JP6267103B2

JP6267103B2 - Endothelin-1 inhibitor and skin external preparation for whitening

Info

Publication number: JP6267103B2
Application number: JP2014252836A
Authority: JP
Inventors: 秀須藤
Original assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2018-01-24
Anticipated expiration: 2034-12-15
Also published as: JP2015134752A

Description

本発明は、エンドセリン−１の過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤に関する。 The present invention is to obtain a preparation that suppresses excessive production of endothelin-1 and keeps the skin healthy, and particularly relates to a preparation effective for whitening.

メラニンは、紫外線から生体を保護する役目があり、紫外線を浴びると皮膚内に生成される。しかしながら、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミやソバカスの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善するため、即ち美白のためには、メラニンの産生を抑制すること、或いは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。 Melanin has a role of protecting the living body from ultraviolet rays, and is produced in the skin when exposed to ultraviolet rays. However, excessive production and uneven accumulation cause skin darkening, spots and freckles. In general, melanin is changed from tyrosine to dopa and from dopa to dopaquinone by the action of an enzyme tyrosinase biosynthesized in pigment cells, and then formed through an intermediate such as 5,6-dihydroxyindophenol. Therefore, in order to prevent and improve skin darkness (skin pigmentation), that is, for whitening, it is considered effective to suppress the production of melanin or to lightly bleach already produced melanin. It is done.

これまでの美白剤の開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきた。しかし、最近、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１、幹細胞増殖因子（ＳｔｅｍＣｅｌｌＦａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。 The development of whitening agents so far has been focused on tyrosinase, the rate-limiting enzyme for melanin production. Recently, however, production from epidermal keratinocytes has increased after UV-B irradiation, and as cytokines that activate pigment cells (melanocytes), α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), endothelin-1, stem cell growth factor ( Stem Cell Factor (SCF), nitric oxide, basic fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte / macrophage / colony stimulating factor (GM-CSF), etc. have been reported. By blocking the information transmission system, the development of substances that suppress the production of melanin and lead to the whitening effect has been actively performed.

エンドセリン−１は、２１残基のアミノ酸からなる血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドで、エンドセリン−１は標的細胞のエンドセリン受容体を介してホスホリパーゼＣの活性化、カルシウムチャンネルの開口など多様な細胞内シグナル伝達系を活性化する。その結果、ホルモン・神経伝達物質分泌調節、細胞増殖・分化作用などさまざまな作用が奏される。一般的に、エンドセリン−１の濃度上昇は高血圧症や心疾患などの原因となる。 Endothelin-1 is a potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells consisting of 21-amino acid residues. Endothelin-1 is diverse in that it activates phospholipase C, opens calcium channels through the endothelin receptor of target cells. Activates the intracellular signaling system. As a result, various effects such as regulation of hormone / neurotransmitter secretion and cell proliferation / differentiation are exhibited. In general, an increase in the concentration of endothelin-1 causes hypertension, heart disease and the like.

また、エンドセリン−１は、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞（ケラチノサイトとも言う）でエンドセリン−１が産生され（非特許文献１参照）、産生されたエンドセリン−１は、表皮メラニン細胞（メラノサイトとも言う）を刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。したがって、表皮角化細胞のエンドセリン−１の合成を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる
またエンドセリンは、血管平滑筋収縮作用および血圧上昇作用であることが知られており、現在脚光を浴びている生理活性物質のひとつであり、高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患に有効である。 Endothelin-1 is produced by epidermal keratinocytes (also referred to as keratinocytes) when ultraviolet rays hit the skin (see Non-Patent Document 1), and the produced endothelin-1 is epidermal melanocytes (melanocytes). Also synthesize melanin causing freckles and freckles. Therefore, it is possible to treat or prevent spots and buckwheat if the synthesis of endothelin-1 in epidermal keratinocytes can be inhibited. Endothelin is known to have a vascular smooth muscle contraction action and a blood pressure increase action. , One of the physiologically active substances currently in the limelight, for diseases such as hypertension, pulmonary hypertension, cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage, renal failure, myocardial infarction, asthma, arteriosclerosis, vasculitis, sepsis It is valid.

このようにエンドセリン−１の過剰産生は、色素細胞の過剰増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。したがって、これらの発現を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。 Thus, it is thought that excessive production of endothelin-1 leads to hyperproliferation of pigment cells, promotes melanin production, and causes spots, buckwheat, dullness, and the like. Therefore, suppressing these expressions is thought to be useful for preventing pigment cell proliferation, suppressing melanin overproduction in the skin, and preventing or suppressing pigmentation, spots, freckles, etc. after sunburn. .

ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ［１９９５，３７１（２）：１８８−１９０］FEBS Letters [1995, 371 (2): 188-190]

本発明の目的はエンドセリン−１の過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤を得ることにある。
さらには高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患にも有効な製剤を得ることにある。 An object of the present invention is to obtain a preparation that suppresses the excessive production of endothelin-1 and keeps the skin healthy, and particularly to obtain a preparation effective for whitening.
Furthermore, it is to obtain a preparation effective for diseases such as hypertension, pulmonary hypertension, cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage, renal failure, myocardial infarction, asthma, arteriosclerosis, vasculitis, and sepsis.

本発明者らが鋭意検討した結果、ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニンの混合物が本発明の課題を解決する手段として有効なことがわかった。
さらには以下の割合がエンドセリン−１の産生を阻害する効果が高いこともわかった。
ピロリドンカルボン酸またはその塩を２０〜５０重量部、Ｌ−アルギニンを１０〜２０重量部、Ｌ−アスパラギン酸を５〜１５重量部、グリシンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−アラニンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−セリンを１．０〜３．０重量部、Ｌ−バリンを１．０〜２．０重量部、Ｌ−プロリンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−スレオニンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−イソロイシンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−ヒスチジンを０．１〜０．５重量部、Ｌ−フェニルアラニンを０．１〜０．５重量。
さらに乳酸ナトリウムを配合することによって有効であることもわかった。 As a result of intensive studies by the present inventors, pyrrolidonecarboxylic acid or a salt thereof, L-arginine, L-aspartic acid, glycine, L-alanine, L-serine, L-valine, L-proline, L-threonine, L- It has been found that a mixture of isoleucine, L-histidine and L-phenylalanine is effective as a means for solving the problems of the present invention.
Furthermore, the following ratios were also found to have a high effect of inhibiting endothelin-1 production.
20 to 50 parts by weight of pyrrolidonecarboxylic acid or a salt thereof, 10 to 20 parts by weight of L-arginine, 5 to 15 parts by weight of L-aspartic acid, 2.0 to 5.0 parts by weight of glycine, and L-alanine 2.0-5.0 parts by weight, L-serine 1.0-3.0 parts by weight, L-valine 1.0-2.0 parts by weight, L-proline 0.4-1.2 parts by weight Parts, L-threonine 0.4-1.2 parts by weight, L-isoleucine 0.4-1.2 parts by weight, L-histidine 0.1-0.5 parts by weight, L-phenylalanine 0. 1-0.5 weight.
Furthermore, it was also found effective by adding sodium lactate.

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
上記のアミノ酸の混合物を皮膚外用剤に０．０１〜６０重量％、好ましくは０．１〜５０重量％配合する。 The preparation of the present invention exhibits drug efficacy for oral, injection, and external use, but is preferably used as a skin external preparation. Skin external preparations include skin cosmetics, external quasi-drugs, and medical skin external preparations.
The above-mentioned mixture of amino acids is blended in the skin external preparation in an amount of 0.01 to 60% by weight, preferably 0.1 to 50% by weight.

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。 In addition to the above ingredients, the preparations of the present invention include surfactants, oily ingredients, moisturizers, polymer compounds, ultraviolet absorbers, anti-inflammatory agents, bactericides, Antioxidants, sequestering agents, preservatives, vitamins, pigments, fragrances, water and the like can be blended.

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。 As the surfactant, any of anionic, cationic, nonionic, natural, and synthetic surfactants can be used, but it is preferable to use a nonionic surfactant in consideration of irritation to the skin. Examples of the nonionic surfactant include glycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbite fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol. , Polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, alkylglycoside and the like.

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。 Examples of the oil component include fats and oils, waxes, hydrocarbons, higher fatty acids, higher alcohols, esters, essential oils, silicone oils, and the like. Examples of the fats and oils include soybean oil, nutka oil, jojoba oil, avocado oil, almond oil, olive oil, cacao oil, sesame oil, persic oil, castor oil, coconut oil, mink oil, beef fat, pork fat and the like, and these Hardened oil obtained by hydrogenation of natural fats and oils and synthetic triglycerides such as myristic acid glyceride and 2-ethylhexanoic acid triglyceride; waxes include, for example, carnauba wax, whale wax, beeswax, lanolin and the like; hydrocarbons For example, liquid paraffin, petrolatum, paraffin microcrystalline wax, ceresin, squalane, bristan etc .; higher fatty acids include, for example, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid, Linolenic acid, lanolinic acid, isostearic acid, etc .; Examples of the class alcohols include lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, lanolin alcohol, cholesterol, 2-hexyldecanol, etc .; examples of the esters include cetyl octanoate, triglyceride octanoate, myristyl lactate, cetyl lactate, Examples of essential oils include mint oil and jasmine. Oil, pepper brain oil, cypress oil, spruce oil, ryu oil, turpentine oil, cinnamon oil, bergamot oil, mandarin oil, ginger oil, pine , Lavender oil, bay oil, clove oil, hiba oil, rose oil, eucalyptus oil, lemon oil, thyme oil, peppermint oil, rose oil, sage oil, menthol, cineole, eugenol, citral, citronellal, borneol, linalool, geraniol, Camphor, thymol, spirantol, pinene, limonene, terpene compounds, etc .; examples of silicone oils include dimethylpolysiloxane. These oily components described above can be used alone or in combination of two or more. In the present invention, among these, myristic acid glyceride, 2-ethylhexanoic acid triglyceride, lanolin, liquid paraffin, petrolatum, paraffin microcrystalline wax, squalane, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, isostearic acid , Cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, cholesterol, cetyl octanoate, triglyceride octanoate, isopropyl myristate, octyldodecyl myristate, cholesterol isostearate, POE sorbite fatty acid ester, peppermint oil, spruce oil, cinnamon oil, rose Oil, menthol, cineol, eugenol, citral, citronellal, geraniol, pinene, limonene, dimethylpolysiloxane It is preferable to use.

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。 The following components can be further added to the preparation of the present invention, but the components are not limited thereto.
Colors: Yellow color No. 4, Blue No. 1 and Yellow No. 202 are recognized as food additives such as tar color dyes I and II, chlorophyll, riboflavin, crocin, safflower, anthraquinone, etc. Natural pigments.
Vitamins; vitamin A, vitamin C, vitamin D, vitamin E, etc.
Others: bactericides, preservatives, other ingredients necessary for formulation.

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
実施例
ピロリドンカルボン酸ナトリウム３７．５重量部
ピロリドンカルボン酸１０．９重量部
Ｌ−アルギニン２０．０重量部
Ｌ−アスパラギン酸１３．０重量部
グリシン３．２重量部
Ｌ−アラニン３．０重量部
Ｌ−セリン２．０重量部
Ｌ−バリン１．６重量部
Ｌ−プロリン１．０重量部
Ｌ−スレオニン１．０重量部
Ｌ−イソロイシン１．０重量部
Ｌ−ヒスチジン０．４重量部
Ｌ−フェニルアラニン０．４重量部
乳酸ナトリウム３０．０重量部
精製水１２５．０重量部
以上の原料を充分に撹拌して得られる水溶液。 The preparation of the present invention can be produced according to a conventional method by adding the optional components to the essential components as necessary, and can be in the form of cream, emulsion, lotion or the like.
Examples Sodium pyrrolidone carboxylate 37.5 parts by weight Pyrrolidone carboxylic acid 10.9 parts by weight L-arginine 20.0 parts by weight L-aspartic acid 13.0 parts by weight Glycine 3.2 parts by weight L-alanine 3.0 parts by weight L-serine 2.0 parts by weight L-valine 1.6 parts by weight L-proline 1.0 part by weight L-threonine 1.0 part by weight L-isoleucine 1.0 part by weight L-histidine 0.4 part by weight L- Phenylalanine 0.4 parts by weight Sodium lactate 30.0 parts by weight Purified water An aqueous solution obtained by sufficiently stirring 125.0 parts by weight or more of raw materials.

確認試験ｍＲＮＡ遺伝子発現試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。 Confirmation test mRNA gene expression test The human foreskin-derived epidermis cells (Kurabo) at the second passage were cultured in HuMedia-KG2 medium (without phenol red) so as to be 50-70% confluent, and the calcium concentration was set to 1.8 mM the day before. Examples were added to the modified HuMedia-KG2 medium and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 2 days.

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶＴｏｔａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。 <Extraction of RNA>
Total RNA was extracted from the cells after peeling with trypsin / EDTA and using SV Total RNA Isolation System (Promega) according to the manual attached to Promega (prepared in Japanese protocol NoTM048J, June 2001). The RNA concentration was calculated using NanoDrop1000 (Thermo SCIENTIFIC).

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌＲＮＡを使い、ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳＦＯＲＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ，東洋紡社）、７５００リアルタイムＰＣＲＳｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。 <RT reaction and real-time PCR>
Using 2.5 μg of total RNA, RT reaction was performed according to Toyobo recommended protocol (TOYOBO BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE 2008/2009, page 1-42) using MMLV Reverse Transcriptase RNase H- (Toyobo).
Real-time PCR was performed as follows using Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Using the SYBR Green method (THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix, Toyobo Co., Ltd.) and the 7500 Real-Time PCR System operation manual (Applied Biosystems), gene expression comparison was performed by the Comparative CT (ΔΔCT) method (n = 3). GAPDH was used as an internal standard.

＜使用プライマー＞
エンドセリン−１：フォワードプライマーがＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット <Primer used>
Endothelin-1: Set of forward primer is TCCTCTGCTGGTTCCTGAACT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer is CAGAAACTCCACCCCGTGT (SEQ ID NO: 2) GAPDH: Forward primer is GAGTCAACGGATTTGGTCGGT (SEQ ID NO: 3) and reverse sequence Set with the base sequence of the primer TTGATTTTGAGGGAGTCTCG (SEQ ID NO: 4)

実施例を１．０％作用させて実験した結果を図１に示す。
結果を見ると、実施例は１．０％で作用させた場合、エンドセリン−１の遺伝子発現量を約６０％抑制することがわかった。 FIG. 1 shows the results of an experiment conducted with 1.0% working of the example.
When the result was seen, when an Example was made to act at 1.0%, it turned out that the gene expression level of endothelin-1 is suppressed about 60%.

また実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、エンドセリン−１の産生を抑制し、美白に有効なことがわかった。 Moreover, the external preparation which mix | blended the Example was created, As a result of actually using it, it turned out that production of endothelin-1 is suppressed and it is effective for whitening.

実施例の終濃度１．０％での確認試験の結果で、エンドセリン−１の遺伝子発現量変化を示す図である。縦軸は実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。It is a figure which shows the gene expression level change of endothelin-1 by the result of the confirmation test in the final concentration of 1.0% of an Example. The vertical axis represents the gene expression level when the gene expression level when no example is added is 1.

Claims

Pyrrolidone carboxylic acid or a salt thereof, L-arginine, L-aspartic acid, glycine, L-alanine, L-serine, L-valine, L-proline, L-threonine, L-isoleucine, L-histidine, and L-phenylalanine An endothelin-1 inhibitor containing as an active ingredient.

20 to 50 parts by weight of pyrrolidonecarboxylic acid or a salt thereof, 10 to 20 parts by weight of L-arginine, 5 to 15 parts by weight of L-aspartic acid, 2.0 to 5.0 parts by weight of glycine, and L-alanine 2.0-5.0 parts by weight, L-serine 1.0-3.0 parts by weight, L-valine 1.0-2.0 parts by weight, L-proline 0.4-1.2 parts by weight Parts, L-threonine 0.4-1.2 parts by weight, L-isoleucine 0.4-1.2 parts by weight, L-histidine 0.1-0.5 parts by weight, L-phenylalanine 0. The endothelin-1 inhibitor of Claim 1 which mix | blended 1-0.5 weight part.

Furthermore, the endothelin-1 inhibitor of Claim 1 thru | or 2 which mix | blended sodium lactate.