(BJ)iPS, SeV-hiPS(HU)iPS)は、SSEA4, OCT4の各未分化マーカーをいずれも高発現していることが確認された。
具体的には、実施例1で得られたSeV-hiPS細胞をアセトン/メタノール(1:3)で固定し、0.1% Triton-X-100 / PBSにより細胞膜透過処理を施したうえで、抗ヒトSSEA4抗体(ES Cell Marker Sample Kit)(Millipore Co, Bedford, MA, USA)、抗ヒトOCT3/4抗体(ES Cell Marker Sample Kit)(Millipore Co)、抗ヒトNanog抗体(ReproCELL Inc, Tokyo, Japan)X 1/100を用いて一次抗体反応を行った。なお、抗ヒトSSEA4抗体、抗ヒトOCT3/4抗体については、Kitのプロトコールにしたがって行った。そして、Alexa Fluor 488標識抗ウサギIgG抗体(Life Technologies, Inc)X 1/2000を用いて二次抗体反応を行った後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
その結果、実施例1で得られたSeV-hiPS細胞は、SSEA4, OCT4, Nanogの各未分化マーカーをいずれも高発現していることが確認された。
実施例1で得られたSeV-hiPS細胞よりSeVベクター由来外来遺伝子が除去された株を得るためにクローニングを行った。
SeVベクター由来外来遺伝子の除去の目安として、抗SeV抗体(Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Nagoya, Japan)による免疫染色を行った。SeV-iPS細胞を10%マイルドホルム(WAKO Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)で固定し、一次抗体として抗SeV抗体、二次抗体としてAlexa Fluor 488標識抗ウサギIgG抗体(Life Technologies, Inc.)を用いた染色を行った後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
その結果、実施例1で得られたSeV-hiPS細胞株は、SeV抗原陰性であり、SeVベクター由来外来遺伝子を保持しないことが確認された。そのため、SeV-hiPS細胞株は、レトロウイルスベクターで作製されたiPS細胞に比して、臨床的使用、薬剤評価系、病態モデル系への使用にも適する。
京都大学・再生医科学研究所より供与されたヒト胚性幹細胞(KhES-1 〜 KhES-5)、および[実施例1]〜[実施例3]により樹立したヒト人工多能性幹細胞(SeV-hiPS(BJ)iPS, SeV-hiPS(HU)iPS)はいずれも、X線照射処理済みのMEF上で、20% Knockout Serum Replacement(KSR)(Life Technologies, Inc.)、5 ng/ml FGF2、1% non-essential amino acids solution、100μM 2-mercaptethanol、2 mM L-glutamine含有DMEM/F12(Life Technologies, Inc.)培地を用いて維持培養を行った。
1)分化培地の調製
ヒト胚性幹細胞(KhES-1, KhES-3, KhES-5)および[実施例1]〜[実施例3]に記載の方法で樹立されたヒトSeV-hiPS細胞(SeV-hiPS(BJ)iPS, SeV-hiPS(HU)iPS)を用いて、以下に示す組成の分化培地(サイトカイン添加)(Nakahara M et al., Cloning Stem Cells. 2009, 11:509-522)を用いて血管内皮細胞の分化誘導を行った。
・イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、シグマケミカル製)、
・15重量% 牛胎児血清(PAA Laboratories GmbH、オーストリア)
・1mM β−メルカプトエタノール(シグマケミカル製)、
・2mM L−グルタミン(インビトロジェン製)、
・終濃度20ng/ml 血管内皮成長因子(VEGF)、
・終濃度20ng/ml 骨形成タンパク質-4(BMP-4)、
・終濃度20ng/ml 幹細胞因子(SCF)、
・終濃度10ng/ml Flt3-リガンド、
・終濃度20ng/ml インターロイキン-3(IL3)、
・終濃度10ng/ml インターロイキン-6(IL6)
ステップ(A)
分化培地(サイトカイン添加)を用いた浮遊培養法により、胚葉体類似の細胞凝集塊細胞を作成した。具体的には、直径10cmの円形培養皿で維持中のヒト多能性幹細胞を専用剥離液(リプロセル製)で処理することで剥離回収し、さらにピペッティング操作により細胞集塊をできるだけ細かく分散させた。この際、完全に1個の細胞レベルにまで分散させると細胞生存性が著しく損なわれるため、数個-数十個程度の細胞からなる微小集塊に分散させることを目指してピペッティングを行った。
3日後には培養液中に多数の細胞凝集塊の形成が肉眼的に確認されたので、これらを回収して、0.1%ゼラチンでコートした培養皿(直径10cmまたは6cm)の上で、分化培地(サイトカイン添加)を用いて、CO2インキュベータにおいて、37℃、5体積%CO2で接着培養を開始した。以後、3〜4日ごとに培地を交換した。ヒト多能性幹細胞の凝集塊は、平面上に広がりながら生長を続けた。
約2週間後に、嚢状構造物の形成、接着細胞の増殖、および浮遊細胞(球状細胞)の産生が確認された。培養上清を回収して遠心することで浮遊細胞(球状細胞)を沈降回収した。接着細胞は、トリプシン/EDTA液(インビトロジェン製)を用いて37℃、5分間反応させることで剥離回収した。
回収した接着細胞に関して、0.1%ゼラチンでコートした新しい培養皿で、分化培地(サイトカイン添加)を用いて接着培養を行った。以後、3〜4日ごとに細胞をトリプシン/EDTA液を用いて剥離しながら1/2〜1/3程度の希釈で継代を行ったところ、10回以上の継代培養が可能であった。細胞形態、各種マーカー発現および機能アッセイにより、全ての細胞が血管内皮細胞に分化していることが確認された(SeV-iPS(HU)については図2を参照、他は非特許文献2、非特許文献3を参照)。
1)Wire injury処置によるマウス大腿動脈狭窄モデル
9週令のICR系統マウスの鼡径部に、脱毛(脱毛クリーム)と消毒(ヨード剤)の処置を行った後、ペントバルビタール(ソムノペンチル)麻酔下で、マウスに苦痛を与えずに鼡径部を2 cm程度切開した。先端の丸いピンセットを用いて、鈍的切開により大腿動脈を露出させて大腿深動脈を結紮し、その近位部に横方向に切開を入れ、0.014インチの血行再建ガイド(COCK社製)を腸骨動脈に向けて挿入した。ガイドが下大動脈に達したら、ガイドを10回上下方向に動かして擦過し、さらに5回回転させて擦過することで大腿動脈の内腔面にある血管内皮細胞を、一様かつ完全に剥脱させた。その後は、大腿深動脈の大腿動脈との分岐部に絹糸(6号)をかけて、ガイドを静かに引き抜きながら同部を結紮した。その後は皮膚切開部を縫合した。
上記のwire injury処置により、大腿動脈内腔面から血管内皮細胞が剥離し、血管平滑筋細胞は増殖を開始し、血管狭窄が惹起された。処置後4週間程度で血管狭窄の病理像は完成するとされるが、実際には、図3に示すように、処置2週間後にマウスをソムノペンチル麻酔下で灌流固定し、処置部の大腿動脈を核出し、同部をパラフィン包埋して薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施したところ、すでに明らかな血管平滑筋層の肥厚が観察され、血管狭窄は顕在化していることが判明した。
なお灌流固定は、あらかじめヘパリン含有PBSを左心室から投与し、右心房を切開して脱血しながら、合計50mlのPBS灌流を行なった後に、100μlの4 % paraformaldehyde液を左心室内に投与することで実施した。
BJ細胞から作製されたSeV-hiPS細胞株(SeV-hiPS(BJ))から、実施例5に記載の方法で血管内皮細胞(SeV-hiPS(BJ)dEC)を作製した。1x106個のSeV-hiPS(BJ)dEC(継代数13)を、滅菌した1.5 mlチューブに入れて氷上に置いた。また別の1.5 mlの滅菌チューブを氷冷し、20μlのBDマトリゲル 基底膜マトリックス(BD社製)を入れて氷上に置いた。移植する直前に、SeV-iPSdECの培養上清を除去し、200μlのピペットチップを用いて、上記のBDマトリゲル 基底膜マトリックスと混合した。(注:混合後は速やかに、次項3)の処置に用いた)。
あらかじめ、300μgの抗アシアロGM1抗体(和光純薬工業株式会社製)を尾静脈したICR系統マウスを用いて、実施例6の1)の記載の方法でwire injury処置を行なった。この際、wire injury処置における深大腿動脈分枝部の縫合の直後に、大腿動脈壁の上面に、2)で作製した「ヒトSeV-iPSdECマトリゲル包埋体」を200μlのピペットチップから押し出して載せ、大腿動脈の上面で体温によりゲル化させた。その後は、実施例6の1)に記載の方法で、皮下を縫合した。以後は、一週間に2回、300μgの抗アシアロGM1抗体を投与した。なお、抗アシアロGM1抗体は、NK細胞の機能を阻害することで、ヒト由来細胞の生着を促進する目的で投与した。
1週間後にマウスを灌流固定した後で大腿動脈を核出してパラフィン包埋し、薄切切片を作製してヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を行なった。結果は、図4に示すように、未処置の大腿動脈では、一層の血管内皮細胞(左図、矢印)が観察された。また、血管平滑筋層は17μm程度であった(左図、中カッコ)。これに対して、wire injury処置を行なったマウスでは、血管内皮細胞は検出されず、血管内腔面にはフィブリン塊が観察され(中央図、矢頭)、血管平滑筋層も30μmに肥厚していた(中央図、中カッコ)。一方、SeV-iPSdECのPVVT移植を行なったマウスでは、一層の血管内皮細胞(右図、矢印)が血管内腔面を被覆しており、血管平滑筋層の厚さも15 μm程度と未処置のマウスと同等またはそれ以下であり、血管平滑筋層の肥厚は完全に抑制されていることが判明した(左図、中カッコ)。
またPVVT移植を行なったマウスの大腿動脈内腔で検出された血管内皮細胞(図4の右図、矢印)が、確かに移植したヒトSeV-iPSdECに由来することは、ヒトの血管内皮細胞のみを認識し、マウスの血管内皮細胞を認識しない「ヒトPECAM1特異的抗体」(Santa Cruz社製、sc-8306)による免疫染色により確認された。即ち、未処置マウスの大腿動脈血管内皮細胞は、この抗体を用いた免疫染色では陰性であったが(図5上図)、ヒトSeV-iPSdECのPVVT移植を行なったマウスの大腿動脈血管内皮細胞は、この抗体を用いた免疫染色で陽性であった(図5下図、矢印)。
以上、ヒトSeV-iPSdECのPVVT移植により、血管内皮細胞の欠損による血管狭窄の惹起は完全に防止された。
(1)ヒト血管内皮細胞に関するマイクロアレイ解析による「悪玉血管内皮細胞選択的遺伝子RGS5」の抽出
各種のヒト血管内皮細胞(善玉・悪玉)からRNAを回収して、マイクロアレイ(GeneChipTM Human Gene ST Array、Affimetrix社製)を行なった。マイクロアレイはまず最初に、「善玉」としては、「血管平滑筋増殖抑制作用」が確認された「継代数7のヒトEPC由来内皮細胞(ドナー1)」を用いた(非特許文献2)。また悪玉としては、図6のパネル1に示すように、ヒト初代血管内皮細胞として、HUVEC、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)(Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland)、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)(Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., Osaka Japan)を用いた(特許文献1、非特許文献2)(図6のパネル1)。しかし、群間比較で特徴的な発現様式を示す遺伝子が数百以上も見いだされ、絞り込みは困難であった。Bioinformatics(蛋白機能や局在に関する情報等)を加味してさらに候補の絞り込みを試みたが、real time PCRにおいてアレイの結果が再現されなかったり、後述のcDNA導入実験やshRNA導入実験で予想された作用が確認できなかったりしたため、最終的にはすべての遺伝子が候補から外れた。
結果、パネル1の候補の絞り込みに成功し、この2つのパネルで共通に、「善玉」「悪玉」を特徴づける発現様式を示す遺伝子RGS5を同定することができた。RGS5の発現は、「悪玉」は「善玉」に対してパネル1では10.47〜14.01倍、パネル2では2.73〜3.73倍のシグナル値の上昇を示した。
以上より、悪玉で選択的に発現上昇している遺伝子としてRGS5が同定された。
前項の(1)において、唯一、抽出されたRGS5遺伝子に関して、血管内皮細胞の悪玉化への関与を検証した。
まず、悪玉内皮細胞であるHUVECに、RGS5を標的としたshRNAの発現ベクター(ORIGENE社製)をリポフェクション法で導入してRGS5発現をノックダウンさせ、特許文献1に記載の方法に則って、血管平滑筋細胞の増殖に与える影響を定量的に評価した。結果は、図7に示すように、RGS5を標的とした shRNAの導入により、HUVECにおけるRGS5 mRNAレベルは6割程度に減少し(図7左)、かつ血管平滑筋増殖促進作用は7割強に減少した(図7右)。
次に、「スーパー善玉内皮細胞」であるSeV-iPS由来内皮細胞に、RGS5のcDNA(独立行政法人 製品評価技術基盤機構製(AK315357.1;配列番号:1)をもとに、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡株式会社)を用いて、第一コドン(ATG)のAから数えて238番目のGをAに、315番めのTをCに置換することで、RGS5 transcript varient 1(NM_003617.3)と塩基配列を同一にしたもの(配列番号:1)を用いた)が挿入された発現ベクターをリポフェクション法で導入し、特許文献1に記載の方法に則って、血管平滑筋細胞の増殖に与える影響を定量的に評価した。結果は、図8に示すように、RGS5発現ベクターの導入によりRGS5 mRNA発現は陽性になり(図8左)、かつSeV-hiPS由来内皮細胞の血管平滑筋増殖抑制作用は約半分に減少した(図8右)。
以上、血管平滑筋増殖促進作用(=悪玉作用)はRGS5のノックダウンにより減少し、血管平滑筋増殖抑制作用(=善玉作用)はRGS5の過剰発現により減少したことから、RGS5は悪玉血管内皮細胞の単なるマーカーではなく、血管内皮細胞の悪玉化そのものに関与している「悪玉化遺伝子」であることが明らかとなった。
(1)Real time RT-PCR法によるRGS5 mRNA発現量の測定による血管内皮細胞(善玉・悪玉)の品質評価
各種のヒト血管内皮細胞、即ち、「善玉」である「ドナー1のEPC由来血管内皮細胞(継代数6)」、「悪玉」である市販ヒト初代血管内皮細胞(HUVEC, HAEC, HMVEC, HCAEC)、および「スーパー善玉」である「SeV-hiPS(BJ)由来血管内皮細胞(継代数9)」と「SeV-hiPS(HU)由来血管内皮細胞(継代数10)」に関して、Applied Biosystem社製のStep One Plus Real-Time PCR Systemを使用して、RGS5 mRNA発現量を測定した。なおプライマーは、(Fw: GGAGGCTCCTAAAGAGGTGA(配列番号:13), Rv: GGGAAGGTTCCACCAGGTTC(配列番号:14))を用いた。またmRNA発現量のNormalizationにはGAPDH(Fw: CCACTCCTCCACCTTTGAC(配列番号:15), Rv:ACCCTGTTGCTGTAGCCA(配列番号:16))を使用した。
結果は図9に示すように、「善玉」および「スーパー善玉」ではRGS5 mRNA発現は低値であり、「悪玉」ではRGS5 mRNA発現が高値であることが判明した。ここで縦軸は対数表示であり、「悪玉」のうちEPCに由来する血管内皮細胞では、RSG5 mRNAの発現が「善玉」の10倍程度に、「悪玉」のうちヒト初代血管内皮細胞(市販)ではRSG5 mRNAの発現が「善玉」の100倍程度に増大していることが解った。
また、与えられた血管内皮細胞が「善玉」であるかどうかの判断は、「善玉」の中で最もRGS5発現値が高かった「SeV-hiPS(BJ)由来血管内皮細胞(継代数9)」と比較し、RGS5メッセージmRNAの発現量が同等(またはそれ以下)であることを検証するか、あるいは、入手が最も容易であるHUVEC等の市販のヒト初代培養血管内皮細胞と比較し、RGS5メッセージ発現量が100分の1程度(またはそれ以下)であるかを検証することで、判断が可能である。
「善玉」である「ヒトES細胞(KhES-5株)由来血管内皮細胞(継代数3)」、ならびに「スーパー善玉」である「SeV-hiPS(BJ)由来血管内皮細胞(継代数8)」と「SeV-hiPS(HU)由来血管内皮細胞(継代数11)」に対して、強力な酸化ストレスを賦与する過酸化水素(H2O2)の処理を行い、RNAを抽出して、RT-PCRを行なった。RTはSuperscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies,Inc.)を用いて行った。PCRはGeneAmpRTM PCR System 9700を用いて、変性(94℃で5分)、増幅(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒、28サイクル)、後伸張(72℃で10分)の各ステップを行った。用いたプライマーは、(Fw: CTGGATTGCCTGTGAGGATT(配列番号:17), Rv: TCAGGGCATGGATTCTTTTC(配列番号:18)である。なお、RGS5 mRNA発現量を評価するためのインターナル・コントロールは、βアクチン(Fw: GCAGGAGATGGCCACGGCGGC(配列番号:19), Rv: TCTCCTTCTGCATCCTGTCAGC(配列番号:20))を使用した。またRGS5陽性コントロール細胞としてHUVEC(悪玉血管内皮細胞)を用いた。
結果、図10に示すように、通常レベルの「善玉」であるヒトES細胞由来血管内皮細胞ではH2O2処理により細胞形態が変性するとともに、RGS5 mRNAが誘導されて「悪玉」となることが判明した。一方、「スーパー善玉」であるヒトSeV-iPS細胞由来血管内皮細胞ではH2O2処理によっても細胞形態は変化せず、かつRGS5 mRNAは誘導されずに「善玉」の状態を維持することが判明した。
以上、例えば、上記RT-PCRの条件において、RGS5 mRNAのバンドが検出されたものは「悪玉」、検出されなかったものは「善玉」と判断できる。
各種のヒト血管内皮細胞、即ち、「善玉」として「ドナー1のEPC由来血管内皮細胞(継代数7)」、「ヒトES細胞(KhES-1株)由来血管内皮細胞(継代数2)」、「悪玉」として「ドナー1のEPC由来血管内皮細胞(継代数12)」、「ドナー2のEPC由来血管内皮細胞(継代数7)」、「ヒトES細胞(KhES-1株)由来血管内皮細胞(継代数4)」、「市販ヒト初代血管内皮細胞(HUVEC, HAEC, HMVEC)」、および「スーパー善玉」として「SeV-hiPS(BJ)由来血管内皮細胞(継代数9)」と「SeV-hiPS(HU)由来血管内皮細胞(継代数11)」を選択し、これらに関して、RGS5に関する免疫染色を行なった。なお一次抗体反応は、抗RGS5抗体(ポリクローナル)(Abcam社、 ab14265) を200倍希釈で用いて行なった。また二次抗体反応は、Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (A11042) (Invitrogen社製)を1000倍希釈で用いて行なった。またカウンター染色として、DAPIにより細胞核を染色した。
結果、図11に示すように、「善玉」および「スーパー善玉」ではRGS5免疫染色は陰性であり、「悪玉」はRGS5免疫染色が陽性であった。
以上、好ましい一態様においては、抗RGS5抗体を用いた免疫染色において、陰性のものは「善玉」、陽性のものは「悪玉」と判断できる。
「善玉」として「ドナー1のEPC由来血管内皮細胞(継代数6)」、「悪玉」として「ドナー1のEPC由来血管内皮細胞(継代数13)」、「ドナー2のEPC由来血管内皮細胞(継代数8)」を選択し、これらに関して、RGS5に関するWestern blot法を行なった。なお一次抗体反応は、抗RGS5抗体(Abcam社製、 ab83230) を1000倍希釈で用いて行なった。また二次抗体反応は、Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (Cell Signaling社 #7074S) を2000倍希釈で用いて行なった。なお、RGS5蛋白量の発現を評価するインターナル・コントロールはβ-tubulinを適用し、この際の一次抗体反応は、抗β-tubulin 抗体(Santa Cruz社製、sc-9104)を1000倍希釈で用い、二次抗体反応はAnti-rabbit IgG HRP-linked antibody (Cell Signaling社 #7074S) を2000倍希釈で用いて行なった。
結果は、図12に示すように、「善玉」ではRGS5蛋白のバンドは検出されず、「悪玉」はRGS5蛋白のバンドが検出された。
以上、好ましい一態様においては、抗RGS5抗体を用いたWestern blot法において、陰性のものは「善玉」、陽性のものは「悪玉」と判断できる。
(1)免疫染色法によるRGS5蛋白発現検討による血管内皮細胞(善玉・悪玉)の品質評価
正常人の動脈(USbio社製)、高血圧症例の動脈(BioChain社製)、動脈硬化症例の動脈(BioChain社製)、全身性エリテマトーデス(SLE)症例、の各動脈の凍結固定標本の薄切切片を購入して、実施例8の(3)に記載の方法でRGS5の免疫染色を行なった。なお、血管内皮細胞の同定のために、RGS5とPECAM1との二重染色を行なった。なお免疫染色は、RGS5染色に関しては実施例8の(3)に記載の方法で行い、PECAM1染色に関しては、一次抗体はrabbit poly IgG (Santa Cruz社製、sc-8306) を 50倍希釈で用い、二次抗体はAlexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen社製、A11008)を1000倍希釈で用いた。またカウンター染色としてDAPIで細胞核を染色した。
結果は、図13に示すように、正常動脈では、血管内腔面に一層の血管内皮細胞が「PECAM1陽性(緑色蛍光陽性)かつRGS5陰性(赤色蛍光陰性)」として検出された。一方、SLE症例では、血管平滑筋層の軽度な肥厚が見られ、かつ血管内腔面に一層の血管内皮細胞が「PECAM1陽性(緑色蛍光陽性)かつRGS5陽性(赤色蛍光陽性)」として検出された。また高血圧症例では、血管平滑筋層の中等度の肥厚が見られ、かつ血管内腔面に一層の血管内皮細胞が「PECAM1陽性(緑色蛍光陽性)かつRGS5強陽性(赤色蛍光陽性)」として検出された。さらに、動脈硬化症例では、血管平滑筋層の高度な肥厚が見られるとともに、血管内腔面に一層の血管内皮細胞が「PECAM1陽性(緑色蛍光陽性)かつRGS5強陽性(赤色蛍光陽性)」として検出され、さらに新生内膜においてもRGS5強陽性細胞が多数検出された。後者に関しては、新生内膜の中に黒く抜けてみえる「vasa vasorum」の周囲に検出されたことから、vasa vasorumを構成する血管内皮細胞(未熟血管内皮細胞であるためPECAM1は陰性である)であると判断された。
以上、臨床検体においても、「善玉」の血管内皮細胞はRGS5陰性、「悪玉」の血管内皮細胞はRSG5陽性、と判断ができる。
上記技術は、血管狭窄のPCI施術後の合併症(再狭窄、ステント血栓症等)を防止するものであり、現行のPCI療法が抱える問題点を克服した、画期的かつ根本的治療を可能とする新しい治療技術である。
Claims (13)
- 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する細胞を検出する方法であって、血管内皮細胞におけるRGS5(Regulator of G-protein signaling 5)の発現を検出する工程、および該発現を、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性の低下および/または血管平滑筋細胞の増殖を促進する活性の上昇の指標とする工程を含む方法。
- RGS5 mRNAを検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- RT-PCRまたはリアルタイムRT-PCRによりRGS5 mRNAを検出する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- RGS5蛋白質を検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 免疫染色、エライザ(ELISA)、またはウェスタンブロット法によりRGS5蛋白質を検出する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 血管内皮細胞が誘導多能性幹細胞(iPS)から生成された細胞である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 誘導多能性幹細胞がセンダイウイルスベクターを用いて多能性が誘導された細胞である、請求項6に記載の方法。
- 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、請求項1から7のいずれかの方法により該細胞を検出する工程、および該細胞を回収する工程を含む方法。
- 血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、血管内皮細胞を含む1または複数の細胞集団を製造する工程、該細胞集団において、請求項1から7のいずれかの方法により血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する細胞を検出する工程、および、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する細胞が検出された細胞集団を選択する工程を含む方法。
- RGS5の発現を検出するプライマーまたはプローブ、あるいはRGS5蛋白質に結合する抗体を含む、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を検出するための試薬。
- 血管内皮細胞におけるRGS5遺伝子の発現を阻害する工程を含む、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有する血管内皮細胞を製造する方法。
- RGS5遺伝子のプロモータの下流にインディケータ遺伝子が挿入されたノックイン血管内皮細胞の、血管内皮細胞の血管平滑筋細胞の増殖を抑制する活性のマーカーとしての使用。
- 血管内皮細胞および/または血管内皮前駆細胞(EPC)におけるRGS5の発現、あるいはRGS5遺伝子のプロモータの下流にインディケータ遺伝子が挿入されたノックイン血管内皮細胞におけるインディケータ遺伝子の発現を検出し、該発現を低下または上昇させる化合物または培養条件を選択する工程を含む、血管内皮細胞の血管平滑筋細胞増殖抑制活性をそれぞれ上昇または低下させる化合物または培養条件のスクリーニング方法。
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