JP6244140B2 - Preventive and therapeutic agents for type I allergic diseases - Google Patents
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Description
本発明は、フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進し、これらの欠乏に起因するＩ型アレルギー疾患を予防・治療する予防・治療剤に関する。 The present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent that promotes the production of filaggrin, involucrin, loricrin, corneodesmosine, etc., and prevents / treats type I allergic diseases caused by these deficiencies.
フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシンの産生を促進することによって、皮膚機能を正常化し、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、アトピー性皮膚炎等に有効な皮膚外用剤が得られることは知られている。 By promoting the production of filaggrin, involucrin, loricrin, and corneodesmosine, it is possible to obtain skin preparations that are effective in normalizing skin function and suppressing wrinkle formation, preventing rough skin, normalizing skin texture, atopic dermatitis, etc. Are known.
トチュウ（杜仲）（学名Eucommia ulmoides）は、中国原産のトチュウ目トチュウ科の落葉高木で、生薬としては樹皮が利用されている。
トチュウの樹皮（これを杜仲という場合もある）は『神農本草経』の上品に収載され、腰痛、足腰の倦怠感解消、頻尿、肝機能・腎機能の強化、高血圧に効果があるとされている。
また、トチュウの葉は杜仲茶として、血圧の降下や肝機能の機能向上に効果があるとされ、広く飲料として利用されている。
皮膚外用剤としては樹皮に美白作用があることが知られ（特許文献１）、部位は判然としないが、抗酸化作用がある（特許文献２）。
しかしながら、トチュウの葉の抽出物がフィラグリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進することは知られていなかった。
Eucommia ulmoides (scientific name: Eucommia ulmoides) is a deciduous tree of the Euphoraceae family that is native to China, and its bark is used as a herbal medicine.
Eucommia bark (sometimes referred to as Tochu) is listed in “Shinnohonkoshi”, which is said to be effective for lower back pain, fatigue of legs and legs, frequent urination, enhancement of liver and kidney functions, and high blood pressure. ing.
Eucommia leaves are used as Tochu tea, which is effective for lowering blood pressure and improving liver function, and is widely used as a beverage.
As an external preparation for skin, it is known that the bark has a whitening effect (Patent Document 1), and the site is unclear, but has an antioxidant effect (Patent Document 2).
However, it has not been known that the extract of Eucommia leaves promotes the production of filaggrin, loricrin, corneodesmosine and the like.
エゾウコギ(Acanthopanax senticosus)は、北海道、中国東北部、ロシアシベリア地方に自生する落葉低木で、根を薬用として用いられている。
医薬品等の用途では、ストレス性胃潰瘍の治療または予防、活性酸素消去酵素の活性促進、パーキンソン病の予防、グルタチオンレダクターゼの活性増強、セラミド合成促進、メラニン生成抑制等の作用があることが知られている（特許文献３〜９）。
しかしながら、エゾウコギがフィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進することは知られていなかった。
Acanthopanax senticosus is a deciduous shrub that grows naturally in Hokkaido, northeastern China, and the Russian Siberian region, and its roots are used for medicinal purposes.
In pharmaceutical applications, it is known to have effects such as treatment or prevention of stress gastric ulcer, promotion of active oxygen scavenging enzyme activity, prevention of Parkinson's disease, enhancement of glutathione reductase activity, promotion of ceramide synthesis, suppression of melanin production, etc. (Patent Documents 3 to 9).
However, it has not been known that Ezocogi promotes the production of filaggrin, involucrin, loricrin, corneodesmosine and the like.
大葉月橘はムクロジ目、ミカン科、ゲッキツ属の植物で学名Murraya koenigiiで、中国南部、インド、東アジアに広く分布し、乾燥した低地に自生する常緑の低木または高木で、成長すると高さ４〜６ｍほどになる。
南洋山椒、カレーノキ(カレーの木）とも呼ばれ、香辛料として用いられている。
皮膚外用剤として、抗酸化、美白、ヒアルロニダーゼ阻害、抗菌等の用途が知られている（特許文献１０〜１３）。
しかしながら、大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物がフィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進することは知られていなかった。
Ohatsuki Tachibana is a plant belonging to the order of the genus Muclididae, Citrusaceae, and Gecki, with the scientific name Murraya koenigii. It is widely distributed in southern China, India, and East Asia. It will be about 6m.
It is also used as a spice, and is also called the Nanyo Sanroku or Karenoki (curry tree).
As skin external preparations, uses such as antioxidant, whitening, hyaluronidase inhibition, and antibacterial are known (Patent Documents 10 to 13).
However, it has not been known that the extract of the leaves of the Hazukitsuki tachibana and / or the leaf axis promotes the production of filaggrin, involucrin, loricrin, corneodesmosine and the like.
本発明は少なくともフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進することによって、これらの欠乏に起因するＩ型アレルギー疾患を予防・治療する予防・治療剤の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a prophylactic / therapeutic agent for preventing / treating type I allergic diseases caused by these deficiencies by promoting the production of at least filaggrin, loricrin, or corneodesmosine.
本発明は、フィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの欠乏に起因する疾患を予防・治療する予防・治療剤であって、これらフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進するフィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤を有効成分として含み、上記フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤がトチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物であり、上記疾患がＩ型アレルギー疾患であることを特徴とする。特に上記Ｉ型アレルギー疾患が花粉症であることを特徴とする。 The present invention is a prophylactic / therapeutic agent for preventing / treating a disease caused by deficiency of filaggrin, loricrin, or corneodesmosine, and a filaggrin production promoter for promoting production of these filaggrin, loricrin, or corneodesmosine, A lolicrin production promoter or a corneodesmosine production promoter as an active ingredient, and the filaggrin production promoter, loricrin production promoter, or corneodesmosine production promoter is an extract of eucommia leaves or an extract of sorghum root. Or an extract of leaf and / or leaf axis of Tachibana, characterized in that the disease is a type I allergic disease. In particular, the type I allergic disease is hay fever.
上記エゾウコギの根の抽出物は、さらにインボルクリンの欠乏に起因する疾患を予防・治療するインボルクリン産生促進剤であることを特徴とする。
また、上記大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物は、さらにインボルクリンの欠乏に起因する疾患を予防・治療するインボルクリン産生促進剤であることを特徴とする。
The above-mentioned extract of sorghum root is an involucrin production promoter for preventing / treating a disease caused by deficiency of involucrin.
In addition, the above-mentioned extract of large crescent tachibana leaves and / or leaf shaft is further an involucrin production promoter for preventing / treating a disease caused by deficiency of involucrin.
トチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物を有効成分として含有する予防・治療剤は、少なくともフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進することができるので、Ｉ型アレルギー疾患、特に花粉症に有効な予防・治療剤が得られる。 A prophylactic / therapeutic agent containing, as an active ingredient, an extract of eucommia leaves, an extract of sorghum root, or an extract of leaves and / or leaf stems of large leaves is at least of filaggrin, loricrin, or corneodesmosine. Since production can be promoted, a prophylactic / therapeutic agent effective for type I allergic diseases, particularly pollinosis can be obtained.
本発明者らが鋭意検討した結果、トチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物が少なくともフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進することがわかった。また、これら抽出物が花粉症の予防・治療に効果があることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。 As a result of intensive studies by the present inventors, the extract of eucommia leaves, the extract of roots of sorghum, or the extract of leaves and / or stems of the leaves of cypress is at least the production of filaggrin, loricrin, or corneodesmosine. It was found to promote. Moreover, it discovered that these extracts were effective in prevention and treatment of hay fever. The present invention is based on such knowledge.
トチュウの葉、およびエゾウコギの根は、乾燥した後、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
From the viewpoint of extraction efficiency after drying the eucommia leaves and the roots of pearl millet, it is preferable to perform extraction after processing such as chopping, drying, and grinding.
Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer.
大葉月橘の葉等は、カレーリーフとして、生葉あるいは乾燥物として容易に入手可能である。
大葉月橘の葉および／または葉軸より抽出する場合は、未乾燥のものを利用する場合は乾燥した方が抽出効率がよいので、必要により乾燥する。乾燥は天日乾燥や乾燥機を用いて通常通り乾燥し、必要に応じて細断して抽出に用いる。
Large crescent tachibana leaves and the like are easily available as curry leaves, fresh leaves, or dried products.
When extracting from the leaves and / or leaf stems of Daihatsuki Tachibana, if undried ones are used, they are dried as necessary because the extraction efficiency is better when they are dried. Drying is carried out as usual using sun drying or a dryer, and chopped as necessary for extraction.
抽出に用いる溶媒としては、水もしくは親水性有機溶媒またはこれらの混合液を用いる。抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。 As a solvent used for extraction, water, a hydrophilic organic solvent, or a mixed solution thereof is used. Examples of water that can be used as the extraction solvent include pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, and those subjected to various treatments. Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, adjustment of osmotic pressure, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
また、抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン類、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール類などが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。 Examples of the hydrophilic organic solvent that can be used as the extraction solvent include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol; lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; , 3-butylene glycol, propylene glycol, glycerin and other polyhydric alcohols such as C2-C5, and a mixed solvent of these hydrophilic organic solvents and water can be used.
なお、水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、水１０質量部に対して、低級アルコール類の場合は１〜２０質量部、低級脂肪族ケトン類の場合は１〜１５質量部、多価アルコール類の場合は１〜２０質量部添加することが好ましい。 When a mixed solvent of water and a hydrophilic organic solvent is used, 1 to 20 parts by mass for lower alcohols and 1 to 15 for lower aliphatic ketones with respect to 10 parts by mass of water. In the case of mass parts and polyhydric alcohols, it is preferable to add 1 to 20 parts by mass.
抽出に用いる溶媒の量は、原料となるトチュウの葉、エゾウコギの根、または大葉月橘の葉および／または葉軸の単位質量に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度がよい。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
なお、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
The amount of the solvent used for extraction is preferably about 5 to 100 times, more preferably 10 to the unit mass of eucommia leaves, sorghum roots, or leaves and / or leaf axes of the raw material. About 50 times the amount is good. Furthermore, in order to raise extraction efficiency, you may stir or homogenize in an extraction solvent. The extraction temperature is suitably about 5 ° C. to the boiling point of the extraction solvent. The extraction time varies depending on the type of extraction solvent and the extraction temperature, but it is appropriate to set it to about 1 hour to 14 days.
The extraction operation is not limited to a single operation. A fresh solvent can be added again to the residue after extraction to perform an extraction operation, or the extraction solvent can be brought into contact with the extraction raw material a plurality of times.
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えてもよく、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
If necessary, purification treatment such as deodorization and decolorization may be further added as long as the effect is not affected, and the concentration can be achieved by a vacuum concentrator such as an evaporator or solvent removal by heating.
Further, this extract can be further purified using a synthetic adsorbent (Diaion HP20, Sephabies SP825, Amberlite XAD4, MCIgelCHP20P, etc.), dextran resin (Sephadex LH-20, etc.), ultrafiltration, etc. is there.
本発明は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、食品、医薬品に使用できる。例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などを含む）、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、錠菓、飲料等が挙げられる。 The present invention can be used for foods and pharmaceuticals although it exhibits drug efficacy for oral, injection, and external use. For example, powders, pills, tablets, injections, suppositories, emulsions, capsules, granules, liquids (including tinctures, fluid extracts, spirits, suspensions, limonades, etc.), gels, aerosols Agents, ointments, poultices, pastes, plasters, tablet confections, beverages and the like.
また、本発明の予防・治療剤には、上記抽出成分を必須成分として、食品、医薬品の製剤において使用されている他の成分を配合できる。 Further, the preventive / therapeutic agent of the present invention can contain other components used in food and pharmaceutical preparations, with the above-described extract component as an essential component.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
反応容器内に、トチュウの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、ＪＩＳ Ｐ３８０１に規定されるＮｏ５Ｃの濾紙を用いて濾過し、これを凍結乾燥した。
EXAMPLES Next, an Example is given and this invention is demonstrated in detail.
Example 1
Into the reaction vessel, 50 g of eucommia leaves (dried product, shredded product) was added, 1 liter of 30% (V / V) ethanol aqueous solution was added thereto, and extracted at 25 ° C. for 24 hours with occasional stirring. It filtered using the filter paper of No5C prescribed | regulated to JISP3801, and this was freeze-dried.
実施例２
反応容器内に、トチュウの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、限外濾過（アドバンテック ウルトラフィルター Ｑ０１００ 分画分子量１０，０００）した。
膜透過液（実施例２−１）と膜不透過液（実施例２−２）を別々に凍結乾燥した。
Example 2
Into the reaction vessel, 50 g of eucommia leaves (dried product, shredded product) was added, 1 liter of 30% (V / V) ethanol aqueous solution was added thereto, and extracted at 25 ° C. for 24 hours with occasional stirring. Ultrafiltration (Advantech Ultrafilter Q0100 molecular weight cut-off 10,000) was performed.
The membrane permeate (Example 2-1) and the membrane impermeable solution (Example 2-2) were lyophilized separately.
実施例３
反応容器内に、トチュウの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、限外濾過（ミリポア ウルトラセル−ＰＬ公称分画分子量１，０００）し、膜不透過液を凍結乾燥した。
Example 3
Into the reaction vessel, 50 g of eucommia leaves (dried product, shredded product) was added, 1 liter of 30% (V / V) ethanol aqueous solution was added thereto, and extracted at 25 ° C. for 24 hours with occasional stirring. Ultrafiltration (Millipore Ultracell-PL nominal molecular weight cut off 1,000) was performed, and the membrane-impermeable liquid was lyophilized.
得られた抽出物について、以下の確認試験を行った。
確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、各実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
The following confirmation test was performed on the obtained extract.
Confirmation test HuMedia- cultivated human foreskin-derived epidermis cells (Kurabo) at passage 2 in HuMedia-KG2 medium (without phenol red) so as to be 50-70% confluent, and the calcium concentration was changed to 1.8 mM the day before. Each Example was added to KG2 medium and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 2 days.
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
<Extraction of RNA>
Total RNA was extracted from the cells after peeling with trypsin / EDTA and using SV Total RNA Isolation System (Promega) according to the manual attached to Promega (prepared in Japanese protocol NoTM048J, June 2001). The RNA concentration was calculated using NanoDrop1000 (Thermo SCIENTIFIC).
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
<RT reaction and real-time PCR>
Using 2.5 μg of Total RNA, RT reaction was performed using MMLV Reverse Transscriptase RNase H- (Toyobo Co., Ltd.) according to Toyobo recommended protocol (TOYOBO BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE 2008/2009, page 1-42).
Real-time PCR was performed as follows using Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Using the SYBR Green method (THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix, Toyobo Co., Ltd.) and the 7500 Real-Time PCR System operation manual (Applied Biosystems), gene expression comparison was performed by the Comparative CT (ΔΔCT) method (n = 3). GAPDH was used as an internal standard.
＜使用プライマー＞
フィラグリン：フォワードプライマーがＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＣ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣＣ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ロリクリン：フォワードプライマーがＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＡ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＡＣＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＴＴ（配列番号４）の塩基配列とのセット
コルネオデスモシン：フォワードプライマーがＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡ（配列番号５）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧ（配列番号６）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号７）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号８）の塩基配列とのセット
<Primer used>
Filaggrin: set primer with GGCAAATCCCTGAAGAATCC (SEQ ID NO: 1) base sequence and reverse primer TGCTTTCTGTGCTTGTGTCC (SEQ ID NO: 2) base primer: GGAGTTGGAGGTGTTTTCCA (SEQ ID NO: 3) base sequence and reverse primer Is set with the base sequence of ACTGGGGTTGGGAGGTTAGTT (SEQ ID NO: 4): Corneodesmosine: forward primer is CCCATCTCTGAGGGCAAATA (SEQ ID NO: 5) base sequence and reverse primer is CTAGAACTGCTGGGGGACTCG (SEQ ID NO: 6) GAPDH: forward primer Is GAGTCAACGGATTTTGGTC Set of the base sequence of T (SEQ ID NO: 7), reverse primer and the nucleotide sequence of TTGATTTTGGAGGGATCTCG (SEQ ID NO: 8)
図１および図２にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図１は、実施例１の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、フィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。図２は、実施例１の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、ロリクリン、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を示す図である。図１および図２において、縦軸は実施例１を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。また＊印はｔ検定において有意水準５％で有意であることを示している。
図１および図２に示すように、実施例１は０．１質量％濃度で、フィラグリンの遺伝子発現量を約４倍に、ロリクリンの遺伝子発現量を約３．５倍に、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を約２．５倍に、それぞれ増加させることがわかった。
1 and 2 show the results of real-time PCR. FIG. 1 shows the results of confirmation tests in Example 1 at a final concentration of 0.1% by mass, and shows the gene expression level of filaggrin. FIG. 2 shows the results of confirmation tests at a final concentration of 0.1% by mass in Example 1 and shows the gene expression levels of loricrin and corneodesmosine. 1 and 2, the vertical axis represents the gene expression level as a relative value when the gene expression level when Example 1 is not added is 1. The * mark indicates that the significance level is 5% in the t-test.
As shown in FIG. 1 and FIG. 2, in Example 1, 0.1 mass% concentration, filaggrin gene expression level is about 4 times, loricrin gene expression level is about 3.5 times, and corneodesmosine It was found that the gene expression level was increased by about 2.5 times.
図３は、フィラグリンの遺伝子発現増加量を指標に限外濾過による分画の効果を確認するため、実施例１、実施例２−１、実施例２−２の終濃度０．２質量％での確認試験結果である。縦軸は各実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。
図３に示すように、実施例２−２の遺伝子発現量が他の実施例より増加量が多く、有効性成分の多くが、限外濾過で分画した場合に分子量１０,０００以上の分画に存在することがわかった。
FIG. 3 shows that the final concentration of Example 1, Example 2-1, and Example 2-2 was 0.2 mass% in order to confirm the effect of fractionation by ultrafiltration using the increase in gene expression of filaggrin as an index. It is a confirmation test result. The vertical axis represents the gene expression level as a relative value when the gene expression level when each example is not added is 1.
As shown in FIG. 3, the gene expression level of Example 2-2 is larger than that of the other examples, and many of the active ingredients are fractions having a molecular weight of 10,000 or more when fractionated by ultrafiltration. It was found to exist in the painting.
図４は、タンパク質レベルでの増加も確認するため、実施例３でのフィラグリン０．１質量％に対する特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
図４に示すように、タンパク質レベルでも明らかな増加が認められた。
FIG. 4 is a diagram showing the results of Western blotting using a specific antibody against 0.1% by mass of filaggrin in Example 3 in order to confirm an increase at the protein level.
As shown in FIG. 4, a clear increase was also observed at the protein level.
図５は、実施例１を０．１質量％濃度で細胞に作用させたときのＭＴＴ試験結果である。
図５に示すように、実施例１を配合しないコントロールを１として比較したところ、両者に差がなく、実施例１に細胞毒性がないことを確認した。
なお、ＭＴＴ活性の確認方法は以下のように行った。
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで、確認試験と同一条件で培養した後、培地を交換し、１／１０量の５ｍｇ／ｍｌ ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを添加してさらに４時間培養後、等量の０．０４Ｎ塩酸を含むイソプロパノールを添加して完全に溶解する。この溶液をリファレンス波長６３０ｎｍ、測定波長５６０ｎｍで測定して、コントロールに対する相対値として算出した。
FIG. 5 shows the MTT test results when Example 1 was allowed to act on cells at a concentration of 0.1% by mass.
As shown in FIG. 5, when the control which does not mix | blend Example 1 was compared as 1, both were not different and it confirmed that Example 1 had no cytotoxicity.
In addition, the confirmation method of MTT activity was performed as follows.
After culturing in a 24 well plate under the same conditions as in the confirmation test, the medium was changed and 1/10 amount of 5 mg / ml 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide was added. After addition and further incubation for 4 hours, isopropanol containing an equal amount of 0.04N hydrochloric acid is added to dissolve completely. This solution was measured at a reference wavelength of 630 nm and a measurement wavelength of 560 nm, and calculated as a relative value to the control.
実施例４
反応容器内に、エゾウコギの根（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、ＪＩＳ Ｐ３８０１に規定されるＮｏ５Ｃの濾紙を用いて濾過し、これを凍結乾燥した。
Example 4
Into the reaction vessel, 50 g of elephant root (dried product, shredded product) was added, and 1 liter of 50% (V / V) aqueous ethanol solution was added thereto, and extracted at 25 ° C. for 24 hours with occasional stirring. It filtered using the filter paper of No5C prescribed | regulated to JISP3801, and this was freeze-dried.
得られた抽出物について、実施例１と同様な方法で確認試験を行った。なお、ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲにおける使用プライマーとして、以下のプライマーを追加して使用した。
インボルクリン：フォワードプライマーがＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号９）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧ（配列番号１０）の塩基配列とのセット
The obtained extract was subjected to a confirmation test in the same manner as in Example 1. In addition, the following primers were additionally used as primers used in RT reaction and real-time PCR.
Involucrin: A set of a forward primer as a base sequence of GATGTCCCAGCAACACACAC (SEQ ID NO: 9) and a reverse primer as a base sequence of TGCTCACATTCTTGCTCAGGG (SEQ ID NO: 10)
図６および図７にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図６は、実施例４の終濃度０．０１質量％および０．０２質量％での確認試験結果であり、フィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。図７は、実施例４の終濃度０．０１質量％での確認試験結果であり、ロリクリン、コルネオデスモシン、インボクリンの遺伝子発現量を示す図である。図６および図７において、縦軸は実施例４を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。また＊印はｔ検定において有意水準５％で有意であり、＊＊印は有意水準１％で有意であることをそれぞれ示している。
図６に示すように、実施例４はフィラグリンの遺伝子発現量を、０．０１質量％で約１０倍に、０．０２質量％で約２０倍に増加させることがわかった。
また、図７に示すように、ロリクリンの遺伝子発現量を約８．５倍に、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を約３．５倍に、インボルクリンの遺伝子発現量を約１．５倍に、それぞれ増加させることがわかった。
6 and 7 show the results of real-time PCR. FIG. 6 shows the results of confirmation tests in Example 4 at final concentrations of 0.01% by mass and 0.02% by mass, and shows the gene expression level of filaggrin. FIG. 7 shows the results of confirmation tests in Example 4 at a final concentration of 0.01% by mass, and shows the gene expression levels of loricrin, corneodesmosine, and invocrine. 6 and 7, the vertical axis represents the gene expression level as a relative value when the gene expression level when Example 4 is not added is 1. In addition, the asterisk indicates that it is significant at the significance level of 5% in the t test, and the asterisk indicates that it is significant at the significance level of 1%.
As shown in FIG. 6, Example 4 was found to increase filaggrin gene expression about 10 times at 0.01% by mass and about 20 times at 0.02% by mass.
In addition, as shown in FIG. 7, the gene expression level of loricrin is about 8.5 times, the gene expression level of corneodesmosine is about 3.5 times, the gene expression level of involucrin is about 1.5 times, It was found that each increased.
実施例５
反応容器内に、大葉月橘の葉および／または葉軸（乾燥物、細断品）を３０ｇ投入し、これに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、ＪＩＳ Ｐ３８０１に規定されるＮｏ５Ｃの濾紙を用いて濾過し、これを凍結乾燥した。
Example 5
Into the reaction vessel, 30 g of Otsukitsuki tachibana leaves and / or leaf stem (dried product, shredded product) was added, and 1 liter of 50% (V / V) ethanol aqueous solution was added thereto. After extracting at 24 ° C. for 24 hours, the mixture was filtered using No5C filter paper defined in JIS P3801, and freeze-dried.
実施例６
実施例５と同様に抽出した液（実施例５の凍結乾燥前）を限外濾過（ミリポア社製ウルトラセルＰＬ・分画分子量１，０００）した。
膜透過液（実施例６−１）と膜不透過液（実施例６−２）を別々に凍結乾燥した。
Example 6
The liquid extracted in the same manner as in Example 5 (before freeze-drying in Example 5) was subjected to ultrafiltration (Ultracell PL, molecular weight cut off 1,000, manufactured by Millipore).
The membrane permeate (Example 6-1) and the membrane impermeable solution (Example 6-2) were lyophilized separately.
図８〜図１０にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図８は、実施例５の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を示す図である。図９は、実施例５の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリンの遺伝子発現量を示す図である。図１０は、フィラグリンの遺伝子発現増加量を指標に限外濾過による分画の効果を確認するため、実施例６−１の終濃度０．１質量％、実施例６−２の終濃度０．０２質量％での確認試験結果である。図８〜図１０において、縦軸は各実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。
図８および図９に示すように、実施例５は０．１質量％で作用させたとき、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を約２３倍に、フィラグリン、ロリクリンの遺伝子発現量を約３倍に、インボルクリン遺伝子発現量を約６倍に増加させることがわかった。
また、図１０に示すように、分子量１，０００で限外濾過を用いて分画したところ、分子量１，０００以上の分画が、分画前、あるいは分子量１，０００以下の分画より１／５の濃度（０．０２質量％）でも遺伝子発現量はさらに３倍以上の発現量を示した。
8 to 10 show the results of real-time PCR. FIG. 8 shows the result of confirmation test in Example 5 at a final concentration of 0.1% by mass, and shows the gene expression level of corneodesmosine. FIG. 9 shows the results of confirmation tests in Example 5 at a final concentration of 0.1% by mass, and shows the gene expression levels of filaggrin, loricrin, and involucrin. FIG. 10 shows the final concentration of 0.1% by mass of Example 6-1 and the final concentration of Example 6-2 of 0.1% in order to confirm the effect of fractionation by ultrafiltration using the increase in gene expression of filaggrin as an index. It is a confirmation test result in 02 mass%. 8 to 10, the vertical axis represents the gene expression level as a relative value when the gene expression level when each example is not added is 1.
As shown in FIGS. 8 and 9, in Example 5, when acting at 0.1% by mass, the gene expression level of corneodesmosine is about 23 times, and the gene expression levels of filaggrin and loricrin are about 3 times. It was found that the involucrin gene expression level was increased about 6 times.
Further, as shown in FIG. 10, when fractionation was performed using an ultrafiltration at a molecular weight of 1,000, a fraction having a molecular weight of 1,000 or more was found to be 1 before fractionation or from a fraction having a molecular weight of 1,000 or less. Even at a concentration of / 5 (0.02% by mass), the gene expression level was more than 3-fold.
実施例７〜実施例９、比較例１
実施例１で得られた抽出物を有効成分とする花粉症の予防・治療するための飲料を実施例７として、同実施例４で得られた抽出物を有効成分とする飲料を実施例８として、同実施例５で得られた抽出物を有効成分とする飲料を実施例９として、以下の成分表の割合で配合して均一に撹拌して作製した。なお、比較例１の飲料は実施例１、実施例４または実施例５で得られた抽出物を精製水に置き換えたものである。
飲料の成分表
実施例１、実施例４または実施例５で得られた抽出物 １ｇ
キシリトール １０ｇ
ビタミンＢ1塩酸塩 ０．５ｍｇ
ビタミンＢ2 ０．２ｍｇ
ビタミンＣ ５００ｍｇ
ナイアシン １．０ｍｇ
パントテン酸カルシウム １．０ｍｇ
精製水 １００ｇ
Examples 7-9, Comparative Example 1
A beverage for preventing and treating hay fever containing the extract obtained in Example 1 as an active ingredient is used as Example 7, and a beverage containing the extract obtained in Example 4 as an active ingredient is used in Example 8. As an example, a beverage containing the extract obtained in Example 5 as an active ingredient was used in Example 9 at a ratio shown in the following ingredient table and stirred uniformly. The beverage of Comparative Example 1 is obtained by replacing the extract obtained in Example 1, Example 4 or Example 5 with purified water.
Beverage ingredient table 1 g of extract obtained in Example 1, Example 4 or Example 5
Xylitol 10g
Vitamin B 1 hydrochloride 0.5mg
Vitamin B 2 0.2mg
Vitamin C 500mg
Niacin 1.0mg
Calcium pantothenate 1.0mg
100 g of purified water
花粉症を発症している男性被験者９名を３名ずつ第一、第二、第三の３グループに分けて、第一のグループには実施例７の飲料を、第二のグループには実施例８の飲料を、第三のグループには実施例９の飲料を、朝昼夕の３回、飲料５０ｍｌをそれぞれ飲用してもらった。試験は７日間行い、起床から就寝までを１日とし、クシャミの回数（１回を１点とする）、鼻をかんだ回数（１回を１点とする）、喉の違和感の程度（０〜３点、違和感がひどいと点数が高い）により花粉症の症状を判定した。７日間の合計点数を算出し、３名の平均値として評価した。試料の飲用を止め何も処置をせずに過ごすと、３日後には試験以前の状態に戻ったので、試験終了後７日間を空けて、比較例１による試験を行った。結果を表１に示す。 Nine male subjects who develop hay fever are divided into three groups of 1st, 2nd, and 3rd group, each with 3 people. The beverage of Example 8 and the third group were allowed to drink the beverage of Example 9 three times in the morning and evening, respectively, and 50 ml of the beverage. The test is conducted for 7 days, from waking up to going to bed for one day, the number of crushing (one time is one point), the number of times of sniffing (one time is one point), the degree of discomfort in the throat (0 The symptom of hay fever was determined based on 3 points, high discomfort and high score). The total score for 7 days was calculated and evaluated as the average value of 3 people. When the sample was stopped drinking and no treatment was performed, the state returned to the state before the test after 3 days. Therefore, the test according to Comparative Example 1 was conducted after 7 days from the end of the test. The results are shown in Table 1.
本発明は、トチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物を有効成分として含有するので、Ｉ型アレルギー疾患、特に花粉症に有効な予防・治療剤が得られる。 Since the present invention contains an extract of eucommia leaves, an extract of roots of Ezokogi, or an extract of leaves and / or stems of large leaves of the leaves, it is effective for type I allergic diseases, particularly hay fever. Prophylactic / therapeutic agent can be obtained.
Claims (2)
前記フィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進するフィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤を有効成分として含み、前記フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤が大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物であり、
前記疾患が花粉症であることを特徴とする予防・治療剤。 A prophylactic / therapeutic agent for preventing / treating a disease caused by deficiency of filaggrin, loricrin, or corneodesmosine,
A filaggrin production promoter, loricrin production promoter, or corneodesmosine production promoter that promotes production of the filaggrin, loricrin, or corneodesmosine as an active ingredient, and the filaggrin production promoter, loricrin production promoter, or corneo The desmosine production promoter is a leaf and / or leaf stem extract of Otsukitsuki tachibana,
A preventive / therapeutic agent, wherein the disease is hay fever .
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