JP6220405B2 - 染色されたＦＦＰＥＴ切片からマイクロダイセクションした材料のＲＴ−ｑＰＣＲ分析 - Google Patents

Description

本発明は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の免疫組織化学染色のための方法であって、ａ）固体支持体を用意する工程、ｂ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、固体支持体に固定（mounting）する工程、ｃ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片から、パラフィンを除去する工程、ｄ）エピトープを賦活化するために、固体支持体に固定された組織切片を５０〜７０℃で１２〜２４時間加熱する工程、および、ｅ）固体支持体に固定された組織切片を染色する工程、を含み、その際、少なくとも工程ｅ）を０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施する、前記方法に関する。本発明はさらに、この方法を実施するためのキットに関する。

ホルマリン固定およびパラフィン包埋(formalin fixation and paraffin embedding)（ＦＦＰＥ）は、臨床ルーチンにおいて組織診および長期保存のために組織を固定する周知の操作である。ＦＦＰＥ組織(FFPE tissue)（ＦＦＰＥＴ）試料の多量の記録が、バイオマーカー検出試験および初期臨床試験に用いられる。さらに、ＦＦＰＥＴ試料はＲＮＡを単離するために使用でき、それをさらに遺伝子発現分析に利用できる。ＦＦＰＥＴ試料からのＲＮＡは高い分解度を示すが、十分な量の材料をＲＮＡ単離に用いれば、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析にはなお十分である。そのような分析は、最初のバイオマーカー仮説を作成し、そして仮説を簡単に試験するために使用できる(Lohmann et al, Methods. 2013 Jan; 59(1))。

ＦＦＰＥ組織切片から血管および腫瘍細胞巣を分離してＲＴ−ｑＰＣＲ分析を実施することができるように、本発明者らは下記の手法、すなわち免疫組織化学染色後のＦＦＰＥＴからのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture micro-dissection)（ＬＣＭ）とｃＤＮＡのプレアンプリフィケーション(pre-amplification)後のＲＴ−ｑＰＣＲ分析とを組み合わせた。

ＩＨＣ染色されたＦＦＰＥＴ切片からのＬＣＭ後にＲＴ−ｑＰＣＲ分析を組み合わせた際に当業者が直面する問題は、ＬＣＭ後の材料の量がきわめて限られること、試料組織の固定後のＲＮＡ分解、およびさらに免疫組織化学染色操作中のＲＮＡ分解である。古典的な染色操作には、エピトープ賦活化(epitope retrieval)（たとえば、９８℃でのＨＩＥＲプロトコル）、およびＲＮＡｓｅを含まない条件下で調製することができない緩衝液（抗体溶液、洗浄用緩衝液、色素）とのインキュベーション時間が含まれる。ＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲ分析に用いる予定であれば、上記のＲＮＡ分解はＬＣＭ後の材料の量がきわめて限られることと併せてこのワークフローにおける重大な問題である。ＲＮＡ分解は、ＬＣＭ後の遺伝子発現分析、たとえば目的バイオマーカーと基準遺伝子の比において、信頼できない結果をもたらす。ｍＲＮＡの安定性は遺伝子特異的であり、したがって、それらは異なる程度に分解して、遺伝子発現分析のための相対定量に誤った結果をもたらす。

このＲＮＡ分解の問題を克服するために、分解を最小限に留める種々の方法が確立された。大部分の刊行物はたとえば新鮮凍結(Fresh Frozen)（ＦＦ）組織を用い、それはＲＴ−ｑＰＣＲ分析に用いた場合に分解プロセスがより少ないという利点をもつ。しかし、重大な欠点は、ＦＦ組織がＦＦＰＥＴと比較して大幅に限られた供給源であるという事実である(Buckanovich et al., Cancer Biol Ther. 2006 Jun; 5(6):635-42; Gjerdrum et al., Diagn Mol Pathol 2004 (13), p. 224-233)。統計的に有意な結果をもたらす試験を実施するのに十分な量のＦＦ組織を得るのはしばしば困難である。さらに、遡及試験のために入手できる臨床試料材料は一般にＦＦＰＥＴである。

したがって、この分野の主な目標は、ＲＮＡ分解を最小限に抑えつつＦＦＰＥＴをＬＣＭおよびＲＴ−ｑＰＣＲ分析と併せて用いる手法の開発であった。染色に際してのＲＮＡ分解を最小限に抑えるために、ＦＦＰＥＴ切片の超堅ろう(ultra-fast)染色法が開発された。しかし、そのようなマイクロダイセクションされた超堅ろう染色ＦＦＰＥＴ切片からのＲＮＡの分析は、きわめて短いインキュベーション期間（２×５分）での抗体インキュベーション後でもなお、単純な組織染色（ヘマトキシリン）と比較して約９０％のＲＮＡが分解したことを示した(Gjerdrum et al., Diagn Mol Pathol 2004 (13))。さらに、あるものは数時間ないし一夜のインキュベーションを必要とするので、超堅ろう染色プロトコルは必ずしもすべての抗体に適用できるわけではない(Brown et al., RNA Journal 2009 (15), p. 2364-2374)。そのような長時間のインキュベーション操作は著しいＲＮＡ分解をもたらし、したがって遺伝子発現分析は事実上不可能である。

Lohmann et al, Methods. 2013 Jan; 59(1) Buckanovich et al., Cancer Biol Ther. 2006 Jun; 5(6):635-42 Gjerdrum et al., Diagn Mol Pathol 2004 (13), p. 224-233 Brown et al., RNA Journal 2009 (15), p. 2364-2374

したがって、本発明の目的は、その後にＲＮＡ単離に用いるＦＦＰＥＴ切片のための改良された染色法を提供し、その改良された染色法がＦＦＰＥＴ切片から単離されたＲＮＡのＲＮＡ分析、たとえば遺伝子発現分析に十分な収率および品質をもたらすことである。

固体支持体に固定された組織切片に適用される本明細書に記載する染色法における０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの高い塩濃度が、その後に組織切片から単離されるＲＮＡの分解を阻止することが見出された。本発明による方法は、染色後にＲＮＡを単離する、たとえば遺伝子発現分析のために高品質のＲＮＡが必要とされる染色操作に適切である。

したがって本発明は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の免疫組織化学染色のための方法であって、ａ）固体支持体を用意する工程、ｂ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、固体支持体に固定する工程、ｃ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片から、パラフィンを除去する工程、ｄ）エピトープを賦活化するために、固体支持体に固定された組織切片を５０〜７０℃で１２〜２４時間加熱する工程、および、ｅ）固体支持体に固定された組織切片を染色する工程、を含み、その際、少なくとも工程ｅ）を０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施する、前記方法に関する。

さらに、本発明は、本明細書に記載する方法を実施するためのキットであって、下記のものを含むキットに関する：ａ）ポリ−リジンでコートされた固体支持体、ｂ）エピトープ賦活化のための溶液、および、ｃ）０．５〜３．０Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む免疫組織化学染色のための溶液。

図１：この図は、単離されたＲＮＡの分光光度濃度分析の結果を示す。図示したのは、抽出物からのＲＮＡ濃度の中央値±標準偏差であり、当該抽出物は非染色ＦＦＰＥＴ切片から単離したもの（非染色）、塩化ナトリウムの非存在下でＣＤ３１で染色したＦＦＰＥＴ切片から単離したもの（ＮａＣｌ無し）、および、塩化ナトリウムの存在下でＣＤ３１で染色したＦＦＰＥＴ切片から単離したもの（ＮａＣｌ有り）である。データは３つの独立した反復試験それぞれから得られた。 図２：この図は、基準遺伝子ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析のＣｐ値を示す。図示したのは、ＲＴ−ｑＰＣＲ実験からのＣｐ値の中央値±標準偏差である。ＲＮＡは、非染色ＦＦＰＥＴ切片から単離されたもの（非染色）、塩化ナトリウムの非存在下でＣＤ３１で染色したＦＦＰＥＴ切片から単離されたもの（ＮａＣｌ無し）、および、塩化ナトリウムの存在下でＣＤ３１で染色したＦＦＰＥＴ切片から単離されたもの（ＮａＣｌ有り）である。データは３つの独立した反復試験それぞれから得られた。 図３：この図は、基準遺伝子ＡＬＡＳ１（デルタ−アミノレブリネートシンターゼ１）(delta-aminolevulinate synthase 1)のＲＴ−ｑＰＣＲ分析のＣｐ値を示す。図示したのは、ＲＴ−ｑＰＣＲ実験からのＣｐ値の中央値±標準偏差である。ＲＮＡは、非染色ＦＦＰＥＴ切片から単離されたもの（非染色）、塩化ナトリウムの非存在下でＣＤ３１で染色したＦＦＰＥＴ切片から単離されたもの（ＮａＣｌ無し）、および、塩化ナトリウムの存在下でＣＤ３１で染色したＦＦＰＥＴ切片から単離されたもの（ＮａＣｌ有り）である。データは３つの独立した反復試験それぞれから得られた。 図４：この図は、それぞれ基準遺伝子ＨＰＲＴに対して正規化したマーカー１およびマーカー２の発現を示す。図示したのは、それぞれマイクロダイセクションした腫瘍細胞および血管細胞からのマーカー１およびマーカー２の相対遺伝子発現である。実験は二重に実施された。

以下の定義は、本明細書中で用いる種々の用語の意味および範囲を説明および定義するために示される。

用語“a”、“an”および“the”は、状況からそうでないことが示されない限り、一般に複数の指示物を含む。

本明細書中で数値と併せて用いる用語“約”は、境界をそれらの数値の上方および下方へ拡張することによりその数値を修飾する。一般に、用語“約”は、明記した数値の上方および下方へ５％高いかまたは低い分散により数値を修飾する。たとえば、“約１００”の数値は“９５〜１０５”の範囲を意味する。

用語“増幅”は、一般に、ターゲット核酸からの複数の核酸分子の生成を表わし、その際、ポリメラーゼによる延長の開始部位を提供するためにプライマーをターゲット核酸分子上の特定の部位にハイブリダイズさせる。増幅は当技術分野で一般に知られているいずれかの方法、たとえば下記により実施できるが、それらに限定されない：標準ＰＣＲ、ロングＰＣＲ(long PCR)、ホットスタートＰＣＲ(hot start PCR)、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび等温増幅。

本明細書中で用いる用語“抗体”は、完全な免疫グロブリン、たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭ、または抗体のフラグメント、たとえばＦａｂ、ＦｖもしくはＦｃ、または融合抗体、融合抗体フラグメント、または抗体の他の誘導体を表わす。用語“標識抗体”は、酵素、蛍光色素、化学発光物質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体で標識された抗体を表わす。

用語“エピトープ”は、タンパク質、糖質または脂質などの化合物の抗原性領域を表わす。抗原性領域は、一般に５〜８個のアミノ酸からなる。エピトープは、各抗体の抗原結合部位によって特異的に認識される。

用語“固定された組織または細胞”は、本明細書中で、当業者に知られているものに従って用いられ、化学固定法により崩壊から保護された生体組織または細胞を表わす。そのような方法は、そのような生体組織または細胞内での自己溶解または腐敗を阻止する。固定は生化学反応を終止させ、処理された組織の機械的安定性を高める。

用語“免疫組織化学”および“免疫組織化学的”は、ある抗原の存在を組織試料中においてその抗原に特異的に結合できる抗体で検出するための手法を表わす。抗体−抗原複合体の検出は、通常は酵素標識抗体との色素形成反応により、または蛍光標識抗体により行なわれる。

本明細書中で用いる用語“マクロダイセクション(macrodissection)”は、顕微鏡スライドなどの固体支持体に固定された組織切片からメスまたはスパーテルなどの道具を用いて目的領域を掻き取る方法を表わす。

本明細書中で用いる用語“メンブレンスライド(membrane slide)”は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）に用いるための固体支持体または顕微鏡スライドを表わす。マイクロダイセクションには、メンブレンで被覆されたガラススライド、または各種メンブレンで被覆することができる金属フレームからなるフレームスライドを使用できる。メンブレンの材料は、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリエステル（ＰＯＬ）およびフルオロカーボン（ＦＬＵＯ）からなる群から選択できる。

本明細書中で用いる用語“マイクロダイセクション(microdissection)”は、組織試料から１個以上の特定の細胞または目的領域を切断および分離する方法を表わす。マイクロダイセクションは、たとえばレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を用いて関連領域をレーザーで切断することにより実施できる。

用語“核酸”は、一般にＤＮＡまたはＲＮＡを表わし、それは増幅の生成物、合成により作成されたもの、ＲＮＡの逆転写の生成物、または天然物のいずれであってもよい。一般に、核酸は一本鎖または二本鎖の分子であり、天然ヌクレオチドから構成される。二本鎖核酸分子は３‘または５‘オーバーハングをもつ可能性があり、したがって、それらの全長にわたって完全に二本鎖であることは要求または想定されない。さらに、用語核酸は、非天然ヌクレオチド、および／または天然ヌクレオチドに対する修飾体から構成されてもよい。例をここに列記するが、それらに限定されない：それぞれ、ライゲーションを可能にし、またはエキソヌクレアーゼ分解／ポリメラーゼ延長の阻止を可能にする、５‘または３‘ヌクレオチドのリン酸化；共有結合または共有結合に近似する結合(near covalent attachment)のためのアミノ、チオール、アルキンまたはビオチニル修飾；蛍光体およびクエンチャー；分解を阻止するためのヌクレオチド間のホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデートおよびホスホロチエステル結合；ならびに修飾塩基、たとえばデオキシイノシン、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、２−アミノプリン、ジデオキシシチジン、５−メチルｄＣ、ロックされた核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）、イソ−ｄＣおよび−ｄＧ塩基、２‘−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、およびフッ素修飾塩基。

用語“ポリ−リジン”は、数百に及ぶ反復単位を含み、組織切片などの試料と試料を固定するメンブレンスライドとの親和性を高めるのに適した分子を表わす。本発明によるポリ−リジンはポリ−Ｌ−リジンである。本発明によるポリ−Ｌ−リジンは、７０から３００ｋＤａまでの分子量をもつ。ポリ−Ｌ−リジンはプロテアーゼにより消化できる。本発明における他のポリ−リジンは、たとえば、ポリ−Ｄ−リジンである。本発明におけるポリ−Ｄ−リジンは、７０から３００ｋＤａまでの分子量をもつ。ポリ−Ｄ−リジンはプロテアーゼ消化に対して抵抗性である。

用語“ｑＰＣＲ”は、一般にリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、定量ポリメラーゼ連鎖反応、またはキネティックポリメラーゼ連鎖反応として知られるＰＣＲ法を表わす。この手法は、ＰＣＲを用いてターゲット核酸を同時に増幅および定量し、その際、定量はインターカレーション性の蛍光色素、またはターゲット核酸にハイブリダイズした場合にのみ検出できる蛍光レポーター分子を含む配列特異的プローブによる。

用語“ＲＮＡ”は、当業者に知られているように本明細書中で用いられ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡ、転写プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡ（翻訳に使われるもの）、および遺伝子（単数または複数）からの転写物、またはそれに由来する核酸を表わす。転写プロセシングには、スプライシング、編集(editing)、修飾、および分解などのプロセスが含まれる。ｍＲＮＡを含有する試料には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ｍＲＮＡ、遺伝子（単数または複数）のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写により得られるｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡなど。

用語“固体支持体”は、当業者に知られているように本明細書中で用いられ、組織切片を固定または付着できる表面領域をもついずれかの固体材料を表わす。支持体は、材料の組合わせ、たとえばガラス上プラスチック、ガラス上カーボンなどであってもよい。特定の態様において、固体支持体は前記に定義した“メンブレンスライド”であってもよい。

本発明は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の免疫組織化学染色のための方法であって、ａ）固体支持体を用意する工程、ｂ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、固体支持体に固定する工程、ｃ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片から、パラフィンを除去する工程、ｄ）エピトープを賦活化するために、固体支持体に固定された組織切片を５０〜７０℃で１２〜２４時間加熱する工程、および、ｅ）固体支持体に固定された組織切片を染色する工程、を含み、その際、少なくとも工程ｅ）を０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施する、前記方法に関する。当業者に知られているように、用語“塩化ナトリウム”と実験式“ＮａＣｌ”は本明細書中で互換性をもって使用できる。１態様において、塩化ナトリウムは１．５〜２．５Ｍの濃度で存在する。より特定の態様において、塩化ナトリウムは約１．８〜２．２Ｍの濃度で存在する。よりさらに特定の態様において、塩化ナトリウムは約２Ｍの濃度で存在する。

実施例からも分かるように、少なくとも固体支持体に固定された組織切片を染色する工程で０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの高い塩濃度を用いることにより、その後にＦＦＰＥＴから単離されるＲＮＡは分解を阻止されることが見出された。したがって、本発明による０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの高い塩濃度を用いる方法は、染色後にＲＮＡを単離し、高品質のＲＮＡを必要とする染色操作、たとえばＲＴ−ｑＰＣＲ実験に適している。

１態様において、本方法はさらに、ｆ）固体支持体に固定された染色組織切片から、目的領域をダイセクションする工程、ｇ）目的領域からＲＮＡを単離する工程、ｈ）単離されたＲＮＡを分析する工程、を含む。１態様において、単離されたＲＮＡの分析は、当技術分野で知られているいずれかの方法、たとえばＲＮＡプロファイリング、ＲＮＡ配列決定および遺伝子発現分析を含む。こうして、本発明による方法を用いてＦＦＰＥＴ切片から高品質のＲＮＡを単離することができ、その結果、基本的にいかなる後続方法も本明細書に記載するようにＦＦＰＥＴ切片にＲＮＡ安定化法を適用することによって顕著に改良できる。

他の態様において、本方法はさらに、ｆ）固体支持体に固定された染色組織切片から、目的領域をダイセクションする工程、ｇ）目的領域からＲＮＡを単離する工程、ｈ）単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、ｉ）ｃＤＮＡを増幅および定量する工程、を含む。１態様において、工程ｈ）およびｉ）はワンステップ（one-step）ＰＣＲとして実施される。他の態様において、工程ｈ）およびｉ）はツーステップ（two-step）ＰＣＲとして実施される。特定の態様において、ｃＤＮＡを増幅および定量する工程はリアルタイムＰＣＲにより実施される。

１態様において、固体支持体はポリ−Ｌ−リジンでコートされる。他の態様において、固体支持体はポリ−Ｄ−リジンでコートされる。特定の態様において、固体支持体は、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジンの溶液を固体支持体に付与することによりポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジンでコートされる。１態様において、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジンの溶液を付与した後に固体支持体を１５〜４５分間インキュベートする。特定の態様において、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジンの溶液を付与した後に固体支持体を３０分間インキュベートする。特定の態様において、溶液は０．０５〜２％のポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジン濃度をもつ。より特定の態様において、溶液は０．１％のポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジン濃度をもつ。他の特定の態様において、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジンは７０から３００ｋＤａの分子量をもつ。他の特定の態様において、固体支持体はメンブレンスライドである。

１態様において、固体支持体は３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）で処理される。そのようなシラン処理を実施して固体支持体の表面をアルコキシシラン分子で官能化し、その結果、固体支持体上における組織切片の付着を増大させることができる。

１態様において、固体支持体に固定された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片は、２〜１０μｍの厚さをもつ。特定の態様において、固体支持体に固定された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片は、４〜６μｍの厚さをもつ。より特定の態様において、固体支持体に固定された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片は、約５μｍの厚さをもつ。

１態様において、パラフィンの除去は、固体支持体に固定された組織切片をキシロール中でインキュベートすることにより実施される。その後、固体支持体に固定された組織切片を一連の漸減濃度のエタノール、たとえばそれぞれ１００％、９６％および７０％のエタノールで数秒間、続いて水中で２×１分間、再水和する。

ＲＮＡが分解するのを最大限に阻止するために、低温加熱誘導エピトープ賦活化(low-temperature heat induced epitope retrieval)（ＬＴ−ＨＩＥＲ）プロトコルが確立された。エピトープ賦活化は、固体支持体に固定された組織切片を６０℃で１６時間、ｐＨ８において加熱した場合に最良の結果をもたらすことが見出された。１態様において、エピトープ賦活化のための溶液中に塩化ナトリウムが２Ｍの濃度で存在してもよい。

したがって、１態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は１．５〜２．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。他の特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は１．８〜２．２Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。よりさらに特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は約２．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。

１態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は５０〜７０℃で実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は５５〜６５℃で実施される。他の特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は５８〜６２℃で実施される。よりさらに特定の態様において、固体支持体に封入された組織切片の加熱は約６０℃で実施される。

１態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は１２〜２４時間実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は１４〜１８時間実施される。より特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は１５〜１７時間実施される。よりさらに特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は約１６時間実施される。

１態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱はｐＨ５〜９で実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱はｐＨ７．５〜８．５で実施される。より特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱はｐＨ７．８〜８．２で実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は約８のｐＨ値で実施される。

特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片の加熱は、約６０℃で約１６時間、約８のｐＨ値において実施される。１態様において、塩化ナトリウムはエピトープ賦活化のための溶液中に２Ｍの濃度で存在することができる。

加熱工程の後、固体支持体に固定された組織切片を、０．５〜３．０Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝液中で冷却する。特定の態様において、緩衝液はＴＢＳ−Ｔである。他の特定の態様において、塩化ナトリウムは約２Ｍの濃度で存在する。

１態様において、固体支持体に固定された組織切片の染色は抗体ベースの染色を含む。特定の態様において、抗体ベースの染色は一次抗体および二次抗体の使用を含む。より特定の態様において、一次抗体はＣＤ３１結合抗体である。よりさらに特定の態様において、一次抗体はＣＤ３１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローンＪＣ７０である。特定の態様において、二次抗体は抗マウス抗体である。より特定の態様において、二次抗体は基質を１種類以上の生成物に変換できる酵素に共有結合している。よりさらに特定の態様において、二次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合している。

固体支持体に固定された組織切片を一次抗体と共に３７℃で１時間インキュベートし、その際、塩化ナトリウムが２Ｍの濃度で存在する場合に、抗体ベースの染色は最良の結果をもたらすことが見出された。１態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、３４〜４０℃で実施される。１態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、０．５〜１．５時間実施される。１態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、約３７℃で実施される。他の特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、約１時間実施される。さらに他の特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、約２．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。より特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と一次抗体とのインキュベーションは、約３７℃で約１時間実施され、その際、塩化ナトリウムが約２Ｍの濃度で存在する。

二次抗体とのインキュベーションは、室温で２時間、恒湿チャンバー(humidity chamber)内で実施され、その際、塩化ナトリウムは２Ｍの濃度で存在した。１態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、１６〜２４℃で実施される。１態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、１．５〜２．５時間実施される。１態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、約２０℃で実施される。他の特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、約２時間実施される。さらに他の特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、約２．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。より特定の態様において、固体支持体に固定された組織切片と二次抗体とのインキュベーションは、約２０℃で約２時間実施され、その際、塩化ナトリウムが約２Ｍの濃度で存在する。

１態様において、固体支持体に固定された組織切片の染色は、さらに二次抗体に共有結合した酵素により触媒される酵素−基質反応を含む。したがって、特定の態様において、染色は標識抗体の使用を含む。酵素は、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択できる。ペルオキシダーゼ、たとえばＨＲＰは、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、４−クロル−１−ナフトール（ＣＮ）およびｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩からなる群から選択される基質を変換できる。アルカリホスファターゼは、リン酸ナフトールａｓ−ｍｘ、ヘキサゾ化(hexazotizing)トリアミノ−トリトリル−メタンクロリド、リン酸ナフトールＡＳ−ＢＩ、リン酸ナフトールＡＳ−ＴＲ、５−ブロモ−４−クロル−３−インドキシルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルー−テトラゾリウム（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム−バイオレット（ＩＮＴ）、ファストレッド(Fast Red)ＴＲ、ファストレッドＬＢ、ファストブルー(Fast Blue)ＢＢおよびファストガーネット(Fast Garnet)ＧＢＣからなる群から選択される基質を変換できる。

特定の態様において、基質を変換できる酵素はＨＲＰである。特定の態様において、ＨＲＰにより変換される基質はＤＡＢである。１態様において、ＤＡＢ染色は０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施される。特定の態様において、塩化ナトリウムは約２Ｍの濃度で存在する。１態様において、ＤＡＢ染色は５〜２０分間、室温で実施された。特定の態様において、ＤＡＢ染色は約１０分間、室温で実施された。

１態様において、固体支持体はメンブレンスライドである。特定の態様において、固体支持体はＬＣＭに適したメンブレンスライドである。特定の態様において、メンブレンスライドはポリエチレンナフタレートメンブレンスライドである。市販のメンブレンスライド、たとえばポリエチレンナフタレートメンブレンスライドは本発明による方法に適さないことが示された。市販のメンブレンスライドは、コートされたメンブレンスライドに固定された組織切片をエピトープ賦活化のために加熱する工程に際して、ＦＦＰＥＴ切片に対する十分な付着が得られない。加熱工程中のメンブレンスライドとＦＦＰＥＴ切片の付着を改善するために、メンブレンスライドをポリ−Ｌ−リジンでコートした；これにより、ＦＦＰＥＴ切片がメンブレンスライドに安定に付着するほどにメンブレンスライドとＦＦＰＥＴ切片の付着が増大した。

１態様において、固体支持体に固定された染色組織切片から目的領域をダイセクションする工程は、目的領域をマイクロダイセクションまたはマクロダイセクションすることを含む。特定の態様において、マイクロダイセクションする工程は、組織試料から１個以上の特定の細胞または目的領域を切断および分離するプロセスを含む。マイクロダイセクションは、たとえばレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を用いて関連領域をレーザーで切断することにより実施できる。特定の態様において、マクロダイセクションする工程は、顕微鏡スライドなどの固体支持体に固定された組織切片からメスまたはスパーテルなどの道具を用いて目的領域を掻き取るプロセスを含む。

本発明による方法において、メンブレンスライドに付着した染色ＦＦＰＥＴ切片にＬＣＭを用いて、目的領域を組織切片から切断した。目的領域をその後にＲＮＡ単離に用いた。１態様において、目的領域は０．５〜５ｍｍ^２のサイズをもつ。特定の態様において、目的領域は１〜２ｍｍ^２のサイズをもつ。ＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を用いて、たとえばＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥＴ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を用いて、目的領域から単離された。単離されたＲＮＡはその後、ｃＤＮＡを得るために逆転写された。ｃＤＮＡの量が限られているので、ｑＰＣＲ実験に十分な核酸を得るために、ｑＰＣＲによる増幅の前にｃＤＮＡについてプレアンプリフィケーション工程を実施することができる。したがって、１態様において、本発明による方法はさらに、ｆ）コートされたメンブレンスライドに固定された染色組織切片から、目的領域をマイクロダイセクションする工程、ｇ）目的領域からＲＮＡを単離する工程、ｈ）単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、ｉ）ｃＤＮＡをプレアンプリフィケーションする工程、および、ｊ）プレアンプリフィケーションされたｃＤＮＡを増幅および定量する工程、を含む。特定の態様において、ｃＤＮＡを増幅および定量する工程はリアルタイムＰＣＲにより実施される。

特定の態様において、本発明は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の免疫組織化学染色のための方法であって、ａ）ポリ−Ｌ−リジンでコートされたメンブレンスライドを用意する工程、ｂ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、メンブレンスライドに固定する工程、ｃ）固体支持体に固定された組織切片をキシロール中でインキュベートすることにより、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片から、パラフィンを除去する工程、ｄ）エピトープを賦活化するために、メンブレンスライドに固定された組織切片を約６０℃で約１６時間加熱する工程、および、ｅ）メンブレンスライドに固定された組織切片を標識抗体の使用により染色する工程、ｆ）メンブレンスライドに固定された染色組織切片から、１〜２ｍｍ^２のサイズをもつ目的領域をマイクロダイセクションする工程、ｇ）目的領域からＲＮＡを単離する工程、ｈ）単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、ｉ）ｃＤＮＡを増幅および定量する工程、を含み、その際、少なくとも工程ｅ）を約２Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施し、ｃＤＮＡを増幅および定量する工程をリアルタイムＰＣＲにより実施する、前記方法に関する。

本発明は、さらに前記方法を実施するためのキットに関する。したがって、本発明はさらに、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の免疫組織化学染色のための下記の工程を含む方法を実施するためのキットに関する：ａ）固体支持体を用意する工程、ｂ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、固体支持体に固定する工程、ｃ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片から、パラフィンを除去する工程、ｄ）エピトープを賦活化するために、固体支持体に固定された組織切片を５０〜７０℃で１２〜２４時間加熱する工程、および、ｅ）固体支持体に固定された組織切片を染色する工程、を含み、その際、少なくとも工程ｅ）を０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施する。１態様において、塩化ナトリウムは１．５〜２．５Ｍの濃度で存在する。より特定の態様において、塩化ナトリウムは約１．８〜２．２Ｍの濃度で存在する。よりさらに特定の態様において、塩化ナトリウムは約２Ｍの濃度で存在する。

１態様において、上記のキットにより実施される方法はさらに下記の工程を含む：ｆ）固体支持体に固定された染色組織切片から、目的領域をダイセクションする工程、ｇ）目的領域からＲＮＡを単離する工程、ｈ）単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、ｉ）ｃＤＮＡを増幅および定量する工程。１態様において、工程ｈ）およびｉ）は１工程ＰＣＲとして実施される。他の態様において、工程ｈ）およびｉ）は２工程ＰＣＲとして実施される。特定の態様において、ｃＤＮＡを増幅および定量する工程はリアルタイムＰＣＲにより実施される。

１態様において、本発明による方法を実施するためのキットは下記のものを含む：ａ）固体支持体、ｂ）エピトープ賦活化のための溶液、およびｃ）０．５〜３．０Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む免疫組織化学染色のための溶液。他の態様において、本発明による方法を実施するためのキットは下記のものを含む：ａ）ポリ−リジンでコートされたメンブレンスライド、ｂ）エピトープ賦活化のための溶液、およびｃ）０．５〜３．０Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む免疫組織化学染色のための溶液。特定の態様において、キットはさらに、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写ならびにｃＤＮＡの増幅および定量を実施するのに必要なすべての試薬を含む。他の特定の態様において、キットは、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を実施し、ｃＤＮＡをプレアンプリフィケーションし、プレアンプリフィケーションされたｃＤＮＡを増幅および定量するのに必要な、すべての試薬を含む。

以下の実施例１〜３は本発明の理解を補助するために提示され、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。記載した操作を本発明の精神から逸脱することなく改変できることは理解される。

実施例１
ポリ−Ｌ−リジンによるメンブレンスライドのコーティング
ＰＥＮメンブレンスライド（ＭｉｃｒｏＤｉｓｓｅｃｔ ＧｍｂＨ）を約１ｍｌのポリ−Ｌ−リジン溶液（０．１％ ｗ／ｖ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）で被覆し、恒湿チャンバー内で室温において３０分間インキュベートした。強力な振とうによりポリ−Ｌ−リジン溶液を除去した。その後、ＰＥＮメンブレンスライドをＵＶ光下で一夜乾燥させた。

観察結果（図示していない）：
ポリ−Ｌ−リジンによるＰＥＮメンブレンスライドのコーティングにより、低温加熱誘導エピトープ賦活化（ＬＴ−ＨＩＥＲ，６０℃，１６時間，ｐＨ８）に適用した際のメンブレンスライドへの組織切片の付着が増大した。ポリ−Ｌ−リジンでコートされたメンブレンスライド：３つの組織切片のうちスライドから離脱したのは０であった。ポリ−Ｌ−リジン無しのメンブレンスライド：３つの組織切片のうち３つがスライドから離脱した。

実施例２
２Ｍ塩化ナトリウム有り／無しＣＤ３１染色
腫瘍試料のＦＦＰＥＴ切片を、抗体ベースの染色およびその後のＲＮＡ単離に用いた。以下の記載はＦＦＰＥＴ切片を染色するために２Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施した操作のみを述べる。塩化ナトリウム無しの実験については、下記の点が異なる全く同じ操作を実施した：１）染色操作に塩化ナトリウムを用いなかった、２）二次抗体とのインキュベーションを３０分間実施した（２Ｍ塩化ナトリウムを用いた場合の２時間の代わりに）。高い塩濃度は、二次抗体の結合効率が低いためインキュベーション時間の延長を必要とした。

５μｍのＦＦＰＥＴ切片をポリ−Ｌ−リジンコートされたＰＥＮメンブレンスライドに付着させ、ダストフリー環境で一夜乾燥させた。その後、ＦＦＰＥＴ切片を３％ Ｈ_２Ｏ_２（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートした。次いでＦＦＰＥＴ切片をＰＣＲグレードＨ_２Ｏ中で２分間洗浄した。切片のインキュベーションを６０℃で１６時間、エピトープ賦活化溶液（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）中で実施した。その後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）抗マウス抗体（ＤＡＫＯ ＧｍｂＨ）を含むＣＤ３１染色を実施した。塩化ナトリウム（分子生物学グレード，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）を、すべての染色試薬に溶解した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ 無血清（ＤＡＫＯ ＧｍｂＨ）、一次および二次抗体、ＤＡＢ色原体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ）、ならびにＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水およびＴｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）洗浄用緩衝液）。塩化ナトリウムの最終濃度は約２Ｍであった。切片をＴＢＳ−Ｔ／塩化ナトリウム中で室温に５分間冷却した。切片を恒湿チャンバー内で５分間、１００μｌのｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋ／塩化ナトリウムと共にインキュベートした。その後、切片から液体を振り落とし、１００μｌの一次抗体／塩化ナトリウムを添加し、パラフィルムで覆い、３７℃で１時間インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔ／塩化ナトリウムで２×２分間洗浄した後、１００μｌの二次抗体／塩化ナトリウムを添加し、恒湿チャンバー内で室温において２時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ／塩化ナトリウムで２×２分間洗浄した後、１００μｌのＤＡＢ色原体／塩化ナトリウムを添加し、恒湿チャンバー内で室温において５〜１０分間インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔ／塩化ナトリウムで２分間洗浄した。その後、切片をＨ_２Ｏ（ＰＣＲグレード）で２分間洗浄した。染色された切片をダイセクションし、全ＲＮＡを単離した（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐａｒａｆｆｉｎ ＲＮＡ Ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）。ＲＮＡ濃度を分光光度分析（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ １０００分光光度計）により測定した。当技術分野で周知の方法によりＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡをプレアンプリフィケーションした。その後、リアルタイムＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｐｌａｔｆｏｒｍ）により増幅を実施した。

観察結果：
塩化ナトリウム無しのＣＤ３１染色切片のＲＮＡ濃度は、非染色切片と比較して有意に低い。塩化ナトリウム有りのＣＤ３１染色ＦＦＰＥＴ切片のＲＮＡ濃度は、非染色切片のものと有意差がない（図１を参照）。

塩化ナトリウム無しのＣＤ３１染色切片のＣｐ値（基準遺伝子ＨＰＲＴ）は、非染色切片と比較して有意に高い。塩化ナトリウム有りのＣＤ３１染色ＦＦＰＥＴ切片のＣｐ値は、非染色切片のものと有意差がない（図２を参照）。

塩化ナトリウム無しのＣＤ３１染色切片のＣｐ値（基準遺伝子ＡＬＡＳ１）は、非染色切片と比較して有意に高い。塩化ナトリウム有りのＣＤ３１染色ＦＦＰＥＴ切片のＣｐ値は、非染色切片のものと有意差がない（図３を参照）。

実施例３
ＣＤ３１染色されたＦＦＰＥＴ切片からの２種類のマーカーの遺伝子発現分析
この例は、ＣＤ３１染色されたＦＦＰＥＴ切片から単離されたＲＮＡの、遺伝子発現実験についての記載に従った方法との適性を示す。実施例２に記載した方法を、３つの独立した腫瘍試料からのＦＦＰＥＴ切片に適用した。試料をメンブレンスライドに固定した。目的領域（腫瘍および血管）を連続レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによりマイクロダイセクションした。それぞれ腫瘍ダイセクション物および血管ダイセクション物における２種類の異なるマーカー（マーカー１およびマーカー２）の発現に関するデータを、単離されたＲＮＡの分析によって得た。実験を二重に実施した。当技術分野で周知の方法を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。十分な出発物質を得るために、また感度を高めるために、ｃＤＮＡをプレアンプリフィケーションした。プレアンプリフィケーションしたｃＤＮＡを、最後にリアルタイムＰＣＲを用いて二重に分析した。マーカー１およびマーカー２の発現をそれぞれ基準遺伝子ＨＰＲＴに対して正規化することにより、マーカー１およびマーカー２の相対発現を求めた。

観察結果：
図４は、非染色腫瘍試料について実施した先の実験（データを示していない）と一致した、３つの独立したＣＤ３１染色腫瘍試料から得られたマーカー１およびマーカー２の相対発現のパターンに関するデータを示す。図４Ａ）は、マーカー１が血管細胞と比較して腫瘍細胞においてより高度に発現することを示す。さらに、図４Ｂ）は、マーカー２が腫瘍細胞と比較して血管細胞においてより高度に発現することを示す。この場合、腫瘍細胞における発現は血管細胞と比較して発現を検出できないほどきわめて低い（検出されず＝ｎ．ｄ．）。非染色腫瘍試料の分析（データを示していない）は再現できたので、本発明による染色方法は、結果に影響を及ぼすほどＲＮＡの品質に有意に影響することはないと結論できる。結果的に、本発明による方法を用いるとＲＮＡ分解を最小限に抑えることができ、したがってＦＦＰＥＴ試料からのＲＮＡの品質は遺伝子発現分析またはＲＮＡ分析のための他のいずれの方法にも十分である。

Claims (15)

1. ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の免疫組織化学染色のための方法であって、
   ａ）固体支持体を用意する工程、
   ｂ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、固体支持体に固定する工程、
   ｃ）ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片から、パラフィンを除去する工程、
   ｄ）エピトープを賦活化するために、固体支持体に固定された組織切片を５０〜７０℃で１２〜２４時間加熱する工程、および、
   ｅ）固体支持体に固定された組織切片を染色する工程、
   を含み、
   その際、少なくとも工程ｅ）を０．５〜３．０Ｍ塩化ナトリウムの存在下で実施する、
   前記方法。
2. さらに、
   ｆ）固体支持体に固定された染色組織切片から、目的領域をダイセクションし、
   ｇ）目的領域からＲＮＡを単離する工程、
   ｈ）単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
   ｉ）ｃＤＮＡを増幅および定量する工程、
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 固体支持体がポリ−Ｌ−リジンでコートされている、請求項１または２に記載の方法。
4. 塩化ナトリウムが１．５〜２．５Ｍの濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 塩化ナトリウムが１．９〜２．１Ｍの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. パラフィンの除去が、固体支持体に固定された組織切片をキシロール中でインキュベートすることにより実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 固体支持体に固定された組織切片の加熱が５５〜６５℃で１４〜１８時間実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 固体支持体に固定された組織切片の加熱が５７〜６３℃で１５．２〜１６．８時間実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. 染色が標識抗体の使用を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 固体支持体がメンブレンスライドである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 工程ｆ）が、目的領域をマイクロダイセクションまたはマクロダイセクションすることを含む、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 目的領域が１〜２ｍｍ^２のサイズを有する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ｃＤＮＡを増幅および定量する工程がリアルタイムＰＣＲにより実施される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    ａ）ポリ−リジンでコートされた固体支持体、
    ｂ）エピトープ賦活化のための溶液、および、
    ｃ）０．５〜３．０Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む免疫組織化学染色のための溶液、
    を含む、前記キット。
15. さらに、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、ｃＤＮＡの増幅および定量を実施するのに必要なすべての試薬を含む、請求項１４に記載のキット。

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