JP6260947B2 - 蛍光色素 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光色素に関する。さらに詳しくは、特定のリグニンを主成分とする蛍光色素に関する。

組織再生および病理診断において、細胞内外に発現しているタンパク質の分布および動態を評価する技術は重要である。タンパク質の評価において必要なことの一つは、対象タンパク質にマーカーを結合することである。現状では、蛍光色素をマーカーとして利用する方法が一般的である。具体的に述べると、タンパク質の分布を評価する場合には、蛍光色素標識抗体を細胞の対象タンパク質に結合させた後、蛍光顕微鏡を用いて従来から励起光として使用されている波長４０５、４８８、５６６、６３３ｎｍ付近の可視光を蛍光色素に照射して、発生する蛍光を観察する。上述の方法では、蛍光色素が波長４０５ｎｍから６８８ｎｍ付近の励起光で蛍光を発生して、かつ蛍光が安定していることが非常に重要である。

生細胞におけるタンパク質の動態を評価する場合には、蛍光色素標識抗体を生細胞に導入後、蛍光色素と結合した対象タンパク質の軌跡を、蛍光顕微鏡を用いて評価する方法がある。この方法においても、良好な評価結果を得るためには安定した蛍光特性が蛍光色素に要求される。また、細胞内に導入する蛍光色素の量を詳細に検討することも上述の評価において重要であるため、予備実験において蛍光色素は大量に使用されている。しかしながら、蛍光色素は高価であるため、その使用は使用者の負担となっている。

蛍光顕微鏡における細胞観察で用いられる蛍光色素としては、化学合成から製造される蛍光色素がある。そのような蛍光色素の例として、ローダミンやフルオロセインをタンパク質と結合するようにイソチオシアネートで修飾した物質が挙げられる（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、これらの蛍光色素に長時間励起光を照射した場合、蛍光の退色が生じるため、蛍光顕微鏡で長時間安定的に観察することは困難である。特に発現量の少ないタンパク質においては、蛍光の退色によりタンパク質の発現を確認できない可能性もある。また、量子ドットを蛍光色素として用いる手法が特許文献３、４に記載されている。しかしながら、量子ドットは光の点滅を生じることがあるため、蛍光の軌跡を評価する実験では安定的な結果を得ることが容易ではない。また、従来の蛍光色素は高価であるため、その使用が制限されていることも課題の１つである。蛍光色素が高価となる要因は上述したイソチオシアネートを付加する工程を要することにある。さらに、従来の蛍光色素は低温保管する必要があり、管理において使用者の負担が大きかった。

特許４６０３１０９号公報 特開２００７５２８８４６号公報 米国特許第６，１９４，２１３号 米国特許第６，３０６，６１０号

従って、本発明の目的は、蛍光が点滅することなく長時間安定して発生し、かつ安価な蛍光色素を提供することである。

上記本発明の目的を達成するために、本発明者はバイオマスに注目した。バイオマスの成分は特定の励起光が照射された場合、蛍光を発生することが知られている。その一例として、リグニンが挙げられる。リグニンは紫外線を照射することで蛍光を発生することが知られている。植物中のリグニンを評価する方法の一つとして、紫外線を植物切片に照射して、その蛍光輝度からリグニンの有無を評価する方法が報告されている。また、バイオマスからリグニンを回収する方法として、常圧酢酸パルプ化法がある（Holzforschung，49（1995）pp.343-350）。しかしながら、常圧酢酸パルプ化法で回収したリグニンの利用分野としては、従来、炭素繊維や成形物の強化剤などを考慮されているにすぎない。また、微細化した場合における利用方法は検討されていない。

本発明者は、鋭意検討した結果、意外なことに、酢酸を用いて抽出したリグニンは、可視光線により励起され蛍光を発することを見出し、本発明に到達した。リグニンが可視光、就中４８８から５６６ｎｍ付近の可視光により励起され、安定な蛍光を発生することは従来知られておらず、本発明者が初めて見出したことである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。

１．バイオマスから酢酸水溶液を用いて抽出したリグニンを主成分とし、波長４８８から５６６ｎｍ付近の励起光で蛍光を発する蛍光色素。
２．バイオマスが、加水分解によりホロセルロースを一部分解した残渣である前記１の蛍光色素。
３．リグニンがバイオマスから酢酸水溶液と鉱酸を用いて抽出したものである前記１又は２の蛍光色素。
４．リグニンの融点及び熱分解温度が１００℃以上である前記１、２又は３の蛍光色素。
５．リグニンの平均粒径が１０から１００ｎｍ付近である前記１〜４のいずれか１項の蛍光色素。
６．タンパク質の蛍光色素標識用である前記１〜５のいずれか１項の蛍光色素。
７．リグニンと抗体が結合してなる前記６の蛍光色素。

本発明の蛍光色素は、波長４８８から５６６ｎｍ付近の励起光を照射した場合に蛍光を発生し、市販のリグニンに比べて、その蛍光強度は高くなっていることが特徴である。また、本発明の蛍光色素の主成分であるリグニンは安定な物質であるため、励起光の照射による退色が生じず、かつ光の点滅も生じない。さらに、常温でも保管できるため管理が簡易的である。また、安定性があるから生細胞内へ導入できる微細化も可能である。
さらに、本発明の蛍光色素の原料はバイオマスであるため、安価で大量に安定的に入手することが可能である。また、リグニンはタンパク質を吸着する特性を有しているので、細胞観察用の蛍光色素として活用する場合に、対象タンパク質と結合させるための化学修飾が必要でない。以上のことから安価な蛍光色素を製造することが可能となる。

本発明の蛍光色素粒子における製造方法と使用方法のフローチャートである。 本発明の酢酸で回収したリグニンの蛍光特性についての試験結果を示す画像である。 クラソンリグニンの蛍光特性についての試験結果を示す画像である。 酢酸セルロースの蛍光特性についての試験結果を示す画像である。

以下に本発明を詳細に説明する。
蛍光色素は、重量減少率５％と定義した場合における熱分解温度が１００℃以上とする物質であることが好ましい。その理由として１００℃以下では微細化する際の処理において熱分解する可能性があるからである。また、１００℃以下で融点を有しない物質であることも同様の理由から好ましい。さらにセルラーゼなどのタンパク質に吸着する特性を有している物質であることが要求される。リグニンはかかる点において、好ましい物質である。

本発明の蛍光色素は、バイオマスから酢酸水溶液と必要に応じて鉱酸を用いて抽出したリグニンを主成分とする。この蛍光色素は、蛍光顕微鏡に一般に使用する波長４８８ｎｍ付近から５６６ｎｍ付近の励起光を照射することで、強い蛍光を発する。

本発明の原料として使用するバイオマスとは、一般的には、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものと定義される。より具体的には、草本系バイオマスと木質系バイオマスがある。草本系バイオマスでは、例えば、稲わら、麦わら、竹、籾殻、麦柄などを用いることができる。また木質系バイオマスでは、例えば、針葉樹であるスギ、マツ、ヒノキなどを用いることができる。さらに上記バイオマスのホロセルロースを水熱処理や酵素糖化処理などにより加水分解した際に排出される残渣であっても、リグニンを含む残渣であれば本発明に使用することができる。また、粉砕などの機械的処理を施したバイオマスであっても使用することが可能である。

本発明の蛍光色素の製造方法について、図１に基づき説明する。
（ステップＳ１０１）
蛍光色素の製造は、まずバイオマスから酢酸水溶液を用いてリグニンを抽出する。酢酸水溶液の濃度は、特に制限はないが、通常４０〜９０体積％、好ましくは８０〜９０体積％である。また塩酸や硫酸などの鉱酸を酢酸水溶液に添加することで抽出を円滑に進めることができるが、短時間による抽出を必要としない場合は必ずしもその必要はない。鉱酸を添加する場合は、その濃度は、通常０．１〜１．０体積％、好ましくは０．１〜０．５体積％である。
抽出は、常温でも可能であるが、好ましくは加熱することで、より速やかにリグニンを抽出でき、好ましい。通常抽出圧力は大気圧である。抽出時間は、鉱酸を使用しない場合は、通常１２〜４８時間、好ましくは２４〜４８時間、使用する場合は通常１〜１２時間、好ましくは３〜６時間である。

ついで、リグニンの抽出液と残渣物を、公知のろ過装置等で分離して、抽出液を回収する。回収した抽出液は、減圧濃縮等により濃縮する。その際、１００〜１１８℃付近で加熱することが好ましい。濃縮した液に蒸留水を添加後、析出したリグニンを分離回収する。回収は公知のろ過装置等で行うことができる。回収したリグニンは、減圧乾燥等で乾燥する。
このようにして得られるリグニンは粉末である。また、乾燥前に粒径が、１００nｍ以下であれば、そのまま本発明の蛍光色素として使用できる。

（ステップＳ１０２）
上記のごとくしてステップＳ１０１において得られたリグニンは、十分に微細であれば蛍光色素として用いることが可能であるが、必要に応じてさらに微細化して、使用することができる。例えば、リグニンの微細化には粉砕処理を用いる。粉砕処理を行う場合には、公知の湿式の回転ボールミルやビーズミルなどを用いることができる。微細化したリグニンは、公知の方法で乾燥する。このようにして得られるリグニンの平均粒径は、好ましくは１０〜１００ｎｍ、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。

（ステップＳ１０３）
本発明の蛍光色素は、タンパク質の検出用として用いる場合は、抗体と結合した複合体であることが好ましい。抗体（以下、一次抗体）としては目的とするタンパク質と結合するものを選択する。複合体の形成は、蒸留水やリン酸緩衝液中でリグニンと一次抗体を混合することにより行う。リグニンと一次抗体の結合を強固にする場合には、一次抗体のアミノ基とシランカップリング剤やグルタルアルデヒドにリグニンを浸した後、リグニンを乾燥する。その後、蒸留水やリン酸緩衝液などの液中で一次抗体のアミノ基とリグニンを結合させる。

細胞膜に微細な穴を形成した生細胞に導入する場合、細胞膜の処理は界面活性剤やエレクトロポレーション法を用いて行う。また、マイクロインジェクション法により細胞内に上述の複合体を直接注入しても良い。
ホルマリンやパラホルムアルデヒドリン酸緩衝液などで固定した細胞に上述の複合体を導入する場合には、まず、界面活性剤を用いて細胞膜を処理する。その後、上述の複合体を導入する。

以上の工程後、リグニンが結合した抗体は細胞の対象タンパク質に結合する。その後、蛍光顕微鏡を用い、波長４８８〜５６６ｎｍの可視光を照射して蛍光を発生させて、細胞内の蛍光色素を観察することにより、細胞内のタンパク質を観察できる。
また、リグニンが結合した抗体を細胞に導入する前に、Bovine serum albumin (BSA)を添加しておくことにより、上述の観察がより鮮明となる。
細胞膜外で発現しているタンパク質を観察する場合には、一次抗体と結合したリグニンを培養中の生細胞およびホルマリンやパラホルムアルデヒドなどで固定した細胞に添加することで，対象タンパク質を標識する。その後、蛍光顕微鏡で観察することで細胞膜がいのタンパク質を観察することができる。

以下に、実施例、比較例で本発明を説明する。
実施例１
〔酢酸と鉱酸で抽出したリグニンの蛍光特性〕
振動式粉砕機により平均粒径２５μｍまで微細化したスギ微粉末をｐＨ５．５の酢酸緩衝液に投入後，セルラーゼを添加した。その後、５０℃で２４時間加熱した。以上がバイオマスの糖化処理である。その後、濾過フィルターを用いて残渣を回収した。
残渣からリグニンを回収した手順は次のとおりである。容器に入った残渣４０ｇに８０体積％酢酸水溶液を４００ｍＬ注ぎ、その後、０．４ｍＬの塩酸（１１．７ｍＭ）を添加した。その後、６時間、１３０℃で加熱してリグニンを蒸解した。吸引濾過装置を用いてリグニンが抽出した液分のみを回収後、減圧濃縮および蒸留水の添加によりリグニンを析出した。その後、凍結乾燥機により乾燥することでリグニンを回収した。回収したリグニンは粒径が約３０〜６０μｍであった。
なお、粒径は光散乱法と走査型電顕（ＳＥＭ）を適宜併用して測定した。

図２は酢酸で抽出したリグニンの蛍光特性試験についての結果を示す。試験では、リグニンをスライドガラスとカバーガラスに挟み込み共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。照射した励起光の波長は４０５、４８８、５６６、６３３ｎｍである。リグニンは波長４８８、５６６、６３３ｎｍの励起光（レーザー強度４０％）を照射された場合、蛍光が観察された。特に波長４８８、５６６ｎｍにおいて蛍光強度が高かった。また、最も低いレーザー強度５％においても、蛍光を確認することが可能であった。レーザー強度５％は一般の細胞観察において用いるレーザー強度である。このことから酢酸を用いて回収されたリグニンは蛍光色素の原材料として十分に使用できる。

実施例２
〔酢酸で抽出したリグニンの蛍光特性〕
振動式粉砕機により平均粒径２５μｍまで微細化したスギ微粉末をｐＨ５．５の酢酸緩衝液に投入後、セルラーゼを添加した。その後、５０℃で２４時間加熱した。その後、濾過フィルターを用いて残渣を回収した。
残渣からリグニンを回収した手順は次のとおりである。容器に入った残渣４０ｇに８０体積％酢酸水溶液を４００ｍＬ注ぎ、６時間、１３０℃で加熱してリグニンを蒸解した。吸引濾過装置を用いてリグニンが抽出した液分のみを回収後、減圧濃縮および蒸留水の添加によりリグニンを析出した。その後、凍結乾燥機により乾燥することでリグニンを回収した。回収したリグニンの特性は、実施例１と同様であった。

比較例１
〔クラソンリグニンの蛍光特性〕
市販のクラソンリグニンの蛍光特性試験についての結果を図３に示す。試験方法は実施例１と同様である。励起光の波長が４０５ならびに５６６ｎｍの場合にクラソンリグニンは蛍光を発生することが確認された（レーザー強度４０％）。しかしながら、実施例１と比較して、５６６ｎｍの励起光における蛍光強度は低いことが分かった。

比較例２
酢酸セルロースの蛍光特性
市販の酢酸セルロースの蛍光特性試験についての結果を図４に示す。試験方法は実施例１と同様である。酢酸セルロースは波長４８８、５６６、６３３ｎｍの励起光において、蛍光を生じないことが確認された。このことから、実施例１の蛍光は、酢酸ではなく、酢酸で修飾されたリグニンに起因していることが分かった。

本発明の蛍光色素は、波長４８８から５６６ｎｍ付近の励起光を照射した場合に強い蛍光を発生するので、蛍光顕微鏡における細胞観察用の蛍光色素として有用である。

Claims (8)

1. バイオマスから酢酸水溶液を用いて抽出したリグニンを主成分とし、波長４８８から５６６ｎｍ付近の励起光で蛍光を発する蛍光色素。
2. バイオマスが、加水分解によりホロセルロースを一部分解したものである請求項１の蛍光色素。
3. バイオマスが、セルラーゼによる糖化処理を経たバイオマスである請求項１の蛍光色素。
4. リグニンがバイオマスから酢酸水溶液と鉱酸を用いて抽出したものである請求項１、２又は３の蛍光色素。
5. リグニンの融点及び熱分解温度が１００℃以上である請求項１〜４のいずれか１項の蛍光色素。
6. リグニンの平均粒径が１０から１００ｎｍ付近である請求項１〜５のいずれか１項の蛍光色素。
7. タンパク質の蛍光色素標識用である請求項１〜６のいずれか１項の蛍光色素。
8. リグニンと抗体が結合してなる請求項７の蛍光色素。