JP6158234B2 - 筋萎縮性側索硬化症の治療のための新規組成物 - Google Patents

Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症および関連障害の治療のための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、筋萎縮性側索硬化症および関連障害の治療のための新規の組合せ療法に関する。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ルー・ゲーリッグ病としても知られ、最も頻度の高い成人の運動ニューロン疾患であり、フランス人神経学者ジャン‐マルタン・シャルコーが１８６９年に最初に著述した。この疾患は、全身の衰弱および筋萎縮を引き起こす運動ニューロンの変性および死によって特徴づけられる。この疾患の経過は不可避的な進行性であり、発症から３年以内に患者の５０％が亡くなることを伴う。ＡＬＳは、毎年１０万人あたり４〜６人の有病率、そして毎年１０万人あたり１〜２人の発症率の稀な疾患である。

症例の多くは（９０％）、孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）として分類され、そして残りの１０％は、メンデル型の遺伝を伴う家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）として遺伝し、言及される。ＳＡＬＳの発症平均年齢がＦＡＬＳより１０年遅いことを別にすると（５６歳と４６歳）、臨床的観点からは、家族性（ＦＡＬＳ）と孤発性（ＳＡＬＳ）とを互いに判別できない（参考文献１）。ＡＬＳの多くの症例の原因は不明であり、臨床経過は極めて変化しやすく、複数因子が疾患のメカニズムの根底にあることが示されている。利用可能な治療法はほとんどない。

この疾患の特徴は、脳幹、運動皮質、および随意筋の麻痺を引き起こす、脊髄に位置する運動ニューロンの選択的な死である。麻痺は局所的に始まり、変性が、隣接する運動ニューロンプール間に広がることを示すパターンで広まる。通常、横隔膜のコントロールが障害されたとき、および呼吸能力が失われたときに死亡という結果になる。

ＡＬＳは下位および上位運動ニューロンの両方の機能障害の進行的発現により特徴づけられる。下位運動ニューロンは脳幹と脊髄とを筋線維に接続する。下位運動ニューロンの機能障害は、筋萎縮、けいれん、および線維束性収縮（小規模の、局所的、不随意筋肉収縮）を引き起こす。上位運動ニューロンは、大脳皮質の運動野または脳幹に由来し、標的筋肉の刺激を直接的に担う運動ニューロンへ運動情報を運ぶ。上位運動ニューロンの機能障害は、痙縮（歩行、動作、および発話を妨げる連続的筋肉収縮）および病的反射を引き起こす（参考文献２）。通常、その他の関連する運動ニューロン疾患は、障害される神経細胞の型、すなわち上位か下位運動ニューロンかによって識別され、これらは、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮（ＰＭＡ）、仮性球麻痺および進行性球麻痺（ＰＢＰ）として知られる。

ＡＬＳの診断は、履歴、ニューロン消失の組織分布、およびいくつかの特徴的な細胞学的変化の発見に基づいて神経学者により裏付けられた臨床的徴候に依拠する。しかし、利用可能であるＡＬＳの明白な診断テストは存在しない。臨床的特徴は、延髄、頸部、および腰部といった影響を受ける神経学的部位により分類される。

既に述べたように、ＡＬＳにおける変性は主に運動系に作用する。しかしながら昨今では、認知、行動、および感覚症状が報告されており（参考文献３、４）、臨床および病理学の両面で、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）とＡＬＳとに共通する部分があるという証拠が存在する（参考文献１７）。

また、ＡＬＳの発症は推定される環境因子がきっかけになり得ることを示す、いくつかの弱い証拠がある（参考文献５、６）。

いくつかの変異遺伝子またはゲノム領域は、ＡＬＳならびに前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を伴うＡＬＳの原因になるか、または素因になることが報告されている（参考文献７〜９）。例えば、あらゆるＦＡＬＳ症例の約２０％〜２５％およびＳＡＬＳ症例の約１％は、スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ１における突然変異に起因している（参考文献１０）。同一の家族内での複数の臨床症状が、必ずしも同種の表現型を引き起こすわけではない同一のＳＯＤ１の突然変異で起こる。酵素活性や、臨床的進行、疾患の表現型の間に明確な相関性は存在しないが、突然変異がどんなものであろうと疾患の時期は類似する。歴史的には、ＳＯＤ１突然変異の発見によってＡＬＳの最初の動物モデルが生み出され、ヒトＡＬＳに酷似する運動ニューロンの疾患が開発された（参考文献１１、１２）。ＡＬＳまたは運動ニューロン疾患の発現に関連するその他の遺伝子として、Ｒａｂ５Ａの交換因子であるアルシン（ａｌｓｉｎ）（参考文献１３）、ＲＮＡプロセシングに関与する可能性のあるセナタキシン（ｓｅｎａｔａｘｉｎ）、小胞輸送を規定するＶＡＰＢタンパク質、主要な逆行性軸索モータータンパク質であるダイナクチン（ｄｙｎａｃｔｉｎ）、シトクロムｃオキシダーゼおよびイソロイシンｔＲＮＡシンテターゼのミトコンドリア遺伝子（参考文献１４、１５）、血管新生調節因子であるＶＥＧＦおよびアンジオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）（参考文献１６）が言及される。

ＡＬＳは複数の原因を伴う複雑な疾患であり、この疾患の発病に関与する正確なメカニズムはまだ解明されていない。これは有効な薬理的療法の発見の課題である。ＡＬＳにおいて、リルゾールにより、作用ではなく生存期間が若干延長されるということが臨床試験において示されている（参考文献１８）。しかしながら、リルゾールは現在認可されている唯一の薬剤であり、ＡＬＳの唯一の既知の療法である。ゆえに、ＡＬＳに苦しむすべての患者に対し、根治療法化合物として、疾患の重症度に関連して投与されている。

国際公開第２００９／１３３１２８号、国際公開第２００９／１３３１４１号、国際公開第２００９／１３３１４２号、国際公開第２０１１／０５４７５９号、国際公開第２００９／０６８６６８号、および国際公開第２００９／１５３２９１号は、ＡＬＳを含むいくつかの神経変性疾患のための潜在的治療法を公開している。

非薬理的療法のガイドラインを定める初の取組みがおこなわれたが、基準は未だ専門家の意見に基づくものであり、国によって様々である。

したがって、筋萎縮性側索硬化症の治療のための新規で有効な療法が当技術分野において強く必要とされている。

本発明は、ＡＬＳおよび関連障害の治療のための新規の組成物および方法を提供する。中でも、本発明は、ＡＬＳを有する対象者に改善した治療効果と臨床的有用性とをもたらす薬剤の組合せの特定からなる。

より具体的には、本発明の目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療における使用のための、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾールおよびトラセミド、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の化学純度の誘導体、もしくは徐放性製剤から選択される少なくとも２つの薬剤を含む組成物に関する。

本発明のさらなる目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療において、その治療を必要とする対象者における治療の方法であり、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミド、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の化学純度の誘導体、もしくは徐放性製剤から選択される少なくとも２つの薬剤を対象者に投与することを含む方法である。

本発明における使用のための組合せ薬剤の好ましい例は、例えば、バクロフェンおよびアカンプロセート、トラセミドおよびバクロフェン、バクロフェンおよびシナカルセト、トラセミドおよびスルフィソキサゾール、メキシレチンおよびシナカルセト、または、バクロフェンおよびアカンプロセートおよびトラセミド、を含む。

本発明の特定の実施形態では、組成物は、リルゾール、またはその塩、プロドラッグ、任意の化学純度の誘導体、もしくは徐放性製剤をさらに含む。

本発明の組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み、対象者に繰り返し投与されてもよい。また、好適な組成物は経口投与される。さらに薬剤は、一緒に、個別に、または連続して製剤化または投与されてもよい。

本発明は、任意の哺乳類対象、特にヒト対象における、疾患の任意の段階でのＡＬＳの治療に適する。本発明は、疾患の発現の遅延のため、麻痺、運動ニューロン変性および／もしくは疼痛の低減、遅延もしくは抑止のため、ならびに／または生存期間の延長ために用いられてもよい。

図１は、ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸中毒に対する、バクロフェンとアカンプロセートとの組合せ療法の作用を示す。グルタミン酸中毒は、バクロフェン（４００ｎＭ）とアカンプロセート（１．６ｎＭ）との組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のバクロフェンおよびアカンプロセートは、中毒に対する有意な作用を有しない。＊：ｐ＜０．００１、グルタミン酸中毒と有意差がある（ＡＮＯＶＡ＋Ｄｕｎｎｅｔｔ Ｐｏｓｔ−Ｈｏｃテスト）。 図２は、神経筋細胞共培養モデルにおけるグルタミン酸（ＧＬＵ）中毒に対するバクロフェンとアカンプロセートとの組合せ療法の作用を、運動ユニットの（Ａ）領域、（Ｂ）数、および（Ｃ）神経突起長において示す。検討されるエンドポイントが何であっても、グルタミン酸中毒は、バクロフェン（ＢＣＬ、８０ｎＭ）とアカンプロセート（ＡＣＰ、０．３２ｎＭ）との組合せで有意に抑えられ、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のバクロフェンおよびアカンプロセートは、中毒に対する有意な作用を有しない。＊：ｐ＜０．０５、グルタミン酸中毒と有意差がある（ＡＮＯＶＡ＋Ｄｕｎｎｅｔｔ Ｐｏｓｔ−Ｈｏｃテスト）。 図３は、ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸毒性に対する、シナカルセトとメキシレチンとの組合せ療法の作用を示す。グルタミン酸中毒は、シナカルセト（６４ｐＭ）とメキシレチン（２５．６ｐＭ）との組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のシナカルセトおよびメキシレチンは、中毒に対する有意な作用を有しない。＊：ｐ＜０．００１、グルタミン酸中毒と有意差がある（ＡＮＯＶＡ＋Ｄｕｎｎｅｔｔ Ｐｏｓｔ−Ｈｏｃテスト）。 図４は、ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸中毒に対する、スルフィソキサゾールとトラセミドとの組合せ療法の作用を示す。グルタミン酸中毒は、スルフィソキサゾール（６．８ｎＭ）とトラセミド（４００ｎＭ）との組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のスルフィソキサゾールおよびトラセミドは、中毒に対する有意な作用を有しない。＊：ｐ＜０．００１、グルタミン酸中毒と有意差がある（ＡＮＯＶＡ＋Ｄｕｎｎｅｔｔ Ｐｏｓｔ−Ｈｏｃテスト）。 図５において、バクロフェン（ＢＣＬ）とアカンプロセート（ＡＣＰ）との組合せは、神経筋細胞共培養モデル、運動ユニットの（Ａ）領域および（Ｂ）神経突起長において、グルタミン酸中毒に対するリルゾール（ＲＩＬ）の保護作用のエンハンサーとして作用する。ＡＣＰ（０．１４ｎＭ）とＢＣＬ（３６ｎＭ）とが低濃度で用いられるとき、ＡＣＰ（０．３２ｎＭ）とＢＣＬ（８０ｎＭ）とから得られる作用と比較して、有意な強い促進作用が観測される。 図６において、バクロフェン（ＢＣＬ）とアカンプロセート（ＡＣＰ）とは、神経筋細胞共培養モデルにおけるグルタミン酸中毒に対する神経筋接合部の保護において、リルゾールと共に相乗的に作用する。運動ユニットの数、領域、および神経突起長が測定される際、保護の重大な改善が見受けられる。Ａでは、ＡＣＰ（０．１４ｎＭ）とＢＣＬ（３６ｎＭ）との混合物において２％から５％へのエンドポイントの改善が見受けられ、リルゾールを単独（０．０４μＭ）で用いる場合に１２％から１６％への改善が見受けられるが、一方で、３つの薬剤の組合せは、３９％から４３％への改善をもたらす。Ｂでは、ＡＣＰ（０．１４ｎＭ）とＢＣＬ（３６ｎＭ）との混合物において２％から５％へのエンドポイントの改善が見受けられ、リルゾール（５μＭ）を用いる場合に７０％から８８％への改善が見受けられるが、一方で、３つの薬剤の組合せは、１３１％から１６５％への改善をもたらす（＊：ｐ＜０．００１、グルタミン酸中毒と有意差がある、◇：ｐ＜０．００１、有意差（ＡＮＯＶＡ＋Ｄｕｎｎｅｔｔ Ｐｏｓｔ−Ｈｏｃテスト））。

本発明は、ＡＬＳまたは関連障害の治療のための新規の治療方法を提供する。より詳細には、本発明において、そのような疾患を有効に改善し、かつ任意の哺乳類対象者に用いられる、新規の組合せ療法が開示される。

本発明の文脈では、疾患の「治療」という用語は、疾患によって引き起された疼痛の治療、抑止、予防、遅延、または低減を含む。治療という用語は、疾患進行および関連する症状の管理を特に含む。ＡＬＳに関して、治療という用語はまた、麻痺の遅延もしくは発症遅延、運動ニューロン変性の低減もしくは抑止、疼痛の低減、および／または生存時間の延長を指す。

「ＡＬＳ関連障害」という用語は、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮（ＰＭＡ）、仮性球麻痺および進行性球麻痺（ＰＢＰ）、ならびに前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のような運動ニューロン障害に関する。

「組合せまたは組合せ治療／療法」という用語は、ある生物学的作用を引き起こすために少なくとも２つ以上の薬剤を対象者に併用投与する治療を指す。本発明の組合せ療法では、少なくとも２つの薬剤を一緒にもしくは個別に、同時にもしくは連続して投与してもよい。また、この少なくとも２つの薬剤を様々な経路およびプロトコルにより投与してもよい。その結果として、これらを一緒に製剤化してもよいが、組合せ薬剤を個別に製剤化することもできる。

上述のように、本発明は、ＡＬＳおよび関連障害の治療を必要とする対象者における、その治療のための薬剤組成物および方法に関する。

本発明は、より具体的には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または関連障害の治療における使用のための、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミド、またはそれらの塩、もしくはプロドラッグ、もしくは任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤からなる群より選択される少なくとも２つの薬剤を含む組成物に関する。

本発明者らは、これらの化合物が組合せで、ＡＬＳのインビトロモデルにおいて、ニューロン死の原因の１つであるグルタミン酸毒性に対する保護的活性を示すという驚くべき発見をした。

より具体的には、本発明の薬剤が、ＡＬＳにおける神経変性の病因学的原因の１つであるグルタミン酸毒性に対し、運動ニューロンに驚くべき保護的活性をもたらす、ということを本発明は示す。さらに、本発明者らは、これらの化合物が運動ユニットを有効に保護するように低用量で相乗的に作用することを認めた。このことは特に、任意の潜在的な副作用を避けるという実質的な有利性である。また、実験の項で示されるように、これらの組合せ療法は、ＡＬＳの動物モデルのインビボにおいて、麻痺の発症を遅延し、そして生存期間を延長することができる。ゆえに、これらの組合せ療法はＡＬＳ対象者の治療において実質的な改善を示す。

従って、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または関連障害の治療における使用のための、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミド、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤から選択される少なくとも２つの薬剤を含む組成物に関する。

また、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または関連障害の治療のため、その治療を必要とする対象者おいて、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミド、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤からなる群より選択される少なくとも２つの薬剤を対象者に投与することを含む方法に関する。

また、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または関連障害の治療における使用のため、その治療を必要とする対象者に、組合せ、個別、または連続投与される、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミド、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤から選択される少なくとも１つの第２薬剤との組合せにおける、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミド、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤から選択される化合物に関する。

本発明において使用される好ましい組合せは、ＡＬＳまたは関連障害の治療における使用のため、同時、連続または個別投与される、下記の組合せ薬剤、
‐バクロフェンおよびシナカルセト、
‐シナカルセトおよびアカンプロセート、
‐バクロフェンおよびアカンプロセート、
‐バクロフェンおよびアカンプロセートおよびトラセミド
‐メキシレチンおよびシナカルセト、
‐トラセミドおよびバクロフェン、または、
‐トラセミドおよびスルフィソキサゾール、
またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤、のうちの少なくとも１つを含む。

本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、本発明の化合物の任意の機能性誘導体（または前駆体）に関し、生体系へ投与されると、例えば自然化学反応（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、酵素触媒化学反応、および／または、代謝化学反応などの結果として、前述の化合物を生成する。通常、プロドラッグは、不活性であるか、または生じる薬剤より低活性であり、例えば、薬剤の物理化学的特性の改善、特定組織への標的化、薬剤の薬剤動態および薬力学的特性の改善、ならびに／または、望ましくない副作用の低減などに使用可能である。プロドラッグの設計に適する共通の官能基のいくつかは、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミン基、リン酸塩／ホスホン基およびカルボニル基を含むが、これに限らない。典型的に、これらの基の修飾を介して製造されるプロドラッグは、エステル類、炭酸塩類、カルバメート類、アミド類およびリン酸塩類を含むが、これには限らない。適切なプロドラッグ選択のための詳細な技術ガイダンスは技術常識である（参考文献１９〜２３）。加えて、プロドラッグの調製は当業者には既知の従来の方法によっておこなわれることが可能である。その他のプロドラッグを合成するために使用可能な方法は、本主題の数多くの先行文献に記載されている（参考文献２０、２４〜３０）。例を挙げると、アルバクロフェン・プラカルビルは、ＣｈｅｍＩＤ ｐｌｕｓ Ａｄｖａｎｃｅデータベース（ウェブサイト：ｃｈｅｍ．ｓｉｓ．ｎｌｍ.ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｈｅｍｉｄｐｌｕｓ／）に掲載されており、アルバクロフェン・プラカルビルは、バクロフェンのプロドラッグとしてよく知られている（参考文献３１および３２）。バクロフェンのプロドラッグの具体例は、Ｈａｎａｆｉ他の文献（参考文献３３、２０１１年）に掲載されており、具体的には、中枢神経系（ＣＮＳ）を標的に特定指向するバクロフェンエステルおよびバクロフェンエステルカルバメートが挙げられている。故に、このようなプロドラッグは本発明の組成物に特に適している。また、前述のアルバクロフェン・プラカルビルは、既知のプロドラッグであり、本発明の組成物において、バクロフェンの代わりに用いてもよい。バクロフェンのその他のプロドラッグは、特許出願である、国際公開第２０１０１０２０７１号、米国特許第２００９１９７９５８号、国際公開第２００９０９６９８５号、国際公開第２００９０６１９３４号、国際公開第２００８０８６４９２号、米国特許第２００９２１６０３７号、国際公開第２００５０６６１２２号、米国特許第２０１１０２１５７１号、国際公開第２００３０７７９０２号、および国際公開第２０１０１２０３７０号において見受けられる。

アカンプロセートの有用なプロドラッグである、アカンプロセートのパントイン酸エステルネオペンチルスルホニルエステル、ネオペンチルスルホニルエステルプロドラッグ、または潜在性カルボキシレートネオペンチルスルホニルエステルプロドラッグなどは、特に、国際公開第２００９０３３０６９号、国際公開第２００９０３３０６１号、国際公開第２００９０３３０５４号、国際公開第２００９０５２１９１号、国際公開第２００９０３３０７９号、米国特許第２００９／００９９２５３号、米国特許第２００９／００６９４１９号、米国特許第２００９／００８２４６４号、米国特許第２００９／００８２４４０号、および米国特許第２００９／００７６１４７号に掲載されている。

上述のようなプロドラッグは、本発明において、本明細書で開示される化合物の代わりに用いられてもよい。

化合物の「誘導体」という用語は、その化合物に、機能上および／または構造上関連するあらゆる分子を含み、そのような化合物の酸、アミド、エステル、エーテル、アセチル化変異体、ヒドロキシル化変異体、またはアルキル化（Ｃ１−Ｃ６）変異体などのことである。また、誘導体という用語は、先に挙げたような１つ以上の置換基を失った状態の構造上関連した化合物を含む。例として、ホモタウリンはアカンプロセートの脱アセチル化誘導体である。化合物の好ましい誘導体は、既知の方法で定められているように、前記化合物にかなりの程度の類似性を有する分子である。親分子と類似の指標を有する類似化合物は、ＰｕｂＣｈｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｅａｒｃｈ／）またはＤｒｕｇＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／）など、数多くのデータベースに見受けられる。より好ましい実施形態では、誘導体は、親薬剤に対して、０．４を超える、好ましくは０．５を超える、より好ましくは０．６を超える、さらにより好ましくは０．７を超える谷本類似係数（Ｔａｎｉｍｏｔｏ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を有するべきである。谷本類似係数は、２分子間の構造的類似の程度を測定するために広く用いられている。また谷本類似係数は、インターネット上で使用可能なｔｈｅ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｕｂｇｒａｐｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｈｏｒｎｔｏｎ−ｓｒｖ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＳＭＳＤ／）（参考文献３４〜３５）などのソフトウェアにより解析可能である。好適な誘導体は、構造上および機能上の両面において、親化合物に関連するべきであり、言い換えれば、誘導体はまた、少なくとも親薬剤の活性の一部を保持すべきであり、より好ましくは、誘導体は、運動ユニットのグルタミン酸毒性に対する保護活性を示すべきである（実験の項において例示される）。

誘導体という用語はまた、例えば、組織への投与後に通常は特別な酵素系を通過する薬剤における（生化学の）変化または作用の結果であり、その薬剤の生物活性を示すか、または保持する分子などの薬剤の代謝物を含む。代謝物は、親薬剤の治療作用の多くを担っていることが開示されている。具体的な実施形態では、本明細書で使用される「代謝物」は、親薬剤の活性の少なくとも一部を保持する改変または作用後の薬剤を指し、より好ましくは、運動ユニットにおけるグルタミン酸毒性に対する保護活性を示すべきである（実験の項において例示される）。代謝物の例には、薬剤の肝代謝の結果としてのトラセミドのヒドロキシル化形態を含む（Ｄｒｕｇ ｂａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ、参考文献３６）。

用語「塩」は、薬学的に許容され、そして比較的非毒性の、本発明における化合物の無機または有機酸付加塩を示す。医薬塩の形成では、酸性、塩基性、または双性イオン性の薬剤分子を対イオンと対形成させて薬剤の塩型を生成する。幅広い種類の化学種を中和反応において使用することができる。このように、本発明の薬学的に許容される塩は、塩基として機能する主化合物を、塩を形成するための無機または有機酸と反応させることにより得られる塩を含み、例として、酢酸、硝酸、酒石酸、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、またはクエン酸の塩が挙げられる。また、本発明の薬学的に許容される塩は、主化合物が酸として機能し、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩またはコリン塩を形成するために適切な塩基と反応させた塩を含む。所定の活性成分の大部分の塩は生物学的に同等であるが、とりわけ、一部の塩は溶解性または生物学的利用能が増加する可能性がある。現在、塩の選択は、Ｈ．ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ Ｗｅｒｍｕｔｈのハンドブックによる教示のように、薬剤開発過程において一般的な標準作業になっている（参考文献３７）。

好ましい実施形態では、化合物の指示は、化合物それ自体、および任意の薬学的に許容されるその塩、水和物、異性体、またはラセミ化合物を指すことを意図する。

下記の表１は、本発明に用いられる化合物ならびにそれらの化合物の塩、誘導体、代謝物、および／またはプロドラッグのＣＡＳ番号を提供する。

より好ましくは、本発明の薬剤組成物は、ＡＬＳまたは関連障害の治療を必要とする対象者におけるその組合せ治療のための、２、３、４、または５つの異なる薬剤、さらにより好ましくは２、３、または４つの異なる薬剤を含む。

特定の実施形態では、本発明は、バクロフェンおよびシナカルセト、またはアカンプロセートおよびシナカルセト、またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤を含む、組成物それ自体に関する。

さらに特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＳまたは関連障害の治療における使用のための、アカンプロセートおよびシナカルセト、またはそれらの塩、もしくはプロドラッグ、もしくは任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤を含む組成物に関し、アカンプロセートの１日当たりの用量は１０ｍｇと等しいか、またはより低い。

また、別の特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において、リルゾール、またはその塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤がさらに用いられる。実際に示される結果は、驚くべきことに、本発明の組成物がリルゾール（ＣＡＳ番号１７４４−２２−５）との組合せで用いられる際に、患者への治療の臨床的効果を実質的に増進することが可能であることを示す。

従って、本発明の具体的な目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療における、同時、個別または連続使用のための、ｉ）アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミドから選択される少なくとも１つの薬剤、ならびに、ｉｉ）リルゾールを含む組成物である。

本発明の別の具体的な目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療における、同時、個別または連続使用のための、ｉ）アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミドから選択される少なくとも２つの薬剤、ならびに、ｉｉ）リルゾールを含む、上述で開示されたような組成物である。

本発明の好適な目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療における、同時、個別または連続使用のための、下記の組合せ薬剤、
‐リルゾール、バクロフェン、およびシナカルセト、
‐リルゾール、シナカルセト、およびアカンプロセート、
‐リルゾール、バクロフェン、およびアカンプロセート、
‐リルゾール、バクロフェン、およびアカンプロセート、およびトラセミド、
‐リルゾール、メキシレチン、およびシナカルセト、
‐リルゾール、トラセミド、およびバクロフェン、または
‐リルゾール、トラセミド、およびスルフィソキサゾール、
またはそれらの塩、プロドラッグ、任意の純度の誘導体、もしくは徐放性製剤、のうちの少なくとも１つを含む組成物である。

本発明の組合せ薬剤と併用して用いられるその他の追加の療法として、ＡＬＳ疾患の症状を改善する１つ以上の薬剤、ＡＬＳ疾患の緩和治療に用いられる１つ以上の薬剤、またはＡＬＳ疾患の治療において現在臨床試験の枠組み内で評価されている１つ以上の薬剤を含んでもよい。好ましくは、前記１つ以上の薬剤は、ＡＥＯＬ １０１５０、アリモクロモル（ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）、ＡＶＰ−９２３、ボツリヌストキシンＢ型〔Ｍｙｏｂｌｏｃ〕、セフトリアキソン（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）、セラストロール（ｃｅｌａｓｔｒｏｌ）、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、ホンオニク属総グリコシド（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｔｏｔａｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、コエンザイムＱ１０、コパキソン（ｃｏｐａｘｏｎｅ）、クレアチン（ｃｒｅａｔｉｎｅ）、クレアチニン（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、ドロナビノール（ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌ）、エリスロポエチン、エスシタロプラム〔Ｌｅｘａｐｒｏ〕、グラチラマー酢酸塩、顆粒球コロニー刺激因子〔Ｇ−ＣＳＦ〕、成長ホルモン〔ソマトロピン（Ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ）〕、ＧＳＫ１２２３２４９、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、インスリン様成長因子‐１〔ＩＧＦ−Ｉ〕、ＩＧＦ−１−ＡＡＶ、ＫＮＳ−７６０７０４、レテプリニム（ｌｅｔｅｐｒｉｎｉｍ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、レベチラセタム（ｌｅｖｅｔｉｒａｃｅｔａｍ）、ＭＣＩ−１８６、メコバラミン（ｍｅｃｏｂａｌａｍｉｎ）、ミノサイクリン（ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、モダフィニル（Ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）、Ｎａａｌａｄａｓｅ阻害剤、Ｎ−アセチルシステイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ＮＢＱＸ、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、ニモジピン（ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）、オランザピン（ｏｌａｎｚａｐｉｎｅ）、オレソキシム（ｏｌｅｓｏｘｉｍｅ）〔ＴＲＯ１９６２２〕、ＯＮＯ−２５０６、オキセパ（ｏｘｅｐａ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、Ｒ（＋）プラミペキソール二塩酸塩一水和物、オレソキシム（ｏｌｅｓｏｘｉｍｅ）、オキサンドロロン（ｏｘａｎｄｒｏｌｏｎｅ）、キニジン（ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）、フェニル酪酸、ＳＢ−５０９、スクリプタイド（Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）、ｓＮＮ００２９、ソマトロピン（ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎｅ）、タランパネル（ｔａｌａｍｐａｎｅｌ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タウロウルソデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＣＨ３４６、テストステロン、サリドマイド、トレハロース、トレチノイン、ビタミンＥ、ＹＡＭ８０、または１７ベータエストラジオール、２−ＭＰＰＡ（２‐（３‐メルカプトプロピル）ペンタン二酸）、３，４‐ジアミノピリジン、５−ヒドロキシトリプトファン、７−ニトロインダゾール、アルファリポ酸、ＡＭ１２４１、アミノフィリン（ａｍｉｎｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、アンジオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、抗ヒトＳＯＤ１抗体、ｐ７５に対するアンチセンスペプチド核酸〔ＮＴＲ〕、ＡＰ７、アポシニン（ａｐｏｃｙｎｉｎ）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、ＢＤＮＦ、ＢＮ８２４５１、カンナビノール（ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ）、カルジオトロフィン−１、ＣＤ４抗体、ＣＮＴＦ、コリベリン（ｃｏｌｉｖｅｌｉｎ）、食事摂取による銅、コルチコトロフィン（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、デルタ（９）−テトラヒドロカンナビノール（Ｄｅｌｔａ（９）−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ）、ＤＨＥＡ、ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ）、食事摂取による亜鉛、ジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、ＤＭＰＯ、ＤＰ−１０９、ＤＰ−４６０、エダラボン（ｅｄａｒａｖｏｎｅ）、ＥＧＣＧ、エピガロカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）、エチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）、ＦｅＴＣＰＰ、フルボキサミン（ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ）、葉酸、ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）、ガレクチン−１（ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）、ＧＤＮＦ、チョウセンニンジン、ＧＰＩ−１０４６、グアニジン（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＨＧＦ、ヒューマニン（ｈｕｍａｎｉｎ）、ＩＦＮ−アルファ、インターロイキン−３、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、Ｌ−７４５，８７０、Ｌ−カルニチン（Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）、Ｌ−ＤＯＰＡ、レシチン化ＳＯＤ、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ＬＩＦ、Ｌ−ＮＡＭＥ、リシンアセチルサリチル酸（ｌｙｓｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、メラトニン、メピバカイン（ｍｅｐｉｖａｃａｉｎｅ）、メタンフェタミン（ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）、メチルコバラミン（ｍｅｔｈｙｌｃｏｂａｌａｍｉｎ）、ＭＫ−８０１、ＭｎＴＢＡＰ、モダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）、モルヒネ（ｍｏｒｐｈｉｎｅ）、Ｎｅｕ２０００、ＮＧＦ、ノルジヒドログアイアレチン酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ノルトリプチリン（ｎｏｒｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、ＮＴ３、オルメサルタン（ｏｌｍｅｓａｒｔａｎ）、ペニシラミン（ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、ピモジド（ｐｉｍｏｚｉｄｅ）、ポリアミン修飾カタラーゼ（ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｔａｌａｓｅ）、プラミペキソール（ｐｒａｍｉｐｅｘｏｌｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、プロメタジン（ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ）、プトレシン修飾カタラーゼ（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｔａｌａｓｅ）、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）、ラサギリン（ｒａｓａｇｉｌｉｎｅ）、ＲＫ３５、Ｒｏ ２８−２６５３、ロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、ＲＰＲ １１９９９０、ＲＸ７７３６８、 ＳＢ２０３５８０、セレギリン（ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）、セマピモド（ｓｅｍａｐｉｍｏｄ）、セルトラリン（ｓｅｒｔｒａｌｉｎｅ）、ＳＳ−３１、ＳＳＲ１８０５７５、ヒトＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ〔ＳＯＤ１〕に対する安定化ｓｉＲＮＡ、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、タムスロシン塩酸塩（ｔａｍｓｕｌｏｓｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＴＡＴ修飾Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）、ＴＧＦ−ベータ２、チアネプチン（ｔｉａｎｅｐｔｉｎｅ）、トリエンチン（ｔｒｉｅｎｔｉｎｅ）、ＴＲＯ１９６２２、Ｕ−７４３８９Ｆ、ＶＥＧＦ、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ＷＨＩ−Ｐ１３１、ＷＩＮ５５，２１２−２、ＷＸ−３４０、キサリプロデン（ｘａｌｉｐｒｏｄｅｎ）、ＺＫ １８７６３８、およびｚＶＡＤ−ｆｍｋから選択される。

上述で示したように、本発明の好ましい療法は、選択的にその他の治療にさらに関連するか、または組み合わされる２、３、４、またはさらに多くの異なる活性化合物を含む。本発明の組合せ療法では、化合物または薬剤は、一緒にまたは個別に製剤化され、そして一緒に、個別に、または連続して投与されてもよい。

また本発明は、ＡＬＳ疾患または関連障害の治療の方法に関し、その方法は、上述で開示したような組合せ薬剤を、同時に、個別に、または連続して対象に投与することを含む。

本発明の薬剤または組成物は、対象に繰り返し投与されてもよい。

本発明の組成物は、典型的には、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。

本発明のさらなる目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療用の薬剤を製造するための、その治療を必要とする対象への組合せ、個別、または連続投与による、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミドからなる群より選択される少なくとも２つの薬剤の使用に関する。

本発明のさらなる目的は、ＡＬＳまたは関連障害の治療用薬剤を製造するための、その治療を必要とする対象への組合せ、個別、または連続投与による、下記の組合せ薬剤、
‐バクロフェンおよびシナカルセト、
‐シナカルセトおよびアカンプロセート、
‐バクロフェンおよびアカンプロセート、
‐バクロフェンおよびアカンプロセートおよびトラセミド、
‐メキシレチンおよびシナカルセト、
‐トラセミドおよびバクロフェン、または、
‐トラセミドおよびスルフィソキサゾール、
のうちの少なくとも１つの使用に関する。

特定の実施形態では、本発明はまた、ＡＬＳまたは関連障害の治療用の薬剤を製造するための、その治療を必要とする対象への組合せ、個別、または連続投与による、リルゾールとの組合せの、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミドからなる群より選択される少なくとも１つの薬剤の使用に関する。

別の実施形態は、ＡＬＳまたは関連障害の治療用の薬剤を製造するための、その治療を必要とする対象への組合せ、個別、または連続投与による、リルゾールとの組合せの、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミドからなる群より選択される少なくとも２つの薬剤の使用に関する。

さらに特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＳまたは関連障害の治療用薬剤を製造するための、その治療を必要とする対象への組合せ、個別、または連続投与による、リルゾールとの組合せの、下記の組合せ薬剤、
‐バクロフェンおよびシナカルセト、
‐シナカルセトおよびアカンプロセート、
‐バクロフェンおよびアカンプロセート、
‐バクロフェンおよびアカンプロセートおよびトラセミド、
‐メキシレチンおよびシナカルセト、
‐トラセミドおよびバクロフェン、または、
‐トラセミドおよびスルフィソキサゾール、
のうちの少なくとも１つの使用に関する。

本発明のさらなる目的は、医薬組成物の調製方法であり、その方法は上述の化合物を適切な賦形剤または担体内に混合することを含む。

本発明の療法は、家庭で、医師の診療所、クリニックで、病院の外来で、または病院で提供されるので、医師はその治療効果を綿密に観察可能であり、そして必要なあらゆる調整を行うことが可能である。

治療の存続期間は、疾患の段階、患者の年齢および状態、そして患者の治療に対する反応の様子次第である。

また、さらなる神経障害（例えば、糖尿病などに遺伝子的にかかりやすいか、もしくはそれを有する人、または腫瘍を有する状態のため治療を受けている人など）の高い発現リスクを有する人は、結果として起こる神経障害反応を軽減するまたは遅延するための予防処置を受けてもよい。

各薬剤の、投与の用量、頻度、および方法は独立して管理されてもよい。患者の身体が、未だ予期しない任意の副作用から回復する機会をもつため、組合せ療法は休止期間を含むオン・オフサイクルでおこなわれてもよい。また薬剤は、１回の投与で組合せの両方の薬剤を送達するように一緒に製剤化されてもよい。

＜医薬組成物の製剤＞
各組合せ薬剤の投与は、その他の成分と組み合わせて、患者の状態を改善可能である薬剤の濃縮物として、任意の適切な手段によっておこなわれてもよい。

組合せの活性成分は、純粋な化学物質として投与されることが可能であるが、本文脈では医薬製剤としても言及される医薬組成物として提供されることが好ましい。可能な組成物として、経口、経直腸、経局所（経皮、経口腔、および舌下を含む）、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適する組成物が含まれる。

より一般的には、これらの医薬製剤は、幾つかの投与単位を含む「患者用パック」にして、または個別の治療期間に単一包装（通常はブリスターパック）で使用される計量単位用量の投与のための他の手段で、患者に処方される。患者用パックは、患者が常に患者用パックに含まれる添付文書を利用できる（従来処方では通常は紛失している）という点で、薬剤師が医薬の患者への供給分をバルク供給分から分割する従来処方よりも利点がある。また、添付文書の封入は、医師の指示に対する患者の服薬コンプライアンスを改善することが示されている。したがって、本発明は、前述の製剤に適切な包装材料を組み合わせた、本明細書に前記の医薬製剤をさらに含む。このような患者用パックにおいて、組合せ治療のための製剤の使用意図は、その治療に対し最も適切に製剤が使用されるように、指示、仕組み、供給、適用および／または他の手段により推察されることが可能である。このような評価基準により、患者用パックは、本発明の組合せでの治療のための使用に特に適切であり、相応する。

薬剤は、任意の適量で、任意の適切な担体物質中に含まれていてもよい。また薬剤は、組成物の総重量の１重量％〜９９重量％の量で提供されてもよい。組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内）、直腸内、経皮、鼻内、膣内、吸入、皮膚（パッチ）、または眼内の投与経路に適した投与剤形として提供されることが可能である。そして、本組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、泥膏、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、飲薬、浸透圧送達装置、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、噴霧剤、またはエアゾール剤の剤形を取り得る。

本医薬組成物は、従来の製薬の実務により製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．）、ｅｄ． Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ． Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ、１９８８−１９９９、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。

本発明にかかる医薬組成物は、投与直後に、または投与後の任意の所定の時点もしくは期間に、十分に活性薬剤を放出するように製剤化されることができる。

放出制御製剤は、（ｉ）長時間にわたり、体内で実質的に薬剤の一定濃度をもたらす製剤、（ｉｉ）所定の遅延時間後に、長時間にわたり体内で実質的に薬剤の一定濃度をもたらす製剤、（ｉｉｉ）活性薬剤物質の血漿レベルの変動に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えると共に、体内で比較的一定の有効薬剤レベルを維持することにより、所定の期間、薬剤作用を持続する製剤、（ｉｖ）例えば、患部組織もしくは臓器の近く、またはその中に放出制御組成物を空間配置することにより、薬剤作用を局在化させる製剤、および（ｖ）薬剤を特定の標的細胞型に送達するための担体または化学的誘導体を使用することにより、薬剤作用を標的化する製剤、を含む。

放出制御製剤の剤形における薬剤の投与は、その組合せ薬剤が、（ｉ）低い治療指数（すなわち、有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度との間の差が小さい。一般には、治療指数ＴＩは、５０％有効量（ＥＤ５０）に対する５０％致死量（ＬＤ５０）の比として定義される）、（ｉｉ）狭い消化管吸収域、または（ｉｉｉ）非常に短い生物学的半減期（これにより、血漿レベルを治療レベルに維持するために１日に頻回の投与が必要になる）を有する場合に特に好ましい。

問題の薬剤の放出速度が代謝速度を上回る放出制御を得るために、多数の方策のいずれも追求することができる。放出制御は、例えば、様々なタイプの放出制御組成物およびコーティングを包含する、種々の製剤パラメータおよび成分の適切な選択により得られる。すなわち、当該薬剤は、適切な賦形剤と共に、投与により薬剤を制御放出する医薬組成物（単一、または複数単位の錠剤またはカプセル剤組成物で、油性液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、およびリポソーム）に製剤化される。

＜経口使用のための固体投与剤形＞
シロスタゾールおよびリルゾールの好ましい投与経路は経口経路である。経口使用のための製剤は、医薬的に許容される非毒性の賦形剤との混合物中に活性成分を含有する錠剤を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性賦形剤または充填剤（例えば、ショ糖、微結晶性セルロース、バレイショデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、顆粒剤および崩壊剤（例えば、微結晶性セルロースを含むセルロース誘導体、バレイショデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネイト、またはアルギン酸）、結合剤（例えば、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）、ならびに潤滑剤、滑剤、および粘着防止剤（例えば、ステアリン酸、シリカ、またはタルク）であってよい。その他の医薬的に許容される賦形剤は、着色剤、香料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであってよい。

錠剤は、素錠であっても、または場合により消化管での崩壊および吸収を遅延させることにより長時間にわたり持続作用を提供するために、既知の手法によりコーティングされていてもよい。コーティングは、活性薬剤物質を既定のパターンで放出するようにつくる（例えば、放出制御製剤を得るため）か、または胃の通過後まで活性薬剤物質を放出しないようにつくる（腸溶性コーティング）ことができる。コーティングは、糖衣、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレート共重合体、ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンを基剤にする）、または腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、および／もしくはエチルセルロースを基剤にする）であってよい。時間遅延物質として、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを利用することができる。

固体の錠剤組成物は、組成物を不要な化学変化（例えば、活性薬剤物質の放出に先立つ化学分解）から保護することに適したコーティングを含んでもよい。このコーティングは、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載された方法と同様に固体投与剤形に適用されることが可能である。

数種の薬剤が、錠剤中で混合されていても、または仕切られていてもよい。例えば、第１の薬剤の放出前に第２の薬剤の大部分が放出されるように、第１の薬剤は錠剤の内側に、そして第２の薬剤は外側に含まれる。

経口使用のための製剤はまた、活性成分を不活性固体賦形剤（例えば、バレイショデンプン、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合したチュアブル錠として、もしくは硬ゼラチンカプセル剤として、または、活性成分を水もしくは油性媒体、例えば、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセル剤として提示してもよい。散剤および顆粒剤は、錠剤およびカプセル剤について上記で述べた成分を用いて、従来法で調製されることが可能である。

経口使用のための放出制御組成物は、例えば、活性薬剤物質の溶解および／または拡散を制御することにより活性薬剤を放出するように構成されてもよい。

溶解制御放出または拡散制御放出は、薬の錠剤製剤、カプセル剤製剤、ペレット製剤、もしくは顆粒剤製剤に適切なコーティングを施すことにより、または薬剤を適切なマトリックスに組み込むことにより得ることができる。放出制御コーティングは、上記で挙げられているコーティング物質のうちの１つ以上、および／または、例えば、セラック、ミツロウ、グリコワックス（ｇｌｙｃｏｗａｘ）、硬化ヒマシ油（ｃａｓｔｏｒ ｗａｘ）、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／もしくは、ポリエチレングリコールを含む。放出制御マトリックス製剤において、マトリックス物質はまた、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバロウおよびステアリルアルコール、カーボポール９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および／または、ハロゲン化フルオロカーボンを含む。

本特許請求における組合せのうち１つ以上の薬剤を含む放出制御組成物はまた、浮揚性錠剤またはカプセル剤（すなわち、経口投与されると、一定時間、胃の内容物上に浮いている錠剤またはカプセル剤）の剤形であってもよい。薬剤の浮揚性錠剤の製剤は、賦形剤および２０％〜７５％（ｗ／ｗ）の親水コロイド（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）との薬剤の混合物を顆粒化することにより調製されることが可能である。そして、得られた顆粒は錠剤へと圧縮されることが可能である。この錠剤は、胃液と接触すると、その表面周囲に、実質上水不透過性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは１未満の密度を維持することに寄与し、それによって錠剤が胃液中で浮揚性を保持できる。

＜経口投与用液剤＞
水の添加により水性懸濁液の調製に適している散剤、分散性散剤、または顆粒剤は、経口投与に便利な投与剤形である。懸濁液としての製剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、および１つ以上の保存剤との混合物として活性成分を提供する。適切な懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどである。

＜非経口投与用組成物＞
またあまり好ましくはないが、本医薬組成物は、注射、点滴またはインプラント（静脈内、筋肉内、皮下など）により、従来の非毒性の薬学的に許容される担体およびアジュバントを含む、投与剤形、製剤で、または適切な送達装置もしくはインプラントを介して、非経口投与されてもよい。このような組成物の製剤および調製は、医薬品製剤の当業者には周知である。

非経口使用の組成物は、単位投与剤形として（例えば、単回投与用アンプルとして）、または数回の用量を含み、その中に適切な保存剤を加えることが可能なバイアルとして提供されてもよい（以下を参照のこと）。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、点滴装置、もしくはインプラント用の送達装置の剤形をとることが可能であり、または使用前に水もしくは別の適切な媒体で再構成されるドライパウダーとして提供されてもよい。本組成物は、活性薬剤の他に、非経口投与に許容される適切な担体および／または賦形剤を含んでもよい。活性薬剤は、放出制御のためにマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、またはリポソームなどに組み込まれてもよい。また本組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、および／または分散剤を含んでもよい。

本発明の医薬組成物は無菌注射に適した剤形であってもよい。このような組成物を調製するために、適切な活性薬剤は非経口投与に許容される液体媒体に溶解または懸濁される。利用できる許容可能な媒体および溶媒には、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウムもしくは適切な緩衝剤を添加して適切なｐＨに調整した水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。また水性製剤は、１つ以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル、またはｎ−プロピル）を含んでもよい。薬剤の１つが水にやや溶けにくいか溶けにくい場合は、溶解増強剤もしくは可溶化剤を添加してもよい。あるいは、溶媒は１０％〜６０％（ｗ／ｗ）のプロピレングリコールなどを含んでもよい。

非経口用放出制御組成物は、水性懸濁剤、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁性マイクロスフェア、油性液剤、油性懸濁剤、または乳剤の剤形であってもよい。あるいは、活性薬剤は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または点滴装置に組み込まれてもよい。マイクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製に使用される物質は、例えば、ポリグラクチン、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）などの、生分解性／生浸食性ポリマーである。非経口用放出制御製剤を製剤化するときに使用可能である生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。インプラントに使用される物質は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）、または生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）、もしくはポリ（オルトエステル））であってもよい。

＜その他の経路＞
好ましさ、便利さには欠けるが、その他の投与経路およびそのための他の製剤を考慮してもよい。これに関し、直腸内適用では、組成物に適する投与剤形として、坐剤（乳剤または懸濁剤型）、および直腸用ゼラチンカプセル剤（液剤または懸濁剤）が含まれる。典型的な坐剤製剤では、活性薬剤は、薬学的に許容される適切な坐剤基剤（カカオバター、エステル化脂肪酸、グリセリンゼラチンなど）、および種々の水溶性または分散性基剤（ポリエチレングリコールなど）と組み合わせられる。また、様々な添加剤、増強剤、または界面活性剤が組み込まれてもよい。

本医薬組成物はまた、マイクロスフェアおよびリポソームを含む、従来の非毒性の薬学的に許容される担体および賦形剤を含有する投与剤形または製剤として、経皮吸収のために皮膚上に局所投与されてもよい。製剤としては、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、液剤、懸濁剤、スティック剤、噴霧剤、泥膏剤、硬膏剤、および他の種類の経皮薬物送達システムが含まれる。薬学的に許容される担体または賦形剤として、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、および皮膚保護剤を含んでもよい。

乳化剤は、天然起源のゴムであってもよい（例えば、アラビアガム、トラガカントガムなど）。

保存剤、保湿剤、浸透促進剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルのようなパラベン類、および塩化ベンザルコニウム、グリセリン、プロピレングリコール、尿素などであってよい。

また、皮膚への局所投与のための上述の医薬組成物は、治療されるべき身体の部分への、またはその近くへの局所投与に関連して使用されてもよい。組成物は、直接の適用に、または、包帯、もしくは代替的な硬膏、パッド、スポンジ、ストリップ、もしくは他の形態の適切な柔軟性のある素材などの特別な薬剤送達装置による適用に適合させてもよい。

＜用量および治療の期間＞
本組合せ薬剤は、同一もしくは異なる医薬品製剤のいずれかで同時に、または連続して投与されるとよい。連続投与である場合、活性成分のうちの１つを投与する際の遅延は、活性成分の組合せの有効な作用の恩恵を失わないようにすべきである。本詳細な説明に記載の組合せにとって最小限の要件は、組合せにおいて、活性成分の組合せの有効作用の恩恵を伴う組合せでの使用が意図されるべきであるということである。本組合せで意図される使用は、本発明の組合せの使用を補助するための仕組み、設備、適用および／または他の手段により推察されることが可能である。

シロスタゾールの治療有効量は、ＡＬＳ疾患の発現リスクを抑止または低減し、ＡＬＳ疾患が臨床的に顕在化した場合のＡＬＳ疾患の進行を停止または緩慢にするのに適した量である。

本発明における用量の好ましい例において、
‐メキシレチンは、１日当たり約６ｍｇ〜１２０ｍｇ、好ましくは１日当たり６０ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり３０ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり１５ｍｇ未満であり、特に経口投与に適する用量、
‐トラセミドは、１日当たり約０．０５ｍｇ〜４ｍｇ、好ましくは１日当たり２ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０.５ｍｇ未満であり、特に経口投与に適する用量、
‐アカンプロセートは、１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１日当たり４００ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり２００ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり５０ｍｇ未満、または、さらに１日当たり１０ｍｇ未満であり、特に経口投与に適する用量、
‐バクロフェンは、１日当たり０．０１ｍｇ〜１５０ｍｇ、好ましくは１日当たり１００ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり５０ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり３０ｍｇ未満であり、特に経口投与に適する用量、
‐シナカルセトは、１日当たり約０．３ｍｇ〜１５０ｍｇ、より好ましくは１日当たり１００ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり３６ｍｇ未満であり、特に経口投与に適する用量、
‐スルフィソキサゾールは、１日当たり約２０ｍｇ〜８００ｍｇであり、特に経口投与に適する用量、
‐リルゾールは、１日当たり約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１日当たり７５ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり５０ｍｇ未満であり、さらにより好ましくは１日当たり２５ｍｇ未満であり、特に経口投与に適する用量、
である。

実際に投与される薬剤量は、治療されるべき（１つまたはそれ以上の）状態、投与される的確な組成物、個々の患者の年齢、体重および反応、患者の症状の重症度、ならびに選択される投与経路を含む関連する状況に照らして、医師により決定される。さらには、特定の患者に対する薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態、薬力学または有効性プロファイルに及ぼす遺伝子型の影響）情報が、使用される用量に影響を与え得る。したがって、上述の用量範囲は、本明細書における教示のための一般的なガイダンスおよびサポートを提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の活性薬剤は、例えば、１日２回または３回の分割用量で投与されてもよいが、組合せの各薬剤の１日１回服用が好ましく、単一医薬組成物（単位投与剤形）での全ての薬剤の１日１回服用が最も好ましい。「単位投与剤形」という用語は、ヒト対象のための単位用量に適した物理的に個別のユニット（カプセル剤、錠剤、または充填済み注射シリンジなど）に関し、各単位は、望ましい治療効果を生み出すように算出された所定量の活性物質（単数または複数）を、必要な医薬担体と一緒に含む。

投与が１日１回〜数回、数日〜数年にわたることはあり得ることで、患者の生涯にわたることさえある。長期投与または少なくとも定期的に反復される長期投与が、多くの症例において示されている。

最も好ましい実施形態では、本発明の組合せはリルゾールとの組合せで用いられ、すべての薬剤は経口投与される。そのようなプロトコルにおいて、リルゾールは好ましくは反復して、例えば毎日、より好ましくは１日当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの１日量で、さらにより好ましくは１日当たり０．１ｍｇ〜１００ｍｇの１日量で、最も好ましくは１日当たり０．１ｍｇ〜５０ｍｇで、そしてその他の薬剤は上述で示した用量で、投与される。

薬剤は、同時に、すなわち、全く同時または同じ製剤である必要はないが、およそ同じ時間に投与されてもよい。特にリルゾールは、そこに存在し、体内において組合せで作用可能であることを確実にするために、他の薬剤やおよそ同じ時間帯に摂取されるあらゆるものとは別に製剤化されてもよい。また、リルゾールが、アカンプロセート、バクロフェン、シナカルセト、メキシレチン、スルフィソキサゾール、およびトラセミドから選択される少なくとも２つの薬剤を含む組合せと交互に投与されるという治療的プロトコルを定義することも可能である（例えば、ある日はリルゾール、翌日は前記組合せ、というように続く）。また、本発明の組合せ療法が各患者において最も効果的になることを確実にしながら、医師により様々なプロトコルが調整または規定されてもよいということを留意すべきである。

以下の実施例は、例示を目的として述べるもので、限定する目的ではない。

＜＜ＡＬＳモデルにおける組合せ薬剤の保護作用＞＞
本発明の組合せ療法は、神経筋肉共培養モデルのラットの皮質細胞においてインビトロで、ＡＬＳのマウスモデルにおいてインビボでテストされた。方法および結果を本項において示す。

すべての動物実験において、実験動物の維持と使用はアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインに従っておこなわれ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｂｏａｒｄによる承認を受けた。

（１）ニューロン細胞の一次培養におけるグルタミン酸毒性に対する保護作用
グルタミン酸毒性はＡＬＳの発病に関連する。この実験一式で、候補化合物の、ニューロン細胞におけるグルタミン酸の毒性作用を抑止または低減する能力をテストした。薬剤について、最初に個別にテストをし、続いて組合せ作用の評価をする。

＜ニューロン細胞の調製＞
本発明の組合せ薬剤の効能は、一次皮質ニューロン細胞でまず評価された。

ラットの皮質ニューロンは、Ｓｉｎｇｅｒ他（参考文献３８）の記述のように培養された。妊娠後１５日の妊娠期間の雌のラット（ウィスターラット）を頚椎脱臼により短時間で安楽死させ、そしてその胎児を子宮から取り出した。皮質を取り出し、そして、２％ペニシリン１０．０００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、氷温のＬｅｉｂｏｖｉｔｚの培地（Ｌ１５）に配置した。皮質を、２０分間、３７oＣで、トリプシンにより分離した（０．０５％）。ＤＮａｓｅ１グレードＩＩおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の添加によって反応を停止した。その後、１０ｍｌピペットを用いて、３連続継代で、機械的に細胞を解離し、そして＋４℃で、１０分間、５１５ｘｇで遠心分離をした。上清は廃棄され、細胞のペレットを、Ｂ２７（２％）、Ｌ−グルタミン（０．２ｍＭ）、２％ＰＳ溶液、および１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで補完したＮｅｕｒｏｂａｓａｌからなる既定培地に再懸濁した。トリパンブルー排除法を用いて、Ｎｅｕｂａｕｅｒサイトメータで生存細胞をカウントした。９６ウェルプレート（ポリ‐Ｌ‐リジン（１０μｇ／ｍｌ）で、ウェルをあらかじめコーティングした）を用いて、３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で細胞を播種し、そして加湿空気（９５％）／ＣＯ_２（５％）環境において、＋３７℃で培養した。

＜グルタミン酸毒性評価＞
化合物の神経保護作用は、グルタミン酸作動性ニューロンを特異的に示す神経突起網（ニューロフィラメント免疫染色（ＮＦ））の定量化により評価された。

ニューロン培養の１２日後、候補組合せの薬剤を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解した。そしてグルタミン酸損傷の前に、候補組合せをニューロンとともに１時間プレインキュベートした。さらなる薬剤希釈を避けるため、インキュベーションの１時間後に、候補組合せの存在下で、グルタミン酸を４０μＭの最終濃縮物に２０分間加えた。インキュベーションの最後に、培地を、グルタミン酸を除いた候補組合せの培地に変えた。グルタミン酸損傷後、培養を２４時間固定した。陽性対照群として、ＭＫ８０１（ジゾシルピン水素マレイン酸塩（Ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅｈｙｄｒｏｇｅｎ ｍａｌｅａｔｅ）、７７０８６−２２−７、２０μＭ）を用いた。

サポニン（Ｓｉｇｍａ）で透過処理後、１０％ヤギ血清を含むＰＢＳで細胞を２時間遮断し、そして、ニューロフィラメント抗体（ＮＦ、Ｓｉｇｍａ）に対するマウスモノクローナル一次抗体で細胞を培養した。この抗体はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗−マウスＩｇＧで示された。

細胞核は、蛍光マーカ（ヘキスト溶液、ＳＩＧＭＡ）によって標識され、神経突起網が定量化された。条件毎に６ウェルが用いられて、３つの異なる培養におけるニューロン生存が評価された。

＜結果＞
テストをしたすべての組合せ薬剤は、グルタミン酸毒性に対する保護作用を皮質ニューロン細胞にもたらす。結果を下記表２に示す。

図１、図３および図４で例示されるように、本発明の組合せは、上述の実験の条件下で、グルタミン酸毒性からニューロンを強力に保護する。単独で使用される薬剤が有意な保護作用を有しないか、またはより低い保護作用を有する薬剤濃度を用いても、有効な保護作用があることが分かったことは特筆すべきである。

実際に、図３で例示されるように、メキシレチンとシナカルセトとの組合せは、グルタミン酸毒性からニューロン細胞を有効に保護するが、一方で、単独の薬剤は保護作用を提供しない。バクロフェンとアカンプロセートとの組合せ（図１）は、グルタミン酸毒性に対する保護作用をニューロン細胞にもたらす。バクロフェンとアカンプロセートとの組合せは、単独のアカンプロセートと比較して２００％を上回る改善、そして単独で使用されるバクロフェンと比較して４７％を上回る改善をもたらす。

（２）神経筋肉共培養の一次培養におけるグルタミン酸毒性に対する保護作用
＜神経および筋肉細胞の一次共培養＞
先述の方法にしたがって、ヒトの筋肉を健康な対象者の生検の部分から用意する（参考文献３９）。筋肉細胞を、解離細胞（ウェル毎に２万細胞）から株化し、０．１％ゼラチンコーティングした４８ウェルプレート上に配置し、そして、グルタミン２ｍＭ、ウシインスリン１０μｇ／ｍｌ、ヒト組み換え上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、ヒト組み換え繊維芽細胞増殖因子塩基性（ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂａｓｉｃ）２ｎｇ／ｍｌ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ならびに１００００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補完した２５％Ｍ１９９培地と７５％ＭＥＭ培地との混合からなる増殖培地で成長させる。

衛星細胞融合後すぐに、生後１３日のウィスターラットの４つの後根神経節（ＤＲＧ）が付随した胚脊髄の横断面全体を、筋肉単層上に配置した（中央領域に１ウェルにつき１外植片）。ＤＲＧは神経支配の適切な割合を達成するために必要である。神経支配された培養物は、グルタミン２ｍＭ、５％ＦＣＳ、ウシインスリン５μｇ／ｍｌ、ならびに１００００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補完した混合培地（２５％Ｍ１９９を伴う７５％ＭＥＭ）にて保持される。

共培養の２４時間後、脊髄外植片から成長する神経突起が観察される。神経突起は筋管に接触して、約８日後に最初の収縮を引き起こす。その後直ちに、脊髄外植片に近接する神経支配された筋肉繊維は、実質的には連続して収縮する。神経支配された繊維は、非神経支配繊維と形態的および空間的に区別され、容易に識別可能である。

＜グルタミン酸損傷＞
２７日目に、共培養物を、２０分間のグルタミン酸中毒（６０μＭ）の１時間前に、候補化合物、その組合せ、またはリルゾールと共にインキュベートする。そして、共培養物を洗浄し、候補化合物、その組合せ、および／またはリルゾールをさらに４８時間添加する。このインキュベーション時間の後、非固定共培養物を、Ａｌｅｘａ ４８８と結合したα-ブンガロトキシンと共に、５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、室温で１５分間、インキュベートする。その後、共培養物を、室温で２０分間、ＰＦＡにより固定する。０．１％のサポニンで透過処理後、共培養物を、マウスモノクローナル抗ニューロフィラメント抗体（ＮＦ、１／４００希釈）と共にインキュベートする。

これらの抗体はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ ヤギ抗−マウスＩｇＧ（分子プローブ、１／４００希釈）で検知される。ニューロンの核は蛍光マーカ（ヘキスト溶液、同一の溶液内で１μｇ／ｍｌ）により標識される。

エンドポイントは（１）総神経突起長、（２）運動ユニット数、（３）総運動ユニット領域であり、これらは運動ニューロンの生存および機能の指標である。

各条件で、ＩｎＣｅｌｌ ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ １０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ウェル毎の２×１０の写真を、２０倍の拡大率で撮影する。すべての画像は同様の条件で撮影される。

＜リルゾールでの前処理を伴うグルタミン酸損傷＞
２３日目に（すなわち前処理まで４日）、共培養物をリルゾールと共にインキュベートする。４日後（すなわち２７日目）、組合せ薬剤をグルタミン酸添加の１時間前に加え、そしてグルタミン酸（６０μＭ）を２０分間加える。その後共培養物は、上述のように免疫蛍光分析用に処理される。

＜結果＞
薬剤が組合せで用いられるとき、単独で用いられる際には効果が見られない濃度で、３つのエンドポイントすべてにおいて、有意な保護作用が見受けられる。テストをした組合せ薬剤を表３に記載し、図２において例示する。この予期せぬ相乗効果によって非常に低い用量での薬剤の使用が可能になるので、潜在的副作用を克服できる。

本発明の組合せ薬剤は、３つのエンドポイントにおいて、インビトロモデルで、グルタミン酸毒性に対するリルゾールの保護的作用を促進する（表４）。

本発明者らは、本発明の組合せが筋肉神経共培養モデルにおけるリルゾールの保護作用を増強することを発見した。実際に、リルゾール処置をしたグルタミン酸毒性細胞へのバクロフェンおよびアカンプロセートの添加は、細胞に与える保護作用の改善をもたらす。図５に示されるように、発明者らはさらに、この増強効果が特に重大になる薬剤濃度を特定することができた（アカンプロセート０．１４ｎＭおよびバクロフェン３６ｎＭ）。

図６において例示されるように、本発明の組合せ薬剤は、グルタミン酸毒性に対して神経筋接合部を保護するように、リルゾールと共に相乗的に作用する。注目すべきことに、ほとんど効果のない用量（バクロフェンとアカンプロセートとをそれぞれ３６ｎＭ、０．１４ｎＭ）で使用するとき、リルゾール処理をした細胞培地におけるバクロフェンとアカンプロセートとの混合物の添加は、グルタミン酸損傷に対するリルゾールの保護作用をほとんど２倍にする（またはさらに多くなる）という結果をもたらす。

ゆえにまた、本発明の組成物は、その他のＡＬＳ治療（より具体的にはリルゾール）またはＡＬＳの候補治療の付加的療法として特に有効である。

（３）組合せ療法のＡＬＳマウスモデルにおける有効性
トランスジェニックヘテロ接合型マウスのＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／ＪマウスおよびＷＴマウス（１０１２系統、ＪＡＸ）が、模倣ＡＬＳの実験一式において選択された。罹患マウスは、内因性ヒトＳＯＤ１プロモータにより駆動される変異型ヒトＳＯＤ１遺伝子（コドン９３におけるアラニンへのグリシンの単一アミノ酸置換）で設計された、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ導入遺伝子を発現する。

動物は、標準的な温度（２２°Ｃ±１°Ｃ）で、飼料と水とを適宜利用できる調光環境下（午前７時から午後８時まで点灯）で飼育される。すべてのＧ９３Ａ ＳＯＤ１マウスは、生後１００日目から、ケージ内に設置された湿潤粉体飼料（ペースト状にするために水と混合した標準的な実験用飼料）および栄養ゲルを受け取る。さらに、吐水部はマウスが床面の高さから容易に利用できるように延長されている。

＜薬剤投与＞
マウスは、生後６０日目から生後１５０日になるまで、媒体で希釈した候補薬剤の投与を受けた。候補薬剤の希釈溶液は，投与開始の直前に、室温にて水で調製される。リルゾールおよび組合せ薬剤のいずれも経口投与される。シクロデキストリンは、保存用溶液（２０％シクロデキストリン）から、室温において水で希釈した５％の最終濃度で媒体として用いられる。組合せ薬剤（１０ｍｌ／ｋｇ）および媒体での処置は生後６０日から始まり、マウスが生後１５０日になるまで継続される。組合せ薬剤は、午前８〜１１時および午後４〜７時の間に１日２回経口投与される。

＜実験におけるマウスの準備＞
研究用グループの準備において（すなわち、テスト、または処置される対照体）、トランスジェニックマウスは無作為にグループ化され、マウスのすべての同腹仔が１つのテストグループにならないようにして、結果全体における「同腹仔作用」を避ける。さらに、グループの雄と雌との比率を等しく釣り合うようにする。

雌のマウスは最大５グループで飼育され、雄のマウスは単独で飼育される。マウスはあらゆる実験の開始に先立って、少なくとも１時間、実験室に慣らされる。またマウスは、その飼育ケージ内で飼育部屋から実験室へと移される。

＜体重＞
体重の減少は疾患発現と深く関連していることを証明しており、疾患段階と連結して容易に点数化される。マウスは、生後６０日〜９１日のとき、各週の同じ日（月曜日）に週１回体重を計量され、生後９１日（１３週）に達した後は、週に３回（月曜日、水曜日、金曜日）体重を計量される。

＜臨床スコアリング＞
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの産生を記載した原論文（参考文献４０）は、疾患の早期発症（〜１００日）および平均して４０日以内で最終段階に達する発症マウスの急速な衰弱（生存期間の典型は１３０日〜１５０日）を報告している。ゆえに、下記に記載するような臨床スコアリングを用いて、生後９１日目までは週に１回（月曜日）、そして生後９１日に達した後は週に３回（月曜日、水曜日、金曜日）、マウスは慎重に検査される。

最も初期の臨床的徴候は、マウスを尾で空中に一時的にぶら下げた時の肢の振戦および震えである。臨床スコアリングシステムでは１〜５のスケールがあり、１は安楽死のエンドポイントとして、５は疾患の発症徴候がほとんどないか、またはなく、健康であることを示す。動物は、尾の付け根で優しく持ち上げられ、振戦、硬直度、および開脚能力を観察されて、スコアをつけられる。

スコアリングシステムは、
５＝健康、
４〜５＝総じて健康、軽度の振戦、非常に活動的、四肢の開脚、
４＝観察可能な軽度の振戦、四肢の開脚、非常に活動的、
３〜４＝いくらかの軽度の硬直を伴う振戦、非常に活動的、
３＝振戦、肢の硬直、いくらかの軽度の麻痺の可能性、活動的、
２〜３＝振戦、部分的な麻痺、硬直、四肢の開脚への奮闘、活動的、
２＝麻痺、やや活動的、
１〜２＝後肢の麻痺、後肢の開脚なし、動物の行動および３０秒以内に自身で正常にもどる能力次第で安楽死がおこなわれる、
１＝エンドポイント、動物は自身で正常にもどれない、
である。

スコアが疾患段階４に達するとき疾患の発症が記録される。

＜行動テスト＞
すべての行動テストは、媒体群のＴＧマウスの約７０％が失われたとき、２０週齢で中止される。この年齢以降、残りのマウスは運動テストをするには大変衰弱しており、体重計量、疾患段階および生存スコアリングをするのみである。

＜オープンフィールドテスト＞
オープンフィールドテスト測定は、投与が始まる前（基準）、約９０日目（１３週齢）、および１１０日目（１６週齢）におこなわれる。生後２〜４日以内のマウスがオープンフィールドテスト用に利用される。活動室（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ， Ｓｔ Ａｌｂａｎｓ， ＶＴ；２７×２７×２０．３ｃｍ）にはＩＲビームを備える。マウスは部屋の中心に配置されて、その行動が１０分間記録される。移動した距離、垂直立ち上がりの回数、および平均速度が記録される。

＜ロータロッド＞
ロータロッドテストは、投与が始まる前（基準）、約９０日目（１３週齢）、および１１０日目（１６週齢）におこなわれる。生後２〜４日以内のマウスがオープンフィールドテスト用に利用される。１日のセッションには、ロータロッド装置（ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、米国）上において４ＲＰＭで５分間の訓練試行が含まれる。動物は、１時間後に、３６０秒以上で０〜４０ＲＰＭの速度変化および実験中の少なくとも３０分の休憩を伴う、６分の３連続加速実験のテストを受ける。棒からの落下までの時間が記録される。棒上に３６０秒以上残っているマウスは除かれ、その時間は３６０秒としてスコアをつける。

＜結果＞
組合せ療法はＡＬＳのインビボモデルで有効である。

本発明の組合せ薬剤で処置をした疾患動物に疾患の改善が見受けられた。特に、本発明の組合せ薬剤は、疾患の様々な段階におけるこれらの動物の臨床スコア（表５）、そしてまた上述の行動テストにおける成績（表６）を、効果的に改善する。

本発明の組成物はまた、リルゾール処置をした動物における臨床スコアおよび疾患の経過の改善に有効である。

参考文献
1- Camu W, Khoris J, Moulard B, Salachas F, Briolotti V, Rouleau GA, MeiningerV, Genetics of familial ALS and consequences for diagnosis. French ALS ResearchGroup. J Neurol Sci. 1999; 165 Suppl 1(S21-26)
2- Mitchell JD, Borasio GD, Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet 2007;369(9578):2031-41.
3- Phukan J, Pender NP, Hardiman O, Cognitive impairment in amyotrophic lateralsclerosis. Lancet Neurol. 2007; 6(11):994-1003.
4- Hammad M, Silva A, Glass J, Sladky JT, Benatar M,Clinical,electrophysiologic, and pathologic evidence for sensory abnormalities in ALS.Neurology.2007; 69(24):2236-42.
5- Yoshida S, Kihira T, Yase Y, Etiology of Kii ALS/PDC, featuring a mineralhypothesis. Rinsho Shinkeigaku. 2007; 47(11):970-3.
6- Waring SC, Esteban-Santillan C, Reed DM, Craig UK, Labarthe DR, Petersen RC,Kurland LT, Incidence of amyotrophic lateral sclerosis and of theparkinsonism-dementia complex of Guam, 1950-1989. Neuroepidemiology. 2004;23(4):192-200.
7- Sapp PC, Rosen DR, Hosler BA, Esteban J, McKenna-Yasek D, O'Regan JP, HorvitzHR, Brown RH Jr, Identification of three novel mutations in the gene for Cu/Znsuperoxide dismutase in patients with familial amyotrophic lateral sclerosis.Neuromuscul Disord. 1995; 5(5):353-7.
8- Hentati A, Ouahchi K, Pericak-Vance MA, Nijhawan D, Ahmad A, Yang Y, RimmlerJ, Hung W, Schlotter B, Ahmed A, Ben Hamida M, Hentati F, Siddique T, Linkageof a commoner form of recessive amyotrophic lateral sclerosis to chromosome15q15-q22 markers. Neurogenetics. 1998; 2(1):55-60.
9- Ruddy DM, Parton MJ, Al-Chalabi A, Lewis CM, Vance C, Smith BN, Leigh PN,Powell JF, Siddique T, Meyjes EP, Baas F, de Jong V, Shaw CE, Two families withfamilial amyotrophic lateral sclerosis are linked to a novel locus onchromosome 16q. Am J Hum Genet. 2003; 73(2):390-6.
10- Pasinelli P, Brown RH, Molecular biology of amyotrophic lateral sclerosis:insights from genetics. Nat Rev Neurosci. 2006; 7(9):710-23.
11- Gurney ME, Transgenic-mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. N Engl JMed. 1994; 331(25):1721-2.
12- Deng HX, Shi Y, Furukawa Y, Zhai H, Fu R, Liu E, Gorrie GH, Khan MS, Hung WY,Bigio EH, Lukas T, Dal Canto MC, O'Halloran TV, Siddique T, Conversion to theamyotrophic lateral sclerosis phenotype is associated with intermolecularlinked insoluble aggregates of SOD1 in mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A.2006; 103(18):7142-7.
13- Cai H, Lin X, Xie C, Laird FM, Lai C, Wen H, Chiang HC, Shim H, Farah MH,Hoke A, Price DL, Wong PC, Loss of ALS2 function is insufficient to triggermotor neuron degeneration in knock-out mice but predisposes neurons tooxidative stress. J Neurosci. 2005; 25(33):7567-74.
14- Comi GP, Bordoni A, Salani S, Franceschina L, Sciacco M, Prelle A, FortunatoF, Zeviani M, Napoli L, Bresolin N, Moggio M, Ausenda CD, Taanman JW, ScarlatoG, Cytochrome c oxidase subunit I microdeletion in a patient with motor neurondisease. Ann Neurol. 1998; 43(1):110-6.
15- Borthwick GM, Taylor RW, Walls TJ, Tonska K, Taylor GA, Shaw PJ, Ince PG,Turnbull DM, Motor neuron disease in a patient with a mitochondrial tRNAIlemutation. Ann Neurol. 2006; 59(3):570-4.
16- Lambrechts D, Storkebaum E, Morimoto M, Del-Favero J, Desmet F, Marklund SL,Wyns S, Thijs V, Andersson J, van Marion I, Al-Chalabi A, Bornes S, Musson R,Hansen V, Beckman L, Adolfsson R, Pall HS, Prats H, Vermeire S, Rutgeerts P,Katayama S, Awata T, Leigh N, Lang-Lazdunski L, Dewerchin M, Shaw C, Moons L,Vlietinck R, Morrison KE, Robberecht W, Van Broeckhoven C, Collen D, AndersenPM, Carmeliet P, VEGF is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis in miceand humans and protects motoneurons against ischemic death. Nat Genet. 2003;34(4):383-94.
17- Bigio EH, Lipton AM, White CL 3rd, Dickson DW, Hirano A.Frontotemporal andmotor neurone degeneration with neurofilament inclusion bodies: additionalevidence for overlap between FTD and ALS. Neuropathol Appl Neurobiol. 2003Jun;29(3):239-53.
18- Lacomblez L, Bensimon G, Leigh PN, Guillet P, Meininger V.Dose-ranging studyof riluzole in amyotrophic lateral sclerosis. Lancet 1996;347:1425-1431.
19. EttmayerP, Amidon GL, Clement B, Testa B, Lessons learned from marketed and investigationalprodrugs. J Med Chem, 2004. 47(10): p. 2393-404.
20. BeaumontK, Webster R, Gardner I, Dack K Design of ester prodrugs to enhance oralabsorption of poorly permeable compounds: challenges to the discoveryscientist. Curr Drug Metab, 2003. 4(6): p. 461-85.
21. YangCY, Dantzig AH, and Pidgeon C, Intestinal peptide transport systems and oraldrug availability. Pharm Res. 1999. 16(9): p. 1331-43.
22. Steffansen,B., Nielsen CU, Brodin B, Eriksson AH, Andersen R, Frokjaer S, Intestinalsolute carriers: an overview of trends and strategies for improving oral drugabsorption. Eur J Pharm Sci, 2004. 21(1): p. 3-16.
23. HeimbachT, Oh DM, Li LY, Rodriguez-Hornedo N, Garcia G, Fleisher D, Enzyme-mediatedprecipitation of parent drugs from their phosphate prodrugs. Int J Pharm, 2003.261(1-2): p. 81-92.
24. Stella, BORCHARDT R, HAGEMAN M, OLIYAI R, MAAG H, TILLEY J, Prodrugs: Challenges andRewards. Vol. Vol. 1-2. 2007, New York: AAPS Press and Springer.
25. WermuthCG, Designing prodrugs and bioprecursors, in The Practice of MedicinalChemistry, Hardbound, Editor. 2003.
26. PezronI, Mitra AK, Duvvuri S, Tirucherai GS, Prodrug strategies in nasal drugdelivery. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2002. 12(3): pp. 331-340(10).
27. Stella,V.J., Prodrugs as therapeutics Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2004.14(3): p. pp. 277-280(4).
28. HiguchiT, Stella VJ, Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS SymposiumSeries., ed. A.C. Society. 1975, Washington, DC.
29. RocheEB, Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs. 1977,Washington, DC American Pharmaceutical Association.
30. StellaVJ, Nti-Addae KW, Prodrug strategies to overcome poor water solubility. AdvDrug Deliv Rev, 2007. 59(7): p. 677-94.
31. LalR, Sukbuntherng J, Tai EH, Upadhyay S, Yao F, Warren MS, Luo W, Bu L, Nguyen S,Zamora J, Peng G, Dias T, Bao Y, Ludwikow M, Phan T, Scheuerman RA, Yan H, GaoM, Wu QQ, Annamalai T, Raillard SP, Koller K, Gallop MA, Cundy KC, Arbaclofenplacarbil, a novel R-baclofen prodrug: improved absorption, distribution,metabolism, and elimination properties compared with R-baclofen. J PharmacolExp Ther, 2009. 330(3): p. 911-21.
32. XuF, Peng G, Phan T, Dilip U, Chen JL, Chernov-Rogan T, Zhang X, Grindstaff K,Annamalai T, Koller K, Gallop MA, Wustrow DJ, Discovery of a novel potentGABA(B) receptor agonist. Bioorg Med Chem Lett, 2011. 21(21): p. 6582-5.
33. HanafiR, Mosad S, Abouzid K, Niess R, Spahn-Langguth H., Baclofen ester and carbamateprodrug candidates: a simultaneous chromatographic assay, resolution optimizedwith DryLab. J Pharm Biomed Anal, 2011. 56(3):569-76.
34. LeachAR, Gillet VJ, An Introduction to Chemoinformatics. 2007: Springer.
35. RahmanSA, Bashton M, Holliday GL, Schrader R, Thornton JM, Small Molecule SubgraphDetector (SMSD) toolkit. J Cheminform, 2009. 1(1): p. 12.
36. WishartDS, Knox C, Guo AC, Cheng D, Shrivastava S, Tzur D, Gautam B, Hassanali M,DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets. NucleicAcids Res, 2008. 36(Database issue): p. D901-6.
37. Stahl,H. and C.G. Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection,and Use. 2 ed. 2011: Wiley-VCH.
38. Singer CA, Figueroa-Masot XA, Batchelor RH, and Dorsa DMMitogen-activatedprotein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamatetoxicity in primary cortical neurons. J. Neuroscience, 1999. 19(7):2455-2463.
39. Braun S, Croizatb B, Lagrangec MC, Wartera JM, Poindron P. Neurotrophinsincrease motoneurons' ability to innervate skeletal muscle fibers in rat spinalcord-human muscle cocultures.Volume 136, Issues 1-2, March 1996, Pages 17-23.
40. GurneyM, Pu H, Chiu A, Dal Canto M, Polchow C, Alexander D, Caliendo J, Hentati A,Kwon Y, Deng H, Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Znsuperoxide dismutase mutation. Science. 1994 Jun 17;264(5166):1772-5.

Claims (13)

1. ＡＬＳ、または原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮（ＰＭＡ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）から選択される関連疾患の治療に使用するための、アカンプロセートおよびバクロフェン、またはそれらの塩もしくは徐放性製剤を含む組成物。
2. トラセミド、またはその塩もしくは徐放性製剤をさらに含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
3. リルゾール、またはその塩もしくは徐放性製剤をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。
4. 薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
5. 前記化合物は、一緒に、個別に、または連続して製剤化または投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
6. 前記組成物は対象者に繰り返して投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
7. リルゾールは、１日当たり０．０１ｍｇ〜５０ｍｇの用量で投与される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
8. アカンプロセートは、１日当たり５０ｍｇ未満の用量で投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
9. アカンプロセートは、１日当たり１０ｍｇ未満の用量で投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
10. バクロフェンは、１日当たり３０ｍｇ未満の用量で投与される、請求項１〜９のいずれ
    か１項に記載の使用のための組成物。
11. 前記組成物は経口投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
12. 前記組成物は、リルゾールと交互に、１日おきに繰り返して経口投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
13. 前記化合物は一緒に製剤化される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。