JP6175562B2 - 粘膜粘着性ポリ−γ−グルタミン酸ナノミセルおよびこれを用いた薬物伝達体 - Google Patents

Description

本発明は、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルに関し、より詳細には、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルおよびその製造方法と、前記ナノミセルの粘膜粘着特性を用いた薬物伝達体に関する。

本発明は、生体親和性の天然高分子であるポリ−γ−グルタミン酸を用いて薬物または蛍光体を伝達できるポリ−γ−グルタミン酸ナノミセルおよびその製造方法に関する。医薬の投与経路のうち最も多く用いられることが経口投与であるが、粘膜部位に直接投与して治療効果を増大できる薬品の場合、また粘膜を介して吸収されるものが生体利用率の増大に効果的な薬物の場合、粘膜が主な代替投与経路として注目されている。粘膜は、胃腸管など、外部に露出しないところをはじめ、口腔、鼻腔、生殖器、直腸、消化器、皮膚潰瘍部位などに存在している。これらの粘膜部位に投与された生理活性物質は、一般的に経口に投与されて吸収される薬物に比べて、すぐ血流内への吸収が可能で薬効発現にかかる時間が短いという利点がある。また、口腔、鼻腔、呼吸器粘膜、目の粘膜、生殖器粘膜、皮膚潰瘍部位の場合、病巣部位への直接的な薬物適用は、経口投与に比べて薬物の有効性をより増強させることができるという利点がある。

また、粘膜の周りに多くの免疫細胞が集中しているため、インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ワクチン用抗原物質を粘膜を介して伝達することで粘膜免疫性（ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を増強させることも非常に重要である。このときに抗原伝達体として使用される素材が、単に抗原の伝達性を増加させる役割の他にも免疫細胞の活性化に役立つワクチンアジュバント（ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）物質の機能まで行うことができれば、その価値はさらに大きいといえる。

粘膜粘着性高分子としては、ポリアクリル酸素材の物質が多く使用されてきた。米国登録特許第４，２９２，２９９号では、ポリアクリル酸とその誘導体およびポリアクリル酸セルロース誘導体などとの共重合体を用いた粘膜粘着性薬物体が提案されており、ヨーロッパ登録特許第６５４，２６１号では、セルロースエーテル誘導体、ポリアクリル酸誘導体およびゼラチンの物理的混合組成物を粘膜粘着性を得るために使用した。また、米国登録特許第５，９４２，２４３号では、ポリスチレンを基剤とした共重合体を粘膜投与用薬物伝達製剤成分として使用した。しかし、これらの粘膜粘着性素材のほとんどは化学的合成方法により製造された有機合成物質である。したがって、生体親和性のある生体由来素材物質をベースとした粘膜粘着性伝達体の開発が活発に行われている。

粘膜を形成する主成分であるムチンは、動物の外分泌腺から分泌する粘性物質の通称であり、糖質と結合した複合タンパク質を指す。このムチンは、細胞の主成分であるタンパク質の消化を促進して体内で有用な作用をし、胃壁の保護作用、解毒作用をする。このムチンが存在する機関は、口腔、鼻腔、喉頭、胃腸管、目、肛門、膣であり、その厚さは数ｎｍから１７０μｍまで様々である。ムチンネットワークの構造は、様々な結合により維持されるが、その結合には、イオン結合、水素結合、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合、バンデルワールス結合、ムチン同士の絡みなどがある。かかる結合と連結される粘膜付着性高分子に関する研究が活発に進められており、ムチン層に存在する結合と相互作用の強い特徴を有する高分子が主である。一般的に粘膜層は、複雑な多孔性網目構造を有しており、数マイクロメータサイズのバクテリアの場合、一般的に粘膜層を通過することができないが、粘膜層が崩壊したところや薄いところでは一部通過することが知られている。約１０ナノメートルのサイズを有する抗体とそれより大きいプラスミドＤＮＡの場合、粘膜層を通過することはできるが、粘膜層に存在する数多くの酵素により分解されるため粘膜層を通過することが困難である。２００ナノメートル以下のサイズを有するウイルスの場合、粘膜層を迅速に通過すると知られている。

本発明で使用されたポリ−γ−グルタミン酸は、カルボキシル基を有するポリペプチドとして、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸を生産する耐塩性菌株バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リケニホルミス菌株を用いてポリ−γ−グルタミン酸を生産する方法に関する特許（韓国登録特許第５００７９６号）およびポリ−γ−グルタミン酸を含有する抗がん組成物、免疫補強剤、免疫増強剤、ウイルス感染抑制に関する特許（韓国登録特許第４９６６０６号、第５１７１１４号、第４７５４０６号、第０８７３１７９号）を出願した。また、物質の医薬用途に関する研究が行われ続けて、様々な効能が明らかになり続けている。

したがって、本発明者らは、粘膜粘着特性を有する薬物伝達体を開発するために鋭意研究を重ねた結果、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルが粘膜粘着特性と免疫増強効果を有することと、前記ナノミセルを薬物伝達体として使用する場合、粘膜への薬物伝達効果が高いということを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、生体由来の天然高分子であるポリ−γ−グルタミン酸をベースとし、粘膜粘着性に優れたナノミセルおよびその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、粘膜粘着性に優れたナノミセルを用いた薬物伝達体を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルを提供する。

本発明はまた、（ａ）ポリグルタミン酸溶液に親油性化合物−アミン複合体溶液を混合してポリグルタミン酸−親油性化合物複合体を製造するステップと、（ｂ）前記ポリグルタミン酸−親油性化合物複合体にアミン系化合物を処理してポリ−γ−グルタミン酸のカルボキシル基をアミン基で置換し、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルを製造するステップと、を含むカルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルの製造方法を提供する。

本発明はまた、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルの内部に、タンパク質、遺伝子、ペプチド、化合物、抗原および天然素材からなる群から選択される薬物が封入されていることを特徴とするナノミセル薬物伝達体を提供する。

本発明の実施例による粘膜粘着性ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセル（ｒ−ＰＧＡ ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅｓ）の化学構造式とこのナノミセルが有するウイルス抗原伝達体の特性に関する原理を示す概念図（ａ）、また、このナノミセルの粒径をＤＬＳ（ｂ）と、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ（ｃ）で示す図である。 マウスモデルにおいて鼻腔内に注入された粘膜粘着性ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの粘膜粘着性を（ａ）ＳＰＥＣＴ／ＣＴと、（ｂ）免疫組織蛍光映像法（ｂ）を用いて測定した映像を示す図である。 マウスモデルにおいてモデル抗原（ＯＶＡ）が導入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルを鼻腔内に注入した後、抗原特異的な免疫効能を測定した結果を示す図である。（ａ）ＯＶＡ−特異的ＩｇＧ抗体反応の誘導能力測定（比較のためにポリ−γ−グルタミン酸にコレステロールのような親油性基のみで置換されているポリ−γ−グルタミン酸−コレステロール（ｒ−ＰＧＡ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、表面がカルボキシル基からなっている）複合体の場合に示される抗原特異的免疫反応を比較して示した。）、（ｂ）ＯＶＡ−特異的ＩｇＡ抗体反応の誘導能力測定、（ｃ）ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ検定によるＩＦＮ−γを生成する細胞の個数を測定した結果を示す図である（＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１，ｎ．ｓ．，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。 マウスモデルにおいてインフルエンザウイルス抗原が導入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルを鼻腔内に注入した後、抗原特異的な免疫効能を測定した結果を示す図である（１．ＰＢＳ、２．ＰＲ８ ｏｎｌｙ、３．ＰＲ８ ｐｌｕｓ γ−ＰＧＡ ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅ（１０μｇ）、４．ＰＲ８ ｐｌｕｓ γ−ＰＧＡ ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅ（１００μｇ）。（ａ）インフルエンザウイルス特異的なＩｇＧ抗体の生成測定、（ｂ）インフルエンザウイルス特異的なＩｇＡ抗体の生成測定、（ｃ）ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ検定によるＩＦＮ−γを生成する細胞の個数の測定、（ｄ）ウイルス抗体によりヘマグルチニンの血液凝集反応抑制効能の測定、（ｅ）ワクチン投与後、ウイルス感染に対するマウスの体重の変化、（ｆ）ワクチン投与後、ウイルス感染に対するマウスの致死率の測定を示す図である（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１，ｎ．ｓ．，ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。

一観点で、本発明は、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルおよびその製造方法に関するものである。

本発明のカルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルは、以下のステップを経て製造される。

（ａ）ポリグルタミン酸溶液に親油性化合物−アミン複合体溶液を混合してポリグルタミン酸−親油性化合物複合体を製造するステップと、（ｂ）前記ポリグルタミン酸−親油性化合物複合体にアミン系化合物を処理してポリ−γ−グルタミン酸のカルボキシル基をアミン基で置換して、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルを製造するステップ。

本発明において、親油性化合物としては、コレステロールおよびその誘導体、炭素数３〜２１個を有する脂肪族（ａｌｉｐｈａｔｉｃ）化合物（Ｃ３−Ｃ２１）およびベンゼン基を１〜１０個含む芳香族化合物からなる群から選択されるものを使用することができる。

一例として、親油性化合物のうちコレステロール系は、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、コレステロールβ−Ｄ−グルコシド（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、コレステリルＮ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバメートクロリド（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ Ｎ−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、コレステリルオレイルカーボネート（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｏｌｅｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、コレスタノール（Ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ）、ラノステロール（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ）、クロフィブラート（Ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、コレステリルオレアート（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｏｌｅａｔｅ）、メバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、チオコレステロール（Ｔｈｉｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、スチグマスタノール（Ｓｔｉｇｍａｓｔａｎｏｌ）、コレステリルパルミテート（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ジエチルウンベリフェリルホスフェート（Ｄｉｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コレステリルヘプタデカノエート（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏａｔｅ）、β−シトステロール（β−Ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、５α−コレスタン（５α−Ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ）、５−コレステン−３−オン（５−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ−３−ｏｎｅ）などのコレステロールおよびその化合物および誘導体から選択されることを特徴とする。

親油性化合物のうちトコフェロール系は、（±）−α−トコフェロール（（±）−α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、（＋）−δ−トコフェロール（（＋）−δ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ＤＬ−α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）、（＋）−γ−トコフェロール（（＋）−γ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、ビタミンＥアセテート（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ａｃｅｔａｔｅ）、ピノバンクシン（Ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ）、メチルジャスモネート（Ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ）、レチニルアセテート（Ｒｅｔｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）などの約１０〜１００個の炭素からなるトコフェロールおよび前駆体、誘導体化合物から選択されることを特徴とする。

親油性化合物のうち脂肪族化合物は、プロピン（Ｐｒｏｐｙｎｅ）、アクロレン（Ａｃｒｏｌｅｉｎ）、アリルアルコール（Ａｌｌｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、２−プロペン−１−チオール（２−Ｐｒｏｐｅｎｅ−１−ｔｈｉｏｌ）、プロパン（Ｐｒｏｐａｎｅ）、イソプロピルアミン（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、１，３−ジアミノプロパン（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−イソプロピルメチルアミン（Ｎ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ），２−ニトロプロパン（２−Ｎｉｔｒｏｐｒｏｐａｎｅ）、１−ニトロプロパン（１−Ｎｉｔｒｏｐｒｏｐａｎｅ）などを含む３炭素系疎水性化合物および誘導体、ブチン（Ｂｕｔｙｎｅ）、ブチルアルデヒド（Ｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、２−メチル−１−プロパノール（２−Ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）、ジエチルエーテル（Ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）、２−ブタノール（２−Ｂｕｔａｎｏｌ）、１−ブタノール（１−Ｂｕｔａｎｏｌ）、ブチルアルコール（Ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）などの４炭素系を含む疎水性化合物および誘導体、ペンチルアセテート（Ｐｅｎｔｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）、２−ペンチルアセテート（２−Ｐｅｎｔｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）、２−ペンチル−２−シクロペンテン−１−オン（２−Ｐｅｎｔｙｌ−２−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎｅ−１−ｏｎｅ）、ペンチルナイトライト（Ｐｅｎｔｙｌ ｎｉｔｒｉｔｅ）、ペンチルプロピオネート（Ｐｅｎｔｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ペンチルバレラート（Ｐｅｎｔｙｌ ｖａｌｅｒａｔｅ）、Ｎ−（１−ペンチル）ホルムアミド（Ｎ−（１−Ｐｅｎｔｙｌ）ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ペンチルラウレート（Ｐｅｎｔｙｌ ｌａｕｒａｔｅ）、２−ペンチルブチラート（２−Ｐｅｎｔｙｌ ｂｕｔｙｒａｔｅ）の５個炭素を含む疎水性物質およびその誘導体から選択されることができる。

親油性化合物のうちベンゼン基を１個以上含む芳香族化合物は、ベンゼン（Ｂｅｎｚｅｎ）、シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）などの形態をベースとする脂肪族および非芳香性環状化合物および芳香族化合物とその誘導体、ベンジルクロリド（Ｂｅｎｚｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンジルクロロホルメート（Ｂｅｎｚｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、ベンジルホルメート（Ｂｅｎｚｙｌ ｆｏｒｍａｔｅ）、ベンジルメチルエーテル（Ｂｅｎｚｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ベンジルプロピオネート（Ｂｅｎｚｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、フェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）、２−（メチルアミノ）フェノール）（２−（Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｌ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−メチル−フェノール（２−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−６−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｏｌ）、３−（トリフルオロメチル）フェノール（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ）、ダンシルカダベリン（Ｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、３−（ダンシルアミノ）フェニルボロン酸（３−（Ｄａｎｓｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヘキサン、３−オキサビシクロ[３．１．０］ヘキサン−２，４−ジオン（３−Ｏｘａｂｉｃｙｃｌｏ[３．１．０］ｈｅｘａｎｅ−２，４−ｄｉｏｎｅ）、１，６−ビス（トリクロロシリル）ヘキサン（１，６−Ｂｉｓ（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌｙｌ）ｈｅｘａｎｅ）、シクロペンテンオキシド（Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、４−ヘキシルフェノール（４−Ｈｅｘｙｌｐｈｅｎｏｌ）、シクロ（Ｌｅｕ−Ａｌａ）（Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ−Ａｌａ））、アピシジン（Ａｐｉｃｉｄｉｎ）、ボーベリシン（Ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ）など環状構造と非環状構造物から選択されることができる。

また、親油性化合物は、ＱＳ−２１、ＭＰＬＡ、テントキシン（Ｔｅｎｔｏｘｉｎ）、エンニアチンＡ（Ｅｎｎｉａｔｉｎ Ａ）、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）、アンシタビン（Ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、トラポキシンＡ（Ｔｒａｐｏｘｉｎ Ａ）、エンニアチンＡ１（Ｅｎｎｉａｔｉｎ Ａ１）、シクロアルテノール（Ｃｙｃｌｏａｒｔｅｎｏｌ）、シペルメトリン糖（Ｃｙｐｅｒｍｅｔｈｒｉｎ糖）、アミノ酸、有機酸および有機アルコール化合物およびその誘導体、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、マロン酸（Ｍａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、リンゴ酸（Ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、シュウ酸（Ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、酒石酸（Ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、トリオクチルアミン（Ｔｒｉｏｃｔｙｌａｍｉｎｅ）、安息香酸（Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２−フェニル−ペンタン酸（２−ｐｈｅｎｙｌ−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸（Ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ステアリン酸）（Ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ））、ソルビン酸（Ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ヘキサン酸（Ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、イソ吉草酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）、ヘプタン酸クロリド（Ｈｅｐｔａｎｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ドデセン酸（Ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ラウリン酸（Ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）、セバシン酸（Ｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ）、塩酸ピリドキシン（Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ウンデシレン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｕｎｄｅｃｙｌｅｎａｔｅ）のような３Ｃ以上の有機酸、有機酸誘導体および脂肪酸から選択されることを特徴とする。

本発明において、アミン系化合物は、エチレンジアミンを含むアルキルジアミン系化合物、またはポリアミンを含むオリゴマーおよびポリマーを使用することができる。

一例として、ジアミン系化合物のうちモノマー系としては、ヒドラジン（Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、エチレンジアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、１，３−ジアミノプロパン、３，５−ジアミノ−１，２，４−トリアゾール（３，５−Ｄｉａｍｉｎｏ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ）、カダベリン（Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、ヘキサメチレンジアミン（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン（Ｂｉｓ（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｔｒｉａｍｉｎｅ）、トリエチレンテトラミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン（Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、２，２−ビス（アミノエトキシ）プロパン（２，２−Ｂｉｓ（ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎｅ）、ベンジジン（Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、スペルミン（Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（２，２’−（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ）ｂｉｓ（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ））、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ）、シスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）、システアミン（Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）などから選択されることを特徴とする。

ポリマー系としては、ポリ（エチレングリコール）ビス（アミン）（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｂｉｓ（ａｍｉｎｅ））、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）オクタデカエチレングリコール（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｏｃｔａｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ＰＥＩ、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）などの生体親和性ポリマーを媒介としたジアミンおよび多価アミン型ポリマー化合物誘導体から選択されることを特徴とする。

本発明で使用されるポリ−γ−グルタミン酸は、分子量が１〜１５，０００ｋＤａであることを特徴とする。

本発明の一様態では、カルボキシル基を有するポリ−γ−グルタミン酸にコレステロールのような親油性物質複合体に負電荷を帯びる細胞表面と反応することができる正電荷を有するアミン基を置換することにより、薬物や抗原を封入できる生体親和性高分子ナノミセルを製造した。

本発明において、ポリ−γ−グルタミン酸ナノミセルは、ポリ−γ−グルタミン酸にコレステロールのような親油性基とアミン基のような正電荷を帯びる物質が同時に付着されているポリ−γ−グルタミン酸コンジュゲートを水溶液に分散して得た高分子ミセルを示す。

まず、本発明の一実施例により製造されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの特性を確認した。ＤＬＳを用いてナノミセルの粒径を測定した結果、直径が２２．１±２．０ｎｍであることを確認し、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭにより球状のポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルを確認した（図１）。また、ＮＭＲを用いて分析した結果、コレステロールは１．７ｍｏｌ％、元素分析により確認した結果、約２８．１ｍｏｌ％のアミン基が置換されていることを確認することができた。また、動的散乱法を用いて測定した結果、表面電荷は約３６．４３ｍＶであることを確認することができた。

他の観点で、本発明は、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルの内部に、タンパク質、遺伝子、ペプチド、化合物、抗原および天然素材からなる群から選択される薬物が封入されていることを特徴とするナノミセル薬物伝達体に関するものである。

本発明において、前記抗原は、ポリサッカライド、弱毒生完全体微生物（ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、不活性化微生物（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、組み換えペプチドおよびタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポペプチド、合成ペプチド、破裂させた微生物（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）などを使用することができるが、これに制限されるものではない。

本発明の薬物伝達体に含まれた薬物は、薬物伝達体の粘膜粘着特異性を用いて、粘膜を介して伝達され、前記粘膜は、口腔、鼻腔、呼吸器粘膜、目の粘膜、生殖器粘膜、皮膚潰瘍部位などであってもよい。

本発明の一様態では、前記ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの粘膜接着性および抗原伝達体の特性を証明するために、ヨウ素１２３またはＦＩＴＣが標識されたＯＶＡモデル抗原をマウスの鼻腔内に注入した後、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ映像と免疫組織蛍光映像技法によりＯＶＡの生体内挙動を確認した。ＳＰＥＣＴ／ＣＴ映像においてγ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡを注入した場合、１２時間が経過しても鼻腔内にＯＶＡが残っている一方、ＯＶＡのみ注入した場合には、６時間以内にＯＶＡが無くなることを確認した。免疫組織蛍光映像においてγ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡを注入した場合、６時間が経過しても鼻腔内にＯＶＡが残っている一方、ＯＶＡのみ注入した場合には、１時間が経過するとＯＶＡが無くなることを確認した。また、ＯＶＡのみ注入した場合とは異なり、γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡを注入した場合、ＯＶＡが鼻腔粘膜組織内へ効果的に伝達されることを確認した（図２）。

前記結果により、本発明者らは、本発明のポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルが鼻腔粘膜接着性および抗原伝達体の特性を有することを確認し、マウスモデルにおいてモデル抗原であるＯＶＡが導入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルを鼻腔内に注入した後、抗原特異的な免疫効能を測定した。まず、抗原特異的な体液性免疫反応効能を確認するために、マウス血漿内に生成されたＯＶＡ特異的なＩｇＧ抗体を確認した。ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡが注入されたマウスにおいて対照群に比べて、ＩｇＧ抗体生成率が１０．２倍高いことが確認された。また、粘膜免疫で特異的に生成される抗体であるＩｇＡもまた対照群に比べて４．５倍高い生成率を示す（図３）。

参考までに、ポリ−γ−グルタミン酸にコレステロールのような親油性基のみで置換されているポリ−γ−グルタミン酸−コレステロール（表面がカルボキシル基からなっている）の場合には、抗原特異的免疫反応が、抗原自体を使用した場合と比較してみたとき、あまり差がないことを示しており、粘膜を介した抗原伝達が非効率的であることが分かる（図３のａ）。かかる結果は、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルにおいてアミン基（ＮＨ_２）から誘導される正電荷の機能が、粘膜粘着性および粘膜を介した薬物伝達機能と非常に密接に関係していることが分かる。

細胞性免疫反応は、ウイルスの感染を制御し、疾患の兆候を改善し、疾患の回復を促進することから重要な役割を果たすと認められる。このような抗ウイルス細胞性免疫は、細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）とＩＦＮ−γ、ＩＬ−２のような免疫刺激性サイトカインを誘導する類型１ＣＤ４＋ Ｔ−ヘルパーリンパ球（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；Ｔｈ１）の導入により構成される。

したがって、本発明のポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルがＯＶＡ抗原特異的な細胞性免疫を誘導するかをＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ検定により確認した。ワクチンが注入されたマウスの脾臓内細胞のうちＩＦＮ−γを生成する細胞の個数を確認した結果、対照群に比べて５．２倍高い数値であることを確認することにより、細胞性免疫誘導能力を確認した（図３）。

したがって、前記結果により、本発明者らは、本発明のポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルが体液性、細胞性免疫誘導に効果的であることを確認し、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４；ＰＲ８；Ｈ１Ｎ１）抗原を用いてその効能を検証した。

まず、抗原特異的な体液性免疫反応効能を確認するためにＰＲ８抗原特異的な抗体を確認した。ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＰＲ８抗原が注入されたマウスにおいて対照群に比べて２８．６倍の高いＩｇＧ抗体生成、また２７．６倍高いＩｇＡ生成能力を確認した（図４）。ＰＲ８抗原特異的な細胞性免疫を誘導するかをまたＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ検定により確認した。ワクチンが注入されたマウスの脾臓内細胞のうちＩＦＮ−γを生成する細胞の個数を確認した結果、対照群に比べて３．２倍高い数値であることを確認することにより、細胞性免疫誘導能力を確認した。また、抗ウイルス抗体がインフルエンザウイルス表面タンパク質であるＨＡと赤血球が結合することを妨げる原理を用いてＰＲ８抗原特異的な抗体効能を確認した結果、対照群に比べて４倍高いことを確認した（図４）。

前記結果に基づき、本発明者らは、ウイルス感染に対する生存率を確認した。５０％の致死率を有するウイルスの１０倍を用いて生存率を確認した結果、ＰＢＳ注入実験群は１００％の致死率を示し、ＰＲ８抗原のみ注入した実験群は５０％の致死率を示した。一方、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＰＲ８抗原を注入した実験群の場合、１００％生存する結果を示した（図４）。

したがって、前記結果により、本発明者らは、本発明のポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルが、体液性、細胞性免疫誘導に効果的であることを確認し、ウイルス感染に対する抵抗能力を高めることができることを確認した。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものに解釈されないことは、当業者にとって自明であろう。

＜実施例１＞ポリ−γ−グルタミン酸／コレステロールナノミセルの製造
＜１−１＞コレステロール−アミンの合成
２５０ｍｍｏｌのエチレンジアミン（シグマアルドリッチ社製、米国）を２５０ｍＬのトルエンに溶解させた。この際、氷を用いて温度を低く維持した。２．２５ｇコレステロールを５０ｍＬのトルエンに溶解させ、１０分間静置した後、前記製造したエチレンジアミン溶液に滴下して混合させ、直ちに室温で１６時間撹拌して反応させた。反応が終了した後、脱イオン水を用いて数回洗浄した。前記過程を経てクリーンになった有機層を硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、乾燥した溶液でトルエンを回転蒸発させた。蒸発された試料を２０ｍＬのジクロロメタンと２０ｍＬのメタノール混合液で数回洗浄し、１マイクロメータのＰＴＦＥフィルターを用いて濾過した。濾過したクリーンな溶液をまた回転蒸発させ、白色固体形態のコレステロール−アミン試料を得た。このように得られたコレステロール−アミン試料をもってＮＭＲを用いてコレステロールとアミンの結合程度を確認した。ＮＭＲ分析結果、約９８ｍｏｌ％のアミンが結合されたことを確認した。

＜１−２＞ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールの合成
ポリ−γ−グルタミン酸（１ｇ、５０ＫＤａ、Ｂｉｏｌｅａｄｅｒｓ社製、韓国）を４０℃で１０ｍＬのＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に約一日溶解させた。＜１−１＞で製造したコレステロール−アミン（１ｇ）を室温で１０ｍＬのＴＨＦ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ、シグマアルドリッチ社製、米国）に溶解させた。コレステロール−アミン溶液をポリ−γ−グルタミン酸溶液に徐々に滴下し、混合された二つの溶液にＣＤＩ（１ｇ）を入れた後、４０℃で約一日反応させた。反応された溶液を室温で冷やした後、回転蒸発によりＴＨＦを除去した。

前記ＴＨＦが除去された溶液をアセトンにより沈殿させ、遠心分離により溶媒と溶質を十分に分離させてアセトンを除去し、４０℃で残っているアセトンを乾燥させた。乾燥した試料を脱イオン水に入れて炭酸水素ナトリウムを最初反応させたポリ−γ−グルタミン酸と同様なモル数で入れてポリ−γ−グルタミン酸を中和させた。完全に溶解した溶液にアンバーライト（ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）（５ｇ、シグマアルドリッチ社製、米国）で２時間程度撹拌して反応していないコレステロールおよび不純物を除去した。メッシュを介してアンバーライトを除去し、セルロースメンブレンチューブ（ＭＷＣＯ１２，０００、シグマアルドリッチ社製、米国）を用いて２日間透析した。透析した溶液を凍結乾燥してポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセル試料を得た。前記ナノミセルをＮＭＲで分析してコレステロール導入量を測定した。ＮＭＲ分析結果、１．７ｍｏｌ％コレステロールが結合されたことを確認した。

＜１−３＞ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの合成
１００ｍｇのポリ−γ−グルタミン酸−コレステロール複合体と０．５１８ｍＬのエチレンジアミンを６０ｍｇのカルボニルジイミダゾール（Ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が溶解されている５０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した後、約２４時間撹拌する。元素分析（ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）によりＣ、Ｎ、Ｈの量を定量化することにより、導入したアミン基の量を定量化した。分析結果、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロール複合体（γ−ＰＧＡ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の場合、それぞれ、Ｃ（３５．１６±０．０８％）、Ｈ（４．８７±０．１９％）、Ｎ（７．４０±０．０４％）の値を示し、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセル（γ−ＰＧＡ ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅｓ，ｉ．ｅ．，ａｍｉｎａｔｅｄ γ−ＰＧＡ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の場合は、Ｃ（４２．４１±０．３８％）、Ｈ（６．９５±０．１３％）、Ｎ（１５．９０±０．１４％））の値を示した。結果として、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの場合、約２８．１ｍｏｌ％のアミン基が置換されていることを確認することができた。

＜実施例２＞ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの特性化
ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルを蒸留水に１ｍｇ／ｍＬで分散させてＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、大塚製薬社製、日本）測定結果、図１のｂ）のように直径が２２．１±２．０ｎｍであることを確認し、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭにより分析した結果、図１のｃ）のように球状のポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルであることを確認した。また、ＮＭＲを用いて分析した結果、コレステロールは１．７ｍｏｌ％、元素分析により確認した結果、約２８．１ｍｏｌ％のアミン基が置換されていることを確認することができた。また、動的散乱法を用いて測定した結果、表面電荷は約３６．４３ｍＶであることを確認することができた。

＜実施例３＞ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルのＯＶＡ封入
実施例１で作製したポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルにＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、シグマアルドリッチ社製、米国）を封入するために８ｍｇ／ｍＬのナノミセルと１０ｍｇ／ｍＬのＯＶＡを質量比５：１の割合で混合し、１時間反応を行うと、ＯＶＡが封入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルが作製される。遊離ＯＶＡなく１００％封入される割合を見出すために、８ｍｇ／ｍＬのポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルと１０ｍｇ／ｍＬＯＶＡを質量比で２：１から９：１の割合で反応を行い、ポリアクリルアミドゲル（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）（ＳＤＳ ｆｒｅｅ ｇｅｌ）で実験した結果、５：１の割合で１００％封入されたことを確認した。

＜実施例４＞ヨウ素（Ｉ）が導入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの製造
＜４−１＞チロシンが導入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの製造
ヨウ素は、チロシンのフェノール環に対して高い結合親和力を有することからナノミセル構造にチロシンを結合することでヨウ素を導入することができる。実施例１で製造したポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルを水に溶解した後、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−[３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、シグマアルドリッチ社製、米国）、ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、シグマアルドリッチ社製、米国）とチロシンアミド（シグマアルドリッチ社製、米国）を添加してポリ−γ−グルタミン酸のカルボキシル基とチロシンアミドのアミン基とのアミド結合を形成した。透析と凍結乾燥過程を経て未反応物を除去し、パウダー状のナノゲル試料を得ており、ナノミセルに付着されたチロシンは、ＮＭＲ分析結果、約０、７ｍｏｌｅ％が導入された。

＜４−２＞ヨウ素が導入されたナノミセルの製造
チロシンが導入されたナノミセルをＰＢＳに溶解して準備し、同位元体イオン溶液（Ｎａ^１２３Ｉ、ピアス社製、米国）と混合した後、混合液をヨウ素化チューブ内で１時間程度撹拌して室温で反応する。

反応溶液をＰＤ１０カラム（シグマアルドリッチ社製、米国）にロードし、ＰＢＳを移動相とし、すべての溶出液を１ｍＬあるいは０．５ｍＬずつ分画して受け取った。各溶出分画の^１２３Ｉ活性をガンマカウンターで測定して記録した後、最も高い活性を示す溶出分画を選択して使用した。

＜４−３＞マウスモデルにおいてポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの粘膜粘着性（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）の測定
チロシンが導入されたナノミセルとヨウ素の反応後、最も高い活性の溶出分画を選択して準備し、マウス１匹当たり注入する^１２３Ｉ活性を考慮して溶出液をＰＢＳで希釈し、最終濃度は５００μｇ／ｍＬであった。

ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングのための試料の注入量は、鼻腔投与の際に４０μＬ内に略２００μＣｉ以上の^１２３Ｉ活性を有するようにした。鼻腔投与用ｔｉｐを用いて４０μＬの試料をマウスに注入し、注入後、１、６、１２時間後にＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングを開始する。各イメージングにかかる時間は略１時間であり、１０分間ＣＴイメージングした後、続けて５０分間ＳＰＥＣＴイメージングを行う。試料の鼻腔投与の際には注入量が最大４０μＬに制限されるため、イメージングのための^１２３Ｉ活性を確保するために、試料の濃縮過程を必ず必要とする．^１２３Ｉ標識ナノミセルを遠心分離フィルタリング（ｕｌｔｒａｃｅｌ、１０ｋＤａ）を進めて濃縮し、４０μＬ当たりイメージングに必要な活性を確保する。試料の注入は、マウスのサイズと状態を考慮して両鼻腔に交互に数分の間隔で注入した。

その結果、図２に示されたように、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ映像においてγ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡを注入した場合、１２時間が経過しても鼻腔内にＯＶＡが残っている一方、ＯＶＡのみ注入した場合は６時間以内にＯＶＡが無くなることを確認した。免疫組織蛍光映像においてγ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡを注入した場合、６時間が経過しても鼻腔内にＯＶＡが残っている一方、ＯＶＡのみ注入した場合は１時間が経過するとＯＶＡが無くなることを確認した。また、ＯＶＡのみを注入した場合とは異なり、γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡを注入した場合、ＯＶＡが鼻腔粘膜組織内へ効果的に伝達されることを確認した。

＜実施例５＞動物免疫実験
＜５−１＞動物および動物免疫化
前記＜実施例３＞で製造した抗原が封入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での免疫特性を調べるために動物免疫実験を行った。動物実験には、特定の病原菌のない６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（ｃｏｒｅｔｅｃｈ社製、韓国）を使用し、すべての動物実験は、忠南大学共同動物実験センターで承認を受けて行った。まず、体重（ｇ）当たり０．０１ｍＬの２．５％アバチン（ａｖｅｒｔｉｎ；２，２，２−ｔｒｉｂｒｏｍｏｅｔｈａｎｏｌ−ｔｅｒｔ−ａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ、シグマアルドリッチ社製、米国）溶液をマウスの腹腔に注入してマウスを麻酔し、２０μＬの抗原が封入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルをマウスの両鼻腔に１０μＬずつ交互に注入した。対照群には、ＰＢＳに抗原のみを含んで鼻腔内に注入した。免疫方法は３回免疫化で実施し、各注入の間に７日の間隔で免疫化を実施した。

＜５−２＞抗体測定のための試料採取および抗体ＥＬＩＳＡ検査
＜実施例５−１＞で処理された動物免疫１週間後、目の血管で血液を採取して室温で１時間放置した後、室温で約１時間放置した。そして４℃で遠心分離機を用いて上澄み液のみ分離した。この溶液を用いて抗原特異的なＩｇＧ生成を確認した。鼻腔粘液を採取するために３次免疫化の１週間後、頸椎脱骨方法でマウスを犠牲にした後、鼻腔内へ２００μＬのＰＢＳを注入してまた回収した。この溶液を用いて抗原特異的なＩｇＡを測定した。

抗原特異的なＩｇＧ、ＩｇＡの生成は、ＥＬＩＳＡ検定により確認した。マウス抗体ＥＬＩＳＡ検定は、製造業者の指針に従い行った。まず、抗原タンパク質を０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍＬでウエル当たり１００μＬずつＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。４℃で一晩中反応させ、その後、ＰＢＳ−Ｔ（バイオラッド社製、米国）で３回洗浄した後、２％ＢＳＡでブロッキングした。この過程は３７℃で１時間行った。また、洗浄後にＰＢＳで希釈した血漿と鼻腔粘液を順次８進希釈した溶液をウエル当たり１００μＬずつ入れて２時間３７℃で反応した。その後、ＨＲＰが結合された２次抗体を１時間反応させた後、ＴＭＢ溶液（バイオラッド社製、米国）を添加して発色を誘導した。３０分後、２Ｎ硫酸を添加して反応を中止した後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒを用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。抗体の力価は、吸光度０．１で希釈値で決定した。

その結果、図３のａに示されたように、ＩｇＧの抗体生成率は、ポリグルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡが注入されたマウス群が対照群に比べて１０．２倍高い生成率を示すことを確認し、アミン基で表面が置換されていないポリグルタミン酸−コレステロール複合体の場合、抗体生成率の増加を確認することができなかった。

図３のｂに示されたように、粘膜免疫特異的に生成される抗体であるＩｇＡは、ポリグルタミン酸−コレステロールナノミセルとＯＶＡが注入されたマウス群が、対照群に比べて４．５倍高い生成率を示すことを確認した。

＜５−３＞ＥＬＩＳｐｏｔ検定
＜実施例５−１＞で処理された動物免疫１週間後、マウスを頸椎脱骨させて犠牲にした。マウスを１グループ当たり５匹ずつを選択してそれぞれのマウスで脾臓を摘出し、滅菌されたペトリ皿に前記脾臓組織を移し、セルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いて前記脾臓を交換し、組織被膜から細胞を分離した。単一脾臓細胞懸濁液を製造した。マウスＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ（Ｎｕｎｃ、オランダ）検定は、製造業者の指針に従い行った。ＥＬＩＳｐｏｔプレートにＩＦＮ−γ抗体（５μｇ／ｍＬ）を添加して一晩中反応させた後、完全培養培地（１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ）で２時間ブロッキングした。脾臓細胞（５×１０^５）を２００μＬの総体積で３７℃および５％ＣＯ_２で６０時間完全培養培地でペプチド当たり１０μＬ／ｍＬの濃度で刺激させた。次に、洗浄とＨＲＰが結合された２次抗体を２時間処理した後、ＡＥＣ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌ−ｃａｒｂｏｚｏｌｅ、シグマイルドリッチ社製、米国））に１５分間反応させて発色を誘導した後、ＣＴＬ−免疫スポット読み取り機ユニット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）でスポットを計数した。入力脾臓細胞当たりスポット形成細胞（ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；ＳＦＣ）の平均±標準偏差に相当した。

その結果、図３のｃに示されたように、ワクチンが注入されたマウスの脾臓内細胞のうちＩＦＮ−γを生成する細胞の個数を確認した結果、対照群に比べて５．２倍高い数値であることを確認することにより、細胞性免疫誘導能力を確認した。

＜５−４＞血球凝集（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）検定
各グループ別マウス血清での抗体力価測定は、ウイルスに対するＨＩ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）検定により測定した。すべての血清は、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）から抽出したＲＤＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、（デンカ生研社製、日本）を血清サンプルの体積に対して１：１０で処理した後、３７℃で１６時間培養した。血清内非特異的な受容体の活性を除去したサンプルを９６ウエルの丸底プレートで２５μＬずつ順次２進希釈した。第二に、血清サンプルに同一体積の４ＨＡＵウイルスを入れ、３７℃の培養器で３０分間反応させ、最後に０．５％ニワトリ赤血球（ｔＲＮＡ）が含まれたＰＢＳを５０μＬずつ入れた後、室温で４０分間反応させた。力価は、希釈された５０μＬ内で計算された値で、ｌｏｇ１０Ｎ＝１０ＮでＮ値で表記した（図４のｄ）。

＜実施例６＞ウイルス感染に対する生存能検定
本実施例では、ＰＲ８ウイルス抗原が封入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルの鳥インフルエンザウイルスに対する免疫増強効果を調査するために、インフルエンザウイルスを感染させた実験動物の致死率を検定した。

＜６−１＞ウイルスの準備
病原体として使用されたインフルエンザウイルスは、マウスで高病原性を示すＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、韓国生命工学研究院製、韓国）を１０〜１１日経過した白色産卵鶏の有精卵に接種して増幅した後、実験に使用しており、実験動物としては６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（ｃｏｒｅｔｅｃｈ社製、韓国）を使用した。分譲されたウイルスの純粋分離は次のように実施した。１次的に分離したウイルスを抗生剤が入っているＰＢＳに希釈して１０日齢の白色産卵鶏の有精卵に接種した後、３７℃で４８時間静置培養した後、有精卵の液を取り増幅されたウイルスを使用した。卵

＜６−２＞動物免疫およびウイルス感染
対照群としては、インフルエンザウイルスを単独で鼻腔に注入したマウスとＰＲ８ウイルス抗原（Ｍ．−Ｓ．Ｌｅｅ，Ａ．Ｈｕ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：１０３、２０１２）を鼻腔に注入したマウスを使用し、実験群は、ＰＲ８ウイルス抗原が封入されたポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセル鼻腔投与した後、翌日インフルエンザウイルスを投与した。ウイルスの感染は、実験動物にアバチンを２００μＬ腹腔投与して麻酔した後、ウイルス３０μＬを各マウスに鼻腔を介して５０％の致死率は有するウイルスの１０倍（１０ｘＬＤ_５０）を投与した。ウイルス感染２週後までマウスの体重を測定してマウスの致死率を検定した。

その結果、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＰＲ８抗原が注入されたマウスにおいて対照群に比べて２８．６倍の高いＩｇＧ抗体生成、そして２７．６倍の高いＩｇＡ生成能力を確認した（図４のａおよびｂ）。ＰＲ８抗原特異的な細胞性免疫を誘導するかをまたＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ検定により確認した。ワクチンが注入されたマウスの脾臓内細胞のうちＩＦＮ−γを生成する細胞の個数を確認した結果、対照群に比べて３．２倍高い数値であることを確認することにより、細胞性免疫誘導能力を確認した（図４のｃ）。また、抗ウイルス抗体がインフルエンザウイルス表面タンパク質であるＨＡと赤血球が結合することを妨げる原理によりＰＲ８抗原特異的な抗体効能を確認した結果、対照群に比べて４倍高いことを確認した（図４のｄ）。

前記結果に基づき、本発明者らは、ウイルス感染に対する生存率を確認した。５０％の致死率は有するウイルスの１０倍を用いて生存率を確認した結果、ＰＢＳ注入実験群は１００％致死率を示し、ＰＲ８抗原のみ注入した実験群は５０％の致死率を示した。一方、ポリ−γ−グルタミン酸−コレステロールナノミセルとＰＲ８抗原を注入した実験群の場合、１００％生存する結果を示した（図４のｆ）。

以上、本発明における内容の特定の部分について詳細に記述しているところ、当業者にとってかかる具体的技術は単に好ましい実施様態であって、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。

本発明による生体由来の天然高分子であるポリ−γ−グルタミン酸をベースとしたナノミセル薬物伝達体を粘膜部位の薬物伝達分野に活用することにより、薬物の生体安定性および有効性などを向上させることができる。

Claims (8)

1. カルボキシル基の一部がヒドラジン、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、３，５−ジアミノ−１，２，４−トリアゾール、カダベリン、ヘキサメチレンジアミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、トリエチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、２，２−ビス（アミノエトキシ）プロパン、ベンジジン、スペルミン、ミノキシジル、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、アルギニン、リジン、シスタミン、及びシステアミンで構成されている群から選択されるジアミン系化合物のアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と
   コレステロール、コレステロールβ−Ｄ−グルコシド、コレステリルＮ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバメートクロリド、コレステリルオレイルカーボネート、コレスタノール、ラノステロール、クロフィブラート、コレステリルオレアート、メバスタチン、チオコレステロール、スチグマスタノール、コレステリルパルミテート、ジエチルウンベリフェリルホスフェート、コレステリルヘプタデカノエート、β−シトステロール、５α−コレスタン、及び５−コレステン−３−オンで構成されている群から選択されるコレステロール系親油性化合物と
   の複合体で構成されたナノミセル。
2. ポリ−γ−グルタミン酸は、分子量が１〜１５，０００ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載のナノミセル。
3. 次のステップを含む、請求項１に記載のナノミセルの製造方法：
   （ａ）ポリグルタミン酸溶液に、
   コレステロール、コレステロールβ−Ｄ−グルコシド、コレステリルＮ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバメートクロリド、コレステリルオレイルカーボネート、コレスタノール、ラノステロール、クロフィブラート、コレステリルオレアート、メバスタチン、チオコレステロール、スチグマスタノール、コレステリルパルミテート、ジエチルウンベリフェリルホスフェート、コレステリルヘプタデカノエート、β−シトステロール、５α−コレスタン、及び５−コレステン−３−オンで構成されている群から選択されるコレステロール系親油性化合物と
   ヒドラジン、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、３，５−ジアミノ−１，２，４−トリアゾール、カダベリン、ヘキサメチレンジアミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、トリエチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、２，２−ビス（アミノエトキシ）プロパン、ベンジジン、スペルミン、ミノキシジル、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、アルギニン、リジン、シスタミン、及びシステアミンで構成されている群から選択されるジアミン系化合物と
   を混合して得られる親油性化合物−アミン複合体溶液を混合してポリグルタミン酸−親油性化合物複合体を製造するステップと、
   （ｂ）前記ポリグルタミン酸−親油性化合物複合体を、ヒドラジン、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、３，５−ジアミノ−１，２，４−トリアゾール、カダベリン、ヘキサメチレンジアミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、トリエチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、２，２−ビス（アミノエトキシ）プロパン、ベンジジン、スペルミン、ミノキシジル、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、アルギニン、リジン、シスタミン、及びシステアミンで構成されている群から選択されるジアミン系化合物で処理してポリ−γ−グルタミン酸のカルボキシル基をアミン基で置換し、カルボキシル基の一部がアミン基で置換されたポリ−γ−グルタミン酸と親油性化合物の複合体で構成されたナノミセルを製造するステップ。
4. ポリ−γ−グルタミン酸は、分子量が１〜１５，０００ｋＤａであることを特徴とする請求項３に記載のナノミセルの製造方法。
5. 請求項１に記載のナノミセルの内部に、タンパク質、遺伝子、ペプチド、化合物、抗原および天然素材からなる群より選択される薬物が封入されていることを特徴とするナノミセル薬物伝達体。
6. 抗原は、ポリサッカライド、弱毒生完全体微生物、不活性化微生物、組み換えペプチドおよびタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポペプチド、合成ペプチド、並びに破裂された微生物からなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載のナノミセル薬物伝達体。
7. 前記薬物は粘膜を介して伝達されることを特徴とする請求項５に記載のナノミセル薬物伝達体。
8. 前記粘膜は、口腔、鼻腔、呼吸器粘膜、目の粘膜、生殖器粘膜及び皮膚潰瘍部位からなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載のナノミセル薬物伝達体。