JP6122418B2 - アンチトロンビンiii結合部位を2個含む多糖、これの調製および抗血栓薬剤としてのこれの使用 - Google Patents
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Description
70年代以来開発されてきた。これらの生成物は、ヘパリンの化学的または酵素的解重合
によって得られる。これらは多糖の複合混合物であり、凝固カスケードに関与する多様な因子に対してヘパリンよりも大きい作用特異性を有し、特にヘパリンに固有の出血のリスクを低下させることを可能にする。
第一の糖単位の炭素原子4および5の間の点線で表される結合は、単結合または二重結合のどちらかであり、
波線(R1基の場合)は、R1が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上下どちらかに位置する結合を示し、
R1は、式(I)の六糖が多糖の還元末端に位置する場合にOH基を表し、さもなければR1は、前記多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、結合はR1が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上に位置し、
R2は、式(I)の六糖が多糖の非還元末端に位置する場合に水素原子を表し、この場合には、前記六糖の第1の糖単位の炭素原子4および5の間の結合は二重結合であり、さもなければR2は、前記多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、前記六糖の第1の糖単位の炭素原子4および5の間の結合は単結合である。
(A)d−(I)−(B)f−(I)−(C)g (II)
式中:
A、BおよびC単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表す。二糖配列は有利には、場合により置換されている(例えば硫酸化またはアシル化された)ウロン酸およびD−グルコサミンを含む。A、BおよびC二糖単位は、存在するか、または存在しないかのどちらかであり、これは下付文字d、fおよびgによって示される;
式(I)の単位は、先に定義したように(上の式(I)を参照のこと。)、六糖単位を表し、
下付文字d、fおよびgはそれぞれ、0に等しい(この場合、これら下付文字が示すA、BまたはC単位は存在しない。)かまたは1から5の間に含まれる整数を表し、整数d、fおよびgの和が0から5の間に含まれることを条件とする。
(A)n−(I)−(B)m−(I)−(C)k (II bis)
式中:
A、BおよびC単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表す。二糖配列は有利には、場合により置換されている(例えば硫酸化またはアシル化された)ウロン酸およびD−グルコサミンを含む。A、BおよびC二糖単位は、存在するか、または存在しないかのどちらかであり、これは下付文字n、mおよびkによって示される;
式(I)の単位は、先に定義したように(上の式(I)を参照のこと。)、六糖単位を表し、
下付文字n、mおよびkはそれぞれ、下付文字n、mまたはkの1個が1に等しい場合には、他の2個の下付文字が0に等しいという条件で、0に(この場合、これら下付文字が示すA、BまたはC単位は存在しない。)、または1に(この場合、これら下付文字が示すA、BまたはC単位は存在する。)等しい整数を表す。
a)前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖画分および/または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
b)十二糖および/または十四糖画分中の上で定義したような式(III)、(IV)、(V)または(VI)の1つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
c)場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の1つ以上の含有量を定量するステップ
を含む方法でもある。
a)前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖画分および/または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
b)十二糖および/または十四糖画分中の上で定義したような式(III)、(IV)、(V)または(VI)の1つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
c)場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の1つ以上の含有量を定量するステップ、
d)ステップb)により式(III)、(IV)、(V)または(VI)の硫酸化多糖の1つ以上の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップc)により標準試料の事前に規定された含有率の範囲内で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が前記標準試料に一致することを結論付けるステップ
を含む方法でもある。
a)前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖および/または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
b)十二糖および/または十四糖画分中の上で定義したような式(III)、(IV)、(V)または(VI)の1つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
c)場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の1つ以上の含有量を定量するステップ、
d)ステップb)により式(III)、(IV)、(V)または(VI)の硫酸化多糖の少なくとも1つの存在を検出することが可能にならない場合、および場合により、ステップc)により標準試料の事前に規定した含有量の範囲外で前記多糖の定量が行われる場合、試験試料が標準試料に一致しないことを結論付けるステップ
を含む方法である。
a)前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖画分および/または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
b)十二糖および/または十四糖画分中の上で定義したような式(III)、(IV)、(V)または(VI)の1つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
c)場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の1つ以上の含有量を定量するステップを含み、
ステップb)において式(III)、(IV)、(V)または(VI)の硫酸化多糖の1つ以上の存在が検出されること、および場合により、ステップc)において定量された前記多糖の量が標準セムロパリン試料の前記多糖の事前に規定した含有量の範囲内であることにより、試験試料が標準試料に一致することが示され;
ならびにステップb)において式(III)、(IV)、(V)または(VI)の硫酸化多糖の1つ以上の非存在が検出されること、および場合により、ステップc)において定量された前記多糖の量が標準試料の事前に規定した含有量の範囲外であることにより、試験試料が標準試料に一致しないことが示される、方法である。
出発ULMWHの調製
セムロパリン(国際一般名)という名称で、およびラボラトリーコードAVE5026(サノフィ)でも公知である超低分子量ヘパリンを、本発明による多糖を調製するための出発生成物として使用する。前記ヘパリンは、ホスファゼン塩基(BEMP)による有機媒体中でのヘパリンのベンジルエステルの第4級塩の解重合、解重合されたヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩のナトリウム塩への変換、残留エステルの鹸化および最終精製によって調製される。
a)ベンゼトニウムヘパリナートを得るための、ベンゼトニウムクロリドの作用によるヘパリンナトリウムの塩交換、
b)ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩を得るための、ベンジルクロリドの作用によるベンゼトニウムヘパリナートのエステル化、次に酢酸ナトリウムのアルコール性溶液による処理
c)ベンゼトニウム塩を使用する、ヘパリンのベンジルエステルの、第4級アンモニウム塩への塩交換、
d)上で定義したような方法による、ヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩の解重合、
e)第4級アンモニウム(ベンゼトニウム)塩のナトリウム塩への変換、
f)塩基、例えば水酸化ナトリウムの作用による鹸化、
g)特に酸化剤、例えば過酸化水素水溶液などの作用による精製を含む。
十二糖(III)の調製
第一のステップにおいて、バイオゲルP30(200×5cm)(注入1回につき2g)を充填したカラムによるGPCによって、AVE5026を分画した。生成物のおよそ6から11%に相当する十二糖画分を収集して、セファデックスG10(100×7cm)を充填したカラムで脱塩した。この時点では、開始ベースとして、少なくとも5gの十二糖画分を有することが推奨される。第二のステップにおいて、NaCl濃度のステップ勾配(1mMトリス−HCl、pH7.4中、0.7;1.15;1.6;2.05;2.65および3M NaCl)を使用して、画分をすべてATIII親和性カラム(30×5cm)に注入する。200mg、即ちATIIIカラムに対する過剰容量を各流下時に注入する。式(III)の十二糖が濃縮された、80から130mS/cmの間の導電率で溶離した画分を共に集める。これらの画分を脱塩して、次のステップで半分取CTA−SAXカラム(250×22mm)により精製する。画分を分析AS11またはCTA−SAXによって試験する。pHの中和後、収集した画分をメガボンドエルートC18カートリッジ(バリアン)に流下させてから、半分取AS11カラム(ディオネックス)で最終精製する。純粋な十二糖(III)を含有する画分を共に収集して、セファデックスG10で脱塩する。
十四糖(IV)の調製
GPCによる分画の第1のステップを実施例2と同様に行う。分画の終了時に収集した十四糖画分は、出発生成物のおよそ3から7%に相当し、次に実施例2で示すように脱塩する。第2のステップにおいて、画分全体を実施例2に示すようにATIII親和性カラムに注入する。式(IV)の十四糖が濃縮された、100から130mS/cmの間の導電率で溶離した画分を収集する。次のステップにおいて、流下1回につき20mgを注入することによって、画分を半分取AS11カラム(ディオネックス)で脱塩および精製する。画分を分析CTA−SAXにより試験する。純粋な十四糖(IV)を含有する画分を収集して、セファデックスG10で脱塩する。画分を次にCTA−SAXカラム(150×10mm)(3μm)に注入する。画分を試験して、中和し、次にメガボンドエルートC18カートリッジ(バリアン)に流下させてから、半分取AS11カラム(ディオネックス)で最終精製する。純粋な十四糖(IV)を含有する溶離液を収集して、セファデックスG10で脱塩する。
十四糖(V)の調製
GPCによる分画の第1のステップを実施例2と同様に行う。分画の終了時に収集した十四糖画分は、出発生成物のおよそ3から7%に相当し、次に実施例2で示すように脱塩する。第2のステップにおいて、画分全体を実施例2に示すようにATIII親和性カラムに注入する。式(V)の十四糖が濃縮された、100から130mS/cmの間の導電率で溶離した画分を収集する。次のステップにおいて、流下1回につき20mgを注入することによって、これらの画分を半分取AS11カラム(ディオネックス)で脱塩および精製する。画分を分析CTA−SAXにより試験する。純粋な十四糖(V)を含有する画分を収集して、セファデックスG10で脱塩する。画分を次にCTA−SAXカラム(150×10mm)(3μm)に注入する。画分を試験して、中和し、次にメガボンドエルートC18カートリッジ(バリアン)に流下させてから、半分取AS11カラム(ディオネックス)で最終精製する。純粋な十四糖(V)を含有する溶離液を収集して、セファデックスG10で脱塩する。
十四糖(VI)の調製
GPCによる分画の第1のステップを実施例2と同様に行う。分画の終了時に収集した十四糖画分は、出発生成物のおよそ3から7%に相当し、次に実施例2で示すように脱塩する。第2のステップにおいて、画分全体を実施例2に示すようにATIII親和性カラムに注入する。式(VI)の十四糖が濃縮された、100から130mS/cmの間の導電率で溶離した画分を収集する。次のステップにおいて、流下1回につき20mgを注入することによって、これらの画分を半分取AS11カラム(ディオネックス)で脱塩および精製する。画分を分析CTA−SAXにより試験する。純粋な十四糖(VI)を含有する画分を収集して、セファデックスG10で脱塩する。画分を次にCTA−SAXカラム(150×10mm)(3μm)に注入する。画分を試験して、中和し、次にメガボンドエルートC18カートリッジ(バリアン)に流下させてから、半分取AS11カラム(ディオネックス)で最終精製する。純粋な十四糖(VI)を含有する溶離液を収集して、セファデックスG10で脱塩する。
十二糖(III)の定量
本発明による十二糖(III)定量をセムロパリンの多様な試料について行った。ATIIIに親和性を有するすべての十二糖画分の含有率および式(III)の十二糖の含有率を表1に示す。
カラム:100×2.6cm、固定相 バイオゲルP30ファイン(バイオラッド)。
この第2のステップは2つの目的:単離された画分から二重部位の定量を行うのに十分な量の親和性十二糖画分を精製すること、およびさらに、精製した十二糖画分中の親和性画分のパーセンテージを測定することを有する。
溶媒A:0.25M NaCl;1mMトリス、pH7.4
溶媒B:3.5M NaCl;1mMトリス、pH7.4
勾配:t0分,%B=0;t100分、%B=100;t130分、%B=100;t>196分、%B=0
流速:12ml/分
分析時間:310分。
溶媒A:0.25M NaCl;1mMトリス、pH7.4
溶媒B:3M NaCl;1mMトリス、pH7.4
勾配:t0分 %B=0;t75分 %B=100;t90分 %B=100;t>91分 %B=0
流速:1ml/分。
式(III)の二重部位十二糖は、高分解能HPLC法により、即ちウォーターズアクイティBEH C18 1.7μm(2.1×150mm)UPLC(超高性能液体クロマトグラフィー)カラムにより、ペンチルアミンおよびHFIP(ヘキサフルオロイソプロパノール)移動相を用いて定量する。カラム温度を60℃に調整する。溶離液相は以下の通りである:
相A:50mmol/l HFIP、15mmol/l ペンチルアミン水溶液
相B:50mmol/l HFIPおよび15mmol/l ペンチルアミンを含む25−75体積/体積H2O−CH3CN
流速:0.22ml/分
UV検出:232nmおよび245分
セムロパリン試料N°5(表1を参照のこと。)の親和性画分のクロマトグラムを図8に示す(細線:232nmにて検出;太線245nmにて検出)。二重部位十二糖(III)のピークを矢印で示す。このピークは、上の実施例2に従って単離形で得た本生成物の内部標準の使用により、十二糖(III)に割り当てることができる。または、十二糖(III)ピークの同定は、Analytical Chemistry,2009,Vol.81,3485−3499のC.Doneanu et al.による教示に従って、アクイティカラムを質量分析法と連結することによって決定できる。質量分析法では、十二糖(III)は、3226Da(プロトン化形)のこれの分子量により同定される。
薬理学
本発明による多糖は、これの抗血栓特性および治療活性物質としてのこれの値を決定するための薬理学的試験の主題であった。
基準物質としての十二糖(III)およびフォンダパリヌクスのアンチトロンビンとの相互作用を、Journal of Biological Chemistry,2008,283(39),26662−266675に記載されている方法に従って、蛍光滴定法によって試験した。結果を表2にまとめる。
十二糖(III)の抗FXa活性は、凝固を測定するためのACL 7000自動化装置(インスツルメンテーションラボラトリー)により、アンチトロンビンIII、第Xa因子および発色性基質S−2765を含有するヘパリン(登録商標)キットプリパレーション(インスツルメンテーションラボラトリー)を使用して決定した。測定は、メーカーの勧告に従って行った。第2低分子量ヘパリン国際標準(国立生物学的製剤研究所、ロンドン、英国、2003年に制定、コード番号01/608)を使用して、較正曲線を作成した。エノキサパリン(クレキサン(登録商標))およびフォンダパリヌクス(アリクストラ(登録商標))を内部標準化合物として使用した。
Claims (21)
- ヘパリンの構成多糖の一般構造を有し、8000ダルトン未満の分子量を有する硫酸化多糖であって、アンチトロンビンIII結合六糖配列を2個含むことを特徴とし、
ここで、アンチトロンビンIII結合六糖配列は、式(I):
第一の糖単位の炭素原子4および5の間の点線で表される結合は、単結合または二重結合のどちらかであり、
波線は、R1が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上下どちらかに位置する結合を示し、
R1は、式(I)の六糖が多糖の還元末端に位置する場合にOH基を表し、あるいはR1は、多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、結合はR1が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上に位置し、
R2は、式(I)の六糖が多糖の非還元末端に位置する場合に水素原子を表し、この場合には、六糖の第1の糖単位の炭素原子4および5の間の結合は二重結合であり、あるいはR2は、多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、六糖の第1の糖単位の炭素原子4および5の間の結合は単結合である。)に相当し、
多糖が酸形または塩形であることを特徴とする、上記硫酸化多糖。 - 請求項1に記載の多糖であって、12から22個の糖単位を含むことを特徴とする、多糖。
- 請求項1または2に記載の多糖であって、式(II):
(A)d−(I)−(B)f−(I)−(C)g (II)
に相当し、
式中:
A、BおよびC単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表し、
式(I)の単位は、請求項1で定義した通りの、六糖配列を表し、
下付文字d、fおよびgはそれぞれ、0または1〜5の整数を表し、但し、整数d、fおよびgの和が0〜5である
ことを特徴とする、多糖。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載の多糖であって、式(II bis):
(A)n−(I)−(B)m−(I)−(C)k (II bis)
に相当し、
式中:
A、BおよびC単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表し、
式(I)の単位は、請求項1で定義した通りの、六糖配列を表し、
下付文字n、mおよびkはそれぞれ、下付文字n、mまたはkのうち1つが1である場合には、他の2つの下付文字が0であるという条件で、0または1の整数を表す
ことを特徴とする、多糖。 - 請求項1から4のいずれか一項に記載の多糖であって、14個の糖単位を含むことを特徴とする、多糖。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の多糖であって、ナトリウム塩の形である、多糖。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の多糖であって、単離形である、多糖。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の多糖であって、他の多糖との混合物としての、多糖。
- 低分子量または超低分子量ヘパリンであって、請求項1から8のいずれか一項に記載の多糖の1つ以上を含むことを特徴とする、低分子量または超低分子量ヘパリン。
- 請求項11に記載の低分子量または超低分子量ヘパリンであって、請求項5に記載の式(III)の多糖を、ATIIIに親和性を有する十二糖画分に対するパーセンテージ面積として表される、1〜2.5%の含有量で含むことを特徴とする、低分子量または超低分子量ヘパリン。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の多糖を調製する方法であって、低分子量または超低分子量ヘパリンからの前記多糖の直交型分離ステップを含み、前記ステップがゲル透過、高速液体クロマトグラフィー、およびATIII親和性クロマトグラフィーを互いに組み合わせて行うことを含むことを特徴とする、方法。
- 請求項13に記載の方法であって、以下のステップ:
−ゲル透過、次に
−ATIII親和性クロマトグラフィー、次に
−CTA−SAXカラムでの高速液体クロマトグラフィー、次に
−アニオン交換クロマトグラフィーによる精製およびゲル濾過による脱塩
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項13または請求項14に記載の方法であって、超低分子量ヘパリンであるセムロパリンを使用することを特徴とする、方法。
- 医薬であって、請求項1から8のいずれか一項に記載の多糖または該化合物の医薬として許容される酸との付加塩を含むことを特徴とする、医薬。
- 医薬組成物であって、請求項1から8のいずれか一項に記載の多糖または該化合物の医薬として許容される塩と、少なくとも1つの医薬として許容される賦形剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
- 請求項17に記載の医薬組成物であって、抗血栓性オリゴ糖類から選ばれる少なくとも1つの他の活性成分も含むことを特徴とする、医薬組成物。
- 静脈および動脈血栓症、深部静脈血栓症ならびに肺塞栓症を含む血栓症の処置および予防における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載の多糖または該化合物
の医薬として許容される酸との付加塩。 - ヘパリン誘導体のセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下のステップ:
a)試験試料を、前記試料の十二糖画分および/または十四糖画分を単離するステップを含む、請求項13から15のいずれか一項に記載の直交型分離ステップに掛けるステップ、
b)前記十二糖および/または十四糖画分中の、請求項5または7に記載の式(III)、(IV)、(V)または(VI)の1つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
c)場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の1つ以上の含有量を定量するステップ、
d)ステップb)により式(III)、(IV)、(V)または(VI)の硫酸化多糖の1つ以上の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップc)により標準セムロパリン試料の事前に規定された含有量で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が標準試料に一致することを結論付けるステップ、あるいは、ステップb)により式(III)、(IV)、(V)または(VI)の硫酸化多糖の1つ以上の存在を検出することが可能にならない場合、および場合により、ステップc)により標準試料の事前に規定した含有量外で前記多糖の定量が行われる場合、試験試料が標準試料に一致しないことを結論付けるステップ
を含む方法。 - ヘパリン誘導体のセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下のステップ:
a)前記試料の十二糖画分を単離するステップを含む、試験試料に請求項13から15のいずれか一項に記載の直交型分離ステップに掛けるステップ、
b)前記十二糖画分中の、請求項5に記載の式(III)の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
c)場合により、試験試料中の前記多糖(III)の含有量を定量するステップ、
d)ステップb)により多糖(III)の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップc)によりATIII親和性十二糖画分に対するパーセンテージ面積として、1から2.5%の範囲内で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が標準試料に一致することを結論付けるステップ、あるいは、ステップb)
により同じ多糖(III)の存在を検出することが可能にならない場合、および場合によりステップc)により上記1%から2.5%の範囲外で前記多糖が定量される場合、試験試料が標準試料に一致しないことを結論付けるステップを含む方法。
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