JP6210560B2 - トリコデルマ(Trichoderma)属菌を用いた植物病原菌の増殖抑制方法 - Google Patents
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Description
十和田石は、青緑色の美しい色彩と滑りにくく保温性・保湿性を有する事から、40年程前より、建築石材や浴室の床材として、砕石場から切り出されて製品化されている。
トリコデルマ(Trichoderma)属菌の単離源及び担持体としては、特許文献2では、芝(ノシバ)根圏から分離した菌株(SKT-1)、及びサラダナ根圏から分離した菌株(SKT-2)が開示されている。
(1)植物病原菌の増殖抑制能を有し、受託番号がNITE P−1419であるトリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物を培養する工程
(2)前記培養した微生物を植物土壌に植菌する工程
植物病原菌は、リゾクトニア(Rhizoctonia)属又はフザリウム(Fusarium)属に属する糸状菌であることを特徴とする請求項1記載の植物病原菌の増殖抑制方法である。
植物病原菌を抑制する微生物が十和田石に存在することを確認するため、十和田石の植物病原菌リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)に対する抑制実験を行った。
未減菌十和田石粉末
リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)
サンプルA 未滅菌十和田石0.7g、 滅菌水 300μL
サンプルB 滅菌十和田石0.7g、 滅菌水 300μL
サンプルA 2.1×107cfu/mL
サンプルB N.D.
前記作製した各サンプルの培養液を10μLTSA培地および1/10TSA培地に植菌し、同時にリゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)の寒天切片を植菌した。培養は、室温で行い観察を行った。観察は1週間行い、4日目までの観察結果を図2及び図3に示した。
実験例1で、十和田石中に常在する微生物がリゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)の増殖を抑制していることが示唆されたため、本実験ではその微生物の探索を行った。
十和田石粉末
PDA培地
1/10TSA培地
TSA培地
十和田石粉末を0.1g秤量後、滅菌水もしくは滅菌生理食塩水を1mL添加し、懸濁した。この懸濁液を原液として10−6まで希釈系列を作製し、各寒天培地上に20μLずつ植菌した。
1/10TSA培地から細菌7株、真菌4株、TSA培地から細菌2株の計13株の微生物が得られた。PDA培地からは、今のところ菌は単離できていない。それらの微生物をリゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)に対する抑制試験を行い、その結果を図4乃至図7に示した。
実験例1で未滅菌十和田石粉末を用いた場合、リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)を抑制する微生物の存在が確認され、その糸状菌と思われる抑制微生物の単離が実験例2でできたため、十和田石粉末常在菌のコリモナス(Collimonas sp.) D-25(受託番号NITE P−1104)、バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis) RB14、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum) 及びリゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)の計4株にに対する抗菌活性試験を行った。
リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)
コリモナス(Collimonas sp.) D-25(受託番号 NITE P−1104)
バチルス・スブチルス(Bacillus subtilis) RB14
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)
1/10TSA培地
寒天培地で前培養を行った各微生物を爪楊枝で釣菌し、新しい1/10TSA培地に植菌した。単離が確認された十和田石粉末常在菌(以下「HNT−01株」という」を釣菌し、上記の菌それぞれと対称となるように植菌した。植菌後、室温で10日間培養し、HNT−01株が、各微生物を抑制するか、もしくは抑制されるかを確認した。その結果を図8に示す。
十和田石から分離されたHNT−01株の帰属分類を推定するため、以下の同定試験を行った。
以下の条件でHNT−01株を培養し、供試菌体とした。
・培地 ポテトデキストロース寒天培地(PDA)
2%麦芽寒天培地(MA)
オートミール寒天培地(OA)
コーンミール寒天培地(CMA)
・培養温度 25℃および室温
・培養期間 1週間〜6週間
抽出からサイクルシークエンスまでの操作は各プロトコルに基づく。なお、同定試験においてHNT−01株をSIID11835の番号を付して塩基配列解析を行なった。
・DNA抽出 物理的破壊およびMarmur(1961)の改変法
・PCR PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ)
・サイクルシークエンス BigDye Terminator v3.1 Kit(Applied Biosystems)
・使用プライマー NL1およびNL4
ITS5およびITS4
・シークエンス ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer System(Applied Biosystems)
・配列決定 ChromasPro 1.5(Technelysium Pty Ltd.)
・相同性検索および簡易分子系統解析
ソフトウェア アポロン2.0(テクノスルガ・ラボ)
データベース アポロンDB-FU5.0(テクノスルガ・ラボ)
国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)
<HNT−01株の巨視的観察>
上記各培養平板において1週間培養後に巨視的観察を行い、コロニーの直径・色調(コロニー表面および裏面)・表面性状・可溶性色素産生の有無等に関して記録した。
<HNT−01株の微視的観察>
HNT−01株の各培養平板の微視的観察像を図12乃至図17に示す。
菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、無色、有隔壁菌糸の形成が認められた。また、栄養菌糸上に球形、亜球形の無色の厚膜胞子が形成される様子が認められた(図17)。
1.分生子柄および分生子形成細胞
分生子柄は栄養菌糸より直立し、規則または不規則的に分岐し、集合して羊毛状の塊(房)を形成するのが認められた(図12、図13)。
分生子はフィアロ型分生子で、無色〜緑色、亜球形〜卵形、1細胞、表面は平滑であった(図16)。
約6週間の培養検体において有性生殖器官の形成は確認できなかった。
HNT−01株から得られた28S rDNA-D1/D2塩基配列は、アポロンDB-FUに対するBLAST相同性検索の結果、子嚢菌類の一種であるTricoderma atroviride CBS351.93の塩基配列と相同率100%の相同性を示した(表3)。
また、実験例1において、十和田石ケーキを滅菌しない状態で、リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)の増殖が抑制された事と、採掘場の環境から、空中を浮遊するトリコデルマ(Tricoderma)属菌が、たまたま乾燥途上の十和田石ケーキに付着したとは考えらないことから、HNT−01株は、十和田石が切り出され、加工される過程で発生する微細粉排水中や、その排水を沈殿、回収、及び乾燥される工程の中でその生活環を保ち、最終製品である乾燥十和田石ケーキ上にて、厚膜胞子を形成していたものと考えられる。
Claims (2)
- 以下の工程を含む植物病原菌の増殖抑制方法。
(1)植物病原菌の増殖抑制能を有し、受託番号がNITE P−1419であるトリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物を培養する工程
(2)前記培養した微生物を植物土壌に植菌する工程 - 植物病原菌は、リゾクトニア(Rhizoctonia)属又はフザリウム(Fusarium)属に属する糸状菌である請求項1記載の植物病原菌の増殖抑制方法。
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