JP6192889B2 - 透過型電子顕微鏡用試料の調製方法 - Google Patents
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Description
このように液状食品やゲル状食品に対し、透過型電子顕微鏡を用いて、その組織構造を正確に観察する十分に満足できる手段(試料の調製方法)は、いまだ開発されていない。
[2] 液状またはゲル状食品を試料支持台の上に載置させて急速凍結させることを含む、[1]に記載の方法。
[3] 試料支持台から5〜10μmの位置の試料を切り取ることを含む、[2]に記載の方法。
[4] 水を含む固定液を用いて凍結置換させることを含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[6] 液状またはゲル状食品の保存安定性を評価する、[5]に記載の方法。
[7] [6]に記載の方法により、保存安定性が高いと評価された液状またはゲル状食品。
[8] タンパク質粒子の大きさが500nm以下である、少なくとも1kcal/mlの高濃度流動食。
急速凍結では、一般的には、最大氷結晶生成帯である−1〜−5℃を通過するために費やす時間が30分以内、あるいは飲食品の氷結前線が1時間に表面から内部へ進む距離により凍結界面前進速度Vを表し、V=5〜20cm/hの場合が処理条件に設定されている。一方、電子顕微鏡観察における「急速凍結」では、微細構造の観察の障害にならないよう、氷結晶のサイズを10nm以下に抑えることが好ましいと考えられており、この凍結状態を得るには、−3〜−80℃の温度帯を短時間で通り抜けること、具体的には、104 ℃/sec以上の冷却速度が必要とされている(参考図書:「よくわかる電子顕微鏡技術」、P.137、平野寛・宮澤七郎、朝倉書店)。
試料支持台を用いる場合には、熱伝導率の高い材質からなるものであれば、特に限定されないが、例えば、銅、銀、カーボンナノチューブなどの材質が好ましい。また、試料支持台の寸法に関しては、実際に取り扱いやすいことや、より短時間で試料を凍結する観点から、その厚みとして25μm以下の範囲が好ましく、その面積として10mm2以下の範囲が好ましい。
化学固定法による、セットタイプヨーグルトの透過型電子顕微鏡用試料の調製
1.前固定
(1−1) セットタイプヨーグルトの組織を崩さないように注意しながら、1mm×1mm×1mm角に、カッターを用いて切り取る。
(1−2) 前固定液(2%のGA(グルタールアルデヒド)および2%のPFA(パラホルムアルデヒド)を含む0.1Mのリン酸緩衝液)を試料ビンに入れ、前記の切り取った試料を漬ける。
(1−3) 試料ビンを冷蔵庫(約4℃)へ入れ、2時間で保持して、前固定する。
(2−1) 前固定液を捨て、0.1Mのリン酸緩衝液にて30分間×3回で、液交換しながら洗浄する。
(2−2) 0.1Mのリン酸緩衝液を捨て、後固定液(2%のOsO4(四酸化オスミウム)を含む0.1Mのリン酸緩衝液)を試料ビン入れる。
(2−3) 試料ビンを冷蔵庫(約4℃)へ入れ、2時間で保持して、後固定する。
(3−1) 後固定液を捨て、0.1Mのリン酸緩衝液にて軽く洗浄する。
(3−2) 50%のエタノール(10分間、約4℃)、70%のエタノール(10分間、約4℃→約20〜25℃(室温))、90%のエタノール(10分間、室温)、99.5%のエタノール(10分間、室温)、無水エタノール(30分間×2回、室温)の順番で、試料ビンに入れ替え、試料の水分をエタノールに置換する。
(4−1) プロピレンオキサイド(PO)にて30分間×2回で保持して、エタノールを置換した後に、プロピレンオキサイド:樹脂(Quetol - 812)=7:3の混合液を試料ビンに入れて、樹脂を浸透させる。
(4−2) デシケータ内で、プロピレンオキサイドを揮発させ、樹脂(Quetol - 812)に包埋する。
(5−1) 樹脂に包埋された試料から、約70nmの超薄切片を作製する。
(5−2) 酢酸ウラニル染色液と鉛染色液で、タンパク質やリン脂質などを電子染色する。
急速凍結・凍結置換法による、セットタイプヨーグルトの透過型電子顕微鏡用試料の調製
1.急速凍結
(1−1) セットタイプヨーグルトの組織を崩さないように注意しながら、1mm×1mm×1mm角に、カッターを用いて切り取る。
(1−2) MAXTAFORM グリッドII HF51(英国 Pyser・SGエネ)のディスク上に、前記の切り取った試料を裁置し、その上に、もう1枚のディスクを裁置する。
(1−3) この下側のディスクを精密ピンセットで摘み、液化プロパン(約−175℃)に投下する。
(2−1) 固定液(2%のOsO4および2.5%の蒸留水を含むアセトン)を試料ビンに入れ、前記の急速凍結した試料を入れる。
(2−2) 試料ビンをドライアイスアセトン(約−80℃、48時間)で保持して、凍結置換する。
(2−3) 冷凍庫(約−25℃、4時間)、冷蔵庫(約4℃、1時間)の順番で温度を上昇させた後に、冷蔵庫から取り出して、室温に戻す。
(2−4) 無水アセトンで洗浄(15分間×3回)した後に、無水エタノールで置換(15分間×3回)する。
(3−1) プロピレンオキサイド(PO)にて30分間×2回で保持して、エタノールを置換した後に、プロピレンオキサイド:樹脂(Quetol - 812)=7:3の混合液を試料ビンに入れて、樹脂を浸透させる。
(3−2) デシケータ内で、プロピレンオキサイドを揮発させ、樹脂(Quetol - 812)に包埋する。
(4−1) 樹脂に包埋された試料の試料支持台から5〜10μmの位置を切り取り、約70nmの超薄切片を作製する。
(4−2) 酢酸ウラニル染色液と鉛染色液で、タンパク質やリン脂質などを染色する。
化学固定法による観察結果(図1)では、黒く着色されたタンパク質の繋がりが非常に緩く、空白となった脂肪部分との関係性を理解できないのに対して、急速凍結・凍結置換法による観察結果(図2)では、タンパク質の結合が綿密であることが確認でき、ヨーグルト本来の組織構造を観察できた。
寒天の凝固・化学固定法による、牛乳の透過型電子顕微鏡用試料の調製
(1) 均質化処理した牛乳を25℃まで加温し、あらかじめ湯水に溶解しておいた寒天を所定量で添加した。こうして得られた液体を冷却して凝固させた後に、1mm×1mm×1mm角に、カッターを用いて切り取る。
(2) 以下の工程は、比較例1における工程と同様である。
TEM(JEM 1200EX)にて、倍率10200倍で試料を観察・撮影した結果を図3に示す。
1.急速凍結・凍結置換法による、牛乳の透過型電子顕微鏡用試料の調製
(1−1) MAXTAFORM グリッドII HF51(英国 Pyser・SGエネ)のディスク上に、牛乳を約1μlで滴下し、EM - ファイングリッド F-400mesh(日新EM株式会社)を裁置し、その上に、もう1枚のディスクを裁置して挟み込む。
(1−2) この3層にサンドイッチしたグリッドを精密ピンセットで摘み、液化プロパン(約−175℃)に投下する。
(1−3) MAXTAFORM グリッドII HF51のディスクの1枚と、EM - ファイングリッド F-400meshをピンセットで剥がして、残り1枚のディスクを残す。
(2−1) 固定液(2%のOsO4および2.5%の蒸留水を含むアセトン)を試料ビンに入れ、前記の急速凍結した試料を入れる。
(2−2) 試料ビンをドライアイスアセトン(約−80℃、24時間)で保持して、凍結置換する。
(2−3) 冷凍庫(約−20℃、2時間)、冷蔵庫(約4℃、1時間)の順番で温度を上昇させた後に、冷蔵庫から取り出して、室温に戻す。
(2−4) 無水アセトンで洗浄(10分間×3回)する。
以下の工程は、実施例1における工程と同様である。
寒天の凝固・化学固定法による観察結果(図3)では、牛乳の各成分を観察できるが、タンパク質や脂肪が局在化しているため、牛乳本来の組織構造を観察できないのに対して、急速凍結・凍結置換法による観察結果(図4)では、タンパク質や脂肪の分布の様子を理解でき、牛乳本来の組織構造を観察できた。
タンパク質吸着法による、流動食の透過型電子顕微鏡用試料の調製
(1) 流動食を4倍に希釈して、1%のGA溶液で固定し、タンパク質を試料支持台に吸着させる。
(2) 液体を濾紙で吸い取り、乾燥させる。
(3) タンパク質を吸着させた試料支持台に、ゲルマニウムをシャドウイングする。
TEM(JEM 1200EX)にて、倍率5000倍で試料を観察・撮影した結果を図5に示す。
急速凍結・凍結置換法による、流動食の透過型電子顕微鏡用試料の調製
実施例2と同様の工程により、流動食の透過型電子顕微鏡用試料を調製した。
TEM(JEM 1200EX)にて、倍率10200倍で試料を観察、撮影した結果を図6に示す。
タンパク質吸着法による観察結果(図5)では、流動食においてタンパク質の存在している状態が不明であり、タンパク質と結合していない脂肪の状態を確認できないのに対して、急速凍結・凍結置換法による観察結果(図6)では、流動食に存在しているままの状態でタンパク質を観察でき、脂肪の存在する部分だけが明確な空白となるため、脂質の存在している状態も確認できた。
それぞれ組成の異なる流動食のサンプルA(1kcal/ml、株式会社明治)とサンプルB(1.5kcal/ml、株式会社明治)の組織構造を観察するため、実施例3と同様に調製した試料を観察した。それぞれの試料を、TEM(JEM 1200EX)にて、倍率10200倍および30200倍で観察・撮影した結果を図7および図8に示す。
サンプルAのタンパク質粒子は、小さく、いびつな形状である。サンプルAの脂肪球は、タンパク質粒子よりも小さい。
サンプルBのタンパク質粒子は、サンプルAと比較して大きく、完全な球状である。サンプルBの脂肪球は、サンプルAと比較して、ばらつきを平均すると、ほぼ大きさは同じであった。
高濃度の流動食であるサンプルBでは、一般的な濃度の流動食であるサンプルAと比較して、タンパク質粒子が大きく、完全な球状であり、タンパク質粒子が十分に溶解や分散していないと考えられた。一方、サンプルAとBでは、脂肪球の大きさがタンパク質粒子の大きさと比例しておらず、流動食の濃度とは無関係に、ほぼ大きさは同じであった。
粒径の測定において、サンプルBでは、サンプルAと比較して、約3倍の数値を示した。一般的に、粒度分布計を用いて測定した粒径は、脂肪球の大きさ(寸法)を表現する基準とされることが多い。しかし、本発明の方法により調製した流動食の試料の観察により、粒度分布計を用いて測定した粒径は、タンパク質粒子の大きさ(寸法)を強く反映し、タンパク質粒子の大きさを表現していることが示された。
一方、サンプルAでは、粘度が11mPa・sであり、サンプルBでは、20mPa・sであった。サンプルBでは、サンプルAと比較して、粘度が高かったが、この程度の粘度の差違では、沈殿の生成を抑制する効果が低く、タンパク質粒子の大きさが沈殿の生成へ大きく影響を与えていると考えられた。なお、サンプルAとBの保存中に、何れも脂肪の浮上は観察されなかった。
特に、タンパク質粒子の大きさが500nm以下、好ましくは300nm以下である流動食では、粘度に関わらず、サンプルAのように、その保存安定性が高いことが示された。
また、脂肪球の大きさが500nm以下、好ましくは300nm以下である流動食では、粘度に関わらず、サンプルAとBのように、その保存安定性が高いことが示された。
Claims (10)
- 液状またはゲル状食品を、急速凍結後に水分および脂肪を置換媒体で置換し、タンパク質およびリン脂質を電子染色することを含む、前記食品中のタンパク質粒子および脂肪球を区別して観察するために用いられる透過型電子顕微鏡用試料の調製方法。
- 液状またはゲル状食品を試料支持台の上に載置させて急速凍結させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 第1の試料支持台の上に液状またはゲル状食品を載置させ、その上に第2の試料支持台を載せて急速凍結することを含む、請求項2に記載の方法。
- 急速凍結の後に、一方の試料支持台を剥がし、凍結置換することを含む、請求項3に記載の方法。
- 試料支持台から5〜10μmの位置の試料を切り取ることを含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 水を含む固定液を用いて凍結置換させることを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 液状またはゲル状食品が、果汁、牛乳、加工乳、クリーム、植物性クリーム、乳飲料、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料、栄養成分および/または機能性成分を含んだ健康飲料、流動食、スープ、ソース、マヨネーズ、ドレッシング、ヨーグルト、生菓子、寒天、豆腐、蒟蒻、ゲル状・ゼリー状の栄養補助食品からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法により調製した試料を、透過型電子顕微鏡を用いて観察し、タンパク質粒子および脂肪球を区別して観察することを含む、液状またはゲル状食品の品質の評価方法。
- 品質が、保存安定性、食感および/または風味である、請求項8に記載の方法。
- 液状またはゲル状食品の保存安定性を評価する、請求項9に記載の方法。
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