JP6298054B2 - 心不全の診断 - Google Patents
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Description
本発明は、心不全のリスクを有する患者を分類するための方法であって、(i)前記患者から得られたサンプル中のIGFBP2の濃度を測定する工程、並びに(ii)工程(i)で測定したIGFBP2の濃度を、特定の心不全病期にある患者由来のサンプル中のIGFBP2の濃度に由来するコントロール値、及び/又は健常患者由来の血液サンプル中のIGFBP2の濃度に由来するコントロール値と比較する工程を含む方法に関する。
心不全(HF)の有病率は、一般集団では老化及び心血管リスク因子により増加している[Delahaye, F. et al., 2001]。症状が非定型であり特殊なケアを受ける必要があるため、HFの診断は依然として非常に複雑であることが多い。臨床医が心不全を診断するのを助けるために、ナトリウム利尿ペプチド(NP)などの血液HFバイオマーカーが提案されている。しかしながら、NPには限界があり、容易な大規模HFスクリーニングを可能にするより特異的かつより正確なバイオマーカーの必要性がある。加えて、急性呼吸困難のために救急治療室に収容された患者の30%が、診断不可能な<<グレーゾーン>>の脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)濃度を有する。これらの事例では、HFの診断は、費用及び時間のかかる検査を必要とするであろう。しかしながら、患者の迅速な診断及び早期の医療ケアは患者の健康に良い影響を与え、また処置コストを下げると認識されている。
本発明者らは、前向き単一施設ケースコントロール研究を開始し、キャピラリー電気泳動−質量分析技術(CE−MS)を使用することによる全体的な分析戦略を用いて、急性心不全(AHF)又は慢性心不全(CHF)に特異的な尿ポリペプチドを調査した。本発明者らは、心不全バイオマーカーとして、すなわち、心不全患者を分類するためのバイオマーカーとしてIGFBP2濃度を使用し得ることを見出した。
分類及び診断方法
本発明は、心不全のリスクを有する患者を分類するための方法であって、前記患者から得られたサンプル中のIGFBP2の濃度を測定することを含む方法に関する。
(i)前記患者から得られたサンプル中のIGFBP2の濃度を測定する工程、
(ii)工程(i)で測定したIGFBP2の濃度を、特定の心不全病期にある患者由来のサンプル中のIGFBP2の濃度に由来する閾値、及び/又は健常患者由来のサンプル中のIGFBP2の濃度に由来する閾値と比較する工程
をさらに含む。
a)前記患者から得られたサンプル中のIGFBP2の濃度を決定すること;
b)健常又は病気個体集団、好ましくは健常個体100人の生物学的サンプル中のIGFBP2の平均濃度を決定すること;及び
c)a)で得られたIGFBP2の濃度を、b)で得られたIGFBP2の平均濃度と比較する工程
を含む方法に関する。
表1:発見試験セットの人口学的及び臨床的特性。このセットは、「症例」としての急性心不全(AHF)患者12人及び慢性心不全(CHF)患者9人と比較した、「コントロール」としての心血管リスク因子患者(CRF)28人から構成されていた。LVEF:左室駆出率。
表2:ディファレンシャルに発現したポリペプチドのCE−MSによる決定。
曲線下面積(AUC)は、これら9個のポリペプチドが優れたHF予測因子であることを示している。未調整の及びBonferroni又はBenjamini Hochberg (BH)調整後の「p」値。
表3:検証セットの人口学的及び臨床的特性。心血管リスク因子(CRF)患者;非心臓性呼吸困難(NCD)患者、慢性心不全(CHF)患者及び急性心不全(AHF)患者を募集した。LVEF:左室駆出率。
表4:IGFBP2及びBNPレベルと臨床的特徴との相関関係。Rho:Spearman順位相関係数、n=228。Rho>0.5、中度〜高度の関連性を太字で示す。
表5:外部検証コホートの人口学的及び臨床的特性。LVEF:左室駆出率。
実施例1:第1の患者分析
材料及び方法
患者:
1.集団:
本発明者らは、2010年11月〜2011年3月に、Toulouse Rangueil University Hospitalの患者200人超を組み入れて横断的単一施設研究を実施した。3つの患者群は、慢性心不全(CHF)、急性心不全(AHF)及びコントロールから構成されていた。患者全員が承諾書に署名し、フランス保健省、CCTIR、CNIL及び倫理委員会(CPP)によって生体サンプルの採取が承認された。18歳未満の患者又は承諾書を理解不可能な患者若しくは承諾書に署名不可能な患者、並びに腎不全又は移植患者を除外した。
本発明者らは、種々の病因(虚血性心臓病(CMI)、弁膜(CMV)、高血圧後(HTA後CMH)、肥大型遺伝性心筋症(CMH遺伝子)、原発性拡張型心筋症又は毒性(CMD))、不整脈源性右室異形成(Right ventricle arythmogenic dysplasia arythmogen)及び先天性心筋症によるNYHA病期I〜IVの範囲の公知の安定CHFを有する患者(3カ月超にわたっていかなる代償不全も有しない)を組み入れた。組み入れには、心不全の確診(疾患の病歴、経胸壁心エコー検査(TTE)及び/又はBNP)が必要であった。心不全による入院後に、これらの患者をいくつかの心臓病施設に収容した(入院、受診票、Pr Galinier及びPr Carrieの部署)。
推定CHF及びAHFバイオマーカーを同定し得るために、本発明者らは、その種類にかかわらず(左、右、混合型、低心拍出量性、心原性ショック(cardiogenic choc))、急性心臓代償不全のために入院した患者を組み入れた。
入院日にRangueil University Hospitalのアテローム性動脈硬化症予防部を通じて、コントロール患者を組み入れた。
患者全員について、人体計測データ(体重、身長、性別)、病歴、心電図及び生物学的データ(血漿ナトリウム、クレアチニン、肝臓の状態、プロトロンビン、CRP、ヘマトクリット及びヘモグロビン)を収集した。CHF患者及びAHF患者について、BNPレベルのデータを収集した。これらの検査は全て、患者の担当医による処置中に依頼し、心不全の病期だけではなく腎臓及び肝臓の機能、水和及び炎症レベルをモニタリングするために実施した。全ての投薬を記録した。
各患者用のソフトウェアMy Lab Desk−Kontronを使用して、検査中及びデータ処理後のデータ収集を可能にする専用機械(Kontron)で、1人の心臓医が、組み入れた被験体全員について経胸壁心エコー検査(TTE)を実施した。
尿を標準的なポリプロピレンチューブに採取して直ぐに凍結し、−80℃に維持した。血漿をEDTAチューブに採取し、遠心分離し、氷上で分注し、直ぐに−80℃で凍結した。
標準的な手順を使用してCE−MSを実施した[Mischak, H. et al., 2010]。簡潔に言えば、ESI−TOF質量分析計(エレクトロスプレーイオン化−飛行時間型)(MicroTOF, Brucker-Daltonic, Bremen, Germany)に接続した長さ90cm直径50μmのsilice capilar (Beckmann-Coulter, Fullerton, CA, USA)で、ペプチドを電気泳動分離した。CE−MS緩衝液は、20%(v/v)アセトニトリル及び250mMギ酸のHPLC水溶液であった。13μAの強度をもたらす電場(+35〜−40kV)の下で、電気泳動分離を60分間実施する。実行中は、キャピラリー温度を+35℃に維持する。
本発明者らは最初に、患者50人(CHF9人、AHF13人、年齢性別及びリスク因子適合健常コントロール28人)の尿プロテオームをスクリーニングしたところ、HFに特異的なポリペプチドのパネルが明らかになった。CE−MSデータによれば、あるポリペプチド(x64054、質量1878,792Da;キャピラリー電気泳動時間t=20.72分)が高い特異性及び感度でAHF及びCHFを識別することができたので(AUC=0,99;p<0,0001)、非常に関連性があると思われた。MALDI−TOF分析を使用して、本発明者らは、この推定バイオマーカーをインスリン様成長因子結合タンパク質2(IGFBP2)のフラグメントと同定した。
材料及び方法
患者の組み入れ
本研究では、2つの独立したコホートを使用した。発見−検証コホートは、2010年11月〜2011年11月にRangueil University Hospital (Toulouse, France) で募集した患者228人であり、外部検証コホートは、2009年〜2011年にLariboisiere University Hospital (Paris, France)で募集した患者40人であった。
本発明者らは最初に、発見−検証コホートの患者228人から被験体49人の発見−試験セットをランダムに構成した。HF患者21人(AHF67人のうちの9人及びAHF51人のうちの12人)が症例サブセットを構成し、CRF患者67人のうちの28人がコントロールサブセットを構成した。これらの被験体49人の尿をCE−MSプロテオーム分析に使用した(表1)。この分析によって単離したX64054ペプチドをさらに以下のようにIGFBP2と同定し、発見−試験セットの血漿中で試験した。さらなる2つの検証コホートを構成した。Toulouse university hospitalの患者を含む第1のコホート(表3);この検証セットは患者179人を含んでおり、コントロールサブセットはCRF39人及びNCD43人から構成され、症例サブセットはAHF39人及びCHF58人から構成されていた。
被験体全員を静脈切開し、末梢静脈血をナトリウム/EDTAチューブに吸引した。1500g、4℃で10分間遠心分離した後、血漿を分離して分注し、アッセイまで−80℃で保存した。また、被験体から早朝尿サンプルを入手し、20mlをポリプロピレン回収ポットに回収して分注し、上記のように保存した。
サンプルの調製、及びキャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせた(CE−MS)分析
心エコー検査の日に、参加者全員から早朝尿サンプルを採取した。
ピークピッキング、デコンボリューション及びデアイソトーピング(de-isotoping)を含め、MosaiquesVisuソフトウェア(Mosaiques, Hannover, Germany)を使用して、質量スペクトルを処理した。内部ポリペプチド標準を使用して、移動時間及びピーク強度を標準化した。これらのフラグメントは通常の生物学的プロセスの結果であると考えられ、本発明者らのデータベースにおける20,000個のサンプルに基づいてこれまでに研究したいかなる疾患状態によっても影響されないと思われる。得られたピークリストは、その分子量、標準化したキャピラリー電気泳動移動時間、及び標準化した信号強度によって各ポリペプチドの特性を示す。Microsoft SQLデータベースにおいて、検出された全てのポリペプチドをデポジットし、マッチし、アノテーションすることにより、複数の患者群をさらに分析及び比較することができた。
本発明者らは、SASソフトウェア(バージョン9.1.3)(SAS Institute, Cary, NC, USA)を使用して、それぞれt検定及びx2統計によって、発見サンプル及び試験サンプルの臨床的特性及び心エコー特性の平均及び割合を比較した。発見段階では、本発明者らは、Wilcoxon順位和検定を使用して、患者とコントロールとの間のCE−MS尿ポリペプチドプロファイルの自然対数変換した信号振幅を比較した。このノンパラメトリック検定は、スキュープロテオミクスデータに適切である。本発明者らは、患者及びコントロールが、CE−MS尿ポリペプチドプロファイルの信号振幅について同じ連続分布を有するという帰無仮説を試験した。信号振幅は、質量分析装置によって記録された較正カウント(強度)を表す。Benjamini-Hochberg補正を適用することによって、多重検定のための統計的調整を実施した。本発明者らは、個々の被験体におけるバイオマーカーの分布に基づいて、症例とコントロールとを識別する尿ポリペプチドのクラスタを探索した。各症例及び各コントロールについて、サポート−ベクターマシンベースのMosaClusterソフトウェア(バージョン1.6.5)を使用して、選択したポリペプチドをまとめて単一のサマリー変数にした。試験セットでは、研究参加者の臨床状態を把握していない研究者が、クラスタポリペプチドを測定した。コードの解読後、本発明者らは、受信者動作特性(ROC)プロットを使用して、試験セットにおける正しく分類されたサンプルの数を集計することによって、感度及び特異性を計算した。ROC曲線下面積(AUC)により、任意の特定の閾値とは独立した全体的な精度に関する単一の尺度が得られる。
基本的には記載されているように(Carty et al., 2011; Metzger et al., 2012)、Dionex Ultimate 3000 RSLSナノフローシステム(Dionex, Camberly UK)で尿サンプルを分析した。Ultimate 3000 RSオートサンプラー(Dionex, Camberley UK)によって流速5μl/分で、サンプル(5μl)をDionex100 μm x 2 cm 5 μm C18ナノトラップカラムにロードした。ローディング溶液の組成は、0.1%ギ酸及びアセトニトリル(98:2)であった。トラップカラムにロードしたら、次いで、サンプルを洗い流して、流速0.3μm/分でAcclaim PepMap C18ナノカラム75 μm x 15 cm, 2 μm 100Aに入れた。溶媒B(0.1%ギ酸及びアセトニトリル(20:80))に対する溶媒A(0.1%ギ酸及びアセトニトリル(98:2))の直線勾配を1%B(5分間)から開始して90分の時点で30%まで増加させ、次いで120分の時点で50%Bまで増加させることによって、溶出を実施した。Ultimate 3000 RSLCのカラムオーブン内で、トラップ及びナノフローカラムを35℃に維持した。カラムからの溶出液を、陽イオンモードで作動するProxeon nano spray ESI source (Thermo Fisher Hemel UK)に向けて、次いで、Orbitrap Velos FTMSに入れた。イオン化電圧は2.5kVであり、キャピラリー温度は200℃であった。380〜2000amuをスキャンするMS/MSモードで、質量分析計を操作した。フラグメント化方法は、35%衝突エネルギーのHCDであった。反復数1回並びに反復及び除外時間15秒間でデータ依存的な方法を使用して、MS2についてイオンを選択した。電荷状態1の前駆イオンを排除した。MS1のイオン分解能は60,000であり、HCD MS2については7,500であった。いかなる酵素特異性も用いずにThermo Proteome Discovererを使用して、HCD対応のLTQで実施した実験からのデータファイルをIPIヒト非冗長データベースに対して検索した。不定の改変を選択し、メチオニン及びプロリンの酸化を可変改変に設定した。それぞれMS及びMS/MSについて10ppm及び0.05Daの質量誤差範囲を許容した。得られたペプチド同定結果をさらに検証するために、pH2で実行した際のペプチド電荷とCE移動時間との間の厳密な相関関係を用いて、偽陽性判定率(17)を最小限にした。そのペプチド配列(塩基性アミノ酸の数)に基づいて計算した配列候補のCE移動時間を実験的な移動時間と比較した。CE−MS測定に対応する±2分間未満のCE移動時間偏差を許容した。
既に公開されているように(18)、ウサギモノクローナル抗ヒトIGFBP2抗体クローンEPR3380(2)(Clinisciences, Nanterre, France)を使用して、ウエスタンブロットを実施した。製造業者の仕様書に従ってIGFBP2酵素結合免疫吸着アッセイ(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)を使用して、ヒトIGFBP2を測定した。
既に実施されているように[Harmancey R et al, 2007]異なるプライマーを使用して、既に記載されているように、mRNA抽出及びRT−qPCRを実施した。
CE−MS分析で試験した患者数と比較して、信号の量が非常に大量であるため、バックグラウンドの4倍超の信号対雑音比を有する信号のみを維持した。特に指定しない限り、連続変数は、平均(±SD)カテゴリ変数としてパーセンテージで示す。連続変数についてはStudentのt検定若しくはMann-Whitney順位和検定(正規性検定が失敗した場合)を使用して、又はカテゴリ変数についてはカイ二乗検定を使用して、群間の統計的差異を決定した。R計算言語(http://www.R-project.org)及びMedcalc (Medcalc, version 11.6.0.0, Medcalc software bva, Belgium)を使用して、統計分析を実施した。
発見研究
発見−試験セットの人口学的及び臨床的データを表1に示す。投薬、入院時lab、心エコー検査及び入院時バイタルのパラメータに関するコントロールとHF患者との間の有意差は、臨床状態と一致している。従って、HF患者では、血漿BNP及びCRP濃度が有意に高かったのに対して、クレアチニンクリアランス、ナトリウム濃度は減少した。また、HF患者では、平均血圧及び駆出率(EF)が減少した。HF患者はまた、心拍数が増加した。HF患者は、コントロール被験体よりも高齢であった(70±15対53±12;p<0.001)。HF患者の43%は、CADの病歴があった。2つの群では、心血管リスク因子が同様に示された。
本発明者らは、最初の工程として尿サンプルのCE−MS分析を使用して、HF兆候の可能性がある推定バイオマーカープロファイルを検出しようとした。AHF患者及びCHF患者(全ての病期及び病因)並びにCRFコントロール被験体の尿プロテオーム分析に基づいて、本発明者らは、HF(AUCが0.923以上の9個のポリペプチド、p<0.001(Benjamini Hochberg多重検定補正)に特異的なポリペプチドセットを定義した(表2)。あるポリペプチド(x64054、質量1878.792Da;電気泳動時間t=20.7224秒間)が優れたHF識別力(0.988のAUC、p=1.39.10−5)を示したので、非常に興味深いと思われた。従って、本発明者らはこのペプチドに注目し、それをインスリン様成長因子結合タンパク質2(IPI:IPI00297284.1)と同定することに成功した。本発明者らは最初に、ヒト尿及び血液中のIGFBP2の存在を検査したところ、IGFBP2は尿中よりも血漿中に豊富にあることを観察した(データは示さず)。IGFBP2尿濃度のELISA分析により、この濃度は、血漿中よりも505±198(n=35)倍低いことが明らかになった(示さず)。この観察結果により、本発明者らは、ELISAによって血漿サンプル中のIGFBP2をさらに分析した。
血漿中のIGFBP2の分析により、心不全患者では、コントロール個体と対比して有意に増加していることが示され、それぞれ1350±635(p<0.001)及び214±136ng/mlであった(図7)。これらの患者におけるBNPレベルは、HFでは、コントロール患者よりも高濃度で示された;それぞれ806±693及び39±28(p<0.001)(図7)。
検証セットに組み入れた患者の人口学的及び臨床的データを表3に示す。CRF患者は心血管リスク因子を有し、HFに関するいかなる症候及び客観的パラメータも有しない。AHF患者は最高齢の群であった。AHF患者は、高血圧(81%)、冠動脈性心疾患(52%)及び真性糖尿病(24%)を含む有意な併存症状を有していた。ほとんどの患者は、利尿薬(89%)及び抗血小板薬(60%)を受けていた。CHF群の患者の年齢分布は、CRF群とNCD群との間のコントロール群に位置する。CHF患者は62±13歳であり(男性68%)、42人の患者でLVEFが45%以下であった。患者は、高血圧(37%)、冠動脈性心疾患(51%)及び真性糖尿病(30%)を含む有意な併存症状を有していた。やはり、ほとんどの患者は、利尿薬(78%)及び抗血小板薬(54%)を受けていた。群間では、性別の有意差はない。IGFBP2濃度は、CHF患者及びAHF患者では、CRF患者又はNCD患者と対比して有意に増加した。IGFBP2レベルのこの増加は、この患者セットにおけるBNPレベルと類似のパターンに従った(図8)。CRF患者及びNCD患者対CHF患者及びAHF患者のROC曲線分析により、IGFBP2の曲線下面積(AUC)は0.933であり(この場合のYouden指標は0.81であり、556ng/ml超のIGBP2に関連する)、BNP(0.870;p=0.038)よりも高かった。IGFBP2+BNPのロジスティック回帰により、AUCが0.942に増加したが、IGFBP2の性能は有意に増加しなかった(データは示さず)。
IGFBP2及びBNPと患者の主な特徴パラメータとの間の相関関係の単変量分析を表4に報告する。IGFBP2及びBNPレベルは、共に強く相関していた(rho=0.722;p<0.001)。さらに、BNP及びIGFBP2レベルは、利尿薬及びC反応性タンパク質、クレアチニンクリアランス並びにLVEFとも同様に相関していた。
本発明者らは、Paris Lariboisiere Hospitalで募集した患者コホートにおいて、AHF診断に関するIGFBP2の予測価値を試験した。このコホートにはAHF患者及びCOPD患者が含まれており、表5に記載されている。上記発見−検証コホートにおいて予め独立して決定した閾値556ng/mlを使用すると、AHF診断については80%の感度及びCOPD患者については90%の特異性が得られた(データ示さず)。
材料及び方法
ラットHFモデル及び経胸壁心エコー検査
National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animalsに従った調査が、Inserm Animal Ethics Committeeによって許可された。2月齢のSprague-Dawleyラット(Janvier labs)において冠動脈結紮による心筋梗塞を使用する研究が、Local Animal Ethics Committeeによって承認された(#MP/03/03/01/12)。既に実施されたようにVivid 7 pro 7心エコーシステム(GE Medical System)を使用して、左室駆出率の測定のために経胸壁心エコー分析を実施した。
虚血性HFのラットモデルにおけるIGFBP2の試験
20日目(すなわち、手術によって虚血を誘発した4日後)において動物の駆出率は低く(図10A)、この状態は、動物を安楽死させて器官を回収した70日目まで続いた。組織における遺伝子発現レベルの分析により、虚血動物の心房では、IGFBP2 mRNAレベルが偽手術と比較して増加したことが示された(図10B)。興味深いことに、この時点において、HF動物由来の心房のIGFBP2 mRNAレベルは、心室との対比では10倍高く、肝臓との対比では4倍増加していた。
血漿BNP又はNT−プロBNPレベルは、HFを有する患者を診断するのに有益なツールである(2)。従って、本発明者らは、IGFBP2の診断価値をBNPの診断価値と比較し、IGFBP2の推定付加価値をBNPと比較した。IGFBP2測定の診断性能により、本発明者らは、BNPと比較して増加したAUCを用いて、HF症例を、非心疾患コントロール症例(CRF患者及びNCD患者)と識別した。NCD患者とAHF患者との識別においてIGFBP2及びBNPの使用を試験したところ、IGFBP2及びBNPのロジスティックな組み合わせにより、BNP単独と比較して増加したAUCが得られた。BNPが中度に(すなわち、100〜600pg/mlの濃度範囲で)上昇している患者では、IGFBP2診断性能の付加価値がさらにより明白であった。
本出願を通して、本発明に関連する技術水準が様々な参考文献に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
Claims (5)
- 心不全のリスクを有する患者を分類するための方法であって、
i.前記患者から得られたサンプル中のIGFBP2の濃度を測定する工程、
ii.工程(i)で測定したIGFBP2の濃度を、特定の心不全病期にある患者由来のサンプル中のIGFBP2の濃度に由来するコントロール値、及び/又は健常患者由来の血液サンプル中のIGFBP2の濃度に由来するコントロール値と比較する工程
を含み、キャピラリー電気泳動−質量分析技術及びELISAによって、IGFBP2タンパク質のレベルの定量を実施する、方法。 - 患者における心不全を診断するための方法であって、
i.前記患者から得られたサンプル中のIGFBP2の濃度を決定すること;及び
ii.前記濃度をコントロール値と比較すること
を含み、キャピラリー電気泳動−質量分析技術によって、IGFBP2タンパク質のレベルの定量を実施する、方法。 - 心不全が、無症候性心不全、慢性心不全又は急性心不全である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記サンプルが、血漿及び尿サンプルからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- サンプル中のIGFBP2タンパク質のレベルを定量することによって、IGFBP2の濃度を測定する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
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