JP6122438B2 - 液体クロマトグラフィ用の多孔質粒子およびその調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフィの分野に関する。本発明はさらに、充填液体クロマトグラフィカラムにおいて固定相として使用される多孔質粒子およびその調製方法に関する。

液体クロマトグラフィ（ＬＣ）カラムは広範囲にわたって開発がなされており、また分析用および分取用の両方のクロマトグラフィで日常的に使用される。成分の混合物を含む試料（被検体または溶質とも呼ばれる）のクロマトグラフィカラム中での分離は、液体移動相に試料を溶解し、典型的には管状カラム内に充填されている固定相にその移動相を通すことによって、異なる成分の移動相と固定相の間での異なる分配（すなわち、それら成分は異なる分配係数を有する）により試料をその各成分に分離することによって達成される。典型的に、液体クロマトグラフィにおいて固定相は、カラム内に充填された粒子の吸着床の形態である。本発明は、このようないわゆる充填カラムに関する。

一般にはシリカ粒子が固定相吸着床として使用される。非多孔質シリカ粒子は、試料収容能力が低い。したがって一般には多孔質シリカ粒子が使用され、これは固定相の表面積を増すように細孔の網目を含み、こうして分離能力を向上させる。細孔は、２ｎｍ未満のサイズのミクロ細孔であっても、２ｎｍ〜５０ｎｍのメソ細孔であっても、また５０ｎｍを超えるマクロ細孔であってもよい。分離の速度および分解能を向上させるために細孔のサイズを減らす傾向があるが、これは動作圧力を増加させることを代償にしている。また多孔質粒子は過大な粒度分布のものであることもできる。これはピーク分解を限定する。細孔が粒子の全体にわたって広がる完全多孔質シリカ粒子に代わるものは、いわゆる表面多孔質粒子、すなわちそれらの表面のみが多孔質である粒子を使用することであった。これらは妥当な動作圧力を、だが依然として高い分解能のままで使用することを可能にする。それらはまた、狭い粒度分布の可能性を与える。表面多孔質粒子は、外側の多孔質シェルを有する非多孔質のコアを備える。結果として多孔質シェルは短い物質移動距離、したがって迅速な物質移動および迅速な試料の分離をもたらす。これは、例えばタンパク質などの大型生体分子の分離にとって重要である。表面多孔質粒子は、ＡｇｉｌｅｎｔからＰｏｒｏｓｈｅｌｌ（商標）カラムが、またＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）カラムがＨＰＬＣ用に市販されている。

米国特許第３，５０５，７８５号明細書に記載されている既知の手順では、表面多孔質シリカ粒子は、中実のコアとして働く非多孔質シリカ微小球の表面へのシリカコロイドの多層コーティングにより調製される。２層から３０層の間のコロイド粒子が記載されている。この配置は表面の相溶性によって引き起こされ、幾つかの例では相互作用を引き起こすためにシリカ粒子の表面の前処理または変性が必要である。この手順は、現実のコアとしてはかなり複雑であり、シェル粒子が一つ一つ調製され、コアコーティングのステップが続く。この手順はまた、各層を別個のステップで塗布しなければならないために非常に長い工程であり、かつ最終の表面多孔質粒子の粒径および粒度分布を再現するのが難しい。

表面多孔質シリカの別の調製方法は、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｆ．Ａ．Ｔｒｕｓｚｋｏｗｓｋｉ，ａｎｄ Ｃ．Ｈ．Ｄｉｌｋｓ Ｊｒ，Ｇ．Ｓ．Ｅｎｇｅｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，８９０（２０００）３−１３に記載されているコアセルベーション法である。この方法では中実（すなわち非多孔質）のシリカ微小球をポリマーとシリカゾルのコアセルベートによってコーティングし、その後ポリマーを高温で加熱することによって除去する。しかしながらこの多段手法は、多少のコア粒子がコーティングされずに非多孔質粒子を残す可能性があり、かつ多少の完全多孔質粒子が形成される可能性があるという点でさらなる不利点を有する。同様に、本出願の優先日の後に公開された国際公開第２０１２／０１８５９８号パンフレットは、少なくとも２ステップの合成によって形成される表面多孔質粒子について記載しており、まず種となる（ｓｅｅｄｅｄ）シリカ粒子または他の粒子を合成し、次いで多孔質層をその上に生じさせる。

上記手法は、表面多孔質粒子の土台としてのシリカミクロ粒子の表面に多孔質層を使用する。米国特許出願公開第２０１０／００５１８７７号明細書に記載されている別の方法は、シリカミクロ粒子の表面の仮像変換を伴う。この工程の間にコア粒子の外層を溶解し、再沈殿させて表面に多孔質層を形成する。しかしながらこの手法は、第一反応においてコア粒子を形成し、次いでさらなる反応において処理して表面の仮像変換を行い、表面多孔質粒子を形成するためにそれを回収することが必要である。したがってこの手法は、過大な調製時間および再現性の点で不利点を有する。コアは、まず成長させ、品質管理のために調べ、次いで類別しなければならない。これには数週間を要する可能性がある。次いでシェルをコア上に発現させ、所定の厚さまで成長させなければならない。そうする際に粒径が変化しかつ粒度分布が広がり、それは場合によってはさらなる類別を必要とし、さらに数週間を要する可能性がある。

従来はシリカミクロ粒子自体は、Ｓｔｏｂｅｒ法（Ｗ．Ｓｔｏｂｅｒ，Ａ．Ｆｉｎｋ，Ｅ．Ｂｏｈｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２６，Ｉｓｓｕｅ １，１９６８，ｐ．６２−６９）の変型を使用して製造される。この方法ではオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を、エタノールなどのアルコールとアンモニアを含有する過剰な水に加える。ＴＥＯＳの加水分解および縮合によりシリカ粒子が生成される。

多孔質の単分散シリカミクロ粒子を生成するためにＴＥＯＳに代わるシリカ前駆物質供給源としてメルカプト−シランを使用することが、以前にＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００７，２３（２２），ｐｐ．１０８７５−１０８７８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｎｄ Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００１，５０，ｐｐ７７−９０、およびＬｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１１，２７（７）、ｐｐ３３７２−３３８０に記載されている。一般にメルカプト−シランの濃度を増すと粒径が大きくなることが分かっている。他方で、塩基濃度を増すと粒径が減少する。これらの研究で報告されたシリカミクロ粒子は多孔質であるが、ほとんど平滑である。すなわち表面多孔質については何も報告されていない。

これを背景にして本発明がなされた。

本発明の一態様によれば表面多孔質シリカ粒子を製造するためのワンポット法が提供される。この方法は、官能基を含むシリカ前駆物質を加水分解し、縮合して表面多孔質シリカ粒子を形成するステップを含む。この表面多孔質シリカ粒子は、表面により小さなシリカナノ粒子が結合している実質上非多孔質のシリカミクロ粒子を含む。

本発明の別の態様によれば本発明の方法によって得られる表面多孔質シリカ粒子が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、その上により小さなシリカナノ粒子が付着しているシリカミクロ粒子を含む表面多孔質シリカ粒子が提供される。この表面多孔質シリカ粒子のさらなる特徴を以下に記述する。

最初の調製時にそのミクロ粒子およびナノ粒子は、好ましくはメルカプト（ＳＨ）、アミノ（ＮＨ_２）、ヒドロキシル（ＯＨ）、またはエポキシから選択される官能基、最も好ましくはメルカプトを備える。しかしながら、この官能基は、焼結時に６００〜１２５０℃で他の有機官能基と共に実質上燃え尽くされることになる。

本発明のさらに別の態様によれば、液体クロマトグラフィにおける固定相としての本発明の表面多孔質シリカの使用法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、表面多孔質の球体上球体（ｓｐｈｅｒｅｓ−ｏｎ−ｓｐｈｅｒｅ）粒子から作られる、またはそれを含む固定相が提供される。この粒子は、液体クロマトグラフィ、特にＨＰＬＣなどの分離化学において改良された性能を示すので有利である。固定相は、大型生体分子の分離に適している。

本発明のさらに好ましい特徴は、特許請求の範囲の中で詳述される。

形成される粒子は表面多孔質であり、多孔質シェルを有する。本発明により提供される各表面多孔質粒子は、より小さな球体（すなわちナノ粒子）の被膜がコア球体の表面にあるコア球体（すなわちミクロ粒子）の形態を有する。したがって表面多孔質粒子は、球体上球体の形態を有する。したがって表面多孔質粒子は、本明細書中では多くの場合、球体上球体粒子、例えば球体上球体シリカと呼ばれる。典型的には、ナノ粒子はミクロ粒子上の実質上１層であるが、本発明の幾つかの実施形態では多重層が形成されてもよい。下記でより詳細に説明するように、本発明の方法では、典型的にワンポット反応合成において最初にミクロ粒子が形成され、その後にミクロ粒子の表面でのナノ粒子の制御された成長が続くことが分かった。このミクロ粒子およびナノ粒子は、便利には同じ前駆物質から形成することができる。したがって本発明の方法は、従来技術の方法と比べて高速であり、かつ手順的に簡単である。

シリカ前駆物質の加水分解および縮合が、ミクロ粒子およびそのミクロ粒子の表面のナノ粒子の両方を形成する。前駆物質を加水分解し縮合する工程は、好都合には表面に結合したより小さいナノ粒子によって取り囲まれたミクロ粒子を形成するワンポット合成として行うことができることが分かった。この工程を単一のポット中で行うことができることは明らかに有利であり、したがって好ましくは前駆物質を加水分解し縮合するステップはワンポット合成である。したがって、このようにして本発明は、単一のステップで多孔質シェル粒子を製造するこの方法を洗練することによって、幾つかの労働集約的なステップを必要とする従来技術の方法の問題点の少なくとも幾つかを減少させる。本発明の方法は、所望の球体上球体構造およびその表面多孔度の制御を達成するために単純な反応混合物を必要とするので報告されている方法とは異なる。

本発明は本明細書中で述べる表面多孔質シリカおよびその使用法と、その製造方法を提供するが、本発明はシリカ以外の半金属または金属酸化物に適用することもできる。この金属酸化物は、適切な前駆物質の加水分解および縮合によりミクロ粒子として形成することができることが知られている任意の金属酸化物であることができる。例には、これらに限定されないが、亜鉛（Ｚｎ）酸化物、銅（Ｃｕ）酸化物、アルミニウム（Ａｌ）酸化物、チタン（Ｔｉ）酸化物、ジルコニウム（Ｚｒ）酸化物、ニッケル（Ｎｉ）酸化物、および鉄（Ｆｅ）酸化物が挙げられる。幾つかの実施形態では、金属酸化物の上にシリカがある（すなわち同質の金属酸化物ではなく、シリカ以外のものである）球体上球体粒子を調製するための鋳型剤としてシリカ粒子を使用することが可能な場合もある。

一般に表面多孔質粒子のコアのミクロ粒子は、それらのナノ粒子の表面被膜よりも気孔が少ない。ミクロ粒子コアは実質的に非多孔質（すなわち実質的に中実）である。すなわち気孔が殆どまたは全くない。

コアミクロ粒子は、好ましくは１μｍ〜１００μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜５０μｍ、より好ましくは１μｍ〜２０μｍ、さらに一層好ましくは１μｍ〜１５μｍ、最も好ましくは１μｍ〜１０μｍ、とりわけ２μｍ〜５μｍの範囲にある粒径を有する。望ましくはミクロ粒子のサイズは少なくとも１μｍである。また望ましくはミクロ粒子のサイズは１０μｍ未満である。このミクロ粒子のサイズは、レーザー回析技術により測定されるものである。本明細書中の実施例ではミクロ粒子のサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００分析計を用いたレーザー回析技術により測定された。粒度体積分布（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｖｏｌｕｍｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）が得られ、これは典型的にはおおむね釣鐘型曲線である。本明細書中で意味する平均サイズとは、この分布におけるピークサイズ、すなわち曲線の最高点におけるサイズである。

ナノ粒子は、好ましくは１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にある粒径を有する。より好ましくはナノ粒子は、少なくとも１０ｎｍ、さらに一層好ましくは少なくとも２０ｎｍ、なお一層好ましくは５０ｎｍ、さらになお一層好ましくは１００ｎｍ、最も好ましくは少なくとも２００ｎｍの粒径を有する。より好ましくはナノ粒子は、１０００ｎｍ未満、さらに一層好ましくは８００ｎｍ以下、なお一層好ましくは５００ｎｍ以下、最も好ましくは４００ｎｍ以下の粒径を有する。望ましくはナノ粒子は、１０ｎｍ〜８００ｎｍ、より望ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍ、より望ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍ、最も望ましくは１５０ｎｍ〜４００ｎｍや２００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲にある、例えば約２００ｎｍの粒径を有する。このナノ粒子のサイズは、動的レーザー散乱（ＤＬＳ）技術により測定されるものである。本明細書中の実施例ではナノ粒子のサイズは、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ８０２ ＤＬＳ分析計を用いて測定された。ＤＬＳからの本明細書中で使用される主要な結果は、強度分布からの平均値（Ｚ平均と呼ばれる）であり、恐らく散指数（ＰＤＩ）を使用してその分布幅を記述することができる。得られる粒度分布は、この場合は典型的におおむね釣鐘型曲線であり、平均サイズはこの分布におけるピークのサイズ、すなわち曲線の最高点である。

表面多孔質、すなわち球体上球体の粒子は、好ましくは１μｍ〜１００μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜５０μｍ、より好ましくは１μｍ〜２０μｍ、さらに一層好ましくは１μｍ〜１５μｍ、最も好ましくは１μｍ〜１０μｍ、とりわけ２μｍ〜５μｍの範囲にある粒径を有し、レーザー散乱法によって測定される。粒径の範囲もまた関連がある。好ましくは表面多孔質粒子は、３．５以下の、より好ましくは３．０以下の、なお一層好ましくは２．０以下の、さらに一層好ましくは１．６以下の、最も好ましくは１．４以下のＤ_９０／Ｄ_１０を有する。ただし、Ｄ_９０は、レーザー散乱技術によって測定される体積分布における第９０百分位数の直径であり、またＤ_１０は第１０百分位数の直径である。この粒径は、上記と同様にレーザー散乱技術によって測定されるものである。本明細書中の実施例では表面多孔質粒子のサイズはＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００分析計を用いて測定された。粒径は、下記でより詳細に述べるように工程条件を変えることによって制御することができる。

より小さなナノ粒子をミクロ粒子の表面に結合させる。ナノ粒子間の空間または割れ目が細孔をもたらすので、ナノ粒子はミクロ粒子の表面に多孔質層を形成する。すなわち表面の細孔は、表面に詰まったナノ粒子によって生み出される。細孔は、典型的には５ｎｍ未満の細孔径であり、とりわけミクロ細孔、すなわち２ｎｍ未満の細孔径である。より小さなナノ粒子が、そのミクロ粒子を取り囲む多孔質シェルを形成することが好ましい。ナノ粒子が、ミクロ粒子を完全に被覆することが好ましい。ナノ粒子のシェルは、厚さが薄い。シェルは、好ましくはナノ粒子の厚さが実質上１層のみである。粒子の調製工程をミクロ粒子上にナノ粒子の単一層（単層）を生じさせるように行うことができ、前駆物質の最初の投入によりそのようにする傾向がある。２層、所望であれば恐らく３層以上さえ備えたナノ粒子シェルをワンポット合成で形成することが可能である。下記に説明するようにミクロ粒子の成長段階の後、すなわちナノ粒子の成長段階の間に前駆物質のさらなる量を添加することにより２層以上のナノ粒子を生じさせることができることが分かった。多孔質のナノ粒子表面層の安定性は、粒子をか焼することによって向上させることができる。しかしながらナノ粒子の単層を有する粒子が最も安定であることが分かった。単層の薄い多孔質層の厚さでさえ、効率的なクロマトグラフ分離にとって十分すぎるほどであることが分かった。薄い多孔質層の厚さは物質移動距離が短く、したがって迅速な物質移動および迅速な試料分離が可能であることを意味する。

典型的に表面多孔質粒子は、表面への小さなナノ粒子の充填により小さな細孔径を有する。非局在密度汎関数理論（ｎｏｎ−ｌｏｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ）（ＤＦＴ）によって計算される表面多孔質粒子の細孔径は、好ましくは５ｎｍ未満、より好ましくは３ｎｍ未満、さらに一層好ましくは２ｎｍ未満である。

表面多孔質粒子の気孔率は、好ましくは３０〜７０％の範囲にある。

か焼（すなわち、少なくとも５５０℃）後の表面多孔質粒子の表面積は、好ましくは、優先傾向が増す順に少なくとも１０ｍ^２／ｇ、少なくとも２５ｍ^２／ｇ、少なくとも５０ｍ^２／ｇ、少なくとも７５ｍ^２／ｇ、少なくとも１００ｍ^２／ｇ、少なくとも１５０ｍ^２／ｇ、または少なくとも１７５ｍ^２／ｇである。最も好ましくは表面多孔質粒子の表面積は少なくとも２００ｍ^２／ｇである。実例は典型的に１０〜２５０ｍ^２／ｇの範囲の表面積を有することが分かった。

表面多孔質粒子は、改良された機械的安定性を与えるために熱処理、すなわちか焼にかけることができる。本発明の別の利点は、球体上球体粒子が、球体上球体の形態の著しい変形なしに高温、例えば１２５０℃までの温度に対して頑丈であることである。したがって球体上球体の形態の著しい損傷なしに粒子をか焼することができる。好ましくは表面多孔質粒子は、クロマトグラフィの固定相として使用される前にか焼される。

本発明は、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）において固定相吸着床として使用するのに適した表面多孔質粒子を提供し、この粒子はＬＣカラム中に容易に充填することができる。そのＬＣは、順相（ＮＰ）ＬＣでもよく、また逆相（ＲＰ）ＬＣでもよい。好ましくはこの表面多孔質粒子は、ＲＰ固定相として使用される前に官能基化される。このＬＣは、無勾配または勾配溶離条件下であることができる。逆相ＬＣの場合、好ましくは勾配溶離条件が使用される。このＬＣは、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィ（ＵＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）、または別のＬＣ手法であることができる。例えばこのＬＣは、タンパク質などの大型生体分子のＬＣに役立つことができる。多孔質シェルおよび非多孔質コアの存在はすぐれた物質移動特性を実現することができ、その結果として迅速な物質移動、したがってタンパク質などの大型生体分子の迅速な分離をもたらす。したがって本発明は、タンパク質などの大型生体分子のゆっくりとした分離という従来技術の問題を減ずる。表面多孔質粒子はまた、ＨＰＬＣにおける高い背圧に関係する問題を減少させることができる。

この方法は、好ましくは、メルカプト基を含有するシリカ前駆物質（本明細書中ではメルカプト−シリカ前駆物質と呼ぶ）を使用する（ただし、本明細書中で前駆物質に関する言及は、前駆物質の混合物を使用する場合もまた含む）。しかしながらこの方法は、アミノ基を含有する前駆物質（本明細書中では、例えばアミノ−シリカ前駆物質と呼ぶ）および／またはヒドロキシル基を含有する前駆物質（本明細書中では、例えばヒドロキシ−シリカ前駆物質と呼ぶ）および／またはエポキシ基を含有する前駆物質（本明細書中では、例えばエポキシ−シリカ前駆物質と呼ぶ）を使用することもできる。したがって前駆物質の官能基は、好ましくはメルカプト、アミノ、ヒドロキシル、およびエポキシから選択され、最も好ましくはメルカプトである。便宜上、以後の本発明の記述は、主としてメルカプト基を含有する最も好ましい前駆物質のケース、より具体的にはメルカプト−シリカ前駆物質のケースを指すことにするが、文脈上別の解釈をする必要がある場合を除き、メルカプト−シリカ前駆物質に関する言及は、対応するアミノ−シリカ前駆物質、ヒドロキシル−シリカ前駆物質、またはエポキシ−シリカ前駆物質に関する言及によって置き換えることができることを理解されたい。シリカ以外の、例えば別の金属酸化物の表面多孔質粒子を形成する場合、本明細書においてそのメルカプト−シリカ前駆物質などは、これらの官能基の１つを含有する金属酸化物前駆物質であることができる。

メルカプト−シリカ前駆物質は、好ましくはメルカプト−シランである。より好ましくはメルカプト−シリカ前駆物質は、アルキル−メルカプト基、好ましくは（Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル）−メルカプト、例えば３−メルカプト−プロピルを含有する。メルカプト−シランは、好ましくは次の一般式
のものである。
式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は独立してＨ、非置換または置換アルキル（好ましくはメチルまたはエチル）であり、Ｘは非置換または置換アルキル（好ましくはＣ_１〜Ｃ_４アルキル、特にプロピル）である。シリカ供給源として特に好ましいメルカプト−シリカ前駆物質は、３−メルカプト−プロピル−トリメトキシ−シラン（ＭＰＴＭＳ）である。他の好適な前駆物質には、３−メルカプト−プロピル−トリエトキシ−シラン（ＭＰＴＥＳ）を挙げることができる。前述のようにシリカ前駆物質は、上記式中で−ＳＨ基を−ＮＨ_２（アミノ）基、または−ＯＨ基、またはエポキシ基で置き換えたアミノ−シリカ前駆物質、ヒドロキシル−シリカ前駆物質、またはエポキシ−シリカ前駆物質であることができる。さらにＳｉを、Ｍ（Ｍは、例えばＺｎ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｎｉ、およびＦｅからなる群の中の金属である）によって置き換えることができる。

メルカプト−シリカ前駆物質の量は、最終の表面多孔質粒子のサイズに影響を与えることがある。表面多孔質粒子は、典型的には最初のミクロ粒子成長段階のメルカプト−シリカ前駆物質の量を増すにつれて増加する。下記に説明するようにミクロ粒子成長段階の後に、すなわちナノ粒子成長段階の間にさらなる量のメルカプト−シリカ前駆物質を加えることにより、さらなるナノ粒子形成、例えば２層以上のナノ粒子の形成を実現することができることが分かった。

メルカプト−シリカ前駆物質の量（２種類以上のメルカプト−シリカ前駆物質が使用される場合はメルカプト−シリカ前駆物質の合計量を意味する）は、好ましくは０．０５〜３重量部（ｗｔ部）の範囲である。その出発混合物中のメルカプト−シリカ前駆物質の量は、好ましくは少なくとも０．０５重量部、より好ましくは少なくとも０．１重量部、さらに一層好ましくは少なくとも０．３重量部、最も好ましくは少なくとも０．５重量部である。出発混合物中のメルカプト−シリカ前駆物質の量は、好ましくは３重量部以下である。

メルカプト−シリカ前駆物質が、好ましくはただ一つのシリカ供給源として使用される。これは、反応混合物の単純さのために、またメルカプト基を有するシリカ前駆物質が効果的な球体上球体の形態をもたらすことが分かったために有利である。しかしながら、例えばシリカ粒子の形態の多様性を生み出すために、メルカプト−シリカ前駆物質を１種類以上の他のシリカ供給源（すなわち、メルカプト基または本明細書中で指定した他の官能基を有しない）の量と一緒に使用することもできるが、これは典型的に球体上球体粒子形成の効率を下げることが分かった。好適な追加のシリカ供給源の例には、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）およびオルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、ならびに加水分解および縮合によってシリカを形成することが知られている他のシリカ供給源が挙げられる。好ましくはメルカプト−シリカ前駆物質（メルカプト−シリカ前駆物質の混合物の場合もまた含めて）がただ一つのシリカ供給源として好ましくは使用され、または任意の他のシリカ前駆物質が存在する場合、それはシリカ前駆物質の合計量の１０重量％未満、より好ましくは５重量％未満の量で存在する。

加水分解は、好ましくは塩基で触媒される。したがってこの工程は、好ましくはアルカリ性ｐＨを与えるためにその反応媒体または混合物中に一定量の塩基を含ませるステップを含む。最初の塩基性反応媒体のｐＨは、反応が進むにつれて次第に増加するが、その出発ｐＨは存在する塩基の量によって制御することができる。反応媒体の出発ｐＨ（すなわち、加水分解および縮合反応の開始時の）は、好ましくは９以上であり、またより好ましくは９．５以上である。出発ｐＨは、好ましくは１１以下であり、またより好ましくは１０．５以下である。好ましい出発ｐＨは９．０〜１１．０の範囲にあり、また最も好ましい出発ｐＨは９．５〜１０．５の範囲、例えば９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、または１０．４である。

好ましい塩基は水酸化アンモニウムであるが、他の塩基、例えば水酸化ナトリウムを使用することもできる。水酸化アンモニウムの量は、３０％ＮＨ_３標準グレード溶液換算で、好ましくは少なくとも０．１重量部、より好ましくは少なくとも０．２重量部、さらに一層好ましくは少なくとも０．３重量部、最も好ましくは少なくとも０．４重量部である。水酸化アンモニウムの量は、３０％ＮＨ_３標準グレード溶液換算で、好ましくは１重量部以下である。

加水分解および縮合反応のための媒体には水が挙げられる。水は、好ましくは少なくとも３重量部、より好ましくは少なくとも５重量部、さらに一層好ましくは少なくとも７重量部の量で存在する。好ましくは１５重量部以下、より好ましくは１０重量部以下の水が使用される。したがって好ましい範囲には３〜１５重量部および５〜１０重量部の水が挙げられる。

水に加えてこの工程は、好ましくは有機溶媒（本明細書ではこれにはまた有機溶媒の混合物を使用する場合も含まれる）、好ましくはアルコール（本明細書ではこれにはまたアルコールの混合物も含まれる）、特に低分子アルコール（メタノールが最も好ましいアルコールである）を含むアルコールの存在下で行われる。アルコールの存在は、表面多孔質の最終粒子における表面結合ナノ粒子の形成において重要であることが分かった。これは、メルカプト−シランを用いてシリカを形成する上記の従来技術の研究（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１１，２７（７），ｐｐ３３７２−３３８０、これは純粋な水性条件下でメルカプト−シランを加水分解する）とは随分違っている。大きなシリカ粒子が形成されるのが観察され、その場合、それらの表面にはシリカナノ粒子は形成されない（すなわち平滑なシリカミクロ粒子が形成されただけであった）。

アルコール（２種類以上のアルコールが使用される場合はアルコールの合計量を意味する）は、好ましくは少なくとも３重量部、より好ましくは少なくとも５重量部、さらに一層好ましくは少なくとも８重量部の量で存在する。好ましくは１５重量部以下、より好ましくは１２重量部以下のアルコールが使用される。したがって好ましい範囲には３〜１５重量部および５〜１０重量部のアルコールが挙げられる。

したがって、メルカプト−シリカ前駆物質の加水分解用の媒体は、好ましくは少なくとも１種類の有機溶媒、好ましくはメタノールと水との混合物である。反応物中の溶媒と水の合計重量部は、好ましくは少なくとも６重量部、より好ましくは少なくとも８重量部、さらに一層好ましくは少なくとも１０重量部、最も好ましくは少なくとも１２重量部である。好ましくは反応物中の溶媒の合計重量部は、３０重量部以下、より好ましくは２５重量部以下、さらに一層好ましくは２０重量部以下である。溶媒混合物中の有機溶媒（好ましくはメタノール）：水の比（体積を基準にした）は、好ましくは３：１〜１：３、より好ましくは２：１〜１：２の範囲にある。混合物中の有機溶媒（好ましくはメタノール）：水の比（体積を基準にした）は、とりわけ少なくとも１：１である。すなわち有機溶媒の量は、好ましくは水の量に等しいかそれを超え、さらに一層好ましい比は３：１〜１：１の範囲および２：１〜１：１の範囲である。

加水分解および縮合反応は、好ましくは界面活性剤（本明細書ではこれにはまた界面活性剤の混合物の場合も含まれる）の存在下で行われる。この界面活性剤は、好ましくは水溶性である。界面活性剤はその工程の加水分解および縮合の条件下で、好ましくはミセルを形成する。本発明が理論に拘束されることはないが、界面活性剤は、ミクロ粒子の表面のナノ粒子形成の上で安定化の役割を果たすように見える。界面活性剤は、イオン性（カチオン性またはアニオン性または両性イオン性）または非イオン性であることができるが、好ましくはイオン性、より好ましくはカチオン性である。好ましい界面活性剤は、カチオン性の第四級アンモニウム界面活性剤、より好ましくは臭化物または塩化物のどちらかの対イオンを有する第四級アンモニウム界面活性剤であり、より好ましい例は式、（Ｒ_４）（Ｒ_５）（Ｒ_６）（Ｒ_７）（Ｎ）^＋Ｘ⁻のものである。式中、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７のそれぞれが独立してＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ベンジル、およびアリール（とりわけアルキル）から選択され、そのそれぞれが非置換でも置換されてもよい（好ましくはＲ_４、Ｒ_５、Ｒ_６はそれぞれ独立してアルキル基であり、Ｒ_７はアルキルまたはベンジル基（とりわけアルキル基）である）であり、ＸはＢｒまたはＣｌである。とりわけＲ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７の少なくとも１つはＣ_８〜２０アルキル基（非置換または置換）である。とりわけＲ_４、Ｒ_５、Ｒ_６はそれぞれ独立してＣ_１〜２アルキル基（とりわけメチル）であり、Ｒ_７はＣ_８〜２０アルキル基である。とりわけ好ましい例は、臭化または塩化アルキルトリメチルアンモニウム、とりわけ臭化または塩化（Ｃ_８〜２０アルキル）トリメチルアンモニウムであり、ラウリル（Ｃ_１２）、ミリスチル（Ｃ_１４）、セチル（Ｃ_１６）、ステアリル（Ｃ_１８）、およびジデシル（Ｃ_２０）同族体が最も好ましく、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）および／または塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）はとりわけ良好な例である。他の例には、例えば塩化または臭化ベンザルコニウムを挙げることができ、これはまた偶数のアルキル鎖長、例えばＣ_８〜Ｃ_１８を有する塩化または臭化アルキルジメチルベンジルアンモニウムの混合物として知られる。

存在する界面活性剤の量（２種類以上の界面活性剤が使用される場合には界面活性剤の合計量を意味する）は、好ましくは０．０１重量部〜１重量部の範囲である。界面活性剤の量は、好ましくは少なくとも０．０２重量部、より好ましくは少なくとも０．０５重量部、最も好ましくは少なくとも０．１重量部である。界面活性剤の量は、好ましくは３重量部以下、またはより好ましくは２重量部以下である。

反応は、好ましくはコロイド安定化剤（本明細書ではこれにはまたコロイド安定化剤の混合物の場合も含まれる）、より好ましくは高分子コロイド安定化剤、とりわけ親水性ポリマーの存在下で行われ、これはシリカ粒子の合成の間のコロイドの安定化を助け、かつ粒径および粒度分布の制御の度合いを規定することが分かった。親水性ポリマーの好ましい例には、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）およびポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）と、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）と、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）とが挙げられ、ＰＶＡおよびＰＶＰがより好ましい。好ましくはポリマーの（重量平均）分子量Ｍｗは、約５，０００〜１５，０００、より好ましくは約８，０００〜１０，０００である。

親水性ポリマーなどのコロイド安定化剤の量（２種類以上が使用される場合には安定化剤の合計量を意味する）は、好ましくは０．０５重量部〜３重量部の範囲である。親水性ポリマーなどの安定化剤の量は、好ましくは少なくとも０．１重量部、より好ましくは少なくとも０．２重量部である。安定化剤の量は、好ましくは３重量部以下、より好ましくは２重量部以下、最も好ましくは１重量部以下である。

上記を考慮して球体上球体粒子を調製するための好ましい系またはスキームは、上記のやり方において下記の構成要素、すなわちアルカリ性条件、メタノールと水を含む溶媒、メルカプト−シリカ前駆物質（とりわけＭＰＴＭＳ）、界面活性剤（とりわけＣＴＡＢまたはＣＴＡＣ）、および親水性ポリマー（とりわけＰＶＡ）を使用することを含む。

塩基性ｐＨ媒体が好ましくは準備され、次いでその塩基を含有する媒体に好ましくは前駆物質が加えられる。コロイド安定化剤（例えば親水性ポリマー）および界面活性剤などのその他の好ましい試薬は、好ましくは前駆物質の添加の前に塩基性媒体中に取り込まれ、それと混合される。

前駆物質は少しずつ、すなわち一定時間、例えば１秒〜１００秒の範囲の時間をかけてその他の成分に加えられることが好ましい。典型的には約３０秒の時間を使用することができる。

反応成分は、球体上球体粒子の効率的な形成を確実にするために撹拌することが好ましい。好都合には加水分解および縮合は、例えばおよそ室温で行うことができる。

反応は、好ましくは前駆物質の最初の添加後、少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも４５分間、最も好ましくは少なくとも６０分間進行させる。この過程は、少なくとも幾つかの実施形態では２段階で進行することが分かった。本明細書中でミクロ粒子成長段階と呼ぶ第一段階では粒子の成長は主にミクロ粒子の成長である。第一段階後の、本明細書中でナノ粒子成長段階と呼ぶ第二段階では粒子の成長は主にナノ粒子の成長である。典型的にナノ粒子の成長段階はミクロ粒子の成長段階よりも長い時間である。ミクロ粒子成長段階がコアのミクロ粒子を形成するためには約２０分の時間が必要であり、続いてミクロ粒子の表面でのナノ粒子の効率的な形成のためにナノ粒子成長段階のより長い時間が必要であることが分かった。

好ましくは表面多孔質粒子は、例えばクロマトグラフィの固定相として使用する前に溶液から回収されか焼される。好ましいか焼条件は、５５０〜１２５０℃の範囲の温度まで、好ましくは空気中で加熱することを含む。条件の例は、例えば空気中で５５０〜１２５０℃まで加熱（例えば１℃／分で）し、５５０〜１２５０℃の範囲の温度に一定時間、例えば３００分間保持し、次いで室温まで、例えば５℃／分で冷却することである。より好ましくは、表面多孔質粒子は１０００℃を超えない温度、例えば５５０〜１０００℃の範囲の温度で加熱することによってか焼される。このか焼した粒子は、固定相として使用されるＬＣカラム中に容易に充填することができる。

本発明に従って合成された球体上球体シリカ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。 図１Ａで示したシリカ粒子のＮ_２等温線を示す図である。 図１Ａで示したシリカ粒子の細孔径分布を示す図である。 球体上球体シリカ粒子の経時的（単位：分）成長のＳＥＭ画像を示す図である。 本発明による外見的合成機構を示す概略図である。 様々なＮＨ_３濃度を用いて本発明に従って合成された球体上球体シリカ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。 超音波処理後の本発明による球体上球体シリカ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。 本発明による球体上球体シリカ粒子を充填し、ヘプタン：ジオキサン（０．７ｖｖ％）中に１〜１００μｇ／ｍｌのトルエン、ｏ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロアニリン、およびｍ−ニトロアニリンを含有する順相試験混合物を０．３ｍｌ／分の流量で使用してカラムから得られたクロマトグラムを示す図である。 図６と同様の方法だが、より高い流量で得られたクロマトグラムを示す図である。 本発明による官能基化した球体上球体シリカ粒子を充填し、水：アセトニトリル（５０ｖｖ％）中に１〜１００μｇ／ｍｌのベンズアミド、アセトフェノン、ベンゾフェノン、およびビフェニルを含有する逆相試験混合物ＴＭ−２を使用してカラムから得られたクロマトグラムを示す図である。 本発明による官能基化した球体上球体シリカ粒子を充填し、０．１ｖｖ％ＴＦＡ−水の中に２〜１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシン、およびＢＳＡを含有する逆相タンパク質混合物を使用してカラムから得られたクロマトグラムを示す図である。 図１０Ａは、追加の移動相勾配プロフィール（勾配法１）を示し、図１０Ｂは、別の追加の移動相勾配プロフィール（勾配法２）を示しており、それぞれ逆相タンパク質混合物で得られたクロマトグラムに使用された。 勾配法１を用いて得られた逆相タンパク質混合物のクロマトグラムを示す図である。 様々な流量を使用し、勾配法１を用いて得られた逆相タンパク質混合物のクロマトグラムを示す図である。 様々な流量を使用し、勾配法２を用いて得られた逆相タンパク質混合物のクロマトグラムを示す図である。 逆相タンパク質混合物で得られたクロマトグラムに使用した更に最適化された勾配プロフィール（勾配法３）を示す図である。 勾配法３（上側の線）および勾配法２（下側の線）を用いて得られたクロマトグラムの比較を示す図である。 クロマトグラフ分離を行った後のアンパック処理された本発明による球体上球体シリカ材料のＳＥＭ画像を示す図である。

次に、本発明のさらなる理解のために添付の図面を参照して様々な実施例を記述するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。下記は本発明の例に過ぎないが、実施例から明白な多くの特徴、例えば試薬の添加の好ましい順序などは一般化できることは明らかであろう。

材料の特徴評価
ＳＥＭ
シリカミクロ粒子の形態は、Ｈｉｔａｃｈｉ−Ｓ４８００走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。エタノール中に懸濁させた懸濁液の１滴をＳＥＭのスタッド上に置き、放置して一晩乾燥した。次いでＳＥＭ画像を得るためにスパッタコーター（ＥＭＩＴＥＣＨ Ｋ５５０Ｘ）を用いてこの試料に金を３０ｍＡで３分間コーティングした。ＳＴＥＭ検出器を用いて粒子を観察するために懸濁液の１滴をＴＥＭのグリッド上に置き、次いで一晩乾燥させたすぐ後に観察した。

粒径
シリカミクロ粒子は、分散装置を備えたＭａｌｖｅｒｎ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を用いて測定した。分析は、広いサイズ範囲にわたってすぐれた検出感度を得るために青色光源との併用によるＨｅ−Ｎｅレーザーを用いて行った。散乱光の角強度は、分粒性能を高めるように前方および後方散乱検出によって検出する。粒子の散乱は、Ｍｉｅ散乱モデルによって正確に予測される。測定を６回行って２０００ｒｐｍでの分散における平均粒度分布を得た。水中懸濁物としてのシリカナノ粒子は、水和粒子サイズを得るためのＶｉｓｃｏｔｅｋ Ｍｏｄｅｌ ８０２ ＤＬＳシステムを用いた動的レーザー散乱（ＤＬＳ）によって特徴を調べた。測定は石英セル中で室温において行い、６回の測定後に平均粒度分布を得た。

ｐＨ
溶液混合物のｐＨを一定の間隔で少なくとも２時間の間、連続的に測定した。

表面積および細孔容積
Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡＳＡＰ ２０２０吸着分析装置を用いて、７７ＫにおけるＮ_２吸着によりＢｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）表面積および細孔容積を測定した。細孔径分布は、Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）脱離データおよび非局所密度汎関数理論（ＤＦＴ）データから計算した。試料は分析前に１２０℃で１０時間脱気した。

ＨＰＬＣ
カラムのＨＰＬＣ特徴評価については、真空脱気装置、クォータナリポンプ、ＡＬＳオートサンプラー、加熱カラムコンパートメント、およびＵＶ−Ｖｉｓ検出装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ高性能液体クロマトグラフィシステムを使用した。データ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ Ｂ．０２．０１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いて行った。

実施例１：球体上球体シリカの調製
下記の化学製品および試薬、すなわち（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）（９５％）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）（≧９８％）、水酸化アンモニウム溶液（試薬用、主成分は２８〜３０％ＮＨ_３）、親水性ポリマーのポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）（Ｍｗ １０Ｋ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）（Ｍｗ ８Ｋ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（Ｍｗ １０Ｋ）、およびメタノール（分析用）を使用した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびクロロ（ジメチル）オクチルシラン（Ｃ８）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用した。実験を通じて蒸留水を使用した。

親水性ポリマー（０．２５ｇ）およびＣＴＡＢ（０．１ｇ）を５ｇの水に溶解した。この溶液に８ｍｌのメタノールを撹拌しながら加えた。購入した水酸化アンモニウム溶液（０．５ｇ）を２ｍｌの水と混合することによって希釈し、次いで２ｍｌのこの希釈したアンモニア溶液を反応混合物に加えた。１５分間撹拌した後、０．５ｍｌのＭＰＴＭＳを３０秒間かけて一滴ずつ加えた。これら実施例におけるポリマーおよび界面活性剤の濃度は水の体積を指す。反応物を室温で２４時間撹拌した。結果として得られたシリカ粒子を、その懸濁物を遠心分離することにより回収した。これらの回収したシリカ粒子を炉（Ｃａｒｂｏｌｉｔｅ、ＣＷＦ１５００）中でか焼して、官能基などの有機鋳型剤および他の有機成分を除去した。か焼条件は、空気中において１℃／分で５５０〜１２５０℃までの加熱、３００分間の保持、次いで５℃／分で室温までの冷却である。

ＭＰＴＭＳを加えたとき、球体上球体粒子がワンポット合成で形成された。親水性ポリマーとしてＰＶＡを使用した場合、球体上球体粒子の粒度分布は２．５〜１２．９μｍの範囲にあり、５．６７μｍでピークに達した。ｄ_０．１およびｄ_０．９の値は、それぞれ３．２１μｍおよび９．８９μｍであった。球体上球体粒子の得られたＳＥＭ画像を図１Ａに示す。大きなシリカ微小球が２００〜４００ｎｍの範囲のサイズのシリカナノ粒子で被覆され、シリカナノ粒子がシリカ微小球の表面に整然と配列しているのが見られた。か焼後のＢＥＴ表面積は２０４ｍ^２／ｇであった。Ｎ_２等温線は、ミクロ細孔シリカで普通に得られるＩ型等温線を示した（図１Ｂに示す）。ＢＪＨモデルの限界のため、２ｎｍ未満の細孔を計算することができない。したがってミクロ細孔材料の場合は非局所密度汎関数理論（ＤＦＴ）法を使用すべきである。ＤＦＴデータから計算された細孔径分布は、ミクロ細孔が０．９１および１．５１ｎｍでピークに達することを示した（図１Ｃ）。

実施例２：成長の検討
球体上球体粒子がワンポット合成の間にどのように成長するかを知るために時間分析を行った。これは、試料を一定の時間間隔で試験することによって行った。各試料を得るためにそれを１３０００ｒｐｍで遠心分離して懸濁物からのシリカ粒子の完全な抽出を確実にし、次いでそれを水で十分に洗浄して未反応のシリカ前駆物質を除去した。得られた試料をＳＥＭで分析し、その画像を図２に示す（各画像上の数字は、反応開始後、試料が抽出された時点の時間（単位：分）を表す）。２段階の核形成が起こるように思われる。第一段階は、シリカミクロ粒子の成長を含み、約２０分間続く。次いで核形成の第二段階が、その形成されたミクロ粒子の表面で起こる。１８０分で球体上球体粒子が完全に形をなしたように見えた。反応を２４時間監視したが、その時間中にさらなる顕著な成長は見られなかった。本発明の範囲がこの理論に拘束されることはないが、外見的合成の説明図を図３に示す。

実施例３：ｐＨの検討
溶液のｐＨは加水分解の開始前は約９．９であり、そのプロセスが完了する時間（１５０分間）までには１０．５を少し下回った。通常はケイ酸の形成によりｐＨの低下が観察されるので、経時的に現時点のｐＨパターンが、従来のプロセスにおけるＴＥＯＳと比較してかなり違った。理論に拘束されることはないが、この挙動はチオール基によって、それが塩基性条件下で脱プロトン化するときに引き起こされることがあるように思われる。

上記反応条件は、合成の間の２ｍｌの２５重量％希釈ＮＨ_３溶液の使用を伴い、これはミクロ粒子の表面に２００〜４００ｎｍのサイズの整然と密に配置されたナノ粒子の形成をもたらした。ｐＨの影響を、５重量％および１重量％のより希釈されたＮＨ_３溶液を用いてさらに調べた。これらの場合、ＳＥＭ画像（図４の画像ＣおよびＤ参照）は、低いＮＨ_３濃度によるより高密度の充填ほどナノ粒子のサイズが大きくなることを示した。比較のために、２５重量％ＮＨ_３溶液を用いた上記試料のＳＥＭを図４の画像Ｂに示す。１重量％ＮＨ_３の添加の場合、シリカナノ粒子は表面に強く融着または凝集するように見える。希釈度が大きいほど粒子の沈殿がゆっくり進行し、より大きな粒子の形成につながる。これは粒度分布に影響を与え、かつより大きな粒子が形成される。か焼の後、これらのより希釈度の大きいＮＨ_３溶液を用いて作製した試料はまた、より低い表面積（３０ｍ^２／ｇおよび１９ｍ^２／ｇ）を有した。非希釈（すなわち１００重量％）ＮＨ_３溶液の使用は、図４の画像Ａに示したようにナノ粒子の低い付着量を生じた。

実施例４：粒子の安定性
球体上球体粒子を超音波処理して表面のナノ粒子の安定性を観察した。粒子は１４０Ｗにおいて水中で８時間超音波処理され、ＳＥＭにより明らかにされるようにミクロ粒子の表面から多少のナノ粒子が剥がれている（しかしそれらの全部ではない）のが観察された（図５参照）。これは、ナノ粒子が表面に強く付着し、したがって表面はそのような強い超音波処理後でさえ依然として比較的密に被覆されたままであることを示す。

実施例５：複層の被覆層
上記方法を用いて得られる粒子は、結果として表面にナノ粒子の単層の被覆層を生じた。しかしながら、前もって形成された微小球を取り出すことなくナノ粒子成長段階の間に３０分の時点でさらにＭＰＴＭＳを加える（すなわち２０分後に）ことによって、表面により多くのナノ粒子が成長するのが見られた。溶液中のＭＰＴＭＳ量を増加させるにつれてナノ粒子間の間隔が減り、ずっと緻密な被膜が形成された。この方法は、３０分の時点でさらなる０．５ｍｌのＭＰＴＭＳを加えた場合、複層の被覆層の形成を可能にしたが、この複層の被覆層は洗浄で剥がれるのが観察され、したがって単層ほど安定ではないらしいが、安定性はか焼で向上させることができる。

実施例６：粒子形成の制御
球体上球体の形態に与える界面活性剤の影響は顕著である。界面活性剤濃度を変えることによって表面のナノ粒子のサイズを減少させた。上記実施例１におけるＣＴＡＢ量（加えた水の体積５ｍｌを基準にして２ｗｖ％）とは対照的に、高濃度のＣＴＡＢ（１０ｗｖ％）は、表面でのより小さい約１２８ｎｍのナノ粒子の形成に貢献し、微小球サイズは不変のままであった。ＣＴＡＢ界面活性剤を同じ界面活性剤カチオンだが塩化物対イオン（ＣＴＡＣ）で置き換えることによって、界面活性剤対イオンの性質を調べた。反応の間の異なる界面活性剤対イオンの使用は、同じ球体上球体構造を生じさせた。

固定相粒子の均一性を制御することはクロマトグラフ用途にとってきわめて重要である。ＰＶＡ濃度を２倍に増すことより、球体上球体粒子の粒度分布はｄ_０．１−ｄ_０．９＝２．６８−６．８１μｍに改善された。別の親水性ポリマーであるポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）（Ｍｗ ８Ｋ）をＰＶＡの代わりに反応物に導入した。これもまた球体上球体構造を生じ、別の親水性ポリマーであるヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（Ｍｗ １０Ｋ）の場合も同様であった。その他のポリマーを用いて調製した試料についても同じ５ｗｖ％のポリマー濃度（加えた５ｍｌの水を基準にして）に保った。ＰＶＰを用いた粒度分布は、ＰＶＡポリマーの場合よりも良好であった。ＰＶＰに関しては、より小さくかつより狭い約２．７３μｍの粒度分布が達成され、ｄ_０．１−ｄ_０．９＝１．５４−４．７６（上記ＰＶＡ（５ｗｖ％）の場合のｄ_０．１−ｄ_０．９＝３．２１−９．８９μｍ、ＰＶＡ（１０ｗｖ％）の場合のｄ_０．１−ｄ_０．９＝２．６８−６．８１μｍと比較して）であった。また表面ナノ粒子もより小さく、ＰＶＰは７５ｎｍであった。

ＨＰＬＣ
実施例７：カラム充填および特徴評価
か焼した球体上球体粒子を、シンクロニックカラム充填法を使用して２．１×５０ｍｍステンレス鋼製カラムに充填した。１５ｍｌのメタノール中に懸濁させた０．３ｇのシリカ粒子を用いてスラリーを調製した。このスラリーを１５ｍｌのタンクに注ぎ込み、６０Ｋバールで充填した。

上記のように調製したカラムを順相（ＮＰ）試験条件に対して使用した。この新たに作製したカラムをイソプロパノール（１時間）、次いでヘプタン（１時間）で洗浄した。このＮＰ試験混合物は、ヘプタン：ジオキサン（０．７ｖｖ％）中に１〜１００μｇ／ｍｌのトルエン、ｏ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロアニリン、およびｍ−ニトロアニリンを含有した。

逆相（ＲＰ）クロマトグラフィについてはカラムを、トルエンに溶かしたクロロ（ジメチル）オクチルシランでフラッシュすることによって官能基化した。そのカラムを１００℃で２４時間加熱した。良好な付着量を確実にするためにこの正確な手順を２度繰り返した。最後にカラムをトルエン（１時間）、アセトニトリル（１時間）、およびアセトニトリル：水（１時間）で洗浄した。このＲＰ試験混合物ＴＭ−２は、水：アセトニトリル（５０ｖｖ％）中に１〜１００μｇ／ｍｌのベンズアミド、アセトフェノン、ベンゾフェノン、およびビフェニルを含有した。このＲＰタンパク質混合物は、０．１ｖｖ％ＴＦＡ−水の中に２〜１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシン、およびＢＳＡを含有した。

実施例８：順相（ＮＰ）ＨＰＬＣ
上記５％ＮＨ_３溶液を用いて作製した調製したままの球体上球体粒子を６００℃でか焼し、そのか焼した粒子を、イソプロパノール（１時間）、次いでヘプタン（１時間）で洗浄する以外にさらに処理することなく実施例７の方法によってカラムに充填した。

このカラムを、０．３ｍｌの流量でＮＰ試験混合物を使用し、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出法により試験した。図６は、得られたクロマトグラムを示す。この材料は小分子の分離の良好な効率を示し、最適流量におけるｍ−ニトロアニリンピークに基づく１５０００〜２１０００段／ｍ（ｐ／ｍ）の範囲の段数を有した。この効率は、粒子を類別してもっと狭い粒度分布を生み出すならば、さらに高めることができる。この球体上球体粒子は、良好な分離特性を有するこれらの被検体の迅速な拡散にとって有利である。この固定相は、図７に示すように、より高流量の０．６および１．０ｍｌ／分においてさえよく分解されたピークを生じた。被検体は２分未満のうちに分離されたが、効率のわずかな低下があり、約９０００ｐ／ｍの段数が１ｍｌ／分でのｍ−ニトロアニリンのピークに基づくことが分かった。

実施例９：逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ
球体上球体粒子は、すぐれた物質移動特性のため生体巨大分子の逆相分離にとって望ましい。６００℃でか焼した材料を含有するカラムを上記と同様にクロロ（ジメチル）オクチルシランで官能基化し、逆相条件下で試験した。

勾配溶離
無勾配条件下よりも速い分離を達成するように、ＲＰクロマトグラフ分離の間、水：アセトニトリル移動相強度を徐々に増した。１ｍｌ／分および２５４ｎｍでのＵＶ検出法によるＴＭ−２混合物の分析を、アセトニトリルが５〜７０ｖｖ％の範囲にわたって増加する線形溶媒勾配を用いて行った。溶媒勾配は５分後に初期状態に戻った。図８に示すようにピークはよく分解され、また合計分析時間は４分であった。この勾配法は、もっと高速の分離時間を達成するようにさらに発展させることができた。

タンパク質分離
これら球体上球体粒子の形態は、生体巨大分子の分離に適している。表面に充填されたナノ粒子は、大きな分子がより短時間の拡散距離を有するその細孔構造に入り込むことを可能にする粒子間細孔をもたらす。リボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシン、およびＢＳＡタンパク質のタンパク質混合物を用いた勾配溶離の検討を、ＵＶ検出法により２５℃で２２０ｎｍにおいて行った。使用した移動相は、０．１ｖｖ％ＴＦＡ−水および０．１ｖｖ％ＴＦＡ−アセトニトリルを含んだ。アセトニトリルは２２０ｎｍで吸収するので基線変動は見てわかった。これらのタンパク質の最善の分離を達成するために多くの勾配法を試験した。まず、１３９バールの背圧および１μｌの注入により５〜７０ｖｖ％アセトニトリル：０．１ｖｖ％ＴＦＡの移動相を１ｍｌ／分で使用する単純な線形勾配法を設定した。再現可能な分離を確実にするために各試行の間の再平衡化時間が重要であり、したがってカラムを各試行の前に１０分間放置して平衡化させた。この単純な線形勾配を用いたタンパク質分離を図９に示す。大きな巨大分子であるタンパク質は、すぐれたピーク形状および分解能を伴って４分未満でうまく分離された。これは球体上球体粒子のすぐれた速度論的特性のためである。しかしながらリゾチームおよびトリプシンは、これらの単純な線形勾配条件下では分けることができなかった。したがって５種類のすべてのタンパク質の分離を向上させるためにさらなる勾配法を開発した。図１０Ａおよび１０Ｂは、同じ溶媒系で使用したそれぞれ勾配法１および勾配法２のさらなる勾配プロフィールを示す。

勾配法１および勾配法２の勾配プロフィールは、１ｍｌ／分でタンパク質混合物の良好な分離を示した（勾配法１についての図１１を参照されたい）。５種類のすべてのタンパク質は、４分以内（勾配法１）および３分以内（勾配法２）に完全に分けられた。分解能はすぐれたピーク形状を伴って各ピークについて維持された。しかしながらリゾチームとトリプシンの間には若干の分解能の損失があり、これは勾配法２の下でのこれらのタンパク質のより高速の溶離によって引き起こされた。また、より高い流量をこれらの勾配条件下で試験した。球体上球体粒子のすぐれた速度論的特性のために、このような化合物のより高い移動相速度（例えば１．５および１．７５ｍｌ／分などの流量）でのより高速の分離さえ可能である。様々な流量での分離の結果を、勾配法１については図１２に、また勾配法２については図１３に示す。図１２および１３に示すように１．７５ｍｌ／分でのタンパク質の分離は約３．５分（勾配法１）および２．５分（勾配法２）でそれぞれ完了した。さらに、分解能は良好なピーク形状と共に維持された。カラムの背圧は１．５ｍｌ／分では１８９バールに、また１．７５ｍｌ／分では２４１バールに増加した。これは十分にこのＨＰＬＣ系の動作範囲内である。

図１４は、使用した更に最適化された勾配プロフィール（勾配法３）を示す。この移動相勾配を用いたクロマトグラムから、ＢＳＡピークは、図１５（上側の線）に示すように勾配法２（下側の線）と比較してはるかに尖鋭であり、またわずかに移動した。勾配法３は、リゾチームおよびトリプシンのピークの分離を効果的に改善した。したがって分離の間に適用する勾配次第で、容易にそのカラムによってピークを急速に発達させることも、またそのカラム中で進行を遅らせることもできる。ともかく球体上球体粒子は、タンパク質などのより高い分子質量の化合物を高速で分離する能力を示した。

クロマトグラフ試験の終了後、カラム吸着床は変化しておらず、またカラムをアンパック処理した後、空隙は観察されなかった。また形態をＳＥＭにより観察した。図１６中のＳＥＭ画像はアンパック処理した球体上球体シリカ−Ｃ８材料を示し、その球体上球体の形態は維持されている。これは、ナノ粒子がミクロ粒子の表面に強力に付着していることを示唆する。

特許請求の範囲中を含めて本明細書中で使用される用語の単数形は、文脈上別段の指示がない限り本明細書では複数形を含み、この逆もまた同様と解釈されたい。例えば、文脈上別段の指示がない限り「ａ」または「ａｎ」などの単数形の言及は「１またはそれ以上」を意味する。

本明細書の記述および別添の特許請求の範囲の全体を通して単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、およびこれらの単語の語尾変化、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などは、「含むがこれには限定されない」を意味し、他の構成要素を排除することを意図しない（そして排除しない）。

本発明の前述の実施形態に対する変形形態を、依然として本発明の範囲内に含まれたままで案出できることは理解されるはずである。本明細書中で開示されている各特徴は、別段の指定がない限り、同一、同等、または類似の目的を果たす代わりの特徴によって置き換えることができる。したがって別段の指定がない限り、開示されている各特徴は一般的な一連の同等または類似の特徴の単なる一例である。

本明細書中で提供されるいずれかの、またすべての実施例の使用、または例示的な言い回し（「例えば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」、および同様の言い回し）は、単に本発明をより良く例示することを意図しており、別段で特許請求されない限り本発明の範囲に対する限定を指示すものではない。本明細書中の言い回しは、本発明の実施に不可欠なものとしての任意の非請求要素を指すものと解釈すべきではない。

本明細書中で述べた任意のステップは、別段の指定がない限りまたは文脈上別の解釈が必要とされない限り、任意の順序でまたは同時に行うことができる。

本明細書中で開示した特徴のすべては、そのような特徴および／またはステップの少なくともいずれかが互いに排他的である組合せ以外は、任意の組合せで組み合わせることができる。具体的には、本発明の好ましい特徴は本発明のすべての態様に適用可能であり、任意の組合せで使用することができる。同様に、本質的でない組合せで記述されている特徴は別々に（組合せでなく）使用することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕表面多孔質シリカ粒子を製造するためのワンポット法であって、官能基を備えたシリカ前駆物質を加水分解および縮合して表面多孔質シリカ粒子を形成する工程を含み、前記表面多孔質シリカ粒子が実質上非多孔質のシリカミクロ粒子を含み、前記ミクロ粒子の表面にシリカナノ粒子が結合される、方法。
〔２〕前記官能基がメルカプト基である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記前駆物質がメルカプト−シランを含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記メルカプト−シランが、３−メルカプト−プロピル−トリメトキシ−シランを含む、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記前駆物質がただ一つのシリカ供給源として使用される、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕前記前駆物質の前記加水分解および縮合が、９〜１１の範囲の出発ｐＨを有する塩基性媒体中で行われる、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕前記前駆物質の前記加水分解および縮合が、水および有機溶媒を含む媒体中で行われる、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８〕前記有機溶媒がメタノールを含む、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記前駆物質の前記加水分解および縮合が、界面活性剤の存在下で行われる、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕前記界面活性剤が第四級アンモニウム界面活性剤を含む、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記第四級アンモニウム界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）および／または塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記前駆物質の前記加水分解および縮合が、コロイド安定化剤の存在下で行われる、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕前記コロイド安定化剤が親水性ポリマーを含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕前記親水性ポリマーが、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）および／またはポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記表面多孔質シリカ粒子をか焼する工程をさらに含む、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕前記ミクロ粒子のレーザー回折によって測定される平均粒径が、１μｍ〜２０μｍ、好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲である、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕前記ナノ粒子の動的レーザー散乱（ＤＬＳ）によって測定される平均粒径が、５００ｎｍ以下である、前記〔１〕〜〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１８〕非局所密度汎関数理論（ＤＦＴ）によって計算される前記表面多孔質粒子の細孔径が２ｎｍ未満である、前記〔１〕〜〔１７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１９〕前記ミクロ粒子の前記表面に結合した前記ナノ粒子が単層を形成する、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２０〕前記〔１〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の方法によって得られる、表面多孔質粒子。
〔２１〕球体上球体の形態を有し、かつシリカナノ粒子によって被覆された実質上非多孔質のシリカミクロ粒子を含む、表面多孔質シリカ粒子。
〔２２〕前記シリカミクロ粒子の粒径が１μｍ〜１０μｍの範囲であり、かつ前記シリカナノ粒子の粒径が５００ｎｍ以下である、前記〔２１〕に記載の表面多孔質シリカ粒子。
〔２３〕前記〔２０〕〜〔２２〕のいずれか一項に記載の表面多孔質粒子から作られる、液体クロマトグラフィ用の固定相。

Claims (14)

1. 表面多孔質シリカ粒子を製造するためのワンポット法であって、メルカプト基を備えたシリカ前駆物質を、塩基性媒体中で、かつコロイド安定化剤としての親水性ポリマーの存在下で加水分解および縮合して、表面多孔質シリカ粒子を形成する工程を含み、前記表面多孔質シリカ粒子が、実質上非多孔質のシリカミクロ粒子を含み、前記ミクロ粒子が、その表面に結合したシリカナノ粒子を有する、方法。
2. 前記前駆物質がメルカプト−シランを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記メルカプト−シランが、３−メルカプト−プロピル−トリメトキシ−シランを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記前駆物質がただ一つのシリカ供給源として使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記前駆物質の前記加水分解および縮合が、水および有機溶媒を含む媒体中で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記有機溶媒が、メタノールを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記前駆物質の前記加水分解および縮合が、界面活性剤の存在下で行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記界面活性剤が、第四級アンモニウム界面活性剤を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記第四級アンモニウム界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）および／または塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記親水性ポリマーが、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）および／またはポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記表面多孔質シリカ粒子をか焼する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ミクロ粒子のレーザー回折によって測定される平均粒径が、１μｍ〜２０μｍ、好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲であり、前記ナノ粒子の動的レーザー散乱（ＤＬＳ）によって測定される平均粒径が、５００ｎｍ以下である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ミクロ粒子の前記表面に結合した前記ナノ粒子が、単層を形成する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 液体クロマトグラフィ用の固定相を充填したクロマトグラフィカラムであって、
    前記固定相が、シリカミクロ粒子を含む表面多孔質粒子から作られ、前記ミクロ粒子が、その表面に結合したシリカナノ粒子を有し、それによって前記ミクロ粒子を被覆する多孔質シェルを形成し、前記多孔質シェルの厚さが、前記ナノ粒子の直径に等しいことを特徴とする、クロマトグラフィカラム。