JP6272788B2 - 循環中の免疫複合体を特徴付けるためのマルチプレックス式クロマトグラフィー−イムノアッセイ法 - Google Patents

Description

本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびイムノアッセイを含む多工程法により、生体マトリックス中の循環中免疫複合体を検出し特徴付ける（サイズおよび組成）ための方法を報告する。

発明の背景
大半の生物学的治療製剤は、安全性および効力に因果関係を及ぼす可能性のある望ましくない免疫応答を誘発する可能性があり、これらの応答の頻度および重度は変動する(Buttel, I.C. et al., Biologicals 39 (2011) 100-109; COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu(2007))。

抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成は、薬物動態の変化、効力の消失または減少、天然対応物の中和、並びに、全身免疫反応および過敏症反応（血清病／ＩＩＩ型過敏症反応／免疫複合体により媒介される疾患を含む）をもたらし得る（Buttel, I.C. et al., Biologicals 39 (2011) 100-109; COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu(2007)）。

ＡＤＡ−Ｄ複合体の形成の結果としての血清病様症候群は周知の有害事象であり、そして前臨床試験（Ponce, R. et al., Regul.Toxicol.Pharmacol.54 (2009) 164-182）および診療（COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007); Dreyfus, D.H. et al., Ann.Allergy Asthma Immunol. 96 (2006) 624-627; Gamarra, R.M., J.Emerg.Med. 30 (2006) 41-44; Goto, S. et al., Int.J.Hematol. 89 (2009) 305-309; Hansel, T.T. et al., Nat.Rev.Drug Discov. 9 (2010) 325-338; Pilette, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 120 (2007) 972-973; Tamilvanan, S. et al., J. Drug Target 18 (2010) 489-498）における様々な生物学的製剤に対して報告されている。

市販薬についての、血清病または重度のアレルギー反応などの主要な反応の特徴は臨床的に診断される。関係するｍＡｂの投与後に有害事象が起こる症例では、反応は抗体応答が原因である（COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)）。実際に、ＡＤＡの形成が調査されそしてそれが臨床的に観察されたシグナルと相関していたデータを非常に僅かしか発見することができない（Goto, S. et al., Int. J. Hematol. 89 (2009) 305-309）。

免疫原性が深刻である可能性から、ＥＭＥＡは、ＡＤＡの形成の確認および特徴付けの重要性を強調した（COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP),EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)）。

免疫原性の評価は、典型的には、ＡＤＡを検出するために設計されたイムノアッセイを使用して行なわれる（Mire-Sluis, A.R. et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16; Shankar, G. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 48 (2008) 1267-1281; Koren, E. et al., J. Immunol. Methods 333 (2008) 1-9）。

しかしながら、ＡＤＡの出現の情報は、現在まで、臨床所見および薬物動態の変化との著明な相関を可能とはしていない。

形成されたＡＤＡ−薬物複合体の量およびサイズは、いくつかのパラメーター、例えばＡＤＡおよび薬物の濃度／比、並びにエピトープおよび抗体価に依存している（Abbas, A.K.およびLichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, in: Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, in: Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC ( 2008)）。

複合体のサイズおよび荷電状態は、複合体のクリアランスまたは有害事象の誘導の重要な決定因子である。典型的には、より大きな複合体は細網内皮系によって除去され、小さな複合体は、通常、炎症をトリガーせず、一方、中間サイズの複合体は補体に結合し得、そして組織損傷を引き起こし得る（Abbas, A.K.およびLichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, in: Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, in: Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC (2008); Mannik, M., Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, in: Clinical Immunology: Principles and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996); Sicherer, S.H., Leung D.Y.M., Serum Sickness, in: Nelsons textbook of pediatrics, Kliegman R.M., Behrman R.E., Jenson H.B.J., Stanton B.F. (eds.), Saunders Elsevier, pp. 985-986 (2007)。さらに、複合体の荷電状態は、複合体の組織への沈着にとって重要な因子である(Abbas, A.K.およびLichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, in: Saunders (2003); Mannik, M., Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, in: Clinical Immunology: Principles and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996)）。

ＡＤＡ応答の徹底的な評価のために、形成される可能性のあるＡＤＡ−薬物複合体は、サイズおよび荷電状態に関して特徴付けられるべきである。さらに、内在性の薬物の対応物が存在する場合には、形成されたＡＤＡがこれらの分子と交差反応するかどうか、そして内在性対応物はまた複合体の一部であるかどうかの情報は、価値ある情報である。さらに、免疫複合体における抗原／薬物の構造的特徴付けは、発病に関する情報を提供する。

Coyle et al.は、多発性硬化症の脳脊髄液中の免疫複合体の検出および単離を報告している（Journal of Neuroimmunology 15 (1987) 97-107)。ＥＬＩＳＡ技術と等電点電気泳動の組合せは、免疫複合体の分析のための高感度な方法であるが、これはKneba, M., et al. (J. Immunol. Meth. 61 (1983) 233-243）によって報告されている。Matousovic, K., et al.は、ＩｇＡ腎症患者の尿中のＩｇＡ含有免疫複合体を報告している（Nephrology Dialysis Transplantation 21 (2006) 2478-2484）。牛疫ウイルス感染から生き長らえたウサギにおける循環中の免疫複合体が、Rattan, B., et al. (Acta Vir. 38 (1994) 105-110)によって報告されている。国際公開公報第２００８／０３１５３２号では、抗薬物抗体アッセイが報告されている。Stubenrauch, K., et al.は、ヒト抗体の投与後のカニクイザルの血清試料中の免疫複合体を検出するための、薬物耐容性を有する一般的なイムノアッセイの評価を報告している（J. Pharm. Biomed. Anal. 52 (2010) 249-254）。国際公開公報第２０１１／０５６５９０号では、抗ＴＮＦ薬物および自己抗体の検出のためのアッセイが報告されている。Wang Shui Long et al.は、新規な均一系の移動度シフトアッセイを使用した、患者の血清中のアダリムマブに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の分析を報告している（Am. J. Gastroent. 105 (Sup l, 2010) S444-S445）。ＥＰ２３５４７９２号では、抗薬物抗体を検出するための方法が報告されている。Lambert, P.H., et al.は、血清中の免疫複合体を検出するための１８個の方法の評価についてのＷＨＯの共同比較試験を報告している（J. Clin. Lab. Immunol. 1 (1978) 1-15）。循環中の免疫複合体を測定するための方法が、Levinson, S.S. et al. (Clin. Immunol. Newsletter 3 (1987) 39-42)によって報告されている。

発明の概要
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を少なくとも１回のイムノアッセイと組み合わせて使用する多工程の方法を含む、生体マトリックス中の循環中の免疫複合体、例えば所与の薬物に対するＡＤＡを含む複合体の検出および特徴付け（サイズおよび組成）のための方法を用いて、薬物動態の変化との相関、効力の消失または減少、天然対応物の中和、並びに、全身免疫反応および過敏症反応（血清病／ＩＩＩ型過敏症反応／免疫複合体により媒介される疾患を含む）を測定することができることが判明した。

本明細書において報告された１つの局面は、
ａ）免疫複合体の重量／サイズを測定するための、薬物が少なくとも１回投与された哺乳動物から得られた試料のサイズ排除クロマトグラフィー、
ｂ）場合により、２回目のＳＥＣではないクロマトグラフィー、
ｃ）少なくとも１回のイムノアッセイ、および
ｄ）場合により、質量分析に基づいた分析
を含む、in vivoで形成された循環中免疫複合体（ＣＩＣ）を分析／特徴付けるための方法であり、
前記免疫複合体は、免疫複合体のサイズとイムノアッセイまたは質量分析アッセイの結果／読取値との相関によって特徴付けられる。

本明細書において報告された１つの局面は、（外来性）治療用ポリペプチドおよびin vivoで形成された内在性抗薬物抗体を含む、循環中の複合体を形成した抗薬物抗体免疫複合体を分析測定するための方法であり、これは
ａ）免疫複合体の重量／サイズを測定するための、薬物が少なくとも１回投与された哺乳動物から得られた試料のサイズ排除クロマトグラフィー、
ｂ）場合により、２回目のＳＥＣではないクロマトグラフィー、
ｃ）抗薬物抗体を検出するための少なくとも１回の不均一系のイムノアッセイ、および
ｄ）場合により、質量分析に基づいた分析
を含み、
前記免疫複合体は、免疫複合体のサイズとイムノアッセイまたは質量分析アッセイの読取値／結果との相関によって特徴付けられ、
前記治療用ポリペプチドは合成または非天然の治療用ポリペプチドである。

全ての局面の１つの態様において、試料は血清または脳脊髄液である。

全ての局面の１つの態様において、免疫複合体は薬物特異的免疫複合体である。

薬物特異的免疫複合体は、薬物を、他の薬物ではない分子と共に含む。

全ての局面の１つの態様において、イムノアッセイは、抗薬物抗体検出アッセイ、薬物中和抗体検出アッセイ、薬物動態アッセイ（薬物定量アッセイ）、抗体アイソタイプ決定アッセイ、内在性薬物対応物に対するＡＤＡの交差反応性を決定するためのアッセイ（薬物が、哺乳動物において内在的に発生する部分を含む場合）、補体結合アッセイ（結合した補体または補体に対する結合能）、免疫複合体に含まれる内在性の薬物の対応物を決定するためのアッセイ（薬物が、哺乳動物において内在的に発生する部分を含む場合）を含む群から選択される。

全ての局面の１つの態様において、イムノアッセイは、均一系のイムノアッセイまたは不均一系のイムノアッセイである。１つの態様において、イムノアッセイはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＭＩＴ）、または蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、または発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、またはイムノラジオイムノアッセイ（ＩＲＭＡ）、またはマイクロビーズ−酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、または酵素結合蛍光アッセイ（ＥＬＦＡ）、またはレクチン−酵素イムノアッセイ（ＬＥＩＡ）、または免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、または電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＩＡ）、または免疫磁気電気化学発光アッセイ（ＩＭＥＣＬ）、または化学発光ドット−免疫結合アッセイ（ＣＤＩＡ）、または濁度アッセイ、または粒子増強免疫比濁アッセイである。１つの態様において、イムノアッセイは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＩＡ）、または化学発光ドット−免疫結合アッセイ（ＣＤＩＡ）、または蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、または濁度アッセイ、または粒子増強免疫濁度アッセイである。

全ての局面の１つの態様において、２回目のＳＥＣではないクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー）、または逆相クロマトグラフィー、または親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、または疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、または受容制限物質クロマトグラフィー（ＲＡＭＣ）である。

全ての局面の１つの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、溶出液を分画して回収するサイズ排除クロマトグラフィーである。１つの態様において、各画分はイムノアッセイで分析される。

全ての局面の１つの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーの少なくとも１つの画分は、２回目のＳＥＣではないクロマトグラフィーによってさらに分離され、溶出液は分注して回収される。１つの態様において、各画分はイムノアッセイで分析される。１つの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーの各画分は、２回目のＳＥＣではないクロマトグラフィーによって分析される。

全ての局面の１つの態様において、画分はアリコートである。

全ての局面の１つの態様において、イムノアッセイは酵素結合イムノソルベントアッセイである。

全ての局面の１つの態様において、少なくとも１回のイムノアッセイは、１回、または２回、または３回、または４回、または５回、または６回のイムノアッセイである。

全ての局面の１つの態様において、イムノアッセイは抗薬物抗体イムノアッセイである。

全ての局面の１つの態様において、少なくとも１回のイムノアッセイは架橋酵素結合イムノソルベントアッセイである。

陽性架橋酵素結合イムノソルベントアッセイは、抗薬物抗体がＡＤＡ−Ｄ複合体の一部であったことを示す。より分子量の高い画分、すなわち、サイズ排除クロマトグラフィーのより早期に溶出する画分における抗薬物抗体の検出は、抗薬物抗体がより高い分子量の複合体の一部であったことを示す。

全ての局面の１つの態様において、少なくとも１回の酵素結合イムノソルベントアッセイは、ＡＤＡ−Ｄ複合体の検出のための複合アッセイである。１つの態様において、複合アッセイは、薬物に特異的な捕捉抗体、および検出抗体としての抗種特異的抗体を含む。

全ての局面の１つの態様において、少なくとも１回のイムノアッセイは、薬物におよび／または内在性の薬物の対応物に結合した抗薬物抗体の検出のための直接的アッセイである。１つの態様において、直接的アッセイは、捕捉分子としての固定された薬物または内在性の薬物の対応物、および検出抗体としての抗種特異的抗体を含む。

直接的アッセイは、遊離抗薬物抗体がサイズ排除クロマトグラフィーによって除去された後、試料中の薬物および／または内在性対応物に結合している抗薬物抗体と、固定された薬物との間の平衡の確立を使用する。

全ての局面の１つの態様において、薬物表面コーティングは、高密度の薬物表面コーティングである。

高密度の表面コーティングによって、表面に結合した薬物への結合に対する平衡のシフトの変化が起こる（抗薬物抗体の結合力を使用して）。

全ての局面の１つの態様において、イムノアッセイにおいて試料を１６〜３２時間の時間をかけてインキュベーションする。

本明細書において報告された１つの局面は、その後のＡＤＡアッセイ／イムノアッセイの薬物耐容性を増加させるために、ＡＤＡ−Ｄ複合体から薬物を分離するための方法である。同様に、本明細書において報告された方法を使用して、イムノアッセイの薬物耐容性を増加させることができる。

本明細書において報告された１つの局面は、
ａ）ＡＤＡ−Ｄ複合体の重量／サイズを測定するための、薬物が少なくとも１回投与された哺乳動物から得られた試料のサイズ排除クロマトグラフィー、
ｂ）抗薬物抗体の検出のための少なくとも１回の酵素結合イムノソルベントアッセイ
を含む、in vivoにおいて形成された抗薬物抗体−薬物（ＡＤＡ−Ｄ）複合体の特徴付けのための方法であり、
前記免疫複合体は、
− 陽性酵素結合イムノソルベントアッセイによる低分子量の複合体および約１５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａの重量、
− 陽性酵素結合イムノソルベントアッセイによる中間分子量の複合体および約４００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａの重量、または
− 陽性酵素結合イムノソルベントアッセイによる高分子量の複合体および約１，５００ｋＤａ〜約７，０００ｋＤａの重量
であることが特徴付けられている。

本明細書において報告された１つの局面は、免疫複合体の特性と薬物動態の変化との相関のための本明細書において報告された方法の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、薬物の効力の減少を測定するための本明細書において報告された方法の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、薬物の天然対応物の中和を測定するための本明細書において報告された方法の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、薬物に対する免疫反応および過敏症反応を測定するための本明細書において報告された方法の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、ＩｇＧの糸球体への沈着を測定するための本明細書において報告された方法の使用である。

全ての局面の１つの態様において、免疫反応および過敏症反応は、血清病／ＩＩＩ型過敏症反応／免疫複合体により媒介される疾患である。

本明細書において報告された１つの局面は、免疫複合体を含む自己免疫抗体の存在を決定するための本明細書において報告された方法の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、改変された／複合体を形成した薬物の存在を決定するための本明細書において報告された方法の使用要求である。

全ての局面の１つの態様において、薬物はヒト抗体またはヒト化抗体である。

発明の詳細な説明
定義
「抗薬物抗体」という用語は、薬物の抗原性領域に対して指向される抗体を示す。この抗原性領域は、薬物の抗原性アミノ酸配列、または薬物の糖構造であり得る。１つの態様において、抗薬物抗体は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、またはＢＨＫ細胞などの非ヒト細胞における前記薬物抗体の組換え産生から生じた薬物の第２の改変に対して指向される。一般的に、抗薬物抗体は、薬物が投与された動物の免疫系によって認識される薬物の抗原性領域に対して指向される。このような抗薬物抗体は、「特異的抗薬物抗体」である。薬物は、できるだけ少ない抗原性領域を含むように設計される。例えば、ヒトにおける使用を目的とした薬物は、薬物に対する免疫応答の発生を最小限にするためにヒト患者に適用する前にヒト化することができる。この免疫応答は、このようなヒト化薬物の非ヒト部分に対して指向される抗薬物抗体の形態である（例えばPan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49参照）。

「色原体」という用語は、蛍光基または発光基および色素を示す。

「検出可能な標識」という用語は、酵素、ＮＭＲ活性基または金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンを示す。検出可能な標識はまた、光で活性化され得る架橋基、例えばアジド基またはアジリン基であり得る。電気化学発光によって検出することのできる金属キレートもまた、好ましいシグナル発生基であり、特に好ましいのはルテニウムキレート、例えばルテニウム（ビスピリジル）_３ ^２＋キレートである。適切なルテニウム標識基は、例えば、第ＥＰ０５８０９７９号、国際公開公報第９０／０５３０１号、国際公開公報第９０／１１５１１号、および国際公開公報第９２／１４１３８号に記載されている。

「薬物」という用語は、疾患の処置のために個体に投与することのできるポリペプチド、例えば抗体または非抗体分子を示す。薬物（例えば治療用ポリペプチドまたは治療用モノクローナル抗体）は、癌疾患（例えば血液系腫瘍および固形腫瘍（非ホジキンリンパ腫、乳癌および結腸直腸癌を含む））、免疫疾患、中枢神経疾患、血管疾患、または感染症などの様々な疾患の処置に広く使用されている。このような薬物は、例えば、Levine, A.P., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152に記載されている。このような薬物は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、Ｇ２５０、ＧＤ３、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＤ５６、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ２、ＣＥＡ、ルイスＹ抗原、ＩＬ−６レセプター、またはＩＧＦ−１レセプターに対する抗体である。治療用抗体はまた、Groner, B., et al., Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547；およびHarris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302によって記載されている。

「哺乳動物」という用語は、脊椎動物の綱に属する生物を示す。哺乳動物という用語は、１つの態様において、霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ラット、マウスおよびウサギを示す。１つの態様において、哺乳動物という用語は、マーモセットおよびタマリン（Callitrichidae科）、新世界ザル（Cebidae科）、旧世界ザル（Cercopithecidae科）、ユビトキツネザルおよびネズミキツネザル（Cheirogaleidae科）、アイアイ（Daubentoniidae科）、ブッシュベビーおよびガラゴ（Galagonidae科）、テナガザルおよび小型類小猿（Hylobatidae科）、インドリ、シファカおよび類縁（Indridae科）、キツネザル属（Lemuridae科）、ロリス（Loridae科）、イタチキツネザル（Megaladapidae科）、メガネザル（Tarsiidae科）、並びにその交雑種を含む霊長目の科のメンバーを示す。１つの態様において、哺乳動物は、マーモセットおよびタマリン、旧世界ザル、ユビトキツネザルおよびネズミキツネザル、テナガザルおよび小型類小猿、キツネザル属、並びにその交雑種の科のメンバーを含む群から選択される。この特定の態様において、人類に最も近い類縁である大型類人猿、特にチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびオランウータンの群は除外される。

「試料」という用語は、薬物が投与された哺乳動物に由来する任意の量の物質を示す。このような物質としては、このような哺乳動物に由来する全血、血清、または血漿が挙げられるがそれらに限定されず、これらは前臨床的日常業務において最も広く使用されている試料源である。１つの態様において、試料は、唾液、尿、滑液、全血、血漿、または血清のような液体試料である。１つの態様において、試料は、全血、血漿または血清である。

「固相」という用語は、液体ではない物質を意味し、そしてこれには、ポリマー、金属（常磁性粒子、強磁性粒子）、ガラスおよびセラミックなどの材料から製造された粒子（微粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナおよびポリマーゲルなどのゲル物質；ポリマー、金属、ガラスおよび／またはセラミックから製造され得るキャピラリー；ゼオライトおよび他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；ソリッドストリップ；並びにキュベット、チューブまたは他の分光計サンプル容器が挙げられる。アッセイの固相成分は、アッセイが接触し得る不活性な固体表面とは、「固相」が捕捉抗体と相互作用するように意図されたその表面上の少なくとも１つの部分を含む点で、区別される。固相は、静止成分、例えばチューブ、ストリップ、キュベットもしくはマイクロタイタープレートであり得るか、または、非静止成分、例えばビーズおよび微粒子であり得る。微粒子はまた、均一なアッセイフォーマットのための固相としても使用することができる。ポリペプチドおよび他の物質の非共有結合的または共有結合的な付着のいずれかを可能とする様々な微粒子を使用し得る。このような粒子としては、ポリマー粒子、例えばポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリレート）；金粒子、例えば金ナノ粒子および金コロイド；およびセラミック粒子、例えばシリカ、ガラスおよび金属酸化物の粒子が挙げられる。例えば、Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1, 1998, 322A-327A（これは本明細書に参照により組み入れられる）を参照されたい。

マルチプレックス式の免疫複合体分析法
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をイムノアッセイと組み合わせて使用する多工程法を含む、生体マトリックスにおける投与された薬物に対して指向される免疫複合体の検出および特徴付け（サイズおよび組成）のための方法を用いて、薬物動態の変化との相関、効力の消失または減少、天然対応物の中和、並びに、全身免疫反応および過敏症反応（血清病／ＩＩＩ型過敏症反応／免疫複合体により媒介される疾患を含む）を測定することができることが判明した。

従って、本明細書において、１つの局面として、免疫複合体の重量／サイズを測定するための、薬物が少なくとも１回投与された哺乳動物から得られた試料のサイズ排除クロマトグラフィー、場合により、２回目のＳＥＣではないクロマトグラフィー、および少なくとも１回のイムノアッセイを含む、in vivoで形成された循環中免疫複合体（ＣＩＣ）を分析／特徴付けるための方法が報告され、前記免疫複合体は、免疫複合体のサイズとイムノアッセイの結果／読取値との相関によって特徴付けられる。

本明細書において、１つの局面として、ＡＤＡ−Ｄ複合体の重量／サイズを測定するための、薬物が少なくとも１回投与された哺乳動物から得られた試料のサイズ排除クロマトグラフィー、および抗薬物抗体の検出のための少なくとも１回の酵素結合イムノソルベントアッセイを含む、in vivoで形成された抗薬物抗体−薬物（ＡＤＡ−Ｄ）複合体を特徴付けるための方法がさらに報告され、前記免疫複合体は、陽性酵素結合イムノソルベントアッセイにより低分子量の複合体および約１５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａの重量、陽性酵素結合イムノソルベントアッセイにより中間分子量の複合体および約４００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａの重量、または陽性酵素結合イムノソルベントアッセイにより高分子量の複合体および約１，５００ｋＤａ〜約７，０００ｋＤａの重量であることが特徴付けられる。

また、本明細書において、薬物動態の変化との相関を測定するための、効力の消失または減少を測定するための、薬物の天然対応物の中和を測定するための、免疫反応および過敏症反応（血清病／ＩＩＩ型過敏症反応／免疫複合体により媒介される疾患を含む）を測定するための本明細書において報告された方法の使用が報告されている。

例えば、薬物を哺乳動物に投与した後、哺乳動物の免疫系は、異物として投与薬物を認識し得、そして抗薬物抗体を産生して、投与された異物を中和し得る。薬物が哺乳動物に対して内在性の要素を含む場合、抗薬物抗体はまた、薬物のこの要素に対しても指向され得、そして同様にまた、哺乳動物における内在性対応物も標的化し得る。

投与された治療薬物に対する免疫応答／ＡＤＡの形成／補体活性化により、免疫複合体が形成され得る。免疫複合体（ＡＤＡ−Ｄ複合体）の形成により、薬物動態の特性の変化、または続発症、例えば血清病様症候群が生じ得る。

免疫複合体の特性は、誘導されたフォローアップ効果の重要な決定因子であり得る：
− 複合体のサイズ
大きなサイズの複合体の形成は、細網内皮系による増強されたクリアランスをもたらし得る。
中間サイズの複合体の形成は、補体との結合、続いて、組織への沈着および「血清病」をもたらし得る。
小さなサイズの複合体の形成は、「全く」顕著な効果をもたらさない場合がある。
− 複合体の荷電状態
陽イオン性免疫複合体は、細胞／組織膜（陰イオン性細胞表面）に沈着／結合し得る。
− 複合体の極性
− Ｃ１ｑへの結合または結合能。

従って、綿密な免疫複合体の特徴付けは、in vivoでの効果（薬物動態の変化および／または毒性作用）との相関にとって必要条件である。

しかしながら、例えば抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生に関する唯一の情報は、臨床所見と薬物動態の変化との顕著な相関の判明を可能としない。

抗薬物抗体−薬物複合体（ＡＤＡ−Ｄ複合体）などの形成された免疫複合体の量およびサイズは、いくつかのパラメーター、例えば濃度／比並びにエピトープおよび抗体価に依存する。

複合体のサイズは、複合体のクリアランスまたは有害事象の誘導の重要な決定因子である。典型的には、より大きな複合体は細網内皮系によって除去され、小さな複合体は、通常、炎症をトリガーせず、一方、中間サイズの複合体は補体と結合し得、そして組織損傷を引き起こし得る。

免疫応答の徹底的な評価のために、形成された可能性のある免疫複合体はサイズに関して特徴付けされるべきである。さらに、内在性の薬物の対応物が存在する場合には、例えば、形成されたＡＤＳがこれらの分子と交差反応するかどうか、そして内在性対応物がまた、免疫複合体の一部であるかどうかの情報は価値ある情報である。

情報を、免疫の形成に因る薬物動態の変化または有害事象などの所見と相関させ得、そして、ほんの数人の免疫複合体陽性被験者における、全く影響を伴わない免疫複合体陽性被験者と、薬物動態の変化または続発症または血清病様症候群を伴う免疫複合体陽性被験者との間の差異を説明するさらなる情報を提供し得る。

薬物が投与された哺乳動物における免疫複合体の形成を測定するために、そして形成された免疫複合体を特徴付けるために、２工程の方法が必要とされる。

本明細書において報告された方法は、例えばＡＤＡ−Ｄ複合体並びに自己免疫複合体（自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、ループスなど）の任意の免疫複合体の特徴付けに使用することができる。

サイズ排除クロマトグラフィー
第１工程において、形成された免疫複合体をそのサイズに関して分離し、複合体における見かけの成分数を測定する。これは、溶出液のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および分画（１つの態様において分注）によって行なうことができる。

抗薬物抗体がＩｇＧクラスであると仮定すると、それは約１５０ｋＤａの分子量を有し、そして治療用ポリペプチドの分子量の範囲は約２．５ｋＤａ（ポリペプチド薬物；２０アミノ酸残基からなるポリペプチド）から約２５０ｋＤａ（薬物抗体；追加の融合したエフェクターポリペプチドまたは多重特異的抗体を含むＩｇＧクラスの完全長の治療用抗体）であり、抗薬物抗体と薬物の１：１の化学量論的複合体は、小さなポリペプチド薬物の場合には少なくとも約１５０ｋＤａの分子量を有し、そして複合体薬物抗体の場合には約４００ｋＤａ以下の分子量を有する。

分画時間の選択は、サイズ情報の分解能を規定する。

試料（生体マトリックス）は、血清血漿（例えば抗薬物抗体の検出のための）または滑液（例えばリウマチ疾患において）であり得るが、これはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分画される。サイズ排除クロマトグラフィーは、最初の情報、すなわち分析物（複合体）のサイズを提供する。

サイズ排除クロマトグラフィーの個々の画分をＩＥＣによる分離などの２次元クロマトグラフィーを使用して分析して、複合体の荷電状態を測定することができるか、あるいは逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーまたはＨＩＬＩＣによる分離を使用して、複合体の極性を決定することができる。

また、サイズ排除クロマトグラフィーの個々の画分を、補体結合活性について分析することができる。

また、サイズ排除クロマトグラフィーの個々の画分を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析することができる。

酵素結合イムノソルベントアッセイ
例えば、
− 架橋型ＥＬＩＳＡ（「古典的ＡＤＡスクリーニングアッセイ」）：より高分子量の画分におけるＡＤＡの検出は、ＡＤＡがより高分子量の画分の一部であったことを示す、
− 複合型アッセイ：薬物特異的捕捉および抗種検出を使用したＡＤＡ−Ｄ複合体の検出は、前臨床試験におけるｍＡｂに対する一般的なアプローチである（例えば国際公開公報第２００６／０６６９１２号、国際公開公報第２００８／０３１５３２号を参照、両方共に本明細書に参照により組み入れられる）、
− 直接型アッセイ：固定した薬物および抗種特異的検出を使用することによる、薬物および／または内在性対応物に結合したＡＤＡの検出、
のような種々のイムノアッセイを実施して種々の複合体を測定することができるので、サイズ排除クロマトグラフィー溶出液の分画は、マルチプレックス式のＳＥＣ分析を可能とする。

１つの態様において、各アッセイについての特定のカットポイントは、ブランクまたは理想的には投与前の試料の分析によって評価される。

カットポイントの定義のために、および異なるプレート間の半定量的結果の比較のために、ＥＬＩＳＡシグナルを、一定時間後に読み取られるべきである（１つの態様においてＭＴＰ上の陽性対照の使用によりモニタリング）。

イムノアッセイは当業者に周知である。このようなアッセイ並びに実践的な適用および手順を実施するための方法は、関連参考書に要約されている。関連参考書の例は、Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates (「Practice and theory of enzyme immunoassays」, Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278)および免疫学的検出法を扱った「Methods in Enzymology」, Colowick, S.P. and Caplan, N.O. (eds.), Academic Pressの種々の巻、特に７０、７３、７４、８４、９２および１２１巻である。

種々のイムノアッセイの原理が例えばHage, D.S., in Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304Rによって記載されている。Lu, B., et al., Analyst. 121 (1996) 29R-32Rは、イムノアッセイにおいて使用するための抗体の方向付けされた固定化を報告している。アビジン−ビオチンにより媒介されるイムノアッセイは、例えば、Wilchek, M.およびBayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469によって報告されている。

第２工程において、サイズで分離された複合体は、その組成に基づいて特徴付けられ、例えば、抗薬物抗体の存在が確認され、そして抗薬物抗体の特異性が決定される。１つの態様において、第２工程は、少なくとも１回の酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む。

一般的に、ＥＬＩＳＡは、捕捉分子およびトレーサー分子を含む。捕捉分子は、一般的に、固相に固定／結合している。トレーサー分子は一般的に、検出可能な標識にコンジュゲートし、検出可能な標識は、直接的に検出可能な標識であっても、または間接的に検出可能な標識であってもよい。

抗薬物抗体の存在の決定のために、種々のＥＬＩＳＡフォーマットを使用することができる：

− サンドイッチＥＬＩＳＡ
１つの態様において、固相にコンジュゲートさせた薬物を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた薬物をトレーサー分子として使用する。

サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、抗薬物抗体は、その二価構造に因り、捕捉分子とトレーサー分子との間に橋を形成する。このアッセイフォーマットはまた、架橋ＥＬＩＳＡとも称され得る。

サンドイッチ／架橋ＥＬＩＳＡを使用することによって、抗薬物抗体を検出することができる。その分子量とは異なる（例えば、ＩｇＧ−ＩｇＧ複合体については約３００ｋＤａとは異なる）質量範囲をカバーするＳＥＣ画分におけるＡＤＡの検出は、ＡＤＡがより分子量の高い複合体の一部であったことを示す。

− 複合型ＥＬＩＳＡ
１つの態様において、薬物特異的抗体を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた種特異的抗体に対する抗体をトレーサー分子として使用する。

１つの態様において、固相にコンジュゲートさせた薬物を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた種特異的抗体に対する抗体をトレーサー分子として使用する。

１つの態様において、固相にコンジュゲートさせた種特異的抗体に対する抗体を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた薬物をトレーサー分子として使用する。

１つの態様において、固相にコンジュゲートさせた種特異的抗体に対する抗体を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた薬物特異的抗体をトレーサー分子として使用する。

複合型ＥＬＩＳＡにおいて、抗薬物抗体−薬物複合体を検出することができる。

前臨床試料分析において、薬物特異的捕捉抗体および抗種特異的検出抗体を使用することができる。

臨床試料分析において、抗イディオタイプ抗体などの薬物に特異的な捕捉分子、および抗種特異的検出抗体を検出することができる。

このアッセイは、ＡＤＡが薬物に結合しているか否かの情報を提供する。これは、複合体の捕捉のために（薬物とのまたは抗薬物抗体との相互作用のいずれかを介して）、および捕捉された複合体の検出のために（薬物との相互作用が複合体の捕捉のために使用されている場合には、抗薬物抗体との特異的相互作用を介して、または抗薬物抗体が複合体の捕捉のために使用されている場合には薬物との特異的相互作用を介してのいずれかで）、ＡＤＡ−Ｄ複合体の種々の成分を使用することによって達成される。

抗薬物抗体は、一般的に、薬物が投与された哺乳動物によって産生される完全長抗体であるので、抗薬物抗体は、哺乳動物に特異的な定常領域を含む。それ故、種特異的定常領域の存在を活用して、抗薬物抗体の結合特異性に関係なく、抗薬物抗体の特異的結合（捕捉または検出）のために種特異的抗体を使用することができる。

− 直接型ＥＬＩＳＡ
１つの態様において、固相にコンジュゲートさせた薬物を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた種特異的抗体に対する抗体をトレーサー分子として使用する。

１つの態様において、固相にコンジュゲートさせた内在性の薬物の対応物を捕捉分子として使用し、そして検出可能な標識にコンジュゲートさせた種特異的抗体に対する抗体をトレーサー分子として使用する。

固定された薬物の内在性対応物および検出のための抗種抗体を含む直接型ＥＬＩＳＡを使用することによって、抗薬物抗体を検出し、そしてＡＤＡが薬物または内在性対応物に結合するかどうかを特定することができる。さらに、種およびサブタイプ特異的抗体を使用することによって、抗薬物抗体の抗体アイソタイプを決定することができる。

結果の評価は、シグナルｖｓマトリックスのサイズによりなされる。

１つの態様において、試料を、捕捉分子および／またはトレーサー分子と共に、１６時間〜３２時間の時間をかけてインキュベーションする。

架橋型ＥＬＩＳＡは、二重抗原架橋イムノアッセイを使用して、哺乳動物の試料中の、薬物（Ｄ）と薬物に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）との免疫複合体を免疫学的に測定するための方法である。

免疫複合体はさらに、ＡＤＡ−Ｄ複合体と略称される。

１つの態様において、試料中のＡＤＡ−Ｄ複合体の免疫学的測定は、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含む二重抗原架橋イムノアッセイを使用し、一方の抗体は、哺乳動物のＩｇに特異的に結合する抗体であり、そして他方の抗体は薬物に特異的に結合する抗体であることを特徴とする。

測定の過程で、複合体は、抗哺乳動物Ｉｇ抗体とＡＤＡ−Ｄ複合体と抗薬物抗体との間で形成され、そして形成された複合体の量は、ＡＤＡ−Ｄ複合体、薬物および／またはＡＤＡの濃度に相関する。

１つの態様において、形成されたＡＤＡ−Ｄ複合体の検出のための直接的な試料の分析を実施することができる。このようなアッセイにおいて、陽性シグナルは、試料が薬物および抗薬物抗体の両方を含む場合にのみ認められる。

１つの態様において、試料分析は、試料を予め決定された量の薬物抗体とプレインキュベーションした後に実施される。このようなアッセイにおいて、陽性シグナルは、試料が、試料中の薬物の有無とは独立して抗薬物抗体を含む場合に認められる。

１つの態様において、薬物とそのコンジュゲーション対とのコンジュゲーションは、薬物のアミノ酸骨格のＮ末端および／またはε−アミノ基（リジン）、種々のリジンのε−アミノ基、カルボキシ−、スルフヒドリル−、ヒドロキシル−および／またはフェノール官能基、および／または薬物の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって行なわれる。

１つの態様において、捕捉抗体または薬物は、受動吸着により固相にコンジュゲートし、そしてそれ故、少なくとも２つの異なる抗体部位で固相にコンジュゲートしている。受動吸着は、例えば、Butler, J.E., in "Solid Phases in Immunoassay", page 205-225; Diamandis, E.P.およびChristopoulos, T.K. (Editors): Immunoassays (1996) Academic Press San Diegoによって記載されている。

１つの態様において、捕捉抗体または薬物は、特異的結合対を介して固定されている。このような結合対（第１成分／第２成分）は、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996参照）、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモンレセプター、酵素／基質、ＩｇＧ／プロテインＡおよび／またはＧなどである。１つの態様において、捕捉抗体または薬物は、ビオチンにコンジュゲートし、そして固定は、固定されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して実施される。

１つの態様において、トレーサー抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。１つの態様において、トレーサー抗体は、特異的結合対を介してコンジュゲートしている。このような結合対（第１成分／第２成分）は、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996参照）、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモンレセプター、酵素／基質、ＩｇＧ／プロテインＡおよび／またはＧなどである。１つの態様において、トレーサー抗体は、ジゴキシゲニンおよびジゴキシゲニンに対する抗体を介して、検出可能な標識にコンジュゲートしている。あるいは、トレーサー抗体は、ルテニウムビスピリジル複合体のような電気化学発光標識にコンジュゲートしている。

１つの態様において、前記方法は、二重抗原架橋イムノアッセイを使用してサル種の試料中の薬物に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）を免疫学的に測定するためのものである。

１つの態様において、前記方法は、捕捉分子およびトレーサー分子を含む二重抗原架橋イムノアッセイを使用して哺乳動物の試料中のＡＤＡを免疫学的に測定するためのものであり、捕捉分子またはトレーサー分子のいずれかが、哺乳動物のＩｇＧに特異的に結合する抗体であり、そしてそれぞれの他の分子が薬物であることを特徴とする。

ＡＤＡの免疫学的測定の１つの態様において、捕捉分子は薬物であり、そしてトレーサ分子は、試料が由来する／得られた哺乳動物のＩｇＧに特異的に結合する抗哺乳動物ＩｇＧ抗体である。ＡＤＡの免疫学的測定の１つの態様において、捕捉分子は、試料が由来する／得られた哺乳動物のＩｇＧに特異的に結合する抗哺乳動物ＩｇＧ抗体であり、そしてトレーサー分子は薬物である。測定の過程で、複合体は、薬物とＡＤＡと抗哺乳動物ＩｇＧ抗体との間で形成され、そして形成された複合体の量は、ＡＤＡの濃度に相関する。ＡＤＡの免疫学的測定の１つの態様において、抗哺乳動物ＩｇＧ抗体は、モノクローナル抗体（抗哺乳動物ＩｇＧｍＡｂ）である。

ポリペプチド、例えば薬物ポリペプチドまたは薬物抗体は、多くの反応性部分、例えばアミノ基（リジン、α−アミノ基）、チオール基（シスチン、システインおよびメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）および糖アルコール基を含む。これらは、表面、タンパク質、ポリマー（例えばＰＥＧ、セルローまたはポリスチロール）、酵素、または結合対のメンバー（例えばAslam M.,およびDent, A., Bioconjuation MacMillan Ref. Ltd. (1999) 50-100参照）のような結合パートナーにカップリングさせるために使用することができる。

ポリペプチドの最も一般的な反応基の１つは、アミノ酸リジンの脂肪族ε−アミンである。一般的に、ほぼ全てのポリペプチドが、豊富なリジンを含む。リジンアミンは、ｐＨ８．０（ｐＫａ＝９．１８）超で妥当で良好な求核試薬であり、それ故、様々な試薬と容易かつ明瞭に反応して、安定な結合を形成する。ポリペプチド中の別の一般的な反応基は、硫黄含有アミノ酸シスチンおよびその還元生成物のシステイン（またはハーフシスチン）に由来するチオール残基である。システインは遊離チオール基を含み、これはアミンよりも求核性が高く、そして一般的にタンパク質中の最も反応性の高い官能基である。チオールは、一般的に中性ｐＨで反応性であり、それ故、アミンの存在下で選択的に他の分子とカップリングすることができる。遊離スルフヒドリル基は相対的に反応性であるので、これらの基を有するポリペプチドは、しばしば、それらと共に、その酸化形で、ジスルフィド基またはジスルフィド結合として存在する。シスチンおよびシステインに加えて、いくつかのポリペプチドもまた、アミノ酸のメチオニンを有し、これは、チオエーテル結合中に硫黄を含む。文献は、反応性アミノ基を介して複数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方法を提供するための、いくつかのチオラート架橋試薬、例えばＴｒａｕｔ試薬（２−イミノチオラン）、スクシンイミジル（アセチルチオ）アセテート（ＳＡＴＡ）、またはスルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）の使用を報告している。反応性エステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミン基の修飾のために、とりわけ最も一般的に使用されている試薬である。水性環境における反応に至適なｐＨはｐＨ８．０〜９．０である。イソチオシアネートはアミン修飾試薬であり、そしてタンパク質とチオ尿素結合を形成する。それらはポリペプチドのアミンと水溶液中（至適にはｐＨ９．０〜９．５）で反応する。アルデヒドは、穏やかな水性条件下で脂肪族および芳香族アミン、ヒドラジンおよびヒドラジドと反応して、イミン中間体（シッフ塩基）を形成する。シッフ塩基を、穏やかなまたは強力な還元剤（例えば水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど）を用いて選択的に還元して、安定なアルキルアミン結合を導くことができる。アミンを修飾するために使用される他の試薬は、酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）は、２つのアミン反応性無水物基を含む、二官能基性のキレート剤である。それは、タンパク質のＮ末端およびε−アミン基と反応して、アミド結合を形成することができる。無水物環が開環して、配位化合物中の金属に堅く結合することのできる多価で金属キレートを形成しているアームを作る。

ポリペプチド中の別の一般的な反応基は、カルボン酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）である。ポリペプチドは、Ｃ末端位並びにアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖にカルボン酸基を含む。コンジュゲートのために、カルボン酸基は通常、水溶性カルボジイミドの使用によって反応性エステルに変換され、そして、アミン、ヒドラジドまたはヒドラジンなどの求核試薬と反応させる。アミン含有試薬は、ポリペプチド上の他のアミンの存在下で活性化カルボン酸と選択的に反応するように弱塩基性であるべきである。ポリペプチド架橋は、ｐＨが８．０を超えて上昇する場合に起こり得る。

過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、炭水化物部分の中の糖のアルコール部分をアルデヒドへと酸化することができる。各アルデヒド基を、カルボン酸について記載されているように、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンと反応させることができる。

チオール反応性試薬は、ポリペプチド上のチオール基に結合して、チオエーテル結合した生成物を形成するものである。これらの試薬は、僅かに酸性から中性ｐＨで迅速に反応し、それ故、アミン基の存在下で選択的に反応することができる。ハロアセチル誘導体、例えばヨードアセトアミドはチオエーテル結合を形成し、そしてこれはチオール修飾ための試薬である。反応はシステイン基で起こり、このシステイン基は内在するものであるか、または、ポリペプチドの種々の位置におけるシスチンのジスルフィドの還元から生じたもののいずれかである。さらに有用な試薬はマレイミドである。マレイミドとチオール反応試薬の反応は、本質的にヨードアセトアミドと同じである。マレイミドは、僅かに酸性から中性ｐＨで迅速に反応する。

アミン、ヒドラジド、およびヒドラジンは、アルデヒドおよびカルボン酸に反応性の試薬である（アミド、ヒドラゾンまたはアルキルアミン結合の形成）。アミン、ヒドラジドおよびヒドラジンは、水溶性カルボジイミドによるカルボキシル基の活性化後、ポリペプチドのカルボン酸に結合することができる。アミン含有試薬は、より塩基性の高いリジンのε−アミンの存在下でカルボジイミド活性化ポリペプチドと選択的に反応して安定なアミド結合を形成するために、弱塩基性でなければならない。ポリペプチド上の炭水化物残基の過ヨウ素酸塩による酸化によりポリペプチド上に生成され得るアルデヒド基との反応において、シッフ塩基中間体が形成され、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウム（穏やかおよび選択的）または水素化ホウ素ナトリウム（強力）の水溶性還元剤を用いての中間体の還元を通して、アルキルアミンへと還元され得る。

図１には、薬物ＡＤＡ−Ｄ複合体の形成の動態が示されている（１mgの薬物および１mgのＡＤＡ）。時間が経てば経つほど、より高次の複合体が形成され、例えば、１：１の薬物：ＡＤＡ−複合体から出発して、１：２の薬物：ＡＤＡ複合体を介して、１：３の薬物：ＡＤＡ複合体となることが分かる（時点は０分、５０分、１００分、１６０分、２００分）。さらなるＡＤＡの添加により、試料の組成はさらに、より高い分子量の複合体へとシフトし得、モノマー薬物のピークは減少し得る（図２）。

図３には、本明細書において報告された方法を用いて得られた、例示的な再構成されたＳＥＣ図（ｙ軸はＥＬＩＳＡのＯＤである）およびＥＬＩＳＡの結果が示されている。図４には、試料２０１の再構成されたＳＥＣの拡大表示が示され、Ｙ軸は一定を維持する。それによると、試料組成の差が認められる。

以下の略称を本明細書において使用する：
ＡＢＴＳ ２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート（６）］ジアンモニウム
Ａｂ 抗体
ＡＤＡ 抗薬物抗体
Ｂｉ ビオチン
ＣｏＡ 分析証明書
Ｃｏｎｃ． 濃度
ＣＰＰ カニクイザルのプールされたブランク血漿
Ｄｉｌ． 希釈
ＥＬＩＳＡ 酵素結合イムノソルベントアッセイ
ＨＲＰ セイヨウワサビペルオキシダーゼ
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＭＴＰ マイクロタイタープレート
ＯＤ 吸光度
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ｒｐｍ 毎分回転数
ＲＴ 室温（＋１５〜＋２５℃）
ＲＴＵ 使用準備のできた
ＳＡ ストレプトアビジン
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順を改変できることが理解される。

薬物ＡＤＡ−Ｄ複合体（１mgの薬物および１mgのＡＤＡ）の形成の動態。 ＡＤＡがさらに添加された図１に示されたような動態。 本明細書において報告された方法を用いて得られた、例示的な再構成されたＳＥＣ図およびＥＬＩＳＡの結果。 図３で示された再構成されたＳＥＣの拡大表示。 ５匹のサルの血漿中に適用された薬物の濃度経過（用量＝１００mg/kg、反復適用、試験の１７日目に適用）。 ＩｇＧ沈着陽性動物（半定量評価）。

実施例１
カニクイザル試験の試料の分析
カニクイザル試験から得られた２７個の血漿試料を、投与された薬物に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を含む複合体の検出のために分析した。さらに、複合体のサイズの評価を実施した。

分析は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む２工程法を使用して実施された。

存在し得る複合体のサイズに依存した分離を、ＳＥＣ、続いて、ＳＥＣ溶出液の分画（１分間ずつの分画）によって実施し、これはマルチプレックス式のＳＥＣ分析を可能とする。なぜなら、各画分を、種々のＥＬＩＳＡによって分析できるからである。回収された画分における投与された薬物に対するＡＤＡの検出およびＡＤＡ−Ｄ複合体の存在の検出は、２つの異なるＥＬＩＳＡによって行なわれた。１つは、捕捉のためのビオチニル化薬物および抗カニクイザルＩｇＧ特異的検出抗体を使用することによって、ＡＤＡを検出するように設計され（ＡＤＡアッセイ）、２番目のアッセイは、薬物に特異的な捕捉分子および抗カニクイザルＩｇＧ特異的検出抗体を使用することによって、ＡＤＡ−Ｄ複合体を検出するように設計されている。

カニクイザル血漿試料は、主要な群および回復群の動物から回収した。第１群：プラセボ群（試料０１、０２、０３、０４、０５、０６）、第２群：基本的な用量（試料０７、０８、０９、１０、１１、１２）、第３群：基本的な用量の２倍（試料１３、１４、１５、１６、１７、１８）、第４群：基本的な用量の４倍（試料１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７）。

分画時間の選択は、サイズ情報の分解能を規定する。分画サイズは１分間であった。いくつかの画分のＥＬＩＳＡ結果を合わせて、情報を「高分子量、中間分子量、および低分子量の画分」へと凝縮した。

ＳＥＣ：
カニクイザルの血漿試料を、BioSuite 450で、１３μmのＳＥＣカラムで、約２０，０００から約７，０００，０００Ｄａまでの分子量範囲で分離した。カラム上部におけるタンパク質の望ましくない沈降を回避するために、カニクイザルの血漿をエタノールと混合し（移動相のエタノール組成と同等）、続いて、１分間遠心分離にかけた（カニクイザルの血漿：エタノール（９５重量％）の比は約１６：１；２０，８００ｒｃｆでの１分間の遠心分離）。２０μlの試料をＨＰＬＣシステム（Agilent 1100）に注入した。ＵＶトレースを、２８０nmの波長でモニタリングした。均一溶媒での分離を、移動相としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中５％エタノールを用いて実施した（２５分間０．５ml/分の流速で、その後、１３分間０．７５ml/分の流速で、そして最後の２分間は０．５ml/分の流速で）。

ＳＥＣにより分離した溶出液を分画して、ＥＬＩＳＡによる検出を可能とした。１つの態様において、９分（空隙容量）から２１分までの溶出時間をカバーする、１分間ずつの分画時間を有する１２個の連続画分を回収した。

それぞれの画分に対応する計算された分子量を以下の表に示す。

ＡＤＡアッセイ：
高分子量のＳＥＣ画分（１５０ｋＤａより大きく、これはＩｇＧ／ＡＤＡモノマーの質量に等しい）におけるＡＤＡの検出は、ＡＤＡが、高分子量の複合体の一部であったことを示す。ＡＤＡの検出は、ＡＤＡアッセイを使用して回収された画分の分析によって実施される。複合体のサイズの特徴付けは、ＳＥＣの保持時間に基づく。複合体の組成の特徴付けは、それぞれの画分におけるＡＤＡ−Ｄ複合体（ＡＤＡ−薬物複合体）の存在の分析によって行なわれる。

ＡＤＡおよびＡＤＡ−Ｄ複合体の検出のために、２つの連続的なＥＬＩＳＡ法を確立した。

ＡＤＡの検出のために、ＳＡ−ＭＴＰのウェルを、ビオチニル化薬物（Ｄ−Ｂｉ；ｃ＝１μg/ml）を用いて１時間かけてコーティングした。コーティング溶液を除去した後、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＳＥＣ画分のアリコートを加え、そして振とうしながらＭＴＰ中で一晩インキュベーションする。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ジゴキシゲニン化抗カニクイザルＦｃ抗体（＜Ｃｙｎｏ Ｆｃ＞−Ｄｉｇ、ｃ＝０．１μg/ml）を加え、そして振とうしながら１時間インキュベーションする。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＨＲＰ（ポリ）Ｆａｂフラグメント（５ｍＵ）にコンジュゲートさせた抗ジゴキシゲニン抗体を加え、そして振とうしながら１時間インキュベーションする。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ溶液を加え、そして発色をモニタリングする（測定波長４０５nm；基準波長４９０nm）。

ＡＤＡ−Ｄ複合体の検出のために、ＳＡ−ＭＴＰのウェルを、ビオチニル化抗薬物抗体（＜薬物＞−Ｂｉ：ｃ＝２μg/ml）を用いて１時間かけて振とうしながらコーティングする。コーティング溶液を除去した後、ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＳＥＣ画分のアリコートを加え、そしてＭＴＰ中で１時間かけて振とうしながら複合体の検出のためにインキュベーションする。溶液を除去した後、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ジゴキシゲニン化抗カニクイザルＦｃ抗体（＜Ｃｙｎｏ−Ｆｃ＞−Ｄｉｇ）溶液を加え（ｃ＝０．１μg/ml）、そして振とうしながら１時間インキュベーションする。溶液を除去した後、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、抗ジゴキシゲニン抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ポリ）Ｆａｂフラグメント溶液（５ｍＵ）を加え、そして振とうしながらインキュベーションする。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ溶液を加え、そして発色をモニタリングする（測定波長４０５nm；基準波長４９０nm）。

ＯＤシグナルに基づいたカットオフ値（これを超えるＳＥＣ画分の結果は、ＡＤＡ（ＡＤＡアッセイ）またはＡＤＡ−Ｄ複合体（ＡＤＡ−Ｄアッセイ）の存在について陽性と定義される）は、試験プラセボ試料の分析に基づいて定義された。

ＡＤＡアッセイおよびＡＤＡ−Ｄアッセイについての結果を、以下の表に示す（ＥＬＩＳＡの結果は、プラセボ試料の画分の分析のＯＤ値として列挙される（上の部分：ＡＤＡアッセイ；下の部分：ＡＤＡ−Ｄアッセイ））。

これらのデータに基づいて、ＡＤＡアッセイについてはＯＤ≧０．２０のカットオフ値が定められ、ＡＤＡ−ＤアッセイについてはＯＤ≧０．１０のカットオフ値が定められ、これは分析画分におけるブランクシグナル平均の約２倍を示す。

さらなる半定量評価のために、以下の表に示される数値を定義した（ＡＤＡ−アッセイ（左）およびＡＤＡ−Ｄアッセイ（右）についてのカットオフ値（ＯＤ））。

試験から得られた２７個のカニクイザル血漿試料を、投与された薬物に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を含む複合体の検出のために分析した。さらに、複合体のサイズの評価を実施した。

画分１〜３の結果を合わせて高分子量複合体画分として示され、画分４〜６は中間分子量複合体画分として示され、そして画分７〜８は低分子量複合体画分として示される。試験試料の画分の分析のＥＬＩＳＡ結果の概要を、次の表に提示する（左：ＡＤＡアッセイ；右：ＡＤＡ−Ｄアッセイ；第１群はプラセボ群であり；第２群は基本的な用量であり；第３群は基本的な用量の２倍であり；第４群は基本的な用量の４倍である）。

前の表に示されている試験試料の画分の分析の詳細なＥＬＩＳＡ結果を、次の表に示す（上の部分：ＡＤＡアッセイ；下の部分：ＡＤＡ−Ｄアッセイ：第１群はプラセボ群であり；第２群は基本的な用量であり；第３群は基本的な用量の２倍であり；第４群は基本的な用量の４倍である）。

薬物に対するＡＤＡは、処置動物（第２〜４群）の全ての分析試料において検出することができた。試料間の差異を、シグナル強度に関して、並びに、高分子量画分の陽性度に関して観察する。陰性結果が、以下の試料の特定の画分に観察された：試料７／画分１：試料２３／画分１〜２、試料２４／画分１〜４；試料２６／画分１；試料２７／画分１〜３。

ＡＤＡ−Ｄ複合体を、処置動物の２つの試料（試料１０、２４）を除く全ての試料で検出することができた。試料間の差異を、シグナル強度に関して観察する。試料１９および試料２０の例外を除いて、全ての試料が、高分子量画分（画分１〜３）に陰性の結果を示した。

実施例２
ＳＥＣ−ＥＬＩＳＡ分析と薬物動態との相関
５個のカニクイザル血漿試料を、投与前および以下の時点で、すなわち９日目、１３日目、２１日目、２３日目（全ての試料）および６３日目（動物２００４、２００５、３００２、３１０５）に回収し、そして投与された薬物に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を含む複合体の検出のために分析した。さらに、投与された薬物の薬物動態が観察された複合体のサイズの評価を実施した。

分析を、実施例１に報告したようなサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＡＤＡ−ＤアッセイおよびＡＤＡアッセイ）を含む２工程の方法を使用して実施した。投与された薬物の薬物動態との相関のために、ＡＤＡ−Ｄアッセイの結果のみを使用した。

カニクイザル血漿試料を、１００mg/kgの薬物の投与された５匹のカニクイザルから回収した。

血漿分析から、２００３番および２００５番のカニクイザルと比較して、２００１番、２００２番および２００４番のカニクイザルにおいては、より急速な血清中クリアランスを観察できたことが分かる（図５参照）。

ＳＥＣ分離の溶出液を、９分（空隙容量）から２１分までの溶出時間をカバーする、１分間ずつの分画時間で分画する。それぞれの画分に対応する計算された分子量を上の実施例１に記載のように使用する。

ＯＤシグナルに基づいたカットオフ値（これを超えるＳＥＣ画分の結果は、ＡＤＡ（ＡＤＡアッセイ）またはＡＤＡ−Ｄ複合体（ＡＤＡ−Ｄアッセイ）の存在について陽性と定義される）は、試験動物の投与前試料の分析に基づいて定義された。

ＡＤＡアッセイおよびＡＤＡ−Ｄアッセイの結果を以下の表に示す（ＥＬＩＳＡ結果はプラセボ試料の画分の分析のＯＤ値として列挙される（上の部分：ＡＤＡアッセイ；下の部分：ＡＤＡ−Ｄアッセイ））。

図５から、増強されたクリアランスが、動物２００１、２００２および２００４に観察されることが分かる。これらの動物のために、ＡＤＡ−Ｄアッセイの得られたＯＤの合計（前投与を行わない全ての日および６３日目）のシグナルは１１．９（動物２００１）、８．７（動物２００２）および１０．３（動物２００４）である。これらのシグナルは、明らかに、６．７（動物２００３）および５．９（動物２００４）のシグナルを超えており、これは増強されたクリアランスを示さなかった。従って、漸増量のＡＤＡ−薬物複合体は、より速い血漿クリアランスを示す。

実施例３
ＳＥＣ−ＥＬＩＳＡ分析とＩｇＧの糸球体への沈着の所見との相関
ｔ＝２１日目およびｔ＝２３日目の各アッセイ（ＡＤＡ−アッセイおよびＡＤＡ−Ｄアッセイ）および各投与群（Ａ群およびＢ群）について、９分から１２分（ブロック１）、１２分から１５分（ブロック２）および１５分から１７分（ブロック３）の保持時間ブロックの画分のシグナルを要約する（ＡＤＡ−ＤアッセイおよびＡＤＡ−アッセイについて以下の表を参照）。

時点ｔ＝２３日目で得られた合計されたシグナルを、時点ｔ＝２１日目で得られたシグナルで割ることにより（「指数１」）、ｔ＝２３日目におけるシグナルの減少または上昇が示される。

ＡＤＡ−Ｄアッセイの「指数１」の値を、ＡＤＡ−アッセイの「指数１」の値で割ることにより、「指数２」の値を得る。ブロック１における高い「指数２」の値は（例えば、２または３を超える）、動物の糸球体への沈着を示す。

さらに、各投与群およびブロックの「指数２」の値は、Ｆ検定およびＴ検定（α５％）によって統計学的に試験され、群のブロック１からブロック３の数値／平均が異なるか否かを識別する。

糸球体への沈着のデータは、全く沈着していない場合「−」で、糸球体への沈着が僅かに見られる場合「（＋）」で、動物に見られる糸球体への沈着の半定量的な差異を有する陽性試料については「＋」および「＋＋」でランキングされる。

上の表に列挙した結果は、ＳＥＣにより分離された免疫複合体と動物の糸球体への沈着との相関を示す。ブロック１における高い数値は、動物における糸球体への沈着を示す。Ａ群の全ての動物は、「−」および「（＋）」とランキングされ、そしてＢ群の全ての動物は「＋」および「＋＋」とランキングされる。これらの群の平均値は統計学的に差異がある。

「糸球体への沈着」の表に示したように、ＩｇＧの糸球体への沈着の結果間の半定量的な差異が観察され、動物３００３および３００４がより顕著な沈着を示した。

ＡＤＡ−薬物アッセイおよびＡＤＡ−アッセイについて表に示したように、ブロック１のシグナルの合計は、糸球体への沈着の結果と反比例する（図６も参照）。

Claims (17)

1. 治療用ポリペプチドとin vivoで形成された内在性の抗薬物抗体とを含む循環中の複合体を形成した、抗薬物抗体を測定するための方法であって、
   ａ）免疫複合体の重量／サイズを測定するための、薬物が少なくとも１回投与された哺乳動物からの試料のサイズ排除クロマトグラフィー溶出を分画すること、および
   ｃ）溶出した各画分のそれぞれを抗薬物抗体を検出するための少なくとも１回の不均一系のイムノアッセイにより分析すること
   を含み、
   前記免疫複合体は、免疫複合体のサイズと、イムノアッセイまたは質量分析アッセイの読取値／結果との相関によって特徴付けられ、
   前記治療用ポリペプチドは、合成または非天然の治療用ポリペプチドである、前記方法。
2. さらに、ｂ）２回目のサイズ排除クロマトグラフィーではないクロマトグラフィー、および／またはｄ）質量分析に基づいた分析を含む、請求項１記載の方法。
3. 試料が血清または脳脊髄液であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
4. サイズ排除クロマトグラフィーが、溶出液を分画して回収するサイズ排除クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. サイズ排除クロマトグラフィーの少なくとも１つの画分が、さらに、溶出液を分画して回収する２回目のサイズ排除クロマトグラフィーではないクロマトグラフィーによって分離されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 各画分をイムノアッセイで分析することを特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記イムノアッセイが抗薬物抗体イムノアッセイであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 少なくとも１回の前記イムノアッセイが、架橋酵素結合イムノソルベントアッセイであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 少なくとも１回の前記イムノアッセイが、抗薬物抗体−薬物複合体の検出のための複合アッセイであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 前記複合アッセイが、薬物に特異的な捕捉用抗体および検出抗体としての抗種特異的抗体を含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。
11. 少なくとも１回の前記イムノアッセイが、薬物および／または内在性の薬物の対応物に結合した抗薬物抗体の検出のための直接的なアッセイであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 前記直接的なアッセイが、捕捉分子としての固定された薬物または内在性の薬物の対応物と、検出抗体としての抗種特異的抗体とを含むことを特徴とする、請求項１１記載の方法。
13. 免疫複合体の特性と薬物動態の変化との相関のための請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法の使用。
14. 薬物の効力の減少を測定するための請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法の使用。
15. 薬物の天然対応物の中和を測定するための請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法の使用。
16. 薬物に対する免疫反応および過敏症反応を測定するための請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法の使用。
17. 前記免疫反応および過敏症反応が、血清病／ＩＩＩ型過敏症反応／免疫複合体により媒介される疾患であることを特徴とする請求項１６記載の使用。