JP6177130B2 - 第ｉｘ因子活性を有する融合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有する融合タンパク質に関するもので、より詳細には、非融合の天然型ＦＩＸと比較して２倍のＦＩＸ比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持つ、ＦＩＸおよびトランスフェリンを含む融合タンパク質、これをコードする遺伝子、上記遺伝子を含む組換えベクター及び上記組換えベクターを含む宿主細胞に関するものである。

血友病は、Ｘ染色体に存在する遺伝子の先天的あるいは遺伝的変異によって、血液中に存在する血液凝固因子が不足するようになって発症する出血性疾患である。血液中に存在する様々な凝固因子が連鎖反応によってフィブリンを形成し出血を防止することになるが、このような凝固因子のうち、第ＶＩＩＩ因子（第８凝固因子、ＦＶＩＩＩ）が足りなくなって発症する血友病をＡ型血友病と言い、第ＩＸ因子（第９凝固因子、以下ＦＩＸという）が足りなくなって発症する血友病をＢ型血友病と言う。

Ｂ型血友病は、ＦＩＸが不足したり、ＦＩＸ中に不活性分子が多かったりする場合、血液の凝固のための連鎖反応が起こらなくなって発症する。この場合、凝固因子の数値と出血の種類に応じて、様々な量のＦＩＸを注入して治療することになる。

治療のために注入されるＦＩＸは、人の血液から精製する方法と組換えＦＩＸタンパク質を製造する２つの方法によって生産されている。組換えタンパク質の場合、量産は可能だが、血漿分画タンパク質に比べて活性および安定性が落ちるという短所がある。

これを改善するために、ランダム突然変異法（ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、構造活性関係（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）または糖化（ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）などの試みがあったが、特別な効果を示せないのが実情である。

トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）は、血液中の鉄イオンを運搬する血漿タンパク質であって、血中で３番目に多い量で存在し、アルブミンや免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）よりは短いが、８日という比較的長い半減期を有し、トランスフェリン受容体媒介の循環をする特徴がある。従来、トランスフェリンをいくつかのタンパク質の融合パートナーとして使用した例はあるが、ＦＩＸとの融合に使用した例は全くなく、これによる効果もまた報告されていない。

そこで、本発明者らは、ＦＩＸの活性および安定性を増加させようと努力している中、ＦＩＸに直接トランスフェリンを融合したり、リンカーを介して融合する場合、非融合の天然型ＦＩＸに比べて比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）および血中安定性が著しく上昇していることを確認したことにより、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、天然型の第ＩＸ因子の生物学的活性を保持する融合タンパク質を提供することである。

本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供することである。

本発明のもう一つの目的は、前記組換えベクターを含む宿主細胞を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、ヒト由来の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）とヒト由来のトランスフェリンを含む融合タンパク質を提供する。

上記他の目的を達成するために本発明は、上記融合タンパク質配列をコードする遺伝子を提供する。

上記また他の目的を達成するために本発明は、上記の遺伝子を含んでいる組換えベクターを提供する。

上記また他の目的を達成するために本発明は、上記組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明に係るＦＩＸ活性を有する融合タンパク質は、天然型ＦＩＸに比べて高いＦＩＸの生物学的活性を有しているため、ＦＩＸを用いた治療において有効に用いることができる。

図１の（ａ）は、重複ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を利用してＦＩＸ断片を製造する過程を示す模式図であり、図１の（ｂ）は、イントロン１の構造と短編Ｂを修得する過程を示す模式図である。 図２は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターおよびトランスフェリン（Ｔｆ）の配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターからＦＩＸ−Ｔｆ発現ベクターを製造する過程を示す模式図である。 図３は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクターを製造する過程を示す模式図である。 図４は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ、およびＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクターを製造する過程を示す模式図である。 図５は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸａ−ＴｆとＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸＩａ−Ｔｆ発現ベクターを製造する過程を示す模式図である。 図６は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−アルブミン発現ベクターを製造する過程を示す模式図である。 図７は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ（リンカーなし）、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸａ−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸＩａ−ＴｆとＦＩＸ（ＫＯＩ）発現ベクターのウエスタンブロッティングの結果を示す。 図８ａは、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ（リンカーなし）、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸａ−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸＩａ−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−Ａｌｂｕｍｉｎ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）発現ベクターとｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏベクターを用いて発現されたＦＩＸの活性をＥＬＩＳＡ法および色素形成能（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の分析で確認した結果である。 図８ｂは、図８ａの結果から計算されたＦＩＸの比活性を示すものである。 図８ｃは、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ｄｅｌ−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）発現ベクターおよびｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏベクターを用いて発現されたＦＩＸの活性をＥＬＩＳＡ法および色素形成能（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の分析で確認した結果である。 図８ｄは、図８ｃの結果から計算されたＦＩＸの比活性を示すものである。

本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびトランスフェリンを含む融合タンパク質を提供する。

本発明の融合タンパク質のＦＩＸおよびトランスフェリンは、任意の哺乳動物、好ましくは、ヒト由来のもので有り得る。より好ましくは、上記ＦＩＸおよびトランスフェリンは、ヒトの血液から発見される各々の天然型タンパク質と９５％以上の相同性を持つもので有り得る。最も好ましくは、上記ＦＩＸは配列番号１のアミノ酸配列を持ち、トランスフェリンは配列番号２のアミノ酸配列を持つものでよい。

また、本発明の融合タンパク質には、実質的に同等の機能的活性を持つ機能的同等物または機能的誘導体が含まれる。このような機能的同等物の例として、配列番号１および２で表示されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的に置換されるか、またはこれらの組み合わせによって変異した変異体を含むことができ、この際、当該変化は、ＦＩＸの生物学的活性を付与する活性部位または活性ドメインを実質的に変化させることはない。

場合によっては、本発明の融合タンパク質は、これらの物理、化学的性質を増加または減少させる変形を持つことができ、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されることができ、これらの修飾によってＦＩＸの活性が実質的に維持される限り、このような機能的誘導体も本発明の範囲に含まれる。

上記融合タンパク質において、ＦＩＸおよびトランスフェリンの結合手順は、例えば、ＦＩＸのＣ−末端にトランスフェリンのＮ−末端が結合するもので有り得る。

本発明は、上記融合タンパク質が、ＦＩＸとトランスフェリンとの間にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）をさらに含む融合タンパク質を提供する。上記リンカーは、ＦＩＸのＣ−末端とトランスフェリンのＮ−末端との間に存在し得る。

上記リンカーは、両融合パートナーの潜在的干渉を最小化して融合タンパク質のＦＩＸ活性を増加させることができる。リンカーは、１個〜１００個のアミノ酸を有することが好ましいが、これに制限されることはなく、ＦＩＸとトランスフェリンとを分離させることのできるいずれのペプチドでも可能である。上記リンカーを構成するアミノ酸配列に特別な制限はないが、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を繰り返しまたはランダムなパターンで含むことが望ましい。そのような例として、上記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）_Ｎ（Ｎは１以上の整数、好ましくは１〜２０の整数である）のアミノ酸配列を含むことができ、より好ましくは、配列番号３または４のアミノ酸配列を有するものであり得る（表２参照）。

また、上記リンカーは、損傷した組織において豊富に存在するプロテアーゼによって認識できる、プロテアーゼ切断部位を含むことができる。上記切断部位は、トロンビン、因子Ｘａおよび因子Ｘｉａからなる群より選択されるプロテアーゼによって切断され得る。このようなプロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質は、作用部位（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｉｔｅ）においてＦＩＸおよびトランスフェリンそれぞれのタンパク質に分離されて、個々のタンパク質として機能することになる。好ましくは、上記リンカーは、配列番号５〜１１のアミノ酸配列を有してもよい（表２参照）。

本発明によるＦＩＸ−トランスフェリン融合タンパク質は、非融合の天然型ＦＩＸに比べ１．５倍以上のＦＩＸ比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。本発明の一実施態様によると、非融合の天然型ＦＩＸの比活性に比べて、本発明による特定の融合タンパク質は、約０．５倍〜２倍向上されたＦＩＸ比活性を有する（表３、４および図８ｂ、８ｄを参照）。

本発明はまた、上記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。

上記融合タンパク質をコードする遺伝子は、コドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、または上記融合タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、上記融合タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に対して様々な変形が可能で、コーディング領域を除いた部分においても、タンパク質の発現に影響を及ぼさない範囲内で様々な変形または修飾ができ、そのような変形遺伝子もまた本発明の範囲に含まれる。

好ましくは、上記遺伝子は、第ＩＸ因子の発現を増加させるための、ＦＩＸのイントロンの一部を含むことができる。より好ましくは、ＦＩＸのエキソン１の８８ｂｐに対応する部分に、ＦＩＸのイントロン１の５’末端の９８１ｂｐおよび３’末端の４４３ｂｐを含むことができる。

また、本発明による上記遺伝子は、リンカー部位をコードする遺伝子を含むことができる。

本発明において、融合タンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号１２〜２１の塩基配列で表される遺伝子である。本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、これを発現するベクターによって提供することができる。

本発明は、上記融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。

本発明において、“ベクター”とは、宿主細胞に融合タンパク質をコードするＤＮＡを導入して、融合タンパク質を発現させるための手段を指し、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター、およびウイルスベクター等を含む通常の全てのベクターを含み、好ましくはプラスミドベクターである。

適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーのような発現調節エレメントの外、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含んでおり、目的に応じて多様に製造され得る。開始コドンおよび終止コドンは、遺伝子組換え作物が投与されたとき、個体において必ず作用を表す必要があり、コード配列とインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）にあらなければならない。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。ベクターは、自己複製したり、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたりすることができる。

具体的には、本発明による組換え発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏベクターに上記融合タンパク質配列をコードする遺伝子を挿入して製造することができる。

また、本発明は、上記組換え発現ベクターで形質転換されて融合タンパク質を生産する宿主細胞を提供する。

宿主細胞に応じてタンパク質の発現量と修飾などが異なって現れるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して用いる。宿主細胞としては、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）、ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ２１）、ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）などが挙げられるが、これに制限されるものではない。

本発明に係る組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させるために、当分野に公知の方法を用いることができ、このような方法には、電気ショック遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿法および塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿法などが含まれるが、これに制限されない。

（実施例）
以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

―実施例１：ＦＩＸ発現ベクターの製造―
ＦＩＸ発現ベクターを製造するために、図１ａに示すようにＦＩＸタンパク質をコードするポリヌクレオチド断片Ｅを作製した。上記断片ＥはＦＩＸの発現効率を高めるために、ＦＩＸのエキソンにＦＩＸイントロンの一部を挿入して作製した。つまり、ＦＩＸイントロン１の５’末端９８１ｂｐおよび３’末端４４３ｂｐの部分をＦＩＸエキソン１の８８ｂｐに対応する部分に添加した（ＪＢＣ、ｖｏｌ．２７０、ｐ．５２７６−５２８１）。具体的な製造過程は、下記の通りである。

＜１−１＞断片Ａの製造
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｌａｃＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に配列番号１のＦＩＸ（ｋｏｚａｋ＋ＯＲＦ）を挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１ ＦＩＸ ｐＤＮＡを得た。具体的には、コザーク配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｇ）を含むことができる順方向プライマー（Ｆ１、配列番号２２）と逆方向プライマー（Ｒ１、配列番号２３）とを作製し、ＨｅｐＧ２においてＰＣＲを行い、ＦＩＸ（ｋｏｚａｋ＋ＯＲＦ）を得た。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５６℃でアニールして、６８℃で３分間延長する過程を３０サイクル反応させて行った。上記ＰＣＲ産物をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社のｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）にクローニングした後、塩基配列を確認した。確認されたベクターを鋳型にして、順方向プライマー（Ｆ２、配列番号２４）と逆方向プライマー（Ｒ２、配列番号２５）とを用いてＰＣＲを行い、ＦＩＸ（ｋｏｚａｋ＋ＯＲＦ）挿入体を得た。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５８℃でアニールし、６８℃で３分間延長する過程を１サイクルとして３０サイクル反応させ行った。このようにして得た挿入体をＢａｍＨ１／Ｓｐｅ１で処理した後、ＢａｍＨ１／Ｘｂａ１酵素で処理したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｌａｃＺに、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションを行い、“ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）”発現ベクターを製造した。

上記ｐｃＤＮＡ３．１ ＦＩＸ ｐＤＮＡを鋳型とし、センスプライマー（Ｆ３、配列番号２６）とアンチセンスプライマー（Ｒ２、配列番号２５）およびｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いてＰＣＲを行い、図１ａの断片Ａを得た。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５８℃でアニールして、６８℃で２分間延長する過程を３０サイクル反応させて行った。

＜１−２＞断片Ｂの製造
図１ｂに示す方法に基づいてＦＩＸのイントロン１（“イントロンＦ１＋Ｘ＋イントロンＦ２”で構成）から、図１ａの断片Ｂ（“イントロンＦ１の一部＋イントロンＦ２”で構成）を製造した。具体的には、ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、センスプライマー（Ｆ４、配列番号２７）およびアンチセンスプライマー（Ｒ３、配列番号２８）を用いてＰＣＲを行い、イントロンＦ２ ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５８℃でアニールして、６８℃で２分間延長する過程を３０サイクル反応させて行った。上記イントロンＦ２ＰＣＲ産物に、センスプライマー（Ｆ５、配列番号２９）とアンチセンスプライマー（Ｒ３、配列番号２８）およびｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いてＰＣＲを行い、イントロンＦ１の一部とイントロンＦ２とで構成された断片Ｂを得た。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５８℃でアニールして、６８℃で２分間延長する過程を３０サイクル反応させ行った。

＜１−３＞断片Ｃの製造
実施例＜１−１＞および＜１−２＞で製造された断片ＡおよびＢに、センスプライマー（Ｆ５、配列番号２９）とアンチセンスプライマー（Ｒ２、配列番号２５）およびｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いてＰＣＲを行い、イントロンＦ１の一部とイントロンＦ２およびエキソンＦ２から構成された断片Ｃを得た。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５８℃でアニールさせ、６８℃で３分間延長する過程を３０サイクル反応させ行った。

＜１−４＞断片Ｄの製造
エキソンＦ１とイントロンＦ１とに設定された断片Ｄを製作するために、ＨＥＫ ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、センスプライマー（Ｆ６、配列番号３０）とアンチセンスプライマー（Ｒ４、配列番号３１）とを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いて５８℃でアニールして、６８℃で２分間延長する過程を３０サイクル反応させ行った。

＜１−５＞短編Ｅの製造
実施例＜１−３＞および＜１−４＞で製造された断片ＣおよびＤに、センスプライマー（Ｆ６；配列番号３０）とアンチセンスプライマー（Ｒ２；配列番号２５）およびｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５ｕｎｉｔ／ｕｌ＃６００２５２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、５８℃でアニールして、６８℃で３分間延長する過程を３０サイクル反応させ行った。上記ＰＣＲ産物をプロメガ社のｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）にクローニングし、断片Ｅの配列を確認した。上記断片は、コザック（ｋｏｚａｋ）配列とＯＲＦおよびイントロン１の一部から構成されており、これを“ＦＩＸ（ＫＯＩ）”と命名した。

＜１−６＞発現ベクターの製造
前記実施例＜１−５＞で得られたＦＩＸ（ＫＯＩ）に、センスプライマー（Ｆ２、配列番号２４）とアンチセンスプライマー（Ｒ５、配列番号３２）とを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を９８℃で３０秒間反応させ、９８℃で１０秒、５８℃で４５秒、７２℃で２分間反応させることを１サイクルとして３０サイクル反応させた後、７２℃で７分間反応させて終了した。上記ＰＣＲ産物をＢａｍＨ１およびＸｈｏ１で処理して、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏベクターを同じ酵素で処理した後、Ｔ４ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行い“ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）”発現ベクターを製造した。

上記ＦＩＸ（ＫＯＩ）発現ベクターを製造するために、ＰＣＲに使用したプライマーを下記表１に示した。

−実施例２：ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ）の製造−
ＦＩＸ（ＫＯＩ）にヒトトランスフェリン（Ｔｆ）を連結させた融合タンパク質を発現するベクターを製造した。

上記発現ベクターの製造過程を図２に示した。具体的には、実施例１で製造したｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）発現ベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、ＦＩＸ（ＫＯＩ）断片を増幅させた。この時、ＦＩＸ（ＫＯＩ）の終止コドンを除去し、様々なサイズのリンカーをＦＩＸ（ＫＯＩ）とＴｆとの間に挿入させるためにＡｇｅ１部位（ＡＣＣＧＧＴ）およびＸｈｏ１部位（ＧＡＧＴＣＴ）を含むプライマーとして、トレオニン（Ｔｈｒ）およびグリシン（Ｇｌｙ）に翻訳されるＢｇｌ２部位を内包するセンスプライマー（Ｆ７；配列番号３３）、およびＡｇｅ１とＸｈｏ１部位を内包し、終止コドンを除去するアンチセンスプライマー（Ｒ６；配列番号３４）を用いた。また、ＰＣＲのポリメラーゼとしてＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を用いた。５０μＬの反応液（１μＬベクター鋳型、２μＬのプライマーＦ７およびＲ６（各１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、１０μＬの５ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰ、０．５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼおよび３５．５μＬの水）を９８℃で３０秒間反応させ、９８℃で１０秒、５８℃で４５秒、７２℃で２分間反応させることを１サイクルとして３０サイクル反応させた後、７２℃で７分間反応させて終了した。増幅されたＰＣＲ産物（ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ａｇｅ１−Ｘｈｏ１）をＢｇｌ２およびＸｈｏ１で３７℃にて処理して切断し、ＢａｍＨ１およびＸｈｏ１で処理したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏベクターにクローニングした。

一方、ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）を得るために、ヒトトランスフェリンがクローニングされたｐＣＭＶ６−ＮＥＯベクターを用意した。具体的には、ヒトＣ−タイプトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０６３．２）のｃＤＮＡをＯｒｉｇｅｎｅ社（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｃａｔ＃：ＳＣ３２２１３０）から購入した後、シークエンシングして塩基配列を確認し、そこからＧＡＴ→ＡＡＴ（Ａｓｐ１９７Ａｓｎ）およびＣＣＡ→ＣＡＡ（Ｐｒｏ３３２Ｇｌｎ）の突然変異があることを発見した。突然変異した配列を、ＰＣＲベースの突然変異法（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて変異誘発プライマーＦ８、Ｒ７、Ｆ９、Ｒ８（配列番号３５〜３８）を使用して復元させた。上記ＰＣＲは、２０μＬの反応液（１μＬヒトｃＤＮＡクローンを含むプラスミドＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｃａｔ＃：ＳＣ３２２１３０）、１μＬのＦ８またはＲ７プライマー（１０μＭ）、１μＬのＦ９またはＲ８プライマー（１０μＭ）、０．４μＬ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、２μＬ １０Ｘ Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＰＣＲ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１４．２μＬの蒸留水および０．４μＬのＰｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃６００２５２、２．５ｕｎｉｔｓ／μＬ）を９４℃で５分間反応させ、９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１０．５分反応させることを１サイクルとして１７サイクル反応させた後、７２℃で７分間反応させることによって終了させた。突然変異していないプラスミド鋳型を除去するために、ＰＣＲ生成物を制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＢ、＃Ｒ０１７６Ｓ）で、３７℃で１時間処理した。合成したベクターをＥ．ｃｏｌｉ（ＨＩＴ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ、ＤＨ５α、＃ＲＨ６１７）において増幅させ、ＤＮＡの準備（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）および制限酵素処理により選別した。選別された陽性クローンをＦ１０、Ｒ９、Ｆ１１、Ｒ１０、Ｆ１２、Ｒ１１、Ｆ１３、Ｒ１２、Ｆ１４およびＰｒｉｍｅｒ ＸＬ３９（Ｏｒｉｇｅｎｅ）（配列番号３９〜４８）を用いてＤＮＡシーケンシングで確認した。確認の結果、コード部位において存在していた突然変異は復元されており、配列はヒトトランスフェリンｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＮＭ＿００１０６３．２）と完全に一致した。上記ヒトトランスフェリンｃＤＮＡを鋳型にして、センスプライマー（Ｆ１５、配列番号４９）、アンチセンスプライマー（Ｒ１３、配列番号５０）およびＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、プライマー２０ｐｍｏｌのＦ１５および２０ｐｍｏｌのＲ１３を用いたことを除いては、上記ＦＩＸ（ＫＯＩ）ＰＣＲの反応条件と同様に行った。増幅されたＰＣＲ産物（Ｔｆ）を、Ａｇｅ１およびＸｈｏ１で３７℃にて処理して、上記で製造されたＦＩＸ（ＫＯＩ）がクローニングされているｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏベクターを同じ制限酵素で処理した後、ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）しＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを製造した。

−実施例３：ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ−Ｔｆ発現ベクターの製造−
ＦＩＸ（ＫＯＩ）とＴｆとをリンカーで連結した融合タンパク質を発現するベクターを製造した。上記リンカーとして、４つのグリシンおよび１つのセリンからなるペプチド（GGGGS）を基本リンカー単位として使用し、これらの単位を繰り返して連結した、より長い長さのリンカーを製造した。上記リンカーを“ＧＳ”リンカーと命名し、繰り返し単位が１であるリンカーをＧＳ１（または１ＧＳ）にして繰り返し単位の数に応じてＧＳ２（または２ＧＳ）、ＧＳ３（または３ＧＳ）、ＧＳ４（または４ＧＳ）などで表示した。本実施例では、ＧＳ１、ＧＳ７およびＧＳ１５リンカーを使用した。

＜３−１＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ）の製造
ＦＩＸ（ＫＯＩ）とＴｆがＧＳ１リンカーで接続された融合タンパク質を発現するベクターを下記のように製造した。上記の製造過程を図３に示した。

具体的に、ＧＳ−１リンカーにＴｆを接続させることにおいては、Ｆ１６（配列番号５１）とＲ１３（配列番号５０）プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を９８℃で３０秒間反応させ、９８℃で１０秒、５８℃で４５秒、７２℃で２分間反応させることを１サイクルとして３０サイクル反応させた後、７２℃で７分間反応させて終了させた。増幅されたＰＣＲ生成物を鋳型にして、センスプライマー（Ｆ１７、配列番号５２）、アンチセンスプライマー（Ｒ１３、配列番号５０）とＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を使用してＰＣＲを行い、ＧＳ１−Ｔｆ断片を増幅させた。上記のＰＣＲ条件は、実施例２のＴｆ ＰＣＲ反応条件と同様に行った。増幅されたＰＣＲ産物（ＧＳ１−Ｔｆ）をＡｇｅ１とＸｈｏ１で３７℃にて処理し、ＦＩＸ（ＫＯＩ）がクローニングされているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋ベクターをＡｇｅ１およびＳａｌ１で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションした。この時に使ったＦＩＸ（ＫＯＩ）がクローニングされているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋は次の通り作製した。実施例２においてと同様、ＦＩＸの終止コドンを除去し、増幅されたＰＣＲ産物（ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ａｇｅ１−Ｘｈｏ１）を製作し、ＢａｍＨ１制限酵素のみを処理した後、ＢａｍＨ１／ＥｃｏＲＶで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋にＴ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションして作製した。

ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ断片をｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏベクターに挿入させるために、前記製造されたベクターを鋳型としてセンスプライマー（Ｆ７；配列番号３３）、アンチセンスプライマー（Ｒ１３；配列番号５０）およびＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を使用してＰＣＲを行い、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ断片を増幅させた。上記ＰＣＲ条件は、プライマーＦ７ ２０ｐｍｏｌおよびＲ１３ ２０ｐｍｏｌを使用したことを除いては、実施例２のＴｆ ＰＣＲ反応条件と同様に行った。上記増幅されたＰＣＲ産物（ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ）をＢｇｌ２およびＸｈｏ１で３７℃にて２時間処理し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏベクターをＢａｍＨ１およびＸｈｏ１で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションし、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを製造した。

＜３−２＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ）の製造
ＦＩＸ（ＫＯＩ）およびＴｆがＧＳ１５リンカーで接続された融合タンパク質を発現するベクターを、図４のプロセスに基づいて製造した。

具体的には、ＧＳ１５リンカーがサブクローニングされているベクターをＡｇｅ１で処理してＧＳ１５リンカー断片を確保して、実施例２において製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションし、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ発現ベクターを製造した。

−実施例４：トロンビン切断部位を持つＧＳリンカーを含むＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターの製造−
＜４−１＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ）の製造
ＧＳ１およびトロンビン切断部位（ＴＨＲ）を持つＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、図４のプロセスに従って製造した。

具体的には、ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１がサブクローニングされたベクター（ＳＫケミカル）をＡｇｅ１で３７℃にて処理してＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１断片を確保して、実施例２において製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲースを使用してライゲーションし、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクターを製造した。

＜４−２＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ）の製造
ＧＳ７およびＧＳ７リンカーの間にトロンビン切断部位（ＴＨＲ）を持つＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、図４のプロセスに従って製造した。

具体的には、ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７がサブクローニングされたベクター（ＳＫケミカル）をＡｇｅ１で３７℃にて処理してＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７断片を確保して、実施例２において製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、同じ制限酵素で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲースを使用してライゲーションし、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクターを製造した。

＜４−３＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ｄｅｌ−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ｄｅｌ−Ｔｆ）の製造
実施例４−１で製造したＧＳ１およびトロンビン切断部位（ＴＨＲ）を持つ発現ベクターから、リンカーとＴｆとの間を接続するＡｇｅ１制限酵素配列を除去した。

具体的には、実施例４−１で製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクターを、実施例２において記述されたＰＣＲベースの突然変異法（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用してＡｇｅ１制限酵素を除去した。変異誘発プライマーＦ１８およびＲ１４（配列番号５３および５４）を使用して合成したベクターをＥ．ｃｏｌｉ（ＨＩＴ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ、ＤＨ５α、＃ＲＨ６１７）で増幅させてＤＮＡの準備（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）および制限酵素処理により選別した。選別された陽性クローンを、プライマーＦ１９（配列番号５５）を使用してＤＮＡシーケンシングでＡｇｅ１制限酵素の除去を確認した。

−実施例５：ＦＸａ切断部位を持つＧＳリンカーを含むＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターの製造−
＜５−１＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸａ−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸａ−Ｔｆ）の製造
ＧＳ１リンカーおよびＦＸａ切断部位（ＦＸａ）を持つＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、図５のプロセスに従って製造した。

具体的には、ＦＸａ切断部位を成す二つの相補的配列であるＯａ（配列番号５６）およびＯｂ（配列番号５７）をそれぞれ１００ｐｍｏｌおよび５ｕｌをとり、７２℃で１０分間反応させ、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）した後、Ｂｇｌ２およびＢａｍＨ１で３７℃にて３０分間処理した。一方、実施例＜３−１＞で製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクターをＢａｍＨ１で処理してＧＳ１と接続されたＴｆ断片（Ｔｆ−１とする）を除去して、上記で製造したＦＸａ切断部位とＴ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションした。ＦＸａ切断部位が順方向にきちんとクローニングされたことを確認した後、ＢａｍＨ１の制限酵素で処理し除去していた短編Ｔｆ−１をＢａｍＨ１部位にＴ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を使用して再度ライゲーションした。

＜５−２＞ ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ）の製造
二つのＧＳ７リンカーの間にＦＸａ切断部位を有するＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、図４のプロセスに従って製造した。

具体的には、ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７がサブクローニングされたベクターをＡｇｅ１で３７℃にて処理しＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７断片を確保して、実施例２において製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲースを使用してライゲーションし、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクターを製造した。

上記で使用されたＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７がサブクローニングされたベクターは以下のように作製した。ＦＸａによって切断されるアミノ酸配列であるＩＥＧＲを含むプライマーＯａ（配列番号５６）とＯｂ（配列番号５７）を合成した。製作したそれぞれのプライマー５ｕｌ（１００ｐｍｏｌｅ／ｕＬ）を７２℃で１０分間加熱し、冷却させアニーリングした。このようにして得られたリンカーを７ＧＳがｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏにクローニングされているベクター（ＳＫケミカル）をＢａｍＨ１とＨｐａ１との制限酵素で順次処理したベクターにＴ４ ＤＮＡライゲースを使用してライゲーションした。前記製造されたベクターをＢａｍＨ１とＨｐａ１とで処理して、７ＧＳとＴＦとを含む挿入体をＢｇｌ２とＨｐａ１の制限酵素で処理した後、これをＴ４ ＤＮＡライゲースを用いて前記ベクターにライゲーションした。ここで使用された挿入体は、７ＧＳがｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏにクローニングされているベクターを鋳型にしてＦ１６（配列番号５１）とＲ１３（配列番号５０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を用いて５８℃でアニーリングし、６８℃で２分間延長する過程を３０サイクル反応させて行った。ＰＣＲ生成物をＢｇｌ２とＨｐａ１とで処理した後、ゲル抽出して使用した。

−実施例６：ＦＸＩａ切断部位を持つＧＳリンカーを含むＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターの製造−
＜６−１＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸＩａ−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸＩａ−Ｔｆ）の製造
ＧＳ１リンカーおよびＦＸＩａ切断部位（ＦＸＩａ）を持つＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、図５のプロセスに従って製造した。

具体的には、ＦＸＩａ切断部位を成す二つの相補的な配列であるＯｃ（配列番号５８）およびＯｄ（配列番号５９）をそれぞれ１００ｐｍｏｌおよび５ｕｌを、７２℃で１０分間反応させアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）した後、ＢａｍＨ１で３７℃にて３０分間処理した。一方、実施例＜３−１＞で製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ発現ベクターをＢａｍＨ１で処理してＧＳ１と接続されたＴｆ断片（Ｔｆ−１とする）を除去して、上記で製造したＦＸＩａ切断部位とＴ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）とを用いてライゲーションした。ＦＸＩａ切断部位が順方向にきちんとクローニングされたことを確認した後、ＢａｍＨ１の制限酵素で処理して除去していた短編Ｔｆ−１をＢａｍＨ１ ｓｉｔｅでＴ４ ＤＮＡライゲース（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を使用して再度ライゲーションした。

＜６−２＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ）の製造
ＧＳ７およびＧＳ７リンカーとの間にＦＸＩａ切断部位を持つＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを、図４のプロセスに従って製造した。

具体的には、ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７がサブクローニングされたベクターを、Ａｇｅ１で３７℃にて処理してＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７断片を確保して、実施例２で製造したＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲースを使用してライゲーションし、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクターを製造した。一方、上記で使用されたＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７がクローニングされているベクターは、実施例５の５−２に記述したＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ発現ベクターを作製する方法において、ＦＸＩａによって切断されるアミノ酸配列であるＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦを示すプライマーＯｃ（配列番号５８）とＯｄ（配列番号５９）とを用いたことを除いて同じように実験して製造した。

−比較例１：ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−アルブミン発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−Ａｌｂｕｍｉｎ）の製造−
米国特許２００９００４２７８７ Ａ１号に開示されたＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−アルブミン融合タンパク質を、図６のプロセスに従って製造した。まず、ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型にして遺伝子特異プライマーＦ２０およびＲ１５（配列番号６０および６１）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりヒトアルブミンｃＤＮＡを得た。上記のＲＴ−ＰＣＲは、１０μＬ逆転写反応液（１μＬ１０Ｘ逆転写酵素緩衝液、０．６μＬ オリゴ−ｄＴプライマー、１μＬ ｄＮＴＰ、０．４μＬ 水、および５μＬ ヒト肝臓ｍＲＮＡ（１０ｎｇ／μＬ））を６５℃で５分、室温で５分間反応させた後、１００ｍＭ ＤＴＴ １μＬおよび逆転写酵素緩衝液１μＬを入れ、４２℃で１時間反応させた。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＦ２０およびＲ１５を使用して、ヒトアルブミン配列を確保した。ＰＣＲは、５０μＬ反応液（１μＬｃＤＮＡ、１０μＬ５ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、プライマーＦ２０とＲ１５を各１μＬ、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＬＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ、＃Ｆ−５３０Ｓ ２ｕｎｉｔｓ／μＬ）、３５．５μＬの水）を９８℃で１分間反応させ、９８℃で１０秒、６２℃で３０秒、７２℃で６０秒反応させることを１サイクルとして３０サイクル反応させた後、７２℃で７分反応させることにより終了させた。一方、米国特許２００９００４２７８７ Ａ１号に開示のＧＳリンカーＧ６Ｖ（ＧＧＧＧＧＧＶ）を示すアミノ酸配列を作るためにＦ２１（配列番号６２）およびアルブミンの配列全体をＰＣＲできるプライマーＲ１６（配列番号６３）を用いて、上記で得られたアルブミンを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、２ｕｎｉｔｓ／μＬ、＃Ｆ−５３０Ｓ）を用いて５８℃でアニールして、６８℃で２分間延長する過程を３０サイクル反応させて行った。ＰＣＲ生成物をＡｇｅ１とＸｈｏ１とで処理して、挿入体を準備し、実施例２のＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ａｇｅ１−ＴＦをＡｇｅ１とＸｈｏ１との制限酵素で処理してベクターとして用意し、上記挿入体とベクターをＴ４ ＤＮＡライゲス（Ｔａｋａｒａ、＃２０１１Ａ）を用いてライゲーションした。

上記実施例および比較例で製造した発現ベクターの特徴を下記表２に示した。

−実験例１：融合タンパク質の形質感染および発現−
＜１−１＞融合タンパク質の形質感染
実施例２〜実施例６のＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ発現ベクターおよび比較例１のＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−Ａｌｂｕｍｉｎ発現ベクターをＶＫＯＲＣ１（ビタミンＫエポキシド還元複合体サブユニット１）を安定的に発現するＣＨＯ細胞株であるＣＨＯ−ＤＧ４４（ＶＫ２）細胞に形質感染させ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＶＫ２）は、インビトロゲン社のＣＨＯ−ＤＧ４４ｃｅｌｌにＶＫＯＲＣ１発現ベクターを挿入して、独自に製作した。

具体的には、実施例２〜実施例５及び比較例１の発現ベクターを合成したベクターをＥ．ｃｏｌｉ（ＨＩＴ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ、ＤＨ５α、＃ＲＨ６１７）で増幅させてエンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）排除エンドトキシンフリーマキシプレップキット（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｆｒｅｅ ｍａｘｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ＃１２３６２）を用いて、各々の発現ベクターを抽出した。発現対照群としてｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏベクターおよび実施例１で製造したｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ−ＦＩＸ（ＫＯＩ）ベクターを使用した。

上記ベクターを動物細胞に形質感染させるため下記のように動物細胞を用意した。ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＶＫ２）細胞を１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、＃１４−５０１Ｆ）、１Ｘ ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１０６７−０３０）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、＃１７−６０５Ｅ）および２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１０６８７−０１０）を追加したα−ＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、＃１２−１６９Ｆ）培地で４８時間培養した後、培地を遠心分離して浮遊細胞を除去した。上記細胞を６−ウェルプレートに１．５×１０^６細胞／ウェルの濃度で播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。上記細胞を培地で２４時間培養した後、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ ｎｏ．１１６６８−０１９）を利用して、メーカーの手引きに従って形質感染させた。ウェル当り形質感染ＤＮＡの量および比率は、ＦＩＸ（ＫＯＩ）誘導体ＤＮＡ ３μｇ：β−ガラクトシダーゼＤＮＡ １μｇで使用した。形質感染４時間後、前記培養液を無血清培養液（ＯｐｔｉＭＥＭ）に置き換えて、５μｇ／ｍｌのビタミンＫを追加しました。培養４８時間後、培養液をサンプリングし、−７０℃で保存した。

＜１−２＞ウェスタンブロット法による発現の解析
ブラッドフォード分析を介して前記実験例＜１−１＞で製造した試料のタンパク質を定量した後、４ｘ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＮＰ０００８）と７ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡｆｒｅｅ、＃１ ８３６ １７０）とを使用して、総タンパク質の濃度が１μｇ／μＬになるように調整した。上記の試料１０μＬを４％〜１２％のゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ）にロードし、電気泳動した。電気泳動が終わったゲルをニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ、ＰＲＯＴＲＡＮ＃ＢＡ８３）に移転させた後、上記移転された幕をオムニトレイ（ｏｍｎｉｔｒａｙ）に移し、ブロッキング溶液（３％ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳ ｗｉｔｈ ０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）を添加して、ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）で１時間ブロッキングした。その後、一次抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ＃ＣＬ２００４０ＡＰ）を４℃で１２時間反応させてタンパク質に結合させ、二次抗体（ａｎｔｉ ｇｏａｔ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ＃ＳＣ−２３５０）を室温で１時間反応させ結合させた後、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＥＣＬ溶液ミックス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＲＰＮ１２３２）を利用して、フィルムに現像した。

ウエスタンブロッティングの結果を図７に示した。図７に示すように、本発明に係るＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質は、発現され断片化されず、予想した大きさを持つことが分かった。

−実験例２：ＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の測定−
＜２−１＞ＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質誘導体群（ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１５−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＴＨＲ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸａ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ７−ＦＸＩａ−ＧＳ７−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸａ−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＦＸＩａ−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−Ａｌｂ）と天然型ＦＩＸ（ＫＯＩ）の比活性の測定
実験例１のＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質試料および円ＦＩＸ（ＫＯＩ）を対象に、比活性を測定した。具体的には、試料をＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｐａｉｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｌｉｓａ−Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、ＣＬ２００４１Ｋ、Ｌｏｔ ＥＩＡ９−００２５Ｒ１）を利用して、ＦＩＸタンパク質（抗原）の量を測定し、ＢＩＯＰＨＥＮ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ分析キット（ＨＹＰＥＮ ＢｉｏＭｅｄ、Ｒｅｆ ．２２１８０２）を利用して、ＦＩＸの色素形成能（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の分析を行い、凝固活性（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。標準ヒト血漿（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＲＥＦ ＯＲＫＬ１３、Ｌｏｔ ５０３２１４Ｅ）の量の分析において対照群として使用し、これを１／１００（１００％）から１／３２００（３．１３％）まで１／２ずつ連続希釈して、上記標準のＯＤ値を基準に試料の抗原値を計算した。ＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質の培地試料は、１／４に希釈して使用した。

上記ＥＬＩＳＡ法で生成されたタンパク質（抗原）の量を確認したが、二重ＦＩＸの活性を持たないタンパク質もあり得るので、色素形成能分析によって、得られた値を、ＥＬＩＳＡ法によって得た値で割り、単位活性度（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｒａｔｉｏ ）の値を求めた。

実施例により得られた試料のＥＬＩＳＡおよび色素形成能の分析結果を表３及び図８ａに示し、上記の値に基づいて得られた単位活性度、すなわち、比活性の測定結果を表３及び図８ｂに示す。

表３及び図８ｂに示すように、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−トランスフェリン融合タンパク質の比活性は５．８６で、天然型ＦＩＸ（ＫＯＩ）の２．９８に比べてかなり活性度が増加したことが分かった。また、リンカーを含むＦＩＸ（ＫＯＩ）−トランスフェリン融合タンパク質は、１．５３から５．５８の高い比活性を示し、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−Ｇ６Ｖ−Ａｌｂｕｍｉｎ融合タンパク質の比活性よりも高く測定された。

＜２−２＞ ＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質誘導体（ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ＴｆおよびＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ｄｅｌ−Ｔｆ）並びに天然型ＦＩＸ（ＫＯＩ）の比活性測定
実験例１のＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−Ｔｆ、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ｄｅｌ−Ｔｆおよび天然型ＦＩＸ（ＫＯＩ）のＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質試料を対象に、比活性を測定した。実施例４−１とほぼ同様のリンカー配列を含む、実施例４−３によって得られた試料をＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｐａｉｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｌｉｓａ−Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、ＣＬ２００４１Ｋ、Ｌｏｔ ＥＩＡ９−００２８Ｒ１）を用いて、ＦＩＸタンパク質（抗原）の量を測定し、ＢＩＯＰＨＥＮ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ分析キット（ＨＹＰＥＮ ＢｉｏＭｅｄ、Ｒｅｆ．２２１８０２、Ｌｏｔ０１６０２）を用いて、ＦＩＸの色素形成能（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の分析を行い、凝固活性（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。標準ヒト血漿（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＲＥＦ ＯＲＫＬ１３、Ｌｏｔ ５０３２１６Ｆ）を量分析において対照群として用いて、＜２−１＞と同じ方法で希釈し使用した。

実施例４−１と４−３のＥＬＩＳＡおよび色素形成能の分析結果を表４及び図８ｃに示し、上記の値に基づいて得られた単位活性、すなわち、比活性の測定結果を表４及び図８ｄに示す。

表４および図８ｄに示すように、ＦＩＸ（ＫＯＩ）−トランスフェリンリンカーを含む融合タンパク質の比活性は、１．６から１．８で、天然型ＦＩＸ（ＫＯＩ）の０．９に比べて活性度が増加したことが分かった。また、リンカーを接続するＡｇｅ１制限酵素配列を含むＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ＴＦと、これを除去したＦＩＸ（ＫＯＩ）−ＧＳ１−ＴＨＲ−ＧＳ１−ｄｅｌ−Ｔｆとの比活性はほぼ類似して現れた。

本実験例において、リンカーの長さとＦＩＸ（ＫＯＩ）融合タンパク質の比活性とは一定の関係を示さず、リンカーの切断部位の種類および比活性にも一定の関係を示さなかった。

Claims (10)

1. ヒト由来の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびヒト由来のトランスフェリンを含む融合タンパク質であって、
   前記融合タンパク質は、ＦＩＸとトランスフェリンとの間にリンカーを含み、
   前記リンカーは、配列番号９及び１１のいずれか一つのアミノ酸配列で表示されるペプチドであることを特徴とする融合タンパク質。
2. 前記ＦＩＸは、配列番号1のアミノ酸配列で表示されるポリペプチドまたはその機能的同等物であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記機能的同等物は、ＦＩＸと実質的に同等の機能活性を有し、配列番号１で表示されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基が欠失、挿入または置換されたことを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
4. 前記トランスフェリンが配列番号２のアミノ酸配列で表示されるポリペプチドまたはその機能的同等物であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
5. 前記機能的同等物は、トランスフェリンと実質的に同等の機能活性を有し、配列番号２で表示されるアミノ酸配列においてアミノ酸残基が欠失、挿入または置換されたことを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか一項による融合タンパク質配列をコードする遺伝子。
7. 前記遺伝子は、配列番号２０又は２１の塩基配列で表示される遺伝子であることを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子。
8. 請求項７による遺伝子を含む組み換えベクター。
9. 請求項８の組み換えベクターを含む宿主細胞。
10. 前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅｐ Ｇ２
    細胞からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項９に記載の宿主細胞。