JP6233834B2 - キノンを検出するための化合物および該化合物を用いたキノンの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、キノンを検出するための化合物および該化合物を用いたキノンの検出方法に関する。

キノンは生体にとって非常に重要な化合物である。例えば、ユビキノンやピロロキノリンキノンといったキノンは、数多くの酵素の電子伝達反応に大きく関与していることが知られている。また、ナフトキノン誘導体であるビタミンＫは、血液凝固や骨硬化に関係している。さらに、ドキソルビシンのように医薬品として臨床的に用いられているキノンも存在する。
従って、キノンを簡便かつ選択的に測定可能な化学発光分析試薬として有用な化合物は、キノンの生体内での役割をより詳細に調査するためにも重要であると考えられる。

本願発明は、キノンを検出するための新規な化合物および該化合物を用いたキノンの検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、キノンの酸化還元サイクルに伴って発生するスーパーオキシドアニオンラジカルを化学発光反応を利用して検出することにより、キノンを選択的に測定することができると考え、スーパーオキシドアニオンラジカル応答性化学発光試薬に還元部位を導入した化合物を設計し、合成を行い、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の通りである。
［１］式（Ｉ）：

（式中、
Ａは、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸からカルボン酸基を除いた残基を示し、
Ｂは、それぞれ置換されていてもよい、ベンゼン環または５−ないし６−員芳香族複素環を示し、
Ｒ^１は、Ｃ_１−６アルキル基を示し、および
ｎは、１〜６の整数を示す。）
で表される化合物（以下、本発明の化合物と称する場合がある）；
［２］Ａがα−リポ酸またはジヒドロリポ酸からカルボン酸基を除いた残基であり、Ｂがベンゼン環であり、Ｒ^１がエチルであり、かつ、ｎが４である、［１］に記載の化合物；
［３］キノンの検出のために用いる、［１］または［２］に記載の化合物；
［４］［１］または［２］に記載の化合物と被検試料とを塩基存在下で混合する工程、および
該混合により放出される化学発光を測定する工程
を含む、被検試料中のキノンの検出方法。

本発明の化合物は、一分子中に還元部位と化学発光部位とを持つ化合物である。具体的には、本発明の化合物は、α−リポ酸部位、ジヒドロリポ酸部位、コーヒー酸部位、没食子酸部位または葉酸部位（還元部位）によりキノンの酸化還元サイクルを誘起するとともに、これにより発生するスーパーオキシドアニオンラジカルによってルミノール部位（化学発光部位）が酸化されて発光し、従って、キノンを簡便かつ選択的に測定可能な化学発光分析試薬として有用である。また、本発明の方法は、該化合物を用いて、キノンを高感度で簡便かつ選択的に検出することができる。

図１は、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール−α−リポ酸（ＡＢＥＩ−ＬＡ）の高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）スペクトルを示す。 図２Ａは、キノンとしてメナジオンを用いた場合の、ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液およびブランク溶液の化学発光時間プロフィールを示し、図２Ｂは、ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液の積分化学発光強度を示す。 図３は、ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液およびＡＢＥＩとＬＡとの単なる混合物の溶液の化学発光時間プロフィールを示す。 図４Ａは、キノンとして９，１０−フェナンスレンキノンを用いた場合の、ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液およびブランク溶液の化学発光時間プロフィールを示し、図２Ｂは、ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液の積分化学発光強度を示す。 図５は、キノンとしてフィロキノン、ドキソルビシンおよびユビキノンを用いた場合の、ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液の化学発光時間プロフィールを示す。 図６は、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール−ジヒドロリポ酸（ＡＢＥＩ−ＤＨＬＡ）のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）スペクトルを示す。 図７Ａは、キノンとしてメナジオンを用いた場合の、ＡＢＥＩ−ＤＨＬＡ溶液およびブランク溶液の化学発光時間プロフィールを示し、図７Ｂは、ＡＢＥＩ−ＤＨＬＡ溶液の積分化学発光強度を示す。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
キノンは還元物質により不安定なセミキノンラジカルへと還元され、これが溶存酸素により酸化される過程で、活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカルが発生する。このスーパーオキシドアニオンラジカルを、本発明の化合物を用いて検出することができる。以下に、キノンの酸化還元サイクルを利用した測定原理を示す。

本発明では、還元部位として、構造中にカルボン酸を有し、様々な修飾が容易な抗酸化剤であるα−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸を選択し、スーパーオキシドアニオンラジカル応答性化学発光部位として、スーパーオキシドアニオンラジカルをはじめとする活性酸素により酸化分解する過程で強い発光を生じるルミノール誘導体を選択した。すなわち、以下の反応により、式（Ｉ）で表される化合物を合成した。

Ａは、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸からカルボン酸基を除いた残基を示す。
Ａとしては、α−リポ酸またはジヒドロリポ酸からカルボン酸基を除いた残基が好ましい。

Ｂは、それぞれ置換されていてもよい、ベンゼン環または５−ないし６−員芳香族複素環を示す。
Ｂで示される「それぞれ置換されていてもよい、ベンゼン環または５−ないし６−員芳香族複素環」の「５−ないし６−員芳香族複素環」としては、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１ないし３個含有する５−ないし６−員芳香族複素環、具体的には、フラン環、チオフェン環、ピロール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、イミダゾール環、ピラゾール環、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環等が挙げられる。
Ｂで示される「それぞれ置換されていてもよい、ベンゼン環または５−ないし６−員芳香族複素環」の「ベンゼン環または５−ないし６−員芳香族複素環」は、置換可能な位置に１〜３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、ハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アミノ基、Ｃ_１−６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル）、Ｃ_２−６アルケニル基（例、ビニル、１−プロペン−１−イル、２−プロペン−１−イル、イソプロペニル、２−ブテン−１−イル、４−ペンテン−１−イル、５−へキセン−１−イル）およびＣ_６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリル）が挙げられ、アミノ基、ハロゲン（特に、塩素）およびＣ_６−１４アリール基（特に、フェニル）が好ましい。置換基が２個以上である場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
Ｂとしては、置換されていてもよいベンゼン環が好ましく、ベンゼン環がより好ましい。

Ｒ^１は、Ｃ_１−６アルキル基を示し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
Ｒ^１としては、エチルが好ましい。
ｎは、１〜６の整数を示す。ｎは、好ましくは４である。

式（Ｉ）で表される化合物としては、Ａがα−リポ酸またはジヒドロリポ酸からカルボン酸基を除いた残基であり、Ｂがベンゼン環であり、Ｒ^１がエチルであり、かつｎが４である化合物が好ましい。すなわち、式（Ｉ）で表される化合物としては、α−リポ酸またはジヒドロリポ酸とＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールとの反応により合成される化合物が好ましい。

本発明の化合物は、上記スキームの通り、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸とルミノール誘導体との縮合反応によって合成することができる。
ルミノール誘導体の使用量は、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸１モルに対し、通常０．１モル〜５０モル、好ましくは１モル〜３モルである。
縮合反応は、常法に従って、例えば、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中、縮合剤を用いて行うことができる。
縮合剤としては、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）などのトリアジン系縮合剤；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、ＷＳＣなど）、またはその塩酸塩などのカルボジイミド系縮合剤；シアノリン酸ジエチル、アジ化ジフェニルホスホリルなどのリン酸系縮合剤；カルボニルジイミダゾール、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）などが挙げられる。
縮合剤の使用量は、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸１モルに対し、通常０．１モル〜５０モル、好ましくは１モル〜５モルである。
溶媒としては、例えば、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノールなど）が挙げられる。
反応温度は、例えば、０℃〜１００℃、好ましくは３０℃〜６０℃であり、反応時間は、ルミノール誘導体の種類、反応温度などによって異なり、例えば、１時間〜７２時間、好ましくは５時間〜１０時間である。
なお、原料化合物であるα−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸、没食子酸または葉酸およびルミノール誘導体は、市販品をそのまま使用してもよく、あるいは、自体公知の方法またはこれらに準じた方法に従って製造することもできる。

次に、本発明の被検試料中のキノンの検出方法を説明する。
本発明の方法は、式（Ｉ）で表される化合物と被検試料とを塩基存在下で混合する工程、および該混合により放出される化学発光を測定する工程を含む。

本発明の方法における「被検試料」としては、例えば、ドキソルビシン製剤あるいはキノン含有食品が挙げられる。

本発明の方法における「塩基」としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化セシウム、リン酸三カリウム等の塩基性塩類、ピリジン、ルチジン等の芳香族アミン類、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の第３級アミン類、金属ナトリウム等のアルカリ金属類、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類、ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムヘキサメチルジシラジド等の金属アミド類、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム第三ブトキシド等の金属アルコキシド類等が挙げられる。

塩基としては、塩基性の強さの観点から、水酸化ナトリウムが好ましい。

塩基の使用量は、式（Ｉ）で表される化合物１モルに対し、通常、４０モル〜５００モルであり、好ましくは、２００モル〜４００モルである。塩基の使用量が４０モル未満であると、ルミノール部位による化学発光反応が誘起されない問題があり、５００モルを超えると、ルミノール部位の酸化分解過程で生成するアミノフタレート（Ｂがベンゼン環の場合）の蛍光量子収率が減少する問題がある。

混合の方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、塩基水溶液に式（Ｉ）で表される化合物を溶解し、これに被検試料を添加する方法等が挙げられる。

上記混合により放出される化学発光は、例えば、ルミノメーターを用いて測定することができる。

本発明の方法によって検出されるキノンとしては、特に限定されるものではなく、例えば、ユビキノン、ピロロキノリンキノン、９，１０−フェナンスレンキノン、ナフトキノン誘導体（例、メナジオン（ビタミンＫ_３）、フィロキノン（ビタミンＫ_１））、ドキソルビシン等が挙げられる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール−α−リポ酸（ＡＢＥＩ−ＬＡ）の合成
α−リポ酸（ＬＡ）（２９ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）（３８ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２６ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をエタノール/２％ピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、常温で１０時間撹拌した。エタノールを減圧留去し、残渣をエタノールで再結晶して、表題化合物を薄黄色結晶（３０ｍｇ，収率４６．８％）として得た。

得られた結晶の高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）スペクトルを、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−７００ Ｎ（日本電子製）を用いて測定した。その結果を図１に示す。ＦＡＢ−ＭＳスペクトル上に、ＡＢＥＩ−ＬＡの［Ｍ＋Ｈ］^＋に由来する分子イオンピークが検出された。なお、２７７．２のピークは、未反応のＡＢＥＩの［Ｍ＋Ｈ］^＋に由来する分子イオンピークである。

実施例２：メナジオンの添加によるＡＢＥＩ−ＬＡの化学発光の測定
２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）中の５００μＭのＡＢＥＩ−ＬＡ溶液を小試験管に入れ、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ−９５０７；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）にセット後、メナジオンの１、１０、２０および５０μＭアセトニトリル溶液（５０μＬ）をインジェクターにより自動注入した。生じる化学発光を１８０秒間測定した。このとき、ブランク溶液としては、２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）にアセトニトリル（５０μＬ）のみを添加したものを用いた。その結果を図２に示す。
メナジオンを添加したＡＢＥＩ−ＬＡ溶液では、ブランク溶液と比較して有意に高い化学発光が観察された（図２Ａ）。これは、ＡＢＥＩ−ＬＡのα−リポ酸部位によりメナジオンの酸化還元サイクルが誘起され、これに伴って発生したスーパーオキシドアニオンがＡＢＥＩ−ＬＡのルミノール部位を酸化することにより、化学発光が生じたと考えられる。また、化学発光の強度は、メナジオンの濃度の増加に伴って上昇することが観察された（図２Ｂ）。

実施例３：ＡＢＥＩ−ＬＡの構造に基づく化学発光検出反応の効率化
実施例２と同様にして、実施例２と同一のＡＢＥＩ−ＬＡ溶液と、２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）中のＡＢＥＩとＬＡとの単なる混合物の溶液（ＡＢＥＩおよびＬＡはそれぞれ７５０μＭ）とに、それぞれメナジオンの５０μＭアセトニトリル溶液（５０μＬ）を添加して生じる化学発光を測定した。その結果を図３に示す。
ＡＢＥＩ−ＬＡ溶液は、ＡＢＥＩとＬＡとの単なる混合物の溶液と比較して強い化学発光を与えた。これは、同一分子内に還元部位と化学発光部位とを併せ持つＡＢＥＩ−ＬＡを用いた場合、化学発光検出反応の効率が上昇すると考えられる。

実施例４：９，１０−フェナンスレンキノンの添加によるＡＢＥＩ−ＬＡの化学発光の測定
２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）中の５００μＭのＡＢＥＩ−ＬＡ溶液を小試験管に入れ、９，１０−フェナンスレンキノンの１，５，１０μＭアセトニトリル溶液（５０μＬ）を添加し、５秒間ボルテックス混合した。小試験管をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ−９５０７；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）にセット後、生じた化学発光を３００秒間測定した。このとき、ブランク溶液としては、２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μＬ）にアセトニトリル（５０μＬ）のみを添加したものを用いた。その結果を図４に示す。
９，１０−フェナンスレンキノンを添加したＡＢＥＩ−ＬＡ溶液では、ブランク溶液と比較して有意に高い化学発光が観察された（図４Ａ）。しかしながら、その化学発光強度は、メナジオンを用いて測定したときよりも低く、また、５μＭ以上の濃度ではフェナンスレンキノン濃度に応じた発光の増強は見られなかった（図４Ｂ）。これは、今回測定を行った条件下では、ＡＢＥＩ−ＬＡは、ｏ−キノン（９，１０−フェナンスレンキノン）よりもｐ−キノン（メナジオン）に対して良好な化学発光検出反応を生じることが示唆される。

実施例５：種々のキノンの添加によるＡＢＥＩ−ＬＡの化学発光の測定
実施例２と同様にして、フィロキノン（５０μＭ）、ドキソルビシン（５０μＭ）およびユビキノン（１０μＭ）を用いて化学発光を測定した。その結果を図５に示す。
メナジオンおよび９，１０−フェナンスレンキノンと同様に、フィロキノン、ドキソルビシンおよびユビキノンを添加したＡＢＥＩ−ＬＡ溶液では、高い化学発光が観察された。

実施例６：Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール−ジヒドロリポ酸（ＡＢＥＩ−ＤＨＬＡ）の合成
実施例１で合成したＡＢＥＩ−ＬＡのメタノール溶液（７μＭ）に還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．０７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５時間反応させた。その反応溶液のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）スペクトルを、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−Ｔ１００ＴＤを用いて測定した。その結果を図６に示す。ＥＳＩ−ＭＳスペクトル上に、ＡＢＥＩ−ＤＨＬＡの［Ｍ＋Ｈ］^＋に由来する分子イオンピークが検出された。

実施例７：メナジオンの添加によるＡＢＥＩ−ＤＨＬＡの化学発光の測定
メナジオンの１、１０、２０および５０μＭアセトニトリル溶液（５０μＬ）の代わりにメナジオンの１、２０および５０μＭアセトニトリル溶液（５０μＬ）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、メナジオンの添加によるＡＢＥＩ−ＤＨＬＡの化学発光を測定した。その結果を図７に示す。
メナジオンを添加したＡＢＥＩ−ＤＨＬＡ溶液では、ブランク溶液と比較して有意に高い化学発光が観察された（図７Ａ）。これは、ＡＢＥＩ−ＤＨＬＡのジヒドロリポ酸部位によりメナジオンの酸化還元サイクルが誘起され、これに伴って発生したスーパーオキシドアニオンがＡＢＥＩ−ＤＨＬＡのルミノール部位を酸化することにより、化学発光が生じたと考えられる。また、化学発光の強度は、メナジオンの濃度の増加に伴って上昇することが観察された（図７Ｂ）。

本発明の化合物は、キノンを簡便かつ選択的に測定可能な化学発光分析試薬として有用である。また、本発明の方法、該化合物を用いて、キノンを高感度で検出することができる。

Claims (4)

1. 式（Ｉ）：
   （式中、
   Ａは、α−リポ酸、ジヒドロリポ酸、コーヒー酸または没食子酸からカルボン酸基を除いた残基を示し、
   Ｂは、それぞれ置換されていてもよい、ベンゼン環または５−ないし６−員芳香族複素環を示し、
   Ｒ^１は、Ｃ_１−６アルキル基を示し、および
   ｎは、１〜６の整数を示す。）
   で表される化合物。
2. Ａがα−リポ酸またはジヒドロリポ酸からカルボン酸基を除いた残基であり、Ｂがベンゼン環であり、Ｒ^１がエチルであり、かつ、ｎが４である、請求項１に記載の化合物。
3. キノンの検出のために用いる、請求項１または２に記載の化合物。
4. 請求項１または２に記載の化合物と被検試料とを塩基存在下で混合する工程、および
   該混合により放出される化学発光を測定する工程
   を含む、被検試料中のキノンの検出方法。