JP6113310B2 - AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines and their event-specific identification - Google Patents
AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines and their event-specific identification Download PDFInfo
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
aad−1遺伝子(スフィンゴビウム・ハービシドボランス(Sphingobium herbicidov
orans)を起源とする)は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ(AAD−
1)タンパク質をコードする。この形質は、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸およびアリ
ールオキシフェノキシプロピオネート(一般的に、キザロホップ(quizalofop)のような
「ホップ(fop)」除草剤とよばれる)除草剤に対する耐性を与え、植物形質転換中およ
び育種養樹場における選択マーカーとして用いることができる。aad−1遺伝子自体は
、植物の除草剤耐性について、WO2005/107437において最初に開示された(
US2009−0093366も参照されたい)。
aad-1 gene (Sphingobium herbicidov
orans) is an aryloxyalkanoate dioxygenase (AAD-)
1) Encodes protein. This trait confers resistance to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and aryloxyphenoxypropionate (commonly referred to as “fop” herbicides such as quizalofop) herbicides, It can be used as a selection marker during transformation and in breeding nurseries. The aad-1 gene itself was first disclosed in WO 2005/107437 for herbicide resistance in plants (
See also US 2009-0093366).
植物における異種または外来の遺伝子の発現は、外来遺伝子が染色体のどこに挿入され
るかにより影響される。このことは、例えば、クロマチン構造(例えばヘテロクロマチン
)または組み込み部位に近い転写調節要素(例えばエンハンサー)の近接さを原因とし得
る(Weisingら、Ann. Rev. Genet 22:421〜477、1988)。同じ型のトランスジェニック植
物(またはその他の生物)における同じ遺伝子は、異なるイベント間で広く多様な発現レ
ベルを示すことができる。発現の空間的または時間的なパターンにおける違いも存在する
ことがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的発現における相違は、
導入された遺伝子構築物に存在する転写調節要素から予測されるパターンに対応しないこ
とがある。
Expression of heterologous or foreign genes in plants is affected by where the foreign gene is inserted into the chromosome. This can be due, for example, to the proximity of transcriptional regulatory elements (eg enhancers) close to the chromatin structure (eg heterochromatin) or integration sites (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22: 421-477, 1988). The same gene in the same type of transgenic plant (or other organism) can exhibit a wide variety of expression levels between different events. There may also be differences in the spatial or temporal pattern of expression. For example, the difference in relative expression of transgenes in various plant tissues is
It may not correspond to the pattern predicted from transcriptional regulatory elements present in the introduced gene construct.
よって、多数のイベントがしばしば創出され、ある目的のために満足できるレベルで対
象の導入された遺伝子を発現するイベントを同定するためにスクリーニングされる。商業
的な目的のために、数百〜数千の異なるイベントを生成して、これらのイベントを、所望
の導入遺伝子発現レベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニング
することが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルおよび/またはパターンを有す
るイベントは、導入遺伝子を、他の遺伝子背景に、従来の育種方法を用いる有性外交雑(
sexual outcrossing)により遺伝子移入するために有用である。このような交雑の子孫は
、元の形質転換体に特徴的な導入遺伝子発現を維持する。この方策を用いて、局所的な成
長条件によく適合するいくつかの品種において確実に信頼できる遺伝子発現が得られる。
Thus, a large number of events are often created and screened to identify events that express the introduced gene of interest at a satisfactory level for a purpose. For commercial purposes, it is common to generate hundreds to thousands of different events and screen these events for a single event with the desired transgene expression level and pattern. Events having the desired level and / or pattern of transgene expression can be achieved by sexually crossing the transgene with other genetic backgrounds using conventional breeding methods (
Useful for gene transfer by sexual outcrossing). Such cross offspring maintain the transgene expression characteristic of the original transformant. This strategy ensures reliable gene expression in several varieties that are well suited to local growth conditions.
米国特許出願公開第20020120964A1号および第20040009504A
1号は、ワタイベントPV−GHGT07(1445)ならびにそれを検出するための組
成物および方法に関する。WO02/100163は、ワタイベントMONI5985な
らびにそれを検出するための組成物および方法に関する。WO2004/011601は
、トウモロコシイベントMON863植物ならびにそれを検出するための組成物および方
法に関する。WO2004/072235は、ワタイベントMON88913ならびにそ
れを検出するための組成物および方法に関する。
US Patent Application Publication Nos. 20020120964A1 and 20040009504A
No. 1 relates to cotton event PV-GHGT07 (1445) and compositions and methods for detecting it. WO 02/100163 relates to cotton event MONI 5985 and compositions and methods for detecting it. WO 2004/011601 relates to a corn event MON863 plant and compositions and methods for detecting it. WO 2004/072235 relates to cotton event MON 88913 and compositions and methods for detecting it.
WO2006/098952は、トウモロコシイベント3272に関する。WO200
7/142840は、トウモロコシイベントMIR162に関する。
WO 2006/098952 relates to corn event 3272. WO200
7/142840 relates to the corn event MIR162.
米国特許第7,179,965号は、cry1Fイベントおよびcry1Acイベント
を有するワタに関する。
US Pat. No. 7,179,965 relates to cotton having a cry1F event and a cry1Ac event.
本明細書に開示される特定のイベントを有するAAD−1トウモロコシは、以前に開示
されていなかった。
AAD-1 corn with the specific events disclosed herein has not been previously disclosed.
本発明は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に受託番号PTA−
10244で寄託された種子を有する、DAS−40278−9とよばれるAAD−1ト
ウモロコシイベント、およびそれに由来する子孫に関する。本発明の他の態様は、子孫植
物、種子および穀粒または植物の再生可能な部分ならびにトウモロコシイベントDAS−
40278−9の種子および子孫、ならびにこれらのいずれかから作製される食品または
飼料製品を含む。本発明は、それらに限定されないが、花粉、胚珠、花、苗条(shoot)
、根および葉ならびに栄養細胞、花粉細胞および卵細胞の核を含むトウモロコシイベント
DAS−40278−9の植物部分も含む。本発明は、フェノキシオーキシン型および/
またはアリールオキシアルカノエート除草剤に対する耐性を有するトウモロコシ植物、ト
ウモロコシイベントDAS−40278−9の新規な遺伝子組成およびトウモロコシイベ
ントDAS−40278−9を含むトウモロコシ植物の農業経済学的(agronomic)性能
の態様にもさらに関する。
The present invention is registered with the American Type Culture Collection (ATCC) under the accession number PTA-
It relates to the AAD-1 corn event called DAS-40278-9, with the seed deposited at 10244, and offspring derived therefrom. Other aspects of the invention include progeny plants, seeds and grains or renewable parts of plants and the corn event DAS-
40278-9 seeds and progeny, and food or feed products made from any of these. The present invention includes, but is not limited to, pollen, ovules, flowers, shoots
Also included are plant parts of the corn event DAS-40278-9, including roots and leaves and nuclei of vegetative cells, pollen cells and egg cells. The present invention relates to phenoxyauxin type and / or
Or a maize plant having resistance to aryloxyalkanoate herbicides, a novel genetic composition of maize event DAS-40278-9 and an aspect of agronomic performance of maize plant comprising maize event DAS-40278-9 Also about
本発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、トウモロコ
シ細胞のゲノム内の特定の部位に挿入された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配
列を含むトウモロコシ植物における新規なaad−1形質転換イベントを含む。
The invention relates in part to plant breeding and herbicide-tolerant plants. The present invention includes a novel aad-1 transformation event in a corn plant comprising a polynucleotide sequence described herein, inserted at a specific site in the corn cell genome.
いくつかの実施形態において、前記イベント/ポリヌクレオチド配列は、例えばその他
の除草剤耐性遺伝子(複数可)および/または昆虫阻害タンパク質を含むその他の形質と
「掛け合わせる」ことができる。しかし、主題の発明は、本明細書に記載されるように、
単一イベントを有する植物を含む。
In some embodiments, the event / polynucleotide sequence can be “multiplied” with other traits including, for example, other herbicide resistance gene (s) and / or insect inhibitory proteins. However, the subject invention, as described herein,
Includes plants with a single event.
追加の形質は、植物ゲノムに、植物育種、トウモロコシイベントDAS−40278−
9を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的組み込
みによる新しい形質の追加により掛け合わせることができる。
Additional traits include plant breeding, corn event DAS-40278-
Multiplication can be achieved by retransformation of transgenic plants containing 9 or addition of new traits by targeted integration by homologous recombination.
他の実施形態は、例えばpat遺伝子発現カセットを含むトウモロコシイベントDAS
−40278−9を含むポリヌクレオチド配列の切り出しを含む。ポリヌクレオチド配列
の切り出しにより、改変されたイベントは、特定の染色体の部位に再び標的にされ、ここ
で、追加のポリヌクレオチド配列は、トウモロコシイベントDAS−40278−9と掛
け合わせることができる。
Other embodiments include, for example, a corn event DAS comprising a pat gene expression cassette
Includes excision of a polynucleotide sequence containing -40278-9. By excision of the polynucleotide sequence, the altered event is retargeted to a specific chromosomal site, where additional polynucleotide sequences can be multiplied with the corn event DAS-40278-9.
一実施形態において、本発明は、2008DASトウモロコシ連鎖地図(linakge map
)上のおよそ20cMにてSSRマーカーUMC1265(配列番号30および配列番号
31を参照されたい)とMMC0111(配列番号32および配列番号33を参照された
い)との間のおよそ20cMにて第2染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位を包含
し、ここで、標的部位は異種核酸を含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号2
9においてまたはそれにより規定される場所を含むトウモロコシ染色体標的部位と、当業
者により認識される、本明細書に記載されるその残基を包含する。
In one embodiment, the present invention provides a 2008 DAS linakge map.
) On chromosome 2 at approximately 20 cM between SSR markers UMC1265 (see SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31) and MMC0111 (see SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33) at approximately 20 cM above A corn chromosome target site, wherein the target site comprises a heterologous nucleic acid. In another embodiment, the present invention provides SEQ ID NO: 2
Corn chromosomal target site including the location at or defined by 9 and its residues described herein as recognized by one skilled in the art.
一実施形態において、本発明は、2008DASトウモロコシ連鎖地図上のおよそ20
cMにてSSRマーカーUMC1265(配列番号30および配列番号31を参照された
い)とMMC0111(配列番号32および配列番号33を参照されたい)との間のおよ
そ20cMにて第2染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェ
ニックトウモロコシ植物を作製する方法を包含する。さらに別の実施形態において、挿入
された異種核酸は、配列番号29を参照して本明細書で規定される5’フランキング配列
の全てまたは一部と5’にて接し、配列番号29を参照して本明細書で規定される5’フ
ランキング配列の全てまたは一部と3’にて接する。
In one embodiment, the present invention provides approximately 20 on the 2008 DAS corn chain map.
Heterologous to a position on chromosome 2 at approximately 20 cM between SSR markers UMC1265 (see SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31) and MMC0111 (see SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33) at cM A method of producing a transgenic corn plant comprising the step of inserting a nucleic acid is included. In yet another embodiment, the inserted heterologous nucleic acid touches 5 ′ with all or part of the 5 ′ flanking sequence defined herein with reference to SEQ ID NO: 29, see SEQ ID NO: 29 Then, it makes contact with 3 ′ or all or part of the 5 ′ flanking sequence defined in this specification.
さらに、主題の発明は、(例えばトウモロコシ穀粒の)試料中の主題のイベントの存在
を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、組換え構築物の、トウモロコシゲノ
ムに挿入された、挿入部位に接するゲノム配列上のDNA配列に基づく。アッセイを実行
するために有用なキットおよび条件も提供される。
Further, the subject invention provides an assay for detecting the presence of a subject event in a sample (eg, corn kernels). The assay is based on the DNA sequence of the recombinant construct on the genomic sequence adjacent to the insertion site, inserted into the maize genome. Kits and conditions useful for performing the assay are also provided.
したがって、主題の発明は、部分的に、AAD−1挿入断片全体のDNA配列およびそ
の境界領域(トランスジェニックトウモロコシ系統における)のクローニングおよび解析
に関する。これらの配列は、ユニークである。これらの挿入断片および境界配列に基づい
て、イベント特異的プライマーを作製した。PCR解析は、これらのイベントが、これら
のイベント特異的プライマーセットを用いて生じるPCRアンプリコンの解析により同定
できることを証明した。したがって、これらのおよびその他の関連する手順は、主題の発
明のイベントを含むトウモロコシ系統を独自に同定するために用いることができる。
Accordingly, the subject invention relates in part to the cloning and analysis of the DNA sequence of the entire AAD-1 insert and its border regions (in transgenic corn lines). These sequences are unique. Based on these inserts and border sequences, event-specific primers were generated. PCR analysis demonstrated that these events can be identified by analysis of PCR amplicons generated using these event-specific primer sets. Thus, these and other related procedures can be used to uniquely identify corn lines containing the subject invention event.
発明の詳細な説明
本発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、トウモロコ
シ細胞のゲノム内の特定の位置に挿入された、本明細書に記載される主題のaad−1ポ
リヌクレオチド配列を含むトウモロコシ植物(メイズ(maize))の新規な形質転換イベ
ントを含む。いくつかの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列は、例えばその
他の除草剤耐性遺伝子(複数可)および/または昆虫阻害タンパク質をコードする遺伝子
(複数可)のようなその他の形質と「掛け合わせる」ことができる。いくつかの実施形態
において、上記のポリヌクレオチド配列は、切り出して、その後、追加のポリヌクレオチ
ド配列を用いて再び標的にすることができる。しかし、主題の発明は、本明細書に記載さ
れるように単一イベントを有する植物を含む。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates in part to plant breeding and herbicide tolerant plants. The present invention relates to a novel transformation event of a maize plant (maize) comprising a subject aad-1 polynucleotide sequence described herein, inserted at a specific location in the genome of a maize cell. Including. In some embodiments, the polynucleotide sequence is “multiplied” with other trait such as, for example, other herbicide resistance gene (s) and / or gene (s) encoding insect inhibitory protein. be able to. In some embodiments, the polynucleotide sequences described above can be excised and then retargeted with additional polynucleotide sequences. However, the subject invention includes plants having a single event as described herein.
さらに、主題の発明は、試料中の主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提
供する。主題の発明の態様は、本明細書において例示されるかまたは示唆される任意の診
断用核酸分子、特に主題のフランキング配列に全体的または部分的に基づくものを設計お
よび/または生成する方法を含む。
Furthermore, the subject invention provides an assay for detecting the presence of a subject event in a sample. An aspect of the subject invention is a method of designing and / or generating any diagnostic nucleic acid molecule exemplified or suggested herein, particularly based in whole or in part on the subject flanking sequences. Including.
より具体的には、主題の発明は、部分的に、トランスジェニックトウモロコシイベント
DAS−40278−9(pDAS1740−278としても知られる)、これらのイベ
ントを含む植物系統、ならびにこの挿入断片および/またはその境界領域のDNA配列の
クローニングおよび解析に関する。主題の発明の植物系統は、本明細書に開示され、示唆
される配列を用いて検出できる。
More specifically, the subject invention, in part, is the transgenic corn event DAS-40278-9 (also known as pDAS1740-278), plant lines containing these events, and inserts and / or its It relates to the cloning and analysis of the DNA sequence of the border region. The plant lines of the subject invention can be detected using the sequences disclosed and suggested herein.
いくつかの実施形態において、本発明は、除草剤耐性トウモロコシ系統およびその同定
に関する。主題の発明は、部分的に、有性交雑の子孫が対象のイベントを含有しているか
を決定するために、主題のイベントの存在を検出することに関する。さらに、イベントを
検出するための方法が含まれ、例えば、市場に出す前の承認および組換え作物植物に由来
する食物のラベル付けが必要とされる規制を遵守するために役に立つ。主題のイベントの
存在は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または核酸プローブを用いるDNAハイブリダ
イゼーションのような任意の公知の核酸検出法により検出できる。イベント特異的PCR
は、例えば、Windelsら(Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999)で論
じられている。これは、挿入断片とフランキングDNAとの間の接合部に及ぶプライマー
セットを用いるPCRによる、グリホサート耐性ダイズイベント40−3−2の同定に関
する。より具体的には、1つのプライマーは挿入断片からの配列を含み、第2プライマー
はフランキングDNAからの配列を含んだ。
In some embodiments, the present invention relates to herbicide-tolerant corn lines and their identification. The subject invention relates, in part, to detecting the presence of a subject event to determine whether sexual cross offspring contain the event of interest. In addition, methods for detecting events are included to help comply with regulations that require, for example, pre-market approval and labeling of foods from recombinant crop plants. The presence of the subject event can be detected by any known nucleic acid detection method such as polymerase chain reaction (PCR) or DNA hybridization using nucleic acid probes. Event specific PCR
Are discussed, for example, in Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64 / 5b: 459462, 1999). This relates to the identification of glyphosate resistant soybean event 40-3-2 by PCR using a primer set spanning the junction between the insert and flanking DNA. More specifically, one primer contained the sequence from the insert and the second primer contained the sequence from the flanking DNA.
トウモロコシを、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ(AAD−1)タン
パク質をコードするスフィンゴビウム・ハービシドボランス(Sphingobium herbicidovor
ans)からのaad−1遺伝子の挿入により改変した。この形質は、2,4−ジクロロフ
ェノキシ酢酸およびアリールオキシフェノキシプロピオネート(一般的に、キザロホップ
のような「ホップ」除草剤とよばれる)除草剤に対する耐性を与え、植物形質転換中およ
び育種養樹場における選択マーカーとして用いることができる。プラスミドpDAS17
40からのDNA断片でのトウモロコシの形質転換を育種により行って、イベントDAS
−40278−9を生成した。
Corn is sphingobium herbicidovor, which encodes an aryloxyalkanoate dioxygenase (AAD-1) protein.
modified by insertion of the aad-1 gene from ans). This trait provides resistance to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and aryloxyphenoxypropionate (commonly called “hop” herbicides such as quizalofop) herbicides, during plant transformation and breeding It can be used as a selection marker in a tree place. Plasmid pDAS17
Transformation of maize with DNA fragments from 40 by breeding, event DAS
-40278-9 was produced.
イベントDAS−40278−9の5つの世代に由来する20の個別のトウモロコシ植
物および世代ごとの4つの植物から抽出したゲノムDNA試料を、AAD−1トウモロコ
シイベントDAS−40278−9の分子特徴決定のために選択した。AAD−1タンパ
ク質発現を、AAD−1特異的迅速テストストリップキットを用いて試験した。AAD−
1タンパク質発現について陽性と試験された植物だけを、その後の分子特徴決定のために
選択した。サザンハイブリダイゼーションにより、aad−1遺伝子が、AAD−1タン
パク質発現について陽性と試験されたトウモロコシ植物に存在し、aad−1遺伝子が、
aad−1遺伝子プローブとハイブリダイズした場合にこれらの植物中に単一のインタク
トなコピーとして挿入されたことが確認された。
Genomic DNA samples extracted from 20 individual corn plants from 5 generations of event DAS-40278-9 and 4 plants per generation were used for molecular characterization of AAD-1 corn event DAS-40278-9. Selected. AAD-1 protein expression was tested using an AAD-1 specific rapid test strip kit. AAD-
Only plants that tested positive for 1 protein expression were selected for subsequent molecular characterization. By Southern hybridization, the aad-1 gene is present in corn plants tested positive for AAD-1 protein expression, and the aad-1 gene is
It was confirmed that when hybridized with the aad-1 gene probe, it was inserted into these plants as a single intact copy.
AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9における挿入されたDNAの分子特徴決定も、本明細書に記載される。イベントは、プラスミドpDAS1740のFspI断片を用いるウィスカー形質転換により生成した。サザンブロット解析を用いて、挿入されたDNA断片の組み込みパターンを確立し、イベントDAS−40278−9におけるaad−1遺伝子の挿入断片/コピーの数を決定した。データを作製して、トウモロコシゲノムに挿入されたaad−1導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。プロモーターおよびターミネーターのような非コード領域(コード領域を調節するように設計された)、マトリクス付着領域RB7 Mar v3およびRB7 Mar v4の組み込みの特徴決定、ならびに世代にわたる導入遺伝子挿入断片の安定性を評価した。挿入されたDNAの安定性は、植物の5つの異なる世代にわたって証明された。さらに、アンピシリン抵抗性遺伝子(Apr)領域を含む形質転換プラスミド主鎖配列が存在しないことを、プラスミドpDAS1740の制限部位(FspI)に接する主鎖領域のほぼ全体をカバーするプローブにより証明した。挿入の詳細な物理的な地図は、イベントDAS−40278−9のこれらのサザンブロット解析に基づいて描いた。
Also described herein is the molecular characterization of the inserted DNA at the AAD-1 corn event DAS-40278-9. Events were generated by whisker transformation using the FspI fragment of plasmid pDAS1740. Southern blot analysis was used to establish the integration pattern of the inserted DNA fragment and to determine the number of inserts / copy of the aad-1 gene at event DAS-40278-9. Data was generated to verify the integration and integrity of the aad-1 transgene inserted into the maize genome. Characterization of integration of non-coding regions such as promoters and terminators (designed to regulate the coding region), matrix attachment regions RB7 Mar v3 and RB7 Mar v4, and stability of transgene inserts across generations did. The stability of the inserted DNA has been demonstrated over five different generations of plants. Furthermore, the absence of a transformed plasmid backbone sequence containing the ampicillin resistance gene (Ap r ) region was verified by a probe covering almost the entire backbone region in contact with the restriction site (FspI) of plasmid pDAS1740. A detailed physical map of the insert was drawn based on these Southern blot analyzes of event DAS-40278-9.
AAD−1タンパク質のレベルを、トウモロコシ組織において決定した。さらに、トウ
モロコシのフォレージ(forage)および穀粒について組成解析を行って、同質遺伝子非形
質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコシ系統DAS−40278−9
との間の等価性を調べた(噴霧なし、2,4−Dを噴霧、キザロホップを噴霧および2,
4−Dとキザロホップとを噴霧)。同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統の農業経済学
的特徴も、DAS−40278−9トウモロコシと比較した。
The level of AAD-1 protein was determined in corn tissue. In addition, a compositional analysis was performed on corn forage and kernels to determine isogenic non-transformed corn lines and transgenic corn lines DAS-40278-9.
(No spray, 2,4-D spray, quizalofop spray and 2,
4-D and quizalofop sprayed). The agroeconomic characteristics of isogenic non-transformed maize lines were also compared to DAS-40278-9 maize.
非トランスジェニック対照とアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−1(A
AD−1)を含有するハイブリッドトウモロコシ系統との野外での発現、栄養組成および
農業経済学的試行を、Iowa、Illinois(2箇所)、Indiana、Neb
raskaおよびOntario、Canadaにある6つの現場で同じ年に行った。発
現レベルは、本明細書において、葉、花粉、根、フォレージ、植物全体および穀粒におけ
るAAD−1タンパク質、農業経済学的決定の結果、ならびに対照およびDAS−402
78−9 AAD−1トウモロコシからのフォレージおよび穀粒試料の組成解析について
まとめる。
Non-transgenic control and aryloxyalkanoate dioxygenase-1 (A
Field expression, nutritional composition and agro-economic trials with hybrid maize lines containing AD-1) were studied by Iowa, Illinois (2 places), Indiana, Neb
The same year was done at six sites in Raska and Ontario, Canada. Expression levels are used herein for AAD-1 protein in leaves, pollen, roots, forage, whole plants and kernels, results of agro-economic determinations, and controls and DAS-402.
Summary of composition analysis of forage and kernel samples from 78-9 AAD-1 corn.
可溶性の抽出可能なAAD−1タンパク質を、トウモロコシの葉、花粉、根、フォレー
ジ、植物全体および穀粒において、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法を
用いて測定した。良好な平均発現値が、本明細書により詳細に論じられるように、根およ
び花粉組織において観察された。発現値は、全ての噴霧処理、ならびに2,4−Dおよび
キザロホップ除草剤を噴霧したプロットおよび噴霧しなかったプロットについて同様であ
った。
Soluble extractable AAD-1 protein was measured in corn leaves, pollen, roots, forage, whole plants and grains using a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. Good average expression values were observed in root and pollen tissues, as discussed in more detail herein. The expression values were similar for all spray treatments and plots sprayed and unsprayed with 2,4-D and quizalofop herbicides.
近成組成(proximates)、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、抗栄養素、および
2次代謝産物を含む組成解析を行って、対照に対するDAS−40278−9 AAD−
1トウモロコシ(除草剤処置ありまたはなし)の等価性を調べた。DAS−40278−
9 AAD−1組成試料についての結果は、全て、対照系統および/または従来のトウモ
ロコシに基づいて、対照およびDAS−40278−9 AAD−1トウモロコシプロッ
トから収集された農業経済学的データの解析と同様であったか、またはそれよりも良好で
あった(生物学的および農業経済学的に)。
A composition analysis including proximates, minerals, amino acids, fatty acids, vitamins, anti-nutrients, and secondary metabolites was performed to determine DAS-40278-9 AAD- versus control.
The equivalence of 1 maize (with or without herbicide treatment) was examined. DAS-40278-
The results for the 9 AAD-1 composition samples are all similar to the analysis of agro-economic data collected from the control and DAS-40278-9 AAD-1 corn plots, based on control lines and / or conventional corn Or better (biologically and agroeconomically).
上記の背景技術の部分で言及したように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組み
込みは、いくつかのランダムなイベントを含む(よって、発現される所定の挿入について
の名称「イベント」)。つまり、アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換、「遺
伝子銃」およびウィスカーのような多くの形質転換技術を用いると、ゲノム中のどこに導
入遺伝子が挿入されるかを予測できない。したがって、挿入断片の両側でのフランキング
植物ゲノムDNAを同定することは、所定の挿入イベントを有する植物を同定するために
重要になり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合部領域にわたるPCRアンプリ
コンを生じるPCRプライマーを設計できる。このPCRアンプリコンを用いて、ユニー
クなまたは別個の型の挿入イベントを同定できる。
As mentioned in the background section above, the introduction and integration of a transgene into the plant genome involves several random events (hence the name “event” for a given insertion to be expressed). That is, using many transformation techniques such as Agrobacterium transformation, “gene gun” and whiskers, it is not possible to predict where the transgene will be inserted in the genome. Thus, identifying flanking plant genomic DNA on both sides of the insert can be important for identifying plants with a given insertion event. For example, PCR primers can be designed that produce PCR amplicons that span the junction region of the insert and the host genome. This PCR amplicon can be used to identify unique or distinct types of insertion events.
「イベント」は、もともとランダムなイベントであるので、この開示の一部分として、
イベントを含むトウモロコシ系統の少なくとも2500の種子は、アメリカンタイプカル
チャーコレクション(ATCC)、10801 University Bouleva
rd、Manassas、VA、20110に寄託されており、制限なく一般に利用可能
である(但し、特許権下にある)。この寄託は、ATCC寄託番号PTA−10244(
イエローデントメイズハイブリッド種子(ゼア・メイズ エル.(Zea Mays L.)):D
AS−40278−9;Dow AgroSciences LLCのために寄託;AT
TCによる種子/株(複数可)の受領日:2009年7月10日;生存確認日は2009
年8月17日)とよばれる。この寄託は、特許手続上の種子の寄託に関するブダペスト条
約に従い、この条約の下で行われ、維持される。寄託は、公共の寄託機関であるATCC
寄託機関にて、制限なく、30年または直近の要請後5年、または特許の有効期間のいず
れかより長い期間にわたって維持され、その期間中に生存しなくなった場合は置き換えら
れる。
Since “events” are originally random events, as part of this disclosure,
At least 2500 seeds of the maize line containing the event are American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Bouleva
It has been deposited with rd, Manassas, VA, 20110 and is generally available without limitation (but under patent rights). This deposit is ATCC deposit number PTA-10244 (
Yellow Dent Maze Hybrid Seeds (Zea Mays L.): D
AS-40278-9; deposited for Dow AgroSciences LLC; AT
Date of receipt of seed / strain (s) by TC: July 10, 2009; Survival confirmation date is 2009
August 17). This deposit is made and maintained under this Convention in accordance with the Budapest Treaty on Seed Deposits in Patent Proceedings. The deposit is ATCC, a public depository.
At the depositary institution, without limitation, will be maintained for 30 years or 5 years after the most recent request, or for a longer period of time, either longer than the validity period of the patent, and replaced if it does not survive during that period.
寄託された種子は、主題の発明の一部である。明らかに、トウモロコシ植物は、これら
の種子から成長でき、このような植物は、主題の発明の一部である。主題の発明は、これ
らの植物およびその子孫を検出するために有用なこれらのトウモロコシ植物に含まれるD
NA配列にも関する。主題の発明の検出方法およびキットは、試験の最終目的に応じてこ
れらのイベントのいずれか1つ、2つまたは3つ全てでさえも同定するようにできる。
The deposited seed is part of the subject invention. Clearly, corn plants can be grown from these seeds, and such plants are part of the subject invention. The subject invention is a D contained in these corn plants useful for detecting these plants and their progeny.
It also relates to NA sequences. The subject invention detection methods and kits can be adapted to identify any one, two or even all three of these events depending on the ultimate purpose of the test.
本明細書において、本発明を説明することを補助し、当業者が本発明を行う手引きとな
るように定義および実施例が提供される。そうでないと記載しない限り、用語は、関連す
る技術分野の当業者による従来の慣例に従って理解される。37CFR§1.822に記
載されるDNA塩基についての命名法を用いる。
Definitions and examples are provided herein to assist in describing the present invention and to assist one of ordinary skill in carrying out the present invention. Unless otherwise noted, terms are to be understood according to conventional conventions by those of ordinary skill in the relevant art. The nomenclature for DNA bases described in 37 CFR §1.822 is used.
本明細書で用いる場合、用語「子孫」は、AAD−1トウモロコシイベントDAS−4
0278−9を含む親の植物の任意の世代の子のことをいう。
As used herein, the term “offspring” refers to the AAD-1 corn event DAS-4.
Refers to the child of any generation of the parent plant, including 0278-9.
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種DNA、すなわち対象の導入遺伝
子を含む核酸構築物で形質転換し、導入遺伝子を植物のゲノムに挿入することにより得ら
れる植物の集団を再生し、特定のゲノムの場所への挿入を特徴とする特定の植物を選択す
ることにより生成される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種DNAを含む
形質転換体の子孫のことをいう。用語「イベント」は、形質転換体と、ゲノム/導入遺伝
子DNAを含む別の品種との間の有性外交雑により作出される子孫のこともいう。反復親
との繰り返しの戻し交雑の後でさえ、形質転換された親からの挿入された導入遺伝子DN
AおよびフランキングゲノムDNA(ゲノム/導入遺伝子DNA)は、交雑の子孫におい
て、染色体上の同じ場所に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体およびその子
孫からのDNAのこともいい、それらは、挿入されたDNAを含む1つの親の系統(例え
ば元の形質転換体および自家生殖により得られる子孫)と挿入されたDNAを含まない親
の系統との有性交雑の結果としての、対象の導入遺伝子を含む挿入されたDNAを受ける
子孫に伝達されると予測される挿入されたDNAに直接隣接するフランキングゲノム配列
と挿入されたDNAとを含む。
A transgenic “event” involves regenerating a population of plants obtained by transforming plant cells with a heterologous DNA, ie, a nucleic acid construct containing a transgene of interest, and inserting the transgene into the genome of the plant, to a specific genome. It is generated by selecting a specific plant that is characterized by its insertion at the location. The term “event” refers to the progeny of the original transformant and transformants containing heterologous DNA. The term “event” also refers to progeny produced by sexual crossing between a transformant and another breed containing genomic / transgene DNA. Even after repeated backcrosses with the recurrent parent, the inserted transgene DN from the transformed parent
A and flanking genomic DNA (genomic / transgene DNA) are present at the same location on the chromosome in the offspring of the cross. The term “event” can also refer to DNA from the original transformant and its progeny, which is a single parental line containing the inserted DNA (eg, the original transformant and progeny obtained by autologous reproduction). ) And the inserted DNA that is predicted to be transmitted to the offspring that will receive the inserted DNA containing the transgene of interest as a result of sexual crossing with the parental strain that does not contain the inserted DNA. Flanking genomic sequences and inserted DNA.
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されたDNAが、挿入点に接するトウモロコシの天然
のゲノムからのDNAと連結される点に及び、植物の遺伝子材料における一方または他方
の接合部配列の同定または検出は、イベントに特徴的(diagnostic)であるために十分で
ある。本明細書に記載されるトウモロコシイベントにおける挿入と、類似の長さのフラン
キングDNAとに及ぶDNA配列が含まれる。このような特徴的配列の具体的な例を本明
細書に示す。しかし、挿入の接合部または挿入とゲノム配列との接合部とオーバーラップ
するその他の配列も特徴的であり、主題の発明に従って用いることができる。
“Joint sequence” refers to the point at which DNA inserted into the genome is ligated with DNA from the natural maize genome that contacts the insertion point, and the identification of one or the other junction sequence in the genetic material of the plant or Detection is sufficient to be diagnostic to the event. Included are DNA sequences spanning insertions in the corn events described herein and flanking DNA of similar length. Specific examples of such characteristic sequences are shown herein. However, the junction of the insert or other sequences that overlap the junction of the insert and the genomic sequence are also characteristic and can be used according to the subject invention.
主題の発明は、このようなフランキング配列、接合部配列および挿入断片配列の同定に
関する。関連するPCRプライマーおよびアンプリコンが、本発明に含まれる。主題の発
明に従って、挿入されたDNAとその境界に及ぶアンプリコンを用いるPCR解析法を用
いて、市場にあるトランスジェニックトウモロコシ品種または主題の所有権のあるトラン
スジェニックトウモロコシ系統に由来する系統を検出または同定することができる。
The subject invention relates to the identification of such flanking, junction and insert sequences. Related PCR primers and amplicons are included in the present invention. In accordance with the subject invention, PCR analysis using inserted amplicons and amplicons that span the boundaries is used to detect or derive lines from transgenic corn varieties that are on the market or transgenic corn lines that are the subject of ownership Can be identified.
これらの挿入断片のそれぞれの配列全体を、それぞれのフランキング配列の部分と一緒
に、本明細書において配列番号29として示す。配列番号29(全8557塩基対)に関
するこのイベントについての挿入断片およびフランキング配列の座標を以下に記載する。
このことは、例えば実施例3.8でより詳細に議論する。
The entire sequence of each of these inserts is shown herein as SEQ ID NO: 29, together with a portion of the respective flanking sequence. The insert and flanking sequence coordinates for this event with respect to SEQ ID NO: 29 (total 8557 base pairs) are listed below.
This is discussed in more detail, for example in Example 3.8.
この挿入イベントおよびそのさらなる要素を、図1および2にさらに示す。これらの配
列(特にフランキング配列)は、ユニークである。これらの挿入断片配列および境界配列
に基づいて、イベント特異的プライマーを作製した。PCR解析により、これらのトウモ
ロコシ系統が、異なるトウモロコシ遺伝子型において、これらのイベント特異的プライマ
ーセットを用いて生じるPCRアンプリコンの解析により同定できることが証明された。
したがって、これらのおよびその他の関連する手順を用いて、これらのトウモロコシ系統
を独自に同定できる。本明細書において同定される配列は、ユニークである。例えば、G
ENBANKデータベースに対するBLAST検索は、クローニングされた境界配列と、
データベース中の配列との間にいずれの著しい相同性も明らかにしなかった。
This insertion event and its further elements are further illustrated in FIGS. These sequences (especially flanking sequences) are unique. Based on these insert and border sequences, event specific primers were generated. PCR analysis demonstrated that these maize lines can be identified by analysis of PCR amplicons generated using these event-specific primer sets in different maize genotypes.
Thus, these and other related procedures can be used to uniquely identify these maize lines. The sequences identified herein are unique. For example, G
A BLAST search against the ENBANK database includes a cloned border sequence and
It did not reveal any significant homology with the sequences in the database.
主題の発明の検出技術は、子孫において1または複数の追加の対象の形質を与えるため
の努力において対象のイベントを含む親の植物を別の植物系統と交雑させた後にどの子孫
植物が所定のイベントを含むかを決定するために、植物育種と関連して特に有用である。
これらのPCR解析法は、トウモロコシ育種プログラムならびに特に市場にあるトランス
ジェニックトウモロコシ種子についての品質管理に利益をもたらす。これらのトランスジ
ェニックトウモロコシ系統についてのPCR検出キットも、今回、作製して用いることが
できる。このことも、製品の登録および製品の管理に利益をもたらし得る。
The detection technique of the subject invention is to determine which progeny plant has a given event after crossing a parent plant containing the event of interest with another plant line in an effort to provide one or more additional subject traits in the offspring. Is particularly useful in connection with plant breeding.
These PCR analysis methods benefit corn breeding programs as well as quality control, especially for transgenic corn seeds on the market. PCR detection kits for these transgenic corn lines can also be made and used this time. This can also benefit product registration and product management.
さらに、フランキングトウモロコシ/ゲノム配列を用いて、各挿入断片のゲノムでの場
所を特異的に同定できる。この情報を用いて、各イベントに特異的な分子マーカーシステ
ムを作製できる。これらは、育種方策を促進し、連鎖データを創出するために用いること
ができる。
In addition, flanking maize / genomic sequences can be used to specifically identify the location of each insert in the genome. This information can be used to create a molecular marker system specific to each event. These can be used to promote breeding strategies and create linkage data.
さらに、フランキング配列情報を用いて、導入遺伝子組み込みプロセス、ゲノム組み込
み部位の特徴、イベントの分類、導入遺伝子およびそれらのフランキング配列の安定性、
ならびに遺伝子発現(特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子メチル化パターン、位置効
果、およびMARS[マトリクス付着領域]などのような可能性のある発現関連要素に関
する)を研究して特徴決定できる。
In addition, using the flanking sequence information, the transgene integration process, the characteristics of the genomic integration site, the classification of events, the stability of the transgenes and their flanking sequences,
As well as gene expression (especially with respect to possible expression-related elements such as gene silencing, transgene methylation patterns, position effects, and MARS [matrix attachment region]).
全ての主題の開示に鑑みて、主題の発明が、ATCC寄託番号PTA−10244の下で利用可能な種子を含むことが明確である。主題の発明は、受託番号PTA−10244の下でATCCに寄託された種子から成長した除草剤抵抗性トウモロコシ植物も含む。主題の発明は、葉のような上記の植物の一部分、組織試料、上記の植物により作出される種子、花粉などをさらに含む。
In view of all subject disclosures, it is clear that the subject invention includes seeds that are available under ATCC Deposit Number PTA-10244. The subject invention also includes herbicide- resistant corn plants grown from seed deposited with the ATCC under accession number PTA-10244. The subject invention further includes parts of the above plants such as leaves, tissue samples, seeds produced by the above plants, pollen and the like.
さらに、主題の発明は、寄託された種子から成長した植物の子孫(descendant)および/または子孫(progeny)植物、好ましくは除草剤抵抗性トウモロコシ植物であって、上記の植物が、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムDNA/挿入断片DNA接合部配列を含むゲノムを有する植物を含む。本明細書で用いる場合、用語「トウモロコシ」は、メイズ(ゼア・メイズ(Zea mays))を意味し、トウモロコシと育種できるその全ての品種を含む。
Further, the subject invention is a descendant and / or progeny plant, preferably a herbicide- resistant corn plant, of a plant grown from the deposited seed, wherein said plant is herein Plants having a genome comprising a detectable wild type genomic DNA / insert DNA junction sequence as described. As used herein, the term “corn” means maize (Zea mays) and includes all varieties thereof that can be bred with corn.
本発明は、主題の発明の植物を少なくとも一方の親として用いて交雑種を作製するプロ
セスも含む。例えば、主題の発明は、本明細書に例示される植物のいずれかを一方または
両方の親として有するF1ハイブリッド植物を含む。主題の発明のこのようなF1ハイブ
リッドにより作出される種子も、主題の発明に含まれる。本発明は、例示される植物を、
異なる(例えば近交系の親)植物と交雑させ、得られるハイブリッド種子を収穫すること
によりF1ハイブリッド種子を作出する方法を含む。主題の発明は、雌性の親または雄性
の親のいずれかである例示される植物を含む。得られる植物の特徴は、親の植物を注意し
て考慮することにより改良できる。
The invention also includes a process for producing a hybrid using the subject invention plant as at least one parent. For example, the subject invention includes an F 1 hybrid plant having as one or both parents any of the plants exemplified herein. Seeds that are produced by such F 1 hybrid of the subject invention are also included in the subject invention. The present invention relates to exemplified plants,
Different (e.g. inbred parent) was crossed with a plant, comprising the method of producing the F 1 hybrid seed by harvesting the hybrid seed obtained. The subject invention includes exemplified plants that are either female parents or male parents. The characteristics of the resulting plant can be improved by carefully considering the parent plant.
除草剤耐性トウモロコシ植物は、本明細書で言及する系統のいずれか1つの種子から成長したトウモロコシ植物からなる第1の親のトウモロコシ植物と、第2の親のトウモロコシ植物とをまず有性交雑させ、それにより複数の第1子孫植物を作出し、次いで、除草剤に抵抗性の第1子孫植物(または主題の発明のイベントの少なくとも1つを有するもの)を選択し、第1子孫植物を自家生殖し、それにより複数の第2子孫植物を作出し、次いで、第2子孫植物から、除草剤に抵抗性の植物(または主題の発明のイベントの少なくとも1つを有するもの)を選択することにより育種できる。これらのステップは、第1子孫植物または第2子孫植物を、第2の親のトウモロコシ植物または第3の親のトウモロコシ植物と戻し交雑することをさらに含み得る。主題の発明のトウモロコシ種子を含むトウモロコシ作物またはその子孫を、次いで、植えることができる。
A herbicide-tolerant corn plant first sexually crosses a first parent corn plant consisting of a corn plant grown from the seed of any one of the lines referred to herein with a second parent corn plant. Thereby producing a plurality of first progeny plants, then selecting a first progeny plant that is resistant to the herbicide (or having at least one event of the subject invention) and By regenerating and thereby producing a plurality of second progeny plants, and then selecting, from the second progeny plants, plants that are resistant to the herbicide (or that have at least one event of the subject invention) Can breed. These steps may further include backcrossing the first progeny plant or the second progeny plant with the second parent corn plant or the third parent corn plant. The corn crop or its progeny containing the corn seed of the subject invention can then be planted.
また、2つの異なるトランスジェニック植物を交配させて、2つの独立して分離した付
加外因性遺伝子を含む子を作出することができることも理解されたい。適当な子孫の自家
生殖は、両方の付加外因性遺伝子についてホモ接合の植物を作出できる。親の植物との戻
し交雑および非トランスジェニック植物との外交雑も、栄養繁殖であるので、企図される
。異なる形質および作物について一般的に用いられるその他の育種方法は、当該技術にお
いて知られている。戻し交雑育種は、単純に遺伝された高度に遺伝性の形質についての遺
伝子を、反復親である所望のホモ接合の栽培変種または近交系統に伝達するために用いら
れている。伝達される形質の供給源は、ドナー親とよばれる。得られる植物は、反復親(
例えば栽培変種)の属性と、ドナー親から伝達された所望の形質とを有すると予測される
。最初の交雑の後に、ドナー親の表現型を有する個体を選択し、反復親と繰り返し交雑さ
せる(戻し交雑)。得られる親は、反復親(例えば栽培変種)の属性と、ドナー親から伝
達された所望の形質とを有すると予測される。
It should also be understood that two different transgenic plants can be crossed to produce offspring that contain two independently isolated additional exogenous genes. Self-reproduction of the appropriate offspring can produce homozygous plants for both additional exogenous genes. Backcrosses with parental plants and dipcrosses with non-transgenic plants are also contemplated as vegetative propagation. Other breeding methods commonly used for different traits and crops are known in the art. Backcross breeding has been used to transfer genes for simply inherited highly inherited traits to the desired homozygous cultivated varieties or inbred lines that are recurrent parents. The source of the transmitted trait is called the donor parent. The resulting plant is a recurrent parent (
For example, it is predicted to have attributes of (cultivation variety) and a desired trait transmitted from the donor parent. After the first cross, individuals with a donor parent phenotype are selected and crossed repeatedly with the recurrent parent (backcross). The resulting parent is expected to have the attributes of a recurrent parent (eg, cultivar) and the desired trait transmitted from the donor parent.
本発明のDNA分子は、マーカー支援育種(MAB)法において分子マーカーとして用いることができる。本発明のDNA分子は、当該技術において知られるように、遺伝子的に連結した農業経済学的に有用な形質を同定する方法において用いることができる(例えばAFLPマーカー、RFLPマーカー、RAPDマーカー、SNPおよびSSR)。除草剤抵抗性形質は、主題の発明のトウモロコシ植物との交雑の子孫(またはその子孫および任意のその他のトウモロコシ栽培変種または品種)において、MAB法を用いて追跡できる。DNA分子は、この形質についてのマーカーであり、当該技術において公知のMAB法を用いて、主題の発明の少なくとも1つのトウモロコシ系統またはその子孫は、親または祖先であったトウモロコシ植物における除草剤抵抗性形質(複数可)を追跡できる。本発明の方法を用いて、主題のイベントを有する任意のトウモロコシ品種を同定できる。
The DNA molecule of the present invention can be used as a molecular marker in a marker-assisted breeding (MAB) method. The DNA molecules of the present invention can be used in methods for identifying genetically linked agroeconomically useful traits as known in the art (eg, AFLP markers, RFLP markers, RAPD markers, SNPs and SSR). Herbicide resistance traits can be tracked using the MAB method in the offspring (or their offspring and any other corn cultivars or varieties) with the corn plant of the subject invention. A DNA molecule is a marker for this trait, and using MAB methods known in the art, at least one corn line of the subject invention or its progeny is herbicide resistant in a corn plant that was the parent or ancestor . Track trait (s). The method of the present invention can be used to identify any corn varieties having a subject event.
主題の発明の方法は、除草剤耐性トウモロコシ植物を作出する方法であって、主題の発明の植物を育種するステップを含む方法を含む。より具体的には、上記の方法は、主題の発明の2つの植物、または主題の発明の1つの植物と任意のその他の植物とを交雑するステップを含み得る。好ましい方法は、上記の交雑種の子孫を、主題の発明に従って検出可能なイベントについて上記の子孫を解析することにより選択するステップをさらに含む。例えば、主題の発明は、種々の実施例において本明細書で試験されるもののような農業経済学的形質のようなその他の所望の形質を含む植物との育種サイクル中に主題のイベントを追跡するために用いることができる。主題のイベントおよび所望の形質を含む植物は、例えば検出でき、同定でき、選択でき、さらなる回の育種において迅速に用いることができる。主題のイベント/形質は、昆虫抵抗性形質(複数可)および/またはさらなる除草剤耐性形質と育種により組み合わせ、主題の発明に従って追跡できる。後者のある好ましい実施形態は、除草剤ジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせた主題のイベントを含む植物である。
The subject inventive method includes a method of producing a herbicide-tolerant corn plant comprising breeding the subject inventive plant. More specifically, the above method may comprise the step of crossing two plants of the subject invention, or one plant of the subject invention with any other plant. Preferred methods further comprise the step of selecting the progeny of said hybrid by analyzing said progeny for events detectable in accordance with the subject invention. For example, the subject invention tracks subject events during a breeding cycle with plants that contain other desired traits such as agroeconomic traits such as those tested herein in various embodiments. Can be used for Plants containing the subject event and the desired trait can, for example, be detected, identified, selected and used rapidly in further rounds of breeding. The subject event / trait can be combined by breeding with insect resistance trait (s) and / or additional herbicide tolerance traits and can be tracked according to the subject invention. One preferred embodiment of the latter is a plant comprising the subject event combined with a gene encoding resistance to the herbicide dicamba.
したがって、主題の発明は、例えば、グリホサート抵抗性(例えば抵抗性植物または細菌のEPSPS、GOX、GAT)、グルフォシネート抵抗性(例えばPat、bar)、アセト乳酸合成酵素(ALS)阻害除草剤抵抗性(例えばイミダゾリノン[例えばイマゼタピル]、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピルミジニルチオベンゾエート(pyrmidinylthiobenzoates)およびその他の化学物質[Csr1、SurAら])、ブロモキシニル抵抗性(例えばBxn)、HPPD(4−ヒドロキシフェニル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ)酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエン不飽和化酵素(PDS)の阻害剤に対する抵抗性、光化学系II阻害除草剤に対する抵抗性(例えばpsbA)、光化学系I阻害除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノゲン酸化酵素IX(PPO)阻害除草剤に対する抵抗性(例えばPPO−1)、フェニル尿素除草剤に対する抵抗性(例えばCYP76B1)、ジカンバ分解酵素(例えばUS20030135879を参照されたい)をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを単独または複数の組み合わせで掛け合わせて、雑草のシフトおよび/もしくは上記のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を効果的に制御または妨げる能力を提供できる。
Thus, the subject invention includes, for example, glyphosate resistance (eg, resistant plant or bacterial EPSPS, GOX, GAT), glufosinate resistance (eg, Pat, bar), acetolactate synthase (ALS) inhibitory herbicide resistance ( For example, imidazolinones [eg imazetapyr], sulfonylureas, triazolopyrimidinesulfonanilides, pyrmidinylthiobenzoates and other chemicals [Csr1, SurA et al.], Bromoxynyl resistance (eg Bxn), HPPD (4- hydroxyphenyl - pyruvate - resistance to dioxygenase) inhibitors of the enzyme, resistance to inhibitors of phytoene desaturase (PDS), resistance to photosystem II inhibiting herbicides (e.g. psbA), photosystem I inhibitors herbicides To the agent Resistance to, protoporphyrinogen oxidase IX (PPO) resistance to inhibitors herbicides (e.g. PPO-1), resistance to phenylurea herbicides (e.g. CYP76B1), (see, for example, US20030135879) dicamba degrading enzymes Ability to effectively control or prevent weed shift and / or resistance to any herbicide of the above class, when combined with one or more combinations Can be provided.
さらなる除草剤に関して、いくつかの追加の好ましいALS(AHASとしても知られ
る)阻害剤は、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド(例えばクロランスラム−メチル
、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラムおよびペノキススラム)、ピ
リミジニルチオベンゾエート(例えばビスピリバックおよびピリチオバック)、およびフ
ルカルバゾンを含む。いくつかの好ましいHPPD阻害剤は、メソトリオン、イソキサフ
ルトールおよびスルコトリオンを含む。いくつかの好ましいPPO阻害剤は、フルミクロ
ラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフ
ェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾンおよびジフェニルエーテル(例えば
アシフルオオルフェン、フォメサフェン、ラクトフェンおよびオキシフルオルフェン)を
含む。
With respect to additional herbicides, some additional preferred ALS (also known as AHAS) inhibitors are triazolopyrimidine sulfonanilides (eg, chloransram-methyl, diclosram, flurothram, flumethram, methotram and penoxsulam), pyrimidinylthiobenzoates (eg, Bispyribac and pyrithiobac), and full carbazone. Some preferred HPPD inhibitors include mesotrione, isoxaflutole and sulcotrione. Some preferred PPO inhibitors include flumicrolac, flumioxazin, flufenpyr, pyraflufen, fluthiaset, butaphenacyl, carfentrazone, sulfentrazone and diphenyl ethers (eg, acifluorfen, fomesafen, lactofen and oxyfluorfen) Including.
さらに、AAD−1単独または1もしくは複数の追加のHTC形質を掛け合わせたものは、1または複数の追加の入力(例えば昆虫抵抗性、真菌抵抗性またはストレス耐性など)または出力(例えば収率の増加、油プロファイルの改善、繊維の質の改善など)形質と掛け合わせることができる。したがって、主題の発明を用いて、任意の数の農業経済学的害虫を柔軟にかつ経済的に効率よく制御する能力を有する、作物の質が改善された完全な農業経済学的パッケージを提供できる。
In addition, AAD-1 alone or multiplied by one or more additional HTC traits can be one or more additional inputs (such as insect resistance , fungal resistance or stress resistance) or output (such as yields). (Increased, improved oil profile, improved fiber quality, etc.). Thus, the subject invention can be used to provide a complete agro-economic package with improved crop quality that has the ability to flexibly and economically efficiently control any number of agro-economic pests .
相同組換えにより植物細胞の特定の染色体部位内にポリヌクレオチド配列を組み込む方
法は、当該技術において記載されている。例えば、米国特許出願公開第2009/011
1188A1号に記載されるような部位特異的組み込みは、ドナーポリヌクレオチド配列
の染色体標的への導入を媒介するためのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用につ
いて記載する。さらに国際特許出願第WO2008/021207号は、1または複数の
ドナーポリヌクレオチド配列を、ゲノムの特定の位置に組み込むためのジンクフィンガー
媒介相同組換えについて記載している。米国特許第6720475号に記載されるFLP
/FRTまたは米国特許第5658772号に記載されるCRE/LOXのようなリコン
ビナーゼの使用は、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体部位に組み込むために利用でき
る。最後に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体の場所を標的にさせるためのメガヌ
クレアーゼの使用は、Puchtaら、PNAS USA 93(1996)pp.5055〜5060に記載された。
Methods for incorporating polynucleotide sequences into specific chromosomal sites of plant cells by homologous recombination have been described in the art. For example, US Patent Application Publication No. 2009/011.
Site-specific integration as described in 1188A1 describes the use of recombinases or integrases to mediate introduction of donor polynucleotide sequences into chromosomal targets. International Patent Application No. WO 2008/021207 further describes zinc finger-mediated homologous recombination to integrate one or more donor polynucleotide sequences at specific positions in the genome. FLP described in US Pat. No. 6,720,475
The use of recombinases such as CRE / LOX as described in / FRT or US Pat. No. 5,658,772 can be used to incorporate polynucleotide sequences into specific chromosomal sites. Finally, the use of meganucleases to target donor polynucleotides to specific chromosomal locations has been described in Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060.
植物細胞内の部位特異的組み込みのためのその他の種々の方法は、一般的に知られ、用
いることができる(Kumarら、Trands in Plant Sci. 6(4)(2001)pp.155〜159)。さらに
、いくつかの原核および下等真核生物で同定されている部位特異的組換え系を、植物で用
いるために当てはめることができる。このような系の例は、それらに限定されないが、酵
母ザイゴサッカロミセス・ロキシイ(Zygosaccharomyces rouxii)のpSR1プラスミド
からのR/RSリコンビナーゼ系(Arakiら(1985)J. Mol. Biol. 182:191〜203)および
ファージMuのGin/gix系(MaeserおよびKahlmann(1991)Mol. Gen. Genet. 230:1
70〜176)を含む。
Various other methods for site-specific integration in plant cells are generally known and can be used (Kumar et al., Trands in Plant Sci. 6 (4) (2001) pp.155-159). . In addition, site-specific recombination systems that have been identified in several prokaryotes and lower eukaryotes can be applied for use in plants. Examples of such systems include, but are not limited to, the R / RS recombinase system (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) from the pSR1 plasmid of the yeast Zygosaccharomyces rouxii. ) And the Gin / gix system of phage Mu (Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 1
70-176).
本発明のいくつかの実施形態において、現存するトランスジェニックイベントの近傍に
おいて新しい導入遺伝子(複数可)を組み込むかまたは掛け合わせることが望ましいこと
がある。トランスジェニックイベントは、単一挿入部位、通常のメンデルの分離および安
定な発現のような独自の特徴、ならびに除草剤耐性および複数の環境の場所における、そ
してそれらにわたる農業経済学的性能を含む優れた効力の組み合わせに基づいて選択され
た好ましいゲノム遺伝子座と考えることができる。新しく組み込まれた導入遺伝子は、現
存する形質転換体の導入遺伝子発現の特徴を維持する。さらに、新しく組み込まれたイベ
ントの検出および確認のためのアッセイの開発は、新しく組み込まれたイベントのゲノム
フランキング配列および染色体での場所が既に同定されているので、克服される。最後に
、新しい導入遺伝子を、現存する導入遺伝子と連結された特定の染色体の場所に組み込む
ことは、導入遺伝子を、その他の遺伝子背景に、従来の育種方法を用いる有性外交雑によ
り遺伝子移入することを促進する。
In some embodiments of the invention, it may be desirable to incorporate or multiply the new transgene (s) in the vicinity of an existing transgenic event. Transgenic events include unique features such as single insertion sites, normal Mendelian isolation and stable expression, and agro-economic performance in and across herbicide tolerance and multiple environmental locations It can be considered a preferred genomic locus selected based on a combination of potency. The newly incorporated transgene maintains the transgene expression characteristics of existing transformants. Furthermore, the development of assays for detection and confirmation of newly incorporated events is overcome because the genomic flanking sequences and chromosomal locations of newly incorporated events have already been identified. Finally, incorporating a new transgene into a specific chromosomal location linked to an existing transgene introduces the transgene into other genetic backgrounds by sexual crossbreeding using conventional breeding methods To promote that.
本発明のいくつかの実施形態において、トランスジェニックイベントからポリヌクレオ
チド配列を切り出すことが望ましいことがある。例えば、米国仮特許出願第61/297
,628号に記載されるような導入遺伝子の切り出しは、遺伝子発現カセットからなるポ
リヌクレオチド配列を、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから除去する
ためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用について記載する。除去されるポリヌクレオ
チド配列は、選択マーカーであり得る。ポリヌクレオチド配列の切り出しおよび除去の際
に、改変されたトランスジェニックイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入により再び
標的にできる。ポリヌクレオチド配列の切り出しおよび改変されたトランスジェニックイ
ベントのその後の再標的化は、選択マーカーの再使用または特定の遺伝子の発現に起因す
る植物トランスクリプトームへの意図しない変更を克服する能力のように、利点を提供す
る。
In some embodiments of the invention, it may be desirable to excise a polynucleotide sequence from a transgenic event. For example, US provisional patent application 61/297.
The transgene excision as described in US Pat. No. 628 describes the use of a zinc finger nuclease to remove the polynucleotide sequence consisting of a gene expression cassette from a transgenic event integrated into a chromosome. The removed polynucleotide sequence can be a selectable marker. Upon excision and removal of the polynucleotide sequence, the modified transgenic event can be retargeted by insertion of the polynucleotide sequence. Excision of polynucleotide sequences and subsequent retargeting of modified transgenic events, such as the ability to overcome unintentional changes to the plant transcriptome due to reuse of selectable markers or expression of specific genes Provide benefits.
主題の発明は、本明細書において、異種核酸の導入のために優れたトウモロコシゲノム
中の第2染色体上の特定の部位を開示する。第2染色体上の標的化部位の場所を同定する
ために有用な5’分子マーカー、3’分子マーカー、5’フランキング配列および3’フ
ランキング配列も開示される。したがって、主題の発明は、対象の異種核酸を、この予め
確立された標的部位またはこの標的部位の付近において導入するための方法を提供する。
主題の発明は、開示される標的部位にてまたはそのような部位のほぼ付近において挿入さ
れた任意の異種ヌクレオチド配列を含むトウモロコシ種子および/またはトウモロコシ植
物も包含する。このような標的にされた組み込みを達成するためのある選択肢は、本明細
書で例示するpat発現カセットを切り出し、かつ/またはその代わりに異なる挿入断片
で置き換えることである。この一般的な点において、標的にされた相同組換えを、例えば
、そして制限することなく、主題の発明に従って用いることができる。
The subject invention discloses herein a specific site on chromosome 2 in a maize genome that is superior for the introduction of heterologous nucleic acids. Also disclosed are 5 ′ molecular markers, 3 ′ molecular markers, 5 ′ flanking sequences and 3 ′ flanking sequences useful for identifying the location of the targeting site on chromosome 2. Thus, the subject invention provides a method for introducing a heterologous nucleic acid of interest at or near the pre-established target site.
The subject invention also encompasses corn seeds and / or corn plants comprising any heterologous nucleotide sequence inserted at or near the disclosed target site. One option to achieve such targeted integration is to excise the pat expression cassette exemplified herein and / or replace it with a different insert instead. In this general respect, targeted homologous recombination can be used in accordance with the subject invention, for example and without limitation.
本明細書で用いる場合、遺伝子、イベントまたは形質を「掛け合わせる」ことは、所望の形質を1つのトランスジェニック系統に組み合わせることである。植物育種家は、トランスジェニック形質を、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑種を作製し、次いでこれらの所望の形質の両方を有する子を同定することにより掛け合わせる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、2以上の遺伝子を、植物の細胞核に、形質転換中に同時に伝達することによる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、トランスジェニック植物を、対象の別の遺伝子で再形質転換することによる。例えば、遺伝子掛け合わせは、例えば2以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質(複数可)および疾患抵抗性形質(複数可)、2以上の除草抵抗性性形質、ならびに/または昆虫抵抗性形質(複数可)および除草剤抵抗性形質(複数可)を含む2以上の異なる形質を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝子に加えて選択マーカーを用いることは、遺伝子掛け合わせと考えることもできる。
As used herein, “multiplying” a gene, event or trait is the combination of the desired trait into a single transgenic line. A plant breeder multiplies the transgenic traits by creating crossbreds of parents each having the desired trait and then identifying offspring that have both of these desired traits. Another way of multiplying genes is by simultaneously transferring two or more genes to the plant cell nucleus during transformation. Another way of crossing genes is by retransforming the transgenic plant with another gene of interest. For example, gene crossing can include, for example, two or more different insect traits, insect resistance trait (s) and disease resistance trait (s), two or more herbicidal resistance traits, and / or insect resistance traits ( Can be used to combine two or more different traits, including her (s) and herbicide resistant trait (s). Using a selectable marker in addition to the gene of interest can also be thought of as gene crossing.
「相同組換え」は、それにより2つのヌクレオチド配列が相互作用(組換え)して新し
い組換えDNA配列を形成できる類似のヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有す
るヌクレオチド配列の任意の対同士の反応のことをいう。類似のヌクレオチド配列の部位
は、それぞれ、本明細書において、「相同配列」という。一般的に、相同組換えの頻度は
、相同配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一未満で
ある2つのヌクレオチド配列間で生じ得るが、組換え頻度(または効率)は、2つの配列
間の相違が増加するにつれて減少する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれ
にある1つの相同配列を用いて達成され、それにより、「単一交差」組換え生成物が生じ
得る。代わりに、2つの相同配列を、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配
列のそれぞれに配置できる。ドナー上の2つの相同配列と、標的上の2つの相同配列との
組換えは、「二重交差」組換え生成物を生じる。ドナー分子上の相同配列が、操作される
配列(例えば対象の配列)と接する場合、標的分子との二重交差組換えは、対象の配列が
、標的分子上の相同配列の間に元々あったDNA配列を置き換える組換え生成物をもたら
す。標的とドナーとの間のDNA配列を二重交差組換えイベントにより交換することを、
「配列置き換え」とよぶ。
“Homologous recombination” refers to any pair of nucleotide sequences having corresponding sites containing similar nucleotide sequences by which two nucleotide sequences can interact (recombine) to form a new recombinant DNA sequence. Refers to the reaction. Each site of similar nucleotide sequence is referred to herein as a “homologous sequence”. In general, the frequency of homologous recombination increases as the length of the homologous sequence increases. Thus, homologous recombination can occur between two nucleotide sequences that are less than identical, but the recombination frequency (or efficiency) decreases as the difference between the two sequences increases. Recombination is accomplished using one homologous sequence in each of the donor and target molecules, thereby producing a “single cross” recombination product. Alternatively, two homologous sequences can be placed on each of the target and donor nucleotide sequences. Recombination of two homologous sequences on the donor and two homologous sequences on the target results in a “double crossover” recombination product. Double homologous recombination with the target molecule was originally between the homologous sequences on the target molecule when the homologous sequence on the donor molecule touches the sequence being manipulated (eg, the sequence of interest) This results in a recombinant product that replaces the DNA sequence. Exchanging the DNA sequence between the target and donor by a double crossover recombination event,
This is called “array replacement”.
主題のAAD−1酵素は、ほぼ全ての広葉雑草および禾本雑草(grass weeds)を制御する除草剤の組み合わせに対する耐性をもたらすトランスジェニック発現を可能にする。AAD−1は、例えばその他の除草剤耐性作物(HTC)形質(例えばグリホサート抵抗性、グルフォシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ブロモキシニル抵抗性など)および昆虫抵抗性形質(Cry1F、Cry1Ab、Cry34/45など)と掛け合わせるための優れたHTC形質として働くことができる。さらに、AAD−1は、第2の遺伝子または遺伝子の群で遺伝子的に工学的に操作された植物の1次形質転換体の選択を助けるための選択マーカーとして働くことができる。
The subject AAD-1 enzyme allows for transgenic expression resulting in resistance to a combination of herbicides that control almost all broadleaf and grass weeds. AAD-1 is, for example, other herbicide tolerant crop (HTC) traits (eg glyphosate resistance , glufosinate resistance , imidazolinone resistance , bromoxynyl resistance, etc.) and insect resistance traits (Cry1F, Cry1Ab, Cry34 / 45, etc.) ) And can serve as an excellent HTC trait. Furthermore, AAD-1 can serve as a selectable marker to assist in the selection of plant primary transformants genetically engineered with a second gene or group of genes.
主題の発明のHTC形質は、その他のHTC形質(それに限定されないが、グリホサート耐性を含む)との新規な組み合わせにおいて用いることができる。形質のこれらの組み合わせにより、新しく獲得した抵抗性または除草剤(例えばグリホサート)に対する固有の耐性により、雑草(など)の種を制御する新規な方法が得られる。つまり、HTC形質に加えて、除草剤を用いて雑草を制御するための新規な方法(除草剤耐性は、トランスジェニック作物における上記の酵素により確立された)は、本発明の範囲内である。
The HTC trait of the subject invention can be used in novel combinations with other HTC traits, including but not limited to glyphosate resistance. These combinations of traits provide a new way of controlling weed (etc.) species through newly acquired resistance or inherent resistance to herbicides (eg glyphosate). That is, in addition to HTC traits, a novel method for controlling weeds with herbicides (herbicide resistance established by the above-described enzymes in transgenic crops) is within the scope of the present invention.
さらに、グリホサート耐性作物を世界的に成長させることが普及している。その他のグリホサート耐性作物との輪作が多数になると、グリホサート抵抗性の自生植物(volunteers)の制御は、輪作作物において困難になることがある。したがって、掛け合わされたかまたは作物に個別に形質転換された主題のトランスジェニック形質の使用は、その他のHTC自生作物の制御のためのツールを提供する。
In addition, growing glyphosate-tolerant crops worldwide is widespread. As the number of rotations with other glyphosate-tolerant crops increases, control of glyphosate- resistant volunteers can be difficult in rotation crops. Thus, the use of the subject transgenic traits that have been multiplied or individually transformed into crops provides a tool for the control of other HTC native crops.
主題の発明の好ましい植物または種子は、そのゲノムに、本明細書で同定される挿入配
列を、本明細書で同定される挿入断片の両側の少なくとも20〜500またはそれより長
い連続フランキングヌクレオチドとともに含む。そうでないと示さない限り、フランキン
グ配列についての言及は、配列番号29に関して同定されるもののことをいう(上記の表
を参照されたい)。ここでもまた、配列番号29は、元の形質転換体に挿入された異種D
NAと、挿入されたDNAに直接隣接する説明となるフランキングゲノム配列を含む。こ
れらのフランキング配列の全てまたは一部分は、イベントを含む親の系統の有性交雑の結
果として挿入されたDNAを受ける子孫に伝達されると予測できる。
Preferred plants or seeds of the subject invention have in their genome an insert sequence identified herein with at least 20-500 or more contiguous flanking nucleotides on either side of the insert fragment identified herein. Including. Unless indicated otherwise, references to flanking sequences refer to those identified with respect to SEQ ID NO: 29 (see table above). Again, SEQ ID NO: 29 is the heterologous D inserted into the original transformant.
Contains NA and explanatory flanking genomic sequences immediately adjacent to the inserted DNA. All or a portion of these flanking sequences can be predicted to be transmitted to offspring that receive the inserted DNA as a result of sexual crossing of the parental line containing the event.
主題の発明は、主題の発明の植物の再生可能な細胞の組織培養物を含む。このような組
織培養から再生された植物も含まれ、特に上記の植物は、例示される品種の全ての形態学
的および生理的特性を発現できる。主題の発明の好ましい植物は、寄託された種子から成
長した植物の全ての生理的および形態学的特徴を有する。本発明は、このような種子の子
孫および対象の定性的形質を有する種子をさらに含む。
The subject invention includes a tissue culture of renewable cells of the plant of the subject invention. Plants regenerated from such tissue culture are also included, especially the above-mentioned plants can express all morphological and physiological characteristics of the exemplified varieties. Preferred plants of the subject invention have all the physiological and morphological characteristics of plants grown from deposited seeds. The present invention further includes seeds having such seed progeny and subject qualitative traits.
植物もしくは種子またはその一部分の操作(例えば変異、さらなるトランスフェクショ
ンおよびさらなる育種)は、「従属」(essentially derived)品種とよばれることがあ
るものの創出を導くことがある。植物新品種保護のための国際連合(UPOV)は、ある
品種が保護された品種に従属するかを決定するための以下のガイドラインを提供している
。
品種は、
(i)それが、最初の品種に支配的に由来するか、またはそれ自体が最初の品種に支配的
に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因
する本質的な特徴の発現を保持し、
(ii)それが、最初の品種から明確に区別でき、
(iii)導出の働きに起因する相違を除いて、それが、最初の品種の遺伝子型または遺
伝子型の組み合わせに起因する必須の特徴の発現における最初の品種と同様になる
場合、別の品種(「最初の品種」)に従属するとみなされる。
The manipulation of plants or seeds or parts thereof (eg mutation, further transfection and further breeding) can lead to the creation of what may be referred to as “essentially derived” varieties. The United Nations for Protection of New Plant Varieties (UPOV) provides the following guidelines for determining whether a variety is subordinate to a protected variety:
Variety is
(I) it derives predominantly from the first variety or from a variety that itself derives predominantly from the first variety, but due to the genotype or combination of genotypes of the first variety Retains the expression of essential features,
(Ii) it can be clearly distinguished from the first variety,
(Iii) If it becomes similar to the first variety in the expression of essential characteristics due to the genotype or combination of genotypes of the first variety, except for differences due to the work of derivation, It is considered to be subordinate to the “first variety”).
UPOV、国際機関との第6回会議、ジュネーブ、1992年10月30日;連合の事
務局により作製された文書。
UPOV, 6th meeting with international organizations, Geneva, 30 October 1992; Document produced by the Secretariat of the Union.
本明細書で用いる場合、「系統」は、少なくとも1つの形質について個体間でほとんど
または全く遺伝子的変動を示さない植物の群である。このような系統は、自家受粉および
選択のいくつかの世代、または単一の親からの組織または細胞培養技術を用いる栄養繁殖
により創出できる。
As used herein, a “line” is a group of plants that show little or no genetic variation between individuals for at least one trait. Such lines can be created by self-pollination and several generations of selection, or vegetative propagation using tissue or cell culture techniques from a single parent.
本明細書で用いる場合、用語「栽培変種」(cultivar)および「品種」(variety)は
、同義であり、商業的な生産のために用いられる系統のことをいう。
As used herein, the terms “cultivar” and “variety” are synonymous and refer to a line used for commercial production.
「安定性」または「安定な」は、所定の要素に関して、その要素が世代から世代に維持
され、好ましくは、少なくとも3世代にわたって実質的に同じレベル、例えば好ましくは
±15%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%維持されることを意味する。
安定性は、植えつけの温度、場所、ストレスおよび時期により影響されることがある。野
外条件下でのその後の世代の比較は、その要素を同様の様式で生成する。
“Stability” or “stable” means that for a given element, the element is maintained from generation to generation, preferably at substantially the same level over at least three generations, eg preferably ± 15%, more preferably ± Meaning maintained at 10%, most preferably ± 5%.
Stability can be affected by planting temperature, location, stress and timing. Subsequent generation comparisons under field conditions produce the element in a similar manner.
「商用」(Commercial Utility)は、良好な草勢および高い受精能を有して、作物が、
従来の農業設備を用いて農業家により生産でき、記載される成分を有する油が、従来の粉
砕および抽出装置を用いて種子から抽出できることと定義される。商業的に有用になるた
めに、種子重量、油含量およびエーカー当たりに生産される全油により測定される収率は
、同じ領域で成長した高い価値の形質を有さない、他の点では比較の商業的なカノーラ品
種の平均収率の15%以内である。
“Commercial Utility” has good vigor and high fertility,
It is defined that oils that can be produced by farmers using conventional agricultural equipment and that have the components described can be extracted from seeds using conventional grinding and extraction equipment. To be commercially useful, seed weight, oil content and yield measured by total oil produced per acre do not have high value traits grown in the same area, otherwise compared Is within 15% of the average yield of commercial canola varieties.
「農業経済学的にエリート」は、系統が、収率、成熟度、疾患抵抗性などのような所望の農業経済学的特徴を、主題のイベント(複数可)による昆虫抵抗性に加えて有することを意味する。以下の実施例に示すように、主題の発明のイベントを含む植物において個別または任意の組み合わせで考慮される農業経済学的形質は、主題の発明の範囲内である。これらの農業経済学的特徴およびデータ点のいずれかおよび全てを用いて、このような植物を規定するために用いる特徴の範囲における点として、または一端もしくは両端のいずれかとしてこのような植物を同定できる。
“Agro-economic elite” means that the strain has the desired agro-economic characteristics, such as yield, maturity, disease resistance, etc., in addition to insect resistance due to the subject event (s) Means that. As shown in the examples below, agroeconomic traits that are considered individually or in any combination in a plant containing an event of the subject invention are within the scope of the subject invention. Any and all of these agroeconomic features and data points are used to identify such plants as points in the range of features used to define such plants, or as either one or both ends it can.
当業者は、本開示に鑑みて、例えば検出キットの好ましい実施形態が、「接合部配列」
もしくは「移行部配列」(トウモロコシゲノムフランキング配列が挿入配列と出会うとこ
ろ)に指向され、かつ/またはそれを含むプローブおよび/あるいはプライマーを含み得
ることを認識する。例えば、これは、表1に示すような、一方もしくは両方の接合部配列
(挿入断片がフランキング配列と出会うところ)を同定するように設計されたポリヌクレ
オチドプローブ、プライマーおよび/またはアンプリコンを含む。ある共通の設計は、フ
ランキング領域でハイブリダイズする1つのプライマーと、挿入断片でハイブリダイズす
る1つのプライマーとを有することである。このようなプライマーは、それぞれ、しばし
ば、少なくとも約〜15残基の長さである。この構成を用いて、プライマーは、主題の発
明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを作製/増幅するために用いることが
できる。これらのプライマーを用いて、上記のように接合部配列に及ぶ(そしてそれを含
む)アンプリコンを作製できる。
One skilled in the art will recognize, for example, that a preferred embodiment of a detection kit is a “junction sequence” in light of the present disclosure.
Alternatively, it will be appreciated that probes and / or primers directed to and / or containing a “transition sequence” (where the maize genomic flanking sequence meets the insert sequence) may be included. For example, this includes polynucleotide probes, primers and / or amplicons designed to identify one or both junction sequences (where the insert meets the flanking sequence), as shown in Table 1. . One common design is to have one primer that hybridizes in the flanking region and one primer that hybridizes in the insert. Each such primer is often at least about -15 residues in length. With this configuration, primers can be used to create / amplify detectable amplicons that indicate the presence of the subject invention event. These primers can be used to make amplicons that span (and contain) the junction sequence as described above.
フランキング配列内で「つながる」(touching down)プライマー(複数可)は、約2
00塩基を超えてまたは接合部を超えてハイブリダイズするようには典型的に設計されな
い。つまり、典型的なフランキングプライマーは、挿入断片の始点からフランキング配列
内に200塩基以内のいずれかの鎖の少なくとも15残基を含むように設計される。つま
り、配列番号29の残基約〜1674−1873および/または約〜6690−6890
における適当なサイズの配列を含むプライマーは、主題の発明の範囲内である。挿入プラ
イマーは、同様に、挿入断片上のいずれの場所でも設計できるが、例えば残基約〜187
4−2074および約〜6489−6689は、このようなプライマー設計のために排他
的でなく用いることができる。
About 2 "touching down" primer (s) within the flanking sequence
It is typically not designed to hybridize beyond 00 bases or beyond the junction. That is, a typical flanking primer is designed to include at least 15 residues of any strand within 200 bases within the flanking sequence from the start of the insert. That is, residues about 1674-1873 and / or about -6690-6890 of SEQ ID NO: 29.
Primers containing the appropriate size sequence in are within the scope of the subject invention. Insertion primers can also be designed anywhere on the insert, but for example from about ~ 187 residues
4-2074 and about ~ 6489-6689 can be used non-exclusively for such primer design.
当業者は、プライマーおよびプローブを、ある範囲の標準的なハイブリダイゼーション
および/またはPCR条件の下で、配列番号29(または相補鎖)のセグメントおよびそ
の相補鎖とハイブリダイズするように設計でき、ここで、プライマーまたはプローブは、
例示される配列と完全に相補的でないことも認識している。つまり、ある程度のミスマッ
チが許容できる。およそ20ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、典型的に、1
または2などのヌクレオチドは、ミスマッチ塩基が内部にあるかまたはアンプリコンの反
対にあるプライマーの末端にあるならば、反対の鎖と結合する必要はない。種々の適当な
ハイブリダイゼーション条件を、以下に示す。イノシンのような合成ヌクレオチド類似体
もプローブに用いることができる。ペプチド核酸(PNA)プローブならびにDNAおよ
びRNAプローブも用いることができる。重要なことは、このようなプローブおよびプラ
イマーは、主題の発明のイベントの存在について特徴的(diagnostic)である(独自に同
定して区別できる)ということである。
One skilled in the art can design primers and probes to hybridize to a segment of SEQ ID NO: 29 (or complementary strand) and its complementary strand under a range of standard hybridization and / or PCR conditions, where And the primer or probe is
It is also recognized that it is not completely complementary to the exemplified sequence. In other words, a certain degree of mismatch is acceptable. For an approximately 20 nucleotide primer, for example, typically 1
Or a nucleotide such as 2 need not be bound to the opposite strand if the mismatch base is at the end of the primer inside or opposite the amplicon. Various suitable hybridization conditions are shown below. Synthetic nucleotide analogs such as inosine can also be used in the probe. Peptide nucleic acid (PNA) probes and DNA and RNA probes can also be used. Importantly, such probes and primers are diagnostic for the presence of the subject invention event (which can be uniquely identified and distinguished).
例えばマイナーな配列の誤りをもたらすと考えられるPCR増幅における誤りが生じ得
ることに注意されたい。つまり、そうでないと記載しない限り、本明細書で列挙する配列
は、トウモロコシゲノムDNAから長いアンプリコンを作製し、次いで、アンプリコンを
クローニングして配列決定することにより決定した。この様式で作製され決定された配列
においてわずかな相違およびマイナーな不一致が見出されることは、ゲノムDNAからの
配列決定のために十分なアンプリコンを生じるために必要な多くの回の増幅に鑑みて、異
常なことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定の誤りまたは不一致により
必要になるいずれの調整も、主題の発明の範囲内であることを認識し、そのように通知さ
れる。
Note that errors in PCR amplification can occur, for example, which would result in minor sequence errors. That is, unless stated otherwise, the sequences listed herein were determined by making long amplicons from maize genomic DNA and then cloning and sequencing the amplicons. The slight differences and minor discrepancies found in sequences generated and determined in this manner are in view of the many rounds of amplification necessary to generate sufficient amplicons for sequencing from genomic DNA. It's not unusual. Those skilled in the art will recognize and be notified as such that any adjustments required by these types of general sequencing errors or inconsistencies are within the scope of the subject invention.
例えば、配列をイベントの創出中に挿入する場合に、いくつかのゲノム配列が欠失され
ることは珍しくないことにも注意されたい。つまり、主題のフランキング配列と、例えば
GENBANKに列挙されたゲノム配列との間にもいくらかの相違が出現し得る。
Note also that it is not uncommon for some genomic sequences to be deleted, for example, when inserting sequences during event creation. That is, some differences may appear between the subject flanking sequences and the genomic sequences listed, for example, in GENBANK.
いくらかのこれらの相違(複数可)を、以下の実施例部分で論じる。プローブおよびプ
ライマーへの調整は、しかるべく行うことができる。
Some of these differences (s) are discussed in the Examples section below. Adjustments to probes and primers can be made accordingly.
「挿入断片」のそれぞれの要素を、図1および2に示し、以下の実施例においてより詳
細に論じる。これらの要素またはその断片のDNAポリヌクレオチド配列は、本発明の方
法においてDNAプライマーまたはプローブとして用いることができる。
Each element of the “insert” is shown in FIGS. 1 and 2 and is discussed in more detail in the examples below. The DNA polynucleotide sequences of these elements or fragments thereof can be used as DNA primers or probes in the methods of the present invention.
本発明のいくつかの実施形態において、植物および種子などにおけるトウモロコシ植物
からの導入遺伝子/ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供され
る。本明細書で示す主題の導入遺伝子/ゲノム挿入領域接合部配列(配列番号29の残基
1873〜1874と6689〜6690の間)、そのセグメントならびに例示される配
列の相補鎖およびその任意のセグメントを含むDNA配列が提供される。挿入領域接合部
配列は、ゲノムに挿入された異種DNAと、挿入部位に接するトウモロコシ細胞からのD
NAとの接合部に及ぶ。このような配列は、所定のイベントについて特徴的であり得る。
In some embodiments of the invention, compositions and methods are provided for detecting the presence of a transgene / genomic insert region from a corn plant, such as in plants and seeds. The subject transgene / genome insert region junction sequence (between residues 1873-1874 and 6589-6690 of SEQ ID NO: 29), its segment, and the complementary strand of the exemplified sequence and any segment thereof, as shown herein A DNA sequence comprising is provided. The insertion region junction sequence consists of heterologous DNA inserted into the genome and D from corn cells in contact with the insertion site.
It extends to the junction with NA. Such an arrangement can be characteristic for a given event.
これらの挿入断片および境界配列に基づいて、イベント特異的プライマーを作製できる
。PCR解析は、主題の発明のトウモロコシ系統が、これらのイベント特異的プライマー
セットを用いて生じるPCRアンプリコンの解析により異なるトウモロコシ遺伝子型にお
いて同定できることを証明した。これらのおよびその他の関連する手順は、これらのトウ
モロコシ系統を独自に同定するために用いることができる。つまり、このようなプライマ
ー対に由来するPCRアンプリコンは、ユニークであり、これらのトウモロコシ系統を同
定するために用いることができる。
Based on these inserts and border sequences, event specific primers can be made. PCR analysis demonstrated that the subject invention maize lines can be identified in different maize genotypes by analysis of PCR amplicons generated using these event-specific primer sets. These and other related procedures can be used to uniquely identify these corn lines. That is, PCR amplicons derived from such primer pairs are unique and can be used to identify these corn lines.
いくつかの実施形態において、新規な導入遺伝子/ゲノム挿入領域の連続する断片を含
むDNA配列は、本発明のある態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリ
ヌクレオチドと、上記の3つのトウモロコシ植物の1もしくは複数からのトウモロコシゲ
ノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドとを含むDNA配列、および/またはこれらの
トウモロコシ植物の1もしくは複数について特徴的なアンプリコン生成物の生成のための
プライマー配列として有用な配列が含まれる。
In some embodiments, a DNA sequence comprising a contiguous fragment of the novel transgene / genomic insert region is an aspect of the present invention. A DNA sequence comprising a full length polynucleotide of the transgene insert sequence and a full length polynucleotide of a corn genomic sequence from one or more of the three corn plants described above, and / or these corn Included are sequences useful as primer sequences for the production of characteristic amplicon products for one or more of the plants.
関連する実施形態は、本明細書で同定されるDNA配列(例えば配列番号29およびそ
のセグメント)の導入遺伝子部分の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、2
4、25またはそれより多くの連続ヌクレオチドを含むDNA配列、またはその相補鎖、
およびこれらの配列からの同様の長さのフランキングトウモロコシDNA配列、またはそ
の相補鎖に関する。このような配列は、DNA増幅法においてDNAプライマーとして有
用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本明細書で言及する
任意のトウモロコシイベントについて特徴的である。よって、本発明は、このようなDN
Aプライマーおよび相同的プライマーにより生成されるアンプリコンも含む。
Related embodiments are at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, of the transgene portion of the DNA sequences identified herein (eg, SEQ ID NO: 29 and segments thereof)
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2
A DNA sequence comprising 4, 25 or more contiguous nucleotides, or its complementary strand,
And flanking corn DNA sequences of similar length from these sequences, or their complementary strands. Such sequences are useful as DNA primers in DNA amplification methods. The amplicons produced using these primers are characteristic for any corn event referred to herein. Therefore, the present invention provides such a DN.
Also included are amplicons generated by A and homologous primers.
本発明は、本明細書で言及するトウモロコシイベントに対応するDNAの存在を試料中
で検出する方法も含む。このような方法は、(a)DNAを含む試料を、これらのトウモ
ロコシイベントの少なくとも1つからのDNAとの核酸増幅反応で用いる場合に、上記の
イベント(複数可)について特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接
触させるステップと、(b)核酸増幅反応を行って、それによりアンプリコンを生成する
ステップと、(c)アンプリコンを検出するステップとを含み得る。
The invention also includes a method of detecting in a sample the presence of DNA corresponding to the corn event referred to herein. Such methods include: (a) an amplicon that is characteristic for the event (s) described above when a sample containing DNA is used in a nucleic acid amplification reaction with DNA from at least one of these corn events. Contacting with a primer set that generates, (b) performing a nucleic acid amplification reaction, thereby generating an amplicon, and (c) detecting the amplicon.
主題の発明のさらなる検出方法は、上記のイベントの少なくとも1つに対応するDNA
の存在を試料中で検出する方法であって、(a)DNAを含む試料を、上記のトウモロコ
シイベントの少なくとも1つからのDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下でハイブリダイズし、対照トウモロコシ植物(対象のイベントでないDNA)とス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしないプローブと接触
させるステップと、(b)試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下に供するステップと、(c)DNAへのプローブのハイブリダイゼーションを
検出するステップとを含む方法を含む。
Further detection methods of the subject invention provide DNA corresponding to at least one of the above events
In which a sample comprising DNA is hybridized under stringent hybridization conditions with DNA from at least one of the corn events described above, and a control corn plant ( Contacting DNA that is not the event of interest) with a probe that does not hybridize under stringent hybridization conditions; (b) subjecting the sample and probe to stringent hybridization conditions; (c) Detecting hybridization of the probe.
さらなる実施形態において、主題の発明は、主題の発明のaad−1イベントを含むトウモロコシ植物を作出する方法であって、(a)第1の親のトウモロコシ系統(上記の系統の植物に上記の除草剤抵抗性を与える、本発明の発現カセットを含む)と、第2の親のトウモロコシ系統(この除草剤耐性形質を欠く)とを有性交雑させ、それにより複数の子孫植物を作出するステップと、(b)分子マーカーを用いて子孫植物を選択するステップとを含む方法を含む。このような方法は、子孫植物を第2の親のトウモロコシ系統と戻し交雑して、上記の昆虫耐性形質を含む優良種(true-breeding)トウモロコシ植物を作出するさらなるステップを所望により含み得る。
In a further embodiment, the subject invention is a method of producing a corn plant comprising the aad-1 event of the subject invention, comprising: (a) a first parent corn line (the above-mentioned herbicidal plant in the above lineage). agent confers resistance, and including) an expression cassette of the present invention, the second parental corn line (lacking this herbicide tolerance trait) and were sexually crossed, whereby the steps of producing a plurality of progeny plants (B) selecting a progeny plant using the molecular marker. Such a method may optionally include the further step of backcrossing the progeny plant with a second parental maize line to produce a true-breeding corn plant comprising the insect resistance trait described above.
本発明の別の態様によると、上記の3つのイベントのいずれか1つ(または複数)との
交雑種の子孫の接合状態を決定する方法が提供される。上記の方法は、トウモロコシDN
Aを含む試料を主題の発明のプライマーセットと接触させるステップを含み得る。上記の
プライマーは、上記のトウモロコシイベントの少なくとも1つからのゲノムDNAとの核
酸増幅反応において用いる場合、上記のトウモロコシイベントの少なくとも1つについて
特徴的である第1アンプリコンを生成する。このような方法は、核酸増幅反応を行って、
それにより第1アンプリコンを生成するステップと、第1アンプリコンを検出するステッ
プと、トウモロコシDNAを含む試料を上記のプライマーセット(上記のプライマーセッ
トは、トウモロコシ植物からのゲノムDNAとの核酸増幅反応において用いる場合、トウ
モロコシゲノム領域に相同的な天然トウモロコシゲノムDNAを含む第2アンプリコンを
生成する)と接触させるステップと、核酸増幅反応を行って、それにより第2アンプリコ
ンを生成するステップとをさらに含む。方法は、第2アンプリコンを検出するステップと
、試料中の第1アンプリコンと第2アンプリコンとを比較するステップであって、両方の
アンプリコンの存在が、試料が導入遺伝子挿入についてヘテロ接合性であることを示すス
テップとをさらに含む。
According to another aspect of the invention, a method is provided for determining the mating status of a progeny of a hybrid with any one (or more) of the above three events. The above method is based on maize DN
Contacting a sample comprising A with the primer set of the subject invention may be included. The primer, when used in a nucleic acid amplification reaction with genomic DNA from at least one of the corn events, produces a first amplicon that is characteristic for at least one of the corn events. Such a method performs a nucleic acid amplification reaction,
A step of generating a first amplicon thereby, a step of detecting the first amplicon, and a sample containing corn DNA from the primer set (the primer set is a nucleic acid amplification reaction with genomic DNA from a corn plant) A second amplicon comprising a natural corn genomic DNA homologous to the corn genomic region) and a nucleic acid amplification reaction, thereby producing a second amplicon. In addition. The method includes detecting a second amplicon and comparing a first amplicon and a second amplicon in the sample, wherein the presence of both amplicons is heterozygous for the transgene insertion in the sample. And a step of indicating sex.
DNA検出キットは、本明細書に開示される組成物およびDNA検出の技術分野におい
て公知の方法を用いて開発できる。キットは、試料中の主題のトウモロコシイベントDN
Aを同定するために有用であり、このDNAを含有するトウモロコシ植物を育種する方法
に用いることができる。キットは、例えば、本明細書に開示されるアンプリコンまたは主
題のイベントの導入遺伝子遺伝要素に含まれるDNAに相同もしくは相補的なDNA配列
に相同または相補的なDNA配列を含有する。これらのDNA配列は、DNA増幅反応に
おいて、またはDNAハイブリダイゼーション法におけるプローブとして用いることがで
きる。キットは、検出法の実行のために必要な試薬および材料も含有してよい。
DNA detection kits can be developed using the compositions disclosed herein and methods known in the art of DNA detection. The kit is subject corn event DN in the sample
It is useful for identifying A and can be used in methods for breeding corn plants containing this DNA. The kit contains, for example, a DNA sequence that is homologous or complementary to a DNA sequence that is homologous or complementary to the DNA contained in the amplicon or transgene genetic element of the subject event disclosed herein. These DNA sequences can be used as probes in DNA amplification reactions or in DNA hybridization methods. The kit may also contain reagents and materials necessary for carrying out the detection method.
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子(例えば放射活性同位体
、リガンド、化学発光剤または酵素)と結合した単離核酸分子である。このようなプロー
ブは、本発明の場合は標的核酸の鎖、上記のトウモロコシイベントの1つからのゲノムD
NAの鎖(トウモロコシ植物からまたはイベントからのDNAを含む試料からのいずれか
)に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでな
く、ポリアミドおよび標的DNA配列と特異的に結合し、その標的DNA配列の存在を検
出するために用いることができるその他のプローブ材料を含む。
A “probe” is an isolated nucleic acid molecule conjugated to a conventional detectable label or reporter molecule (eg, a radioactive isotope, ligand, chemiluminescent agent or enzyme). Such a probe is in the present case a target nucleic acid strand, the genome D from one of the above corn events.
It is complementary to a strand of NA (either from a corn plant or from a sample containing DNA from an event). Probes according to the present invention include not only deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid, but also other probe materials that bind specifically to the polyamide and the target DNA sequence and can be used to detect the presence of the target DNA sequence.
「プライマー」は、相補的標的DNA鎖に、核酸ハイブリダイゼーションによりアニー
ルして、プライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成し、次いで、標的DNA鎖に
沿って、ポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼにより伸長される単離/合成核酸であ
る。本発明のプライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはその他の従
来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用のことをいう。
A “primer” anneals to a complementary target DNA strand by nucleic acid hybridization to form a hybrid between the primer and the target DNA strand, and is then extended along the target DNA strand by a polymerase, such as a DNA polymerase. Isolated / synthetic nucleic acid. The primer pairs of the present invention refer to their use for amplification of target nucleic acid sequences, for example, by polymerase chain reaction (PCR) or other conventional nucleic acid amplification methods.
プローブおよびプライマーは、一般的に、
ポリヌクレオチドまたはそれより長い長さである。このようなプローブおよびプライマー
は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリ
ダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な
配列類似性を有するが、標的配列と異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持す
るプローブを、従来の方法により設計できる。
Probes and primers are generally
Polynucleotide or longer length. Such probes and primers specifically hybridize with the target sequence under high stringency hybridization conditions. Preferably, probes and primers according to the present invention have complete sequence similarity to the target sequence, but unlike the target sequence, probes that retain the ability to hybridize with the target sequence can be designed by conventional methods.
プローブおよびプライマーを調製して用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A L
aboratory Manual、第2版、1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989に記載されている。PCRプライマー対は、例えば
その目的を意図するコンピュータプログラムを用いることにより既知の配列から導くこと
ができる。
Methods for preparing and using probes and primers include, for example, Molecular Cloning: AL
aboratory Manual, 2nd edition, 1-3 volumes, edited by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY, 1989. PCR primer pairs can be derived from known sequences, for example by using a computer program intended for that purpose.
本明細書に開示されるフランキングDNA配列および挿入断片配列に基づくプライマー
およびプローブは、開示された配列を、従来の方法、例えば再クローニングおよびそのよ
うな配列の配列決定により確認する(必要であれば修正する)ために用いることができる
。
Primers and probes based on flanking DNA sequences and insert sequences disclosed herein confirm the disclosed sequences by conventional methods such as recloning and sequencing of such sequences (if necessary). Can be used to correct).
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、標的DNA配列とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を用い
て、試料中のトランスジェニックイベントからのDNAの存在を同定できる。核酸分子ま
たはその断片は、あるいくつかの状況の下でその他の核酸分子と特異的にハイブリダイズ
できる。本明細書で用いる場合、2つの核酸分子は、2つの分子が逆平行2本鎖核酸構造
を形成できるならば、互いに特異的にハイブリダイズできるという。核酸分子は、それら
が完全な相補性を示すならば、別の核酸分子の「相補鎖」であるという。本明細書で用い
る場合、分子は、一方の分子の全てのヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的である
場合に、「完全な相補性」を示すという。2つの分子は、それらが互いに、少なくとも従
来の「低ストリンジェンシー」条件の下で互いにアニールしたままであることができるよ
うな十分な安定性で互いにハイブリダイズできるならば、「最小限に相補的」であるとい
う。同様に、分子は、それらが互いに、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いに
アニールしたままであることができるような十分な安定性で互いにハイブリダイズできる
ならば、「相補的」であるという。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989
により記載されている。完全な相補性からの逸脱は、よって、そのような逸脱が、二本鎖
構造を形成する分子の能力を完全に妨げない限りは、許容される。核酸分子がプライマー
またはプローブとして働くためには、採用する特定の溶媒および塩濃度下で安定な2本鎖
構造を形成できる配列において十分に相補的であることだけが必要である。
The nucleic acid probes and primers of the present invention hybridize with the target DNA sequence under stringent conditions. Any conventional nucleic acid hybridization or amplification method can be used to identify the presence of DNA from a transgenic event in a sample. A nucleic acid molecule or fragment thereof can specifically hybridize with other nucleic acid molecules under certain circumstances. As used herein, two nucleic acid molecules are said to be able to specifically hybridize to each other if the two molecules can form an antiparallel double stranded nucleic acid structure. Nucleic acid molecules are said to be the “complementary strand” of another nucleic acid molecule if they exhibit complete complementarity. As used herein, a molecule is said to exhibit “perfect complementarity” when all the nucleotides of one molecule are complementary to the other nucleotide. Two molecules are “minimally complementary” if they can hybridize to each other with sufficient stability so that they can remain annealed to each other at least under conventional “low stringency” conditions. " Similarly, molecules are said to be “complementary” if they can hybridize to each other with sufficient stability such that they can remain annealed to each other under conventional “high stringency” conditions. . Conventional stringency conditions are described in Sambrook et al., 1989.
It is described by. Deviations from perfect complementarity are thus tolerated as long as such deviations do not completely interfere with the ability of the molecule to form a double stranded structure. In order for a nucleic acid molecule to act as a primer or probe, it need only be sufficiently complementary in a sequence that can form a stable double-stranded structure under the particular solvent and salt concentration employed.
本明細書で用いる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件の下で比較
される核酸配列の相補鎖と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語「ストリン
ジェント条件」は、Sambrookら、1989において9.52〜9.55で論じられる特定のハイブリダ
イゼーション手順による標的核酸(すなわち対象の具体的な核酸配列)との核酸プローブ
のハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989の9.47〜9.52
および9.56〜9.58も参照されたい。よって、本発明のヌクレオチド配列は、DNA断片の
相補的なひと続きとの二重分子を選択的に形成するそれらの能力について用いることがで
きる。
As used herein, a substantially homologous sequence is a nucleic acid sequence that specifically hybridizes with the complementary strand of the nucleic acid sequence being compared under high stringency conditions. The term “stringent conditions” is functionally defined with respect to hybridization of a nucleic acid probe to a target nucleic acid (ie, a specific nucleic acid sequence of interest) by a specific hybridization procedure discussed in Sambrook et al., 1989 at 9.52-9.55. The Sambrook et al., 1989, 9.47-9.52.
See also and 9.56-9.58. Thus, the nucleotide sequences of the present invention can be used for their ability to selectively form duplexes with complementary stretches of DNA fragments.
構想する用途に応じて、標的配列に対するプローブの多様な程度の選択性を達成するた
めに、多様なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高い選択性が要求され
る用途のために、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を典型的
に採用し、例えば、約0.02M〜約0.15M NaClで約50℃〜約70℃の温度
により与えられるような比較的低い塩および/または高い温度の条件を選択する。例えば
、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションフィルタを、高ストリンジェンシ
ー洗浄バッファー(0.2×SSC、0.1%SDS、65℃)で少なくとも2回洗浄す
ることを含み得る。DNAハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー
条件、例えば、6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)で約45℃、そ
の後に2.0×SSCで50℃での洗浄は、当業者に知られている、6.3.1〜6.3
.6。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、約2.0×SSCで50℃の低ストリン
ジェンシーから約0.2×SSCで50℃の高ストリンジェンシーまで選択できる。さら
に、洗浄ステップにおける温度は、室温、約22℃の低ストリンジェンシー条件から、約
65℃の高ストリンジェンシー条件まで増加できる。温度および塩はともに変動できるか
、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持しながら他方の変数を変化させてよ
い。このような選択的条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチがあった
とすればそれにほとんど耐えない。ハイブリダイゼーションによるDNA配列の検出は当
業者に公知であり、米国特許第4,965,188号および第5,176,995号の教
示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
Depending on the application envisioned, a variety of hybridization conditions can be used to achieve varying degrees of selectivity of the probe relative to the target sequence. For applications where high selectivity is required, relatively stringent conditions are typically employed to form hybrids, such as from about 50 ° C. to about 70 ° C. with about 0.02 M to about 0.15 M NaCl. Choose relatively low salt and / or high temperature conditions as given by the temperature in ° C. For example, stringent conditions can include washing the hybridization filter at least twice with a high stringency wash buffer (0.2 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.). Appropriate stringency conditions that facilitate DNA hybridization, such as washing at about 45 ° C. with 6.0 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) followed by 2.0 × SSC at 50 ° C. Known, 6.3.1-6.3
. 6. For example, the salt concentration in the wash step can be selected from a low stringency of about 2.0 × SSC at 50 ° C. to a high stringency of about 0.2 × SSC at 50 ° C. Further, the temperature in the wash step can be increased from low stringency conditions at room temperature, about 22 ° C., to high stringency conditions at about 65 ° C. Both temperature and salt can be varied, or the other variable can be changed while either temperature or salt concentration is held constant. Such selective conditions are hardly tolerated if there is a mismatch between the probe and the template or target strand. Detection of DNA sequences by hybridization is known to those skilled in the art, and the teachings of US Pat. Nos. 4,965,188 and 5,176,995 are examples of methods for hybridization analysis.
特に好ましい実施形態において、本発明の核酸は、相補鎖およびその断片を含む本明細
書で例示または示唆されるプライマー(またはアンプリコンもしくはその他の配列)の1
または複数と、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする。本発明の一
態様において、本発明のマーカー核酸分子は、配列番号3〜14に示す核酸配列またはそ
の相補鎖および/もしくは断片を有する。
In particularly preferred embodiments, the nucleic acids of the invention comprise one of the primers (or amplicons or other sequences) exemplified or suggested herein, including complementary strands and fragments thereof.
Alternatively, it specifically hybridizes with a plurality under high stringency conditions. In one embodiment of the present invention, the marker nucleic acid molecule of the present invention has the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3 to 14 or a complementary strand and / or fragment thereof.
本発明の別の態様において、本発明のマーカー核酸分子は、このような核酸配列と、8
0%と100%の間または90%と100%の間の配列同一性を有する。本発明のさらな
る態様において、本発明のマーカー核酸分子は、このような配列と、95%と100%の
間の配列同一性を有する。このような配列は、植物育種法においてマーカーとして用いて
、遺伝的交雑種の子孫を同定できる。標的DNA分子とのプローブのハイブリダイゼーシ
ョンは、当業者に知られる任意の数の方法により検出でき、これらは、それらに限定され
ないが、蛍光タグ、放射活性タグ、抗体に基づくタグおよび化学発光タグを含み得る。
In another aspect of the invention, a marker nucleic acid molecule of the invention comprises such a nucleic acid sequence and 8
Has sequence identity between 0% and 100% or between 90% and 100%. In a further aspect of the invention, the marker nucleic acid molecule of the invention has between 95% and 100% sequence identity with such sequences. Such sequences can be used as markers in plant breeding methods to identify offspring of genetic hybrids. Hybridization of the probe with the target DNA molecule can be detected by any number of methods known to those skilled in the art, including but not limited to fluorescent tags, radioactive tags, antibody-based tags and chemiluminescent tags. May be included.
特定の増幅プライマー対を用いる標的核酸配列の増幅(例えばPCRによる)に関して
、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列(またはその相
補鎖)を有するプライマーが結合し、好ましくはユニーク増幅産物であるアンプリコンを
生成する標的核酸配列のみとハイブリダイズすることを許容する条件である。
For amplification of a target nucleic acid sequence using a particular amplification primer pair (eg by PCR), “stringent conditions” are preferably those in which the primer pair binds to a primer having the corresponding wild-type sequence (or its complementary strand). Is a condition that allows hybridization with only the target nucleic acid sequence that produces the amplicon, which is a unique amplification product.
用語「(標的配列)に特異的」は、プローブまたはプライマーが、標的配列を含む試料
において標的配列のみとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダ
イズすることを示す。
The term “specific for (target sequence)” indicates that a probe or primer hybridizes under stringent hybridization conditions with only the target sequence in a sample containing the target sequence.
本明細書で用いる場合、「増幅されたDNA」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の
一部分である標的核酸配列の核酸増幅の生成物のことをいう。例えば、有性交雑に起因す
るトウモロコシ植物が本発明のトウモロコシ植物からのトランスジェニックイベントゲノ
ムDNAを含有するかを決定するために、トウモロコシ植物組織試料から抽出されるDN
Aを、挿入された異種DNAの挿入部位に隣接する植物のゲノムにおけるフランキング配
列に由来するプライマーと、挿入された異種DNAに由来する第2プライマーとを含むプ
ライマー対を用いて、イベントDNAの存在について特徴的であるアンプリコンを生成す
る核酸増幅法に供することができる。アンプリコンは、ある長さのものであり、これもま
たイベントについて特徴的である配列を有する。アンプリコンは、プライマー対+1ヌク
レオチド塩基対の組み合わさった長さから、および/またはプライマー対+約
もしくはそれより多くのヌクレオチド塩基対(+または−上で列挙する任意の増分)の組
み合わさった長さの範囲であり得る。代わりに、プライマー対は、挿入ヌクレオチド配列
全体を含むアンプリコンを生成するように、挿入されたDNAの両側のフランキング配列
に由来できる。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたDNA
配列からのある距離に位置し得る。この距離は、1ヌクレオチド塩基対から約2万ヌクレ
オチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、DNA熱増幅反応
において形成されることがあるプライマーダイマーを特に除く。
As used herein, “amplified DNA” or “amplicon” refers to the product of nucleic acid amplification of a target nucleic acid sequence that is part of a nucleic acid template. For example, DN extracted from a corn plant tissue sample to determine if a corn plant resulting from sexual crossing contains transgenic event genomic DNA from the corn plant of the present invention.
A using a primer pair comprising a primer derived from a flanking sequence in the genome of a plant adjacent to the insertion site of the inserted heterologous DNA and a second primer derived from the inserted heterologous DNA, It can be subjected to nucleic acid amplification methods that produce amplicons that are characteristic of their presence. An amplicon is of a length and has a sequence that is also characteristic for events. The amplicon is derived from the combined length of primer pair + 1 nucleotide base pair and / or primer pair + approx.
Or a range of combined lengths of more nucleotide base pairs (any increment listed above + or-). Alternatively, the primer pair can be derived from flanking sequences on either side of the inserted DNA so as to generate an amplicon containing the entire inserted nucleotide sequence. The member of the primer pair derived from the plant genome sequence is the inserted DNA
It may be located at a distance from the sequence. This distance can range from 1 nucleotide base pair to about 20,000 nucleotide base pairs. The use of the term “amplicon” specifically excludes primer dimers that may be formed in a DNA thermal amplification reaction.
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む当該技術において知られる種々の
核酸増幅法のいずれによっても達成できる。種々の増幅法は当該技術において知られてお
り、なかでも、米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号
に記載されている。PCR増幅法は、22kbまでのゲノムDNAを増幅するために開発
されている。これらの方法およびDNA増幅の技術分野において知られるその他の方法を
、本発明の実行において用いてよい。異種導入遺伝子DNA挿入断片の配列または主題の
トウモロコシイベントからのフランキングゲノム配列は、このような配列を、イベントか
ら、本明細書で示される配列に由来するプライマーを用いて増幅し、その後、PCRアン
プリコンまたはクローニングされたDNAの標準的なDNA配列決定を行うことにより確
認(そして、必要であれば修正)できる。
Nucleic acid amplification can be accomplished by any of a variety of nucleic acid amplification methods known in the art, including polymerase chain reaction (PCR). Various amplification methods are known in the art and are described in US Pat. No. 4,683,195 and US Pat. No. 4,683,202, among others. PCR amplification methods have been developed to amplify genomic DNA up to 22 kb. These methods and other methods known in the art of DNA amplification may be used in the practice of the present invention. The sequence of the heterologous transgene DNA insert or the flanking genomic sequence from the subject corn event amplifies such a sequence from the event using primers derived from the sequences presented herein and then PCR It can be confirmed (and corrected if necessary) by performing standard DNA sequencing of amplicons or cloned DNA.
これらの方法により生成されるアンプリコンは、複数の技術により検出できる。アガロ
ースゲル電気泳動および臭化エチジウムでの染色は、DNAアンプリコンを検出するため
の一般的な公知の方法である。別のこのような方法は、隣接するフランキングゲノムDN
A配列と挿入されたDNA配列との両方とオーバーラップするようにDNAオリゴヌクレ
オチドが設計される遺伝的ビット解析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプ
レートのウェルに固定化される。対象の領域のPCRの後に(挿入された配列内の1つの
プライマーと、隣接するフランキングゲノム配列内の1つのプライマーとを用いる)、1
本鎖PCR生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズでき、DNAポ
リメラーゼと予測される次の塩基に特異的な標識ddNTPとを用いる単一塩基伸長反応
のための鋳型として働く。読出しは、蛍光またはELISAに基づくことができる。シグ
ナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による挿入断片/フラ
ンキング配列の存在を示す。
Amplicons generated by these methods can be detected by multiple techniques. Agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide are commonly known methods for detecting DNA amplicons. Another such method is the flanking flanking genome DN
Genetic bit analysis in which DNA oligonucleotides are designed to overlap both the A sequence and the inserted DNA sequence. Oligonucleotides are immobilized in the wells of a microwell plate. After PCR of the region of interest (using one primer in the inserted sequence and one primer in the flanking flanking genomic sequence), 1
The double-stranded PCR product can hybridize with the immobilized oligonucleotide and serves as a template for a single base extension reaction using DNA polymerase and a labeled ddNTP specific for the predicted next base. The readout can be based on fluorescence or ELISA. The signal indicates the presence of the insert / flanking sequence due to successful amplification, hybridization, and single base extension.
別の方法は、Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18〜24、2000)により記載されるピロ
シーケンス技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するゲノムDN
Aおよび挿入DNA接合部とオーバーラップするように設計される。オリゴヌクレオチド
を、対象の領域からの1本鎖PCR生成物(挿入された配列内の1つのプライマーと、フ
ランキングゲノム配列内の1つのプライマー)とハイブリダイズさせ、DNAポリメラー
ゼ、ATP、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン5’ホスホ硫酸
およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。DNTPを個別に加え、組み込みは
、光のシグナルをもたらし、これが測定される。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼー
ションおよび単一または多重塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入断片/フランキング配
列の存在を示す。
Another method is the pyrosequencing technique described by Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). In this method, the oligonucleotide is a contiguous genomic DN.
Designed to overlap with A and the inserted DNA junction. The oligonucleotide is hybridized with a single stranded PCR product (one primer in the inserted sequence and one primer in the flanking genomic sequence) from the region of interest, and DNA polymerase, ATP, sulfurylase, luciferase Incubate in the presence of apyrase, adenosine 5 ′ phosphosulfate and luciferin. DNTPs are added separately and incorporation results in a light signal that is measured. The light signal indicates the presence of the transgene insert / flanking sequence due to successful amplification, hybridization, and single or multiple base extension.
蛍光分極は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる別の方法であ
る。この方法に従って、ゲノムフランキングおよび挿入されたDNA接合部とオーバーラ
ップするオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドを、対象の領域からの1本
鎖PCR生成物(挿入されたDNA内の1つのプライマーと、フランキングゲノムDNA
配列内の1つのプライマー)とハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼおよび蛍光標識
ddNTPの存在下でインキュベートする。単一塩基伸長は、ddNTPの組み込みをも
たらす。組み込みは、蛍光計を用いて分極の変化として測定できる。分極の変化は、増幅
、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入断片/フラン
キング配列の存在を示す。
Fluorescence polarization is another method that can be used to detect the amplicons of the present invention. According to this method, oligonucleotides are designed that overlap with genomic flanking and inserted DNA junctions. Oligonucleotide is a single-stranded PCR product from the region of interest (one primer in the inserted DNA and flanking genomic DNA
One primer in the sequence) and incubated in the presence of DNA polymerase and fluorescently labeled ddNTPs. Single base extension results in the incorporation of ddNTPs. Incorporation can be measured as a change in polarization using a fluorometer. A change in polarization indicates the presence of the transgene insert / flanking sequence due to successful amplification, hybridization, and single base extension.
TAQMAN(PE Applied Biosystems、Foster Cit
y、Calif.)は、DNA配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べる
と、ゲノムフランキングおよび挿入DNA接合部とオーバーラップするFRETオリゴヌ
クレオチドプローブを設計する。FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入DNA
配列内の1つのプライマーと、フランキングゲノム配列内の1つのプライマー)を、熱安
定性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で循環させる。特異的増幅の間に、Taq D
NAポリメラーゼは蛍光部分をFRETプローブの消光部分から浄化して放出させる。蛍
光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によるフランキング/導入遺伝
子挿入配列の存在を示す。
TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster Cit
y, Calif. ) Is a method for detecting and quantifying the presence of a DNA sequence. Briefly, FRET oligonucleotide probes are designed that overlap with genomic flanking and inserted DNA junctions. FRET probe and PCR primer (inserted DNA
One primer in the sequence and one primer in the flanking genomic sequence) are circulated in the presence of thermostable polymerase and dNTPs. During specific amplification, Taq D
NA polymerase cleans and releases the fluorescent moiety from the quenching portion of the FRET probe. The fluorescent signal indicates the presence of the flanking / transgene insertion sequence due to successful amplification and hybridization.
分子ビーコンは、配列検出において用いるために記載されている。簡単に述べると、フ
ランキングゲノムおよび挿入DNA接合部とオーバーラップするFRETオリゴヌクレオ
チドプローブを設計する。FRETプローブのユニーク構造により、これは、蛍光部分と
消光部分とが近接したまま維持される2次構造を含有するようになる。FRETプローブ
およびPCRプライマー(挿入DNA配列内の1つのプライマーと、フランキングゲノム
配列内の1つのプライマー)を、熱安定性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で循環さ
せる。PCR増幅が成功した後に、標的配列へのFRETプローブのハイブリダイゼーシ
ョンは、プローブ2次構造の除去と、蛍光部分および消光部分の空間的な分離をもたらす
。蛍光シグナルが得られる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功
によるフランキングゲノム/導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
Molecular beacons have been described for use in sequence detection. Briefly, FRET oligonucleotide probes are designed that overlap the flanking genome and the inserted DNA junction. The unique structure of the FRET probe causes it to contain a secondary structure in which the fluorescent and quenching moieties are kept in close proximity. The FRET probe and PCR primer (one primer in the insert DNA sequence and one primer in the flanking genomic sequence) are circulated in the presence of a thermostable polymerase and dNTPs. After successful PCR amplification, hybridization of the FRET probe to the target sequence results in removal of the probe secondary structure and spatial separation of the fluorescent and quenching moieties. A fluorescent signal is obtained. A fluorescent signal indicates the presence of the flanking genome / transgene insert due to successful amplification and hybridization.
挿入のために優れたトウモロコシゲノムの場所を開示したが、主題の発明は、少なくと
も1つの非aad1挿入断片を、おおよそこのゲノムの場所の付近に含むトウモロコシ種
子および/またはトウモロコシ植物も含む。あるオプションは、異なる挿入断片を、本明
細書で例示されるaad−1挿入断片の代わりに置換することである。一般的にこれらの
点に関して、例えば標的にされた相同組換えを主題の発明に従って用いることができる。
この型の技術は、例えばWO03/080809A2および対応する公開されたU.S.
出願(US20030232410)の主題である。したがって、主題の発明は、本明細
書で同定されるフランキング配列の全てまたは認識可能部分(例えば配列番号29の残基
1〜1873および6690〜8557)と接する異種挿入断片(aad−1のマルチコ
ピーの代わりまたはそれとともに)を含む植物および植物細胞を含む。
Although an excellent corn genome location for insertion has been disclosed, the subject invention also includes corn seeds and / or corn plants that contain at least one non-aad1 insert fragment approximately in the vicinity of the genome location. One option is to replace a different insert in place of the aad-1 insert illustrated herein. In general in these respects, for example, targeted homologous recombination can be used according to the subject invention.
This type of technology is described, for example, in WO 03/080809 A2 and the corresponding published U.S. Pat. S.
This is the subject of the application (US2003302410). Accordingly, the subject invention provides for heterologous inserts (aad-1 multiples) that border all or a recognizable portion of the flanking sequences identified herein (eg, residues 1-1873 and 6690-8557 of SEQ ID NO: 29). Plants and plant cells that contain (instead of or with a copy).
本明細書で言及したかまたは引用した全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度でその全体が参照により組み込まれている。
本発明は以下の態様を含み得る。[1]
配列番号29を含むゲノムを含むトランスジェニックトウモロコシ植物。
[2]
アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に受託番号PTA−10244
の下で寄託された種子に存在するAAD−1イベントDAS−40278−9を含むゲノ
ムを含むトウモロコシ種子。
[3]
配列番号29を含むゲノムを含むトウモロコシ種子。
[4]
配列番号29を含む、請求項2に記載の種子を成長させることにより作出されるトウモ
ロコシ植物。
[5]
AAD−1イベントDAS−40278−9を含む、請求項4に記載のトウモロコシ植
物の子孫植物。
[6]
配列番号29を含む、請求項1に記載のトウモロコシ植物の除草剤耐性子孫植物。
[7]
配列番号30および配列番号31により部分的に増幅可能なSSRマーカーUMC12
65と、配列番号32および配列番号33により部分的に増幅可能なSSRマーカーMM
C0111との間のおよそ20cMにて第2染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位
に導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックトウモロコシ植物であって、標的部位が
異種核酸を含む植物。
[8]
配列番号30および配列番号31により部分的に増幅可能なSSRマーカーUMC12
65と、配列番号32および配列番号33により部分的に増幅可能なSSRマーカーMM
C0111との間のおよそ20cMにて第2染色体上の位置に異種核酸を挿入するステッ
プを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製する方法。
[9]
花粉、胚珠、花、さや(boll)、長繊維(lint)、苗条、根および葉からなる群から選
択され、配列番号29を含む、請求項4に記載の植物の一部分。
[10]
導入遺伝子挿入断片を、配列番号29の残基1〜1873および配列番号1の残基66
90〜8557からなる群から選択されるゲノム配列内に、またはそれに接して含むトラ
ンスジェニックトウモロコシ植物。
[11]
少なくとも15ヌクレオチドを含み、配列番号29の残基1〜1873、配列番号29
の残基6690〜8557およびその相補鎖からなる群から選択される核酸配列とのスト
リンジェントな洗浄条件下でのハイブリダイゼーションを維持する単離ポリヌクレオチド
分子。
[12]
配列番号1〜28および30〜33からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド。
[13]
配列番号29の残基1863〜1875、配列番号29の残基6679〜6700およ
びその相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件
下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド。
[14]
ポリメラーゼ連鎖反応により生じるアンプリコンである、請求項13に記載のポリヌク
レオチド。
[15]
トウモロコシDNAを含む試料においてトウモロコシイベントを検出する方法であって
、前記試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に受託番号PTA
−10244の下で寄託された種子に存在するAAD−1トウモロコシイベントDAS−
40278−9について特徴的である少なくとも1つのポリヌクレオチドと接触させるス
テップを含む方法。
[16]
前記試料を、
a.配列番号29の残基1〜1873、配列番号29の残基6690〜8557およびそ
の相補鎖からなる群から選択されるフランキング配列と結合する第1プライマー、および
b.配列番号1の残基1874〜6689またはその相補鎖を含む挿入配列と結合する第
2プライマー
と接触させるステップと、前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、前記プ
ライマー間に生じるアンプリコンについてアッセイするステップとを含む、請求項15に
記載の方法。
[17]
前記プライマーが、配列番号1〜28からなる群から選択される、請求項16に記載の
方法。
[18]
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも30ヌクレオチドを含み、配列番号29の残基1
863〜1875、配列番号29の残基6679〜6700およびその相補鎖からなる群
から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記方法が、前記
試料および前記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供
するステップと、前記DNAとの前記ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについ
て前記試料をアッセイするステップとをさらに含む、請求項15に記載の方法。
[19]
請求項17に記載の第1プライマーおよび第2プライマーを含むDNA検出キット。
[20]
請求項18に記載の方法を行うためのDNA検出キット。
[21]
請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むDNA検出キット。
[22]
配列番号29を含むポリヌクレオチド。
[23]
請求項22に記載のポリヌクレオチドを生成する方法。
[24]
トウモロコシゲノムのDNAセグメントに導入遺伝子を挿入する方法であって、前記D
NAセグメントが、配列番号29のヌクレオチド残基1〜1873を含む5’末端と、配
列番号1のヌクレオチド残基6690〜8557を含む3’末端とを含む方法。
[25]
トウモロコシ植物を育種する方法であって、配列番号29を含む第1トウモロコシ植物
を第2トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第3トウモロコシ植物を作出するス
テップと、前記第3トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列番号29の存在について
アッセイするステップとを含む方法。
[26]
トウモロコシ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入する方法であって、配列番号29を含
む第1トウモロコシ植物を第2トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第3トウモ
ロコシ植物を作出するステップと、前記第3トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列
番号29の存在についてアッセイするステップとを含む方法。
All patents, patent applications, provisional applications and publications mentioned or cited herein are incorporated by reference in their entirety to the extent that they do not conflict with the explicit teachings of this specification.
The present invention may include the following aspects. [1]
A transgenic corn plant comprising a genome comprising SEQ ID NO: 29.
[2]
Accession number PTA-10244 for American Type Culture Collection (ATCC)
Geno including the AAD-1 event DAS-40278-9 present in seeds deposited under
Corn seeds containing
[3]
Corn seed comprising a genome comprising SEQ ID NO: 29.
[4]
A corn produced by growing seeds according to claim 2 comprising SEQ ID NO: 29.
Rokoshi plant.
[5]
The corn plant of claim 4 comprising AAD-1 event DAS-40278-9.
Progeny plant.
[6]
The herbicide-tolerant progeny plant of the corn plant of claim 1 comprising SEQ ID NO: 29.
[7]
SSR marker UMC12 which can be partially amplified by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31
65 and an SSR marker MM that can be partially amplified by SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33
Maize chromosome target site on chromosome 2 at approximately 20 cM with C0111
A transgenic corn plant containing a transgene insertion fragment in which the target site is
A plant containing a heterologous nucleic acid.
[8]
SSR marker UMC12 which can be partially amplified by SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31
65 and an SSR marker MM that can be partially amplified by SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33
Step for inserting heterologous nucleic acid at a position on chromosome 2 at about 20 cM between C0111
A method for producing a transgenic corn plant comprising
[9]
Selected from the group consisting of pollen, ovule, flower, boll, long fiber (lint), shoots, roots and leaves
A plant part according to claim 4, which is selected and comprises SEQ ID NO: 29.
[10]
The transgene insert was ligated to residues 1-1873 of SEQ ID NO: 29 and residue 66 of SEQ ID NO: 1.
A tiger comprising within or adjacent to a genomic sequence selected from the group consisting of 90-8557
Transgenic corn plant.
[11]
Comprising at least 15 nucleotides, residues 1 to 1873 of SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 29
A nucleic acid sequence selected from the group consisting of residues 6690-8557 and its complementary strand
An isolated polynucleotide that maintains hybridization under lingent wash conditions
molecule.
[12]
Comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-28 and 30-33
Isolated polynucleotide.
[13]
Residues 1863-1875 of SEQ ID NO: 29, residues 6679-6700 of SEQ ID NO: 29 and
Nucleotide sequences selected from the group consisting of DNA and their complementary strands and stringent washing conditions
An isolated polynucleotide that hybridizes underneath.
[14]
The polynucleotide of claim 13, which is an amplicon generated by polymerase chain reaction.
Leotide.
[15]
A method for detecting a corn event in a sample containing corn DNA comprising:
The sample was deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) under the accession number PTA.
AAD-1 corn event DAS- present in seed deposited under 10244
Contacting with at least one polynucleotide characteristic of 40278-9
A method involving tep.
[16]
The sample,
a. Residues 1 to 1873 of SEQ ID NO: 29, residues 6690 to 8557 of SEQ ID NO: 29 and
A first primer that binds to a flanking sequence selected from the group consisting of:
b. A first that binds to an insertion sequence comprising residues 1874-6589 of SEQ ID NO: 1 or its complementary strand
2 primers
Contacting the sample; subjecting the sample to a polymerase chain reaction; and
Assaying for amplicons occurring between the rimers.
The method described.
[17]
17. The primer of claim 16, wherein the primer is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-28.
Method.
[18]
The polynucleotide comprises at least 30 nucleotides and comprises residue 1 of SEQ ID NO: 29
863 to 1875, residues 6679 to 6700 of SEQ ID NO: 29, and their complementary strands
Hybridizing under stringent conditions with a sequence selected from
The sample and the polynucleotide are subjected to stringent hybridization conditions.
And hybridization of the polynucleotide with the DNA.
The method of claim 15, further comprising assaying the sample.
[19]
A DNA detection kit comprising the first primer and the second primer according to claim 17.
[20]
A DNA detection kit for performing the method according to claim 18.
[21]
A DNA detection kit comprising the polynucleotide according to claim 13.
[22]
A polynucleotide comprising SEQ ID NO: 29.
[23]
23. A method for producing the polynucleotide of claim 22.
[24]
A method for inserting a transgene into a DNA segment of a corn genome comprising the above D
A NA segment comprising a 5 ′ end comprising nucleotide residues 1-1873 of SEQ ID NO: 29;
And a 3 ′ end comprising nucleotide residues 6690-8557 of column number 1.
[25]
A method for breeding a corn plant, the first corn plant comprising SEQ ID NO: 29
Is crossed with a second corn plant to produce a third corn plant containing the genome.
Tep and the third corn plant for the presence of SEQ ID NO: 29 in the genome
Assaying.
[26]
A method for introgressing a herbicide tolerance trait into a corn plant comprising SEQ ID NO: 29
The first corn plant is crossed with the second corn plant to produce a third corn containing the genome.
Creating a sorghum plant; and sequencing the third corn plant in the genome
Assaying for the presence of number 29.
以下の実施例は、本発明を実行するための手順を説明し、本発明のあるいくつかの好ま
しい実施形態を示すために含まれる。これらの実施例は、限定すると解釈されるべきでな
い。以下の実施例に開示される技術は、好ましい形態をその実行のために説明するために
用いられる具体的なアプローチを表すことが当業者により認識される。しかし、当業者は
、本開示に鑑みて、これらの具体的な実施形態において多くの変更を行いながら、本発明
の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をまだ得ることができるこ
とを認識している。そうでないと記載しない限り、全てのパーセンテージは重量により、
全ての溶媒混合比率は、そうでないと記載しない限り容量による。
The following examples are included to illustrate procedures for practicing the invention and to illustrate some preferred embodiments of the invention. These examples should not be construed as limiting. It will be appreciated by those skilled in the art that the techniques disclosed in the following examples represent specific approaches used to describe the preferred form for implementation. However, one of ordinary skill in the art, in view of this disclosure, will still be able to obtain similar or similar results without departing from the spirit and scope of the present invention while making many changes in these specific embodiments. It has recognized. Unless stated otherwise, all percentages are by weight,
All solvent mixing ratios are by volume unless stated otherwise.
そうでないと示さない限り、以下の略語を用いる。
AAD−1 アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−1
bp 塩基対
℃ セ氏度
DNA デオキシリボ核酸
DIG ジゴキシゲニン
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
OLP オーバーラッププローブ
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SOP 標準操作手順
SSC 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有するバッファー溶
液、pH7.0
TBE Trisベース、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有するバッファー溶液
、pH8.3
V ボルト
[実施例]
Unless otherwise indicated, the following abbreviations are used.
AAD-1 Aryloxyalkanoate dioxygenase-1
bp base pair degree Celsius DNA deoxyribonucleic acid DIG digoxigenin EDTA ethylenediaminetetraacetic acid kb kilobase μg microgram μL microliter mL milliliter M molar mass OLP overlap probe PCR polymerase chain reaction PTU plant transcription unit SDS sodium dodecyl sulfate SOP standard operating procedure SSC Buffer solution containing a mixture of sodium chloride and sodium citrate, pH 7.0
Buffer solution containing a mixture of TBE Tris base, boric acid and EDTA, pH 8.3
V bolt
[Example]
AAD1イベントpDAS1740−278の形質転換および選択
AAD1イベントであるpDAS1740−278を、メイズ系統Hi−IIのウィス
カー(WHISKER)媒介形質転換により生成した。用いる形質転換法は、米国特許出願公開
第20090093366号に記載されている。プラスミドpDAS1740(pDAB
3812ともよばれる)のFspI断片(図1)を、メイズ系統に形質転換した。このプ
ラスミド構築物は、RB7 MARv3::ゼア・メイズ(Zea mays)ユビキチン1プロ
モーターv2//AAD1 v3//ゼア・メイズPER5 3’UTR::RB7 M
ARv4植物転写ユニット(PTU)を含有する植物発現カセットを含有する。
Transformation and selection of AAD1 event pDAS 1740-278 The AAD1 event pDAS 1740-278 was generated by WHISKER-mediated transformation of the maize line Hi-II. The transformation method used is described in US 20090093366. Plasmid pDAS1740 (pDAB
The FspI fragment (also called 3812) (FIG. 1) was transformed into the maize line. This plasmid construct is RB7 MARv3 :: Zea mays ubiquitin 1 promoter v2 // AAD1 v3 // Zea mays PER5 3′UTR :: RB7 M
Contains a plant expression cassette containing an ARv4 plant transcription unit (PTU).
多数のイベントを生成した。生存し、健常で、ハロキシホップ抵抗性カルス組織を生成したイベントに、推定上の形質転換イベントを表すユニーク識別コードを割り当て、新鮮な選択培地に継続して移した。植物は、各ユニークイベントに由来する組織から再生し、温室に移した。
Generated a large number of events. Events that survived, were healthy, and produced haloxyhop- resistant callus tissue were assigned a unique identification code representing a putative transformation event and were continually transferred to fresh selective media. Plants were regenerated from tissues derived from each unique event and transferred to the greenhouse.
葉の試料を、分子解析のために採取して、AAD−1導入遺伝子の存在を、サザンブロ
ット、DNA境界の確認およびゲノムマーカーにより支援される確認により検証した。陽
性のT0植物を、近交系統と受粉してT1種子を得た。イベントpDAS1470−27
8−9(DAS−40278−9)のT1植物を選択し、自家受粉し、5世代にわたって
特徴決定した。その間に、T1植物を戻し交雑し、エリート生殖質(XHH13)に、マ
ーカーにより支援される選択により数世代にわたって遺伝子移入した。このイベントは、
独立した形質転換単離体から作製した。イベントを、単一挿入部位、標準メンデル分離お
よび安定的な発現のようなそのユニークな特徴、ならびに広い遺伝子型背景におけるおよ
び複数の環境の場所にわたる除草剤耐性および農業経済学的性能を含む優れた効率の組み
合わせに基づいて選択した。以下の実施例は、イベントpDAS−1740−278−9
を特徴づけるために用いたデータを含有する。
Leaf samples were taken for molecular analysis and the presence of the AAD-1 transgene was verified by Southern blot, DNA border confirmation and confirmation supported by genomic markers. Positive T0 plants were pollinated with inbred lines to obtain T1 seeds. Event pDAS1470-27
8-9 (DAS-40278-9) T1 plants were selected, self-pollinated and characterized for 5 generations. In the meantime, T1 plants were backcrossed and transfected into the elite germplasm (XHH13) for several generations with marker-assisted selection. This event
Made from independent transformed isolates. Excellent events including single insertion site, standard Mendelian isolation and its unique features such as stable expression, and herbicide tolerance and agroeconomic performance in a wide genotypic background and across multiple environmental locations Selected based on a combination of efficiencies. The following example shows the event pDAS-1740-278-9.
Contains data used to characterize.
サザンブロットによるpDAS1740−278−9イベントの特徴決定
サザンブロット解析を用いて、挿入されたDNA断片の組み込みパターンを確立し、イ
ベントpDAS−1740−278−9(DAS−40278−9)におけるaad−1
遺伝子の挿入断片/コピーの数を決定した。データを得て、トウモロコシゲノムに挿入さ
れたaad−1導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。
Characterization of pDAS 1740-278-9 event by Southern blot Southern blot analysis was used to establish the integration pattern of the inserted DNA fragment and aad-1 at event pDAS-1740-278-9 (DAS-40278-9)
The number of inserts / copy of the gene was determined. Data were obtained to verify the integration and integrity of the aad-1 transgene inserted into the maize genome.
サザンブロットデータは、トウモロコシイベントDAS−40278−9におけるpDAS1740/FspI断片挿入が、プラスミドpDAS1740からのaad−1 PTUの単一のインタクトなコピーの単純な組み込みとして生じたことを示唆した。詳細なサザンブロット解析を、プラスミド領域に含有される遺伝子、プロモーター、ターミネーターおよびその他の調節要素に特異的なプローブと、プラスミド内にある切断部位を有し、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはトウモロコシゲノムDNAとのプラスミドの接合部に及ぶ断片(境界断片)を生成する説明的な制限酵素とを用いて行った。制限酵素とプローブとの組み合わせについてサザンハイブリダイゼーションから示された分子量は、イベントについてユニークであり、その同定パターンを確立した。これらの解析は、プラスミド断片が、aad−1 PTUの再構成なしにトウモロコシゲノムDNAに挿入されたことも示した。同一のハイブリダイゼーション断片が、トランスジェニックトウモロコシイベントDAS−40278−9の異なる5つの世代において観察され、このことは、世代にわたるaad−1 PTU挿入の遺伝形質の安定性を示す。プラスミドpDAS1740上のFspIの制限部位の外側に位置する3つの主鎖プローブの混合物とのハイブリダイゼーションは、いずれの特定のDNA/遺伝子断片も検出せず、このことは、トランスジェニックトウモロコシイベントDAS−40278−9におけるアンピシリン抵抗性遺伝子の不在と、プラスミドpDAS1740のFspI制限部位に直接隣接するその他のベクター主鎖領域の不在とを示した。aad−1トウモロコシイベントDAS−40278−9における挿入断片の説明のための地図を、図2〜3に示す。
Southern blot data suggested that the pDAS1740 / FspI fragment insertion in corn event DAS-40278-9 occurred as a simple integration of a single intact copy of aad-1 PTU from plasmid pDAS1740. Detailed Southern blot analysis with probes specific for genes, promoters, terminators and other regulatory elements contained in the plasmid region, and cleavage sites within the plasmid that hybridize within the plasmid or maize This was done with an explanatory restriction enzyme that produces a fragment (boundary fragment) that spans the plasmid junction with genomic DNA. The molecular weights shown from Southern hybridization for the combination of restriction enzyme and probe were unique for the event and established its identification pattern. These analyzes also showed that the plasmid fragment was inserted into maize genomic DNA without reconstitution of aad-1 PTU. The same hybridization fragment was observed in five different generations of transgenic maize event DAS-40278-9, indicating the stability of the inherited trait of aad-1 PTU insertions over generations. Hybridization with a mixture of three backbone probes located outside the restriction site of FspI on plasmid pDAS1740 did not detect any particular DNA / gene fragment, which indicates that the transgenic maize event DAS-40278 The absence of the ampicillin resistance gene in -9 and the absence of other vector backbone regions immediately adjacent to the FspI restriction site of plasmid pDAS1740 are shown. A map for the description of the insert in aad-1 corn event DAS-40278-9 is shown in FIGS.
(実施例2.1)
トウモロコシの葉の試料の回収およびゲノムDNA(gDNA)の単離
gDNAを、aad−1トウモロコシイベントDAS−40278−9の個別の植物の
葉から調製した。gDNAを、aad−1トウモロコシイベントDAS−40278−9
を有する個別の植物から収穫した葉組織から抽出した。イベントDAS−40278−9
の5つの異なる世代からのトランスジェニックトウモロコシ種子を用いた。世代あたり4
つの植物に由来する、イベントDAS−40278−9についての20の個別のトウモロ
コシ植物を選択した。さらに、gDNAを、従来のトウモロコシ植物XHH13から単離
したが、これは、本質の系統の代表である遺伝子背景を含有し、aad−1遺伝子は存在
しない。
(Example 2.1)
Corn Leaf Sample Collection and Genomic DNA (gDNA) Isolation gDNA was prepared from leaves of individual plants of aad-1 corn event DAS-40278-9. gDNA, aad-1 corn event DAS-40278-9
Extracted from leaf tissue harvested from individual plants with Event DAS-40278-9
Transgenic corn seeds from 5 different generations were used. 4 per generation
Twenty individual corn plants for event DAS-40278-9, from one plant, were selected. In addition, gDNA was isolated from the traditional corn plant XHH13, which contains a genetic background that is representative of the essence lineage and the aad-1 gene is absent.
gDNAを単離する前に、葉の押し抜きを各植物から採取して、aad−1タンパク質
発現を、迅速テストストリップキット(American Bionostica、Sw
edesboro、NJ)を製造者が推奨する手順に従って用いて試験した。それぞれの
葉の押し抜き試料には、aad−1の存在または不在について、それぞれ+または−の評
点を与えた。イベントDAS−40278−9の5つの世代からの陽性植物だけを、さら
なる特徴決定に供した。
Prior to isolating gDNA, leaf punches were taken from each plant to determine aad-1 protein expression using a rapid test strip kit (American Biostica, Sw
edesboro, NJ) according to the manufacturer's recommended procedure. Each leaf punched sample was given a + or-rating for the presence or absence of aad-1, respectively. Only positive plants from five generations of event DAS-40278-9 were subjected to further characterization.
トウモロコシの葉の試料を、イベントDAS−40278−9および従来の対照XHH
13の個別の植物から回収した。葉の試料を液体窒素中で迅速に凍結し、使用時までおよ
そ−80℃にて貯蔵した。
Samples of corn leaves were used for event DAS-40278-9 and conventional control XHH.
Harvested from 13 individual plants. Leaf samples were quickly frozen in liquid nitrogen and stored at approximately −80 ° C. until use.
個別のゲノムDNAを、凍結トウモロコシ葉組織から、標準的なCTAB法に従って抽
出した。必要な場合に、いくらかのゲノムDNAを、Qiagen Genomic−T
ip(Qiagen、Valencia、CA)を、製造者により推奨される手順に従っ
て用いてさらに精製した。抽出の後に、DNAを、Pico Green試薬(Invi
trogen、Carlsbad、CA)を用いて分光蛍光的に定量した。DNAを、次
いで、アガロースゲル上で視覚化して、Pico Green解析からの値を確認し、D
NAの質を決定した。
Individual genomic DNA was extracted from frozen corn leaf tissue according to standard CTAB methods. If necessary, some genomic DNA is transferred to Qiagen Genomic-T
ip (Qiagen, Valencia, CA) was further purified using the procedure recommended by the manufacturer. After extraction, the DNA was ligated with Pico Green reagent (Invi
(Trogen, Carlsbad, Calif.). The DNA is then visualized on an agarose gel to confirm the value from the Pico Green analysis and D
The quality of NA was determined.
(実施例2.2)
DNA消化および分離
DNAの分子特徴決定のために、トウモロコシイベントDAS−40278−9 DN
A試料および従来の対照からの9マイクログラム(9μg)のゲノムDNAを、DNA1
μgあたりに選択された制限酵素をおよそ5〜11単位と対応する反応バッファーとを各
DNA試料に加えることにより消化した。各試料を、およそ37℃にて一晩インキュベー
トした。制限酵素EcoRI、NcoI、SacI、FseIおよびHindIIIを消
化のために用いた(New England Biolabs、Ipswich、MA)
。陽性のハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドDNAであるpDAS1740
(pDAB3812)を、従来の対照からのゲノムDNAと、トウモロコシゲノムあたり
1コピーの導入遺伝子にほぼ等しい比率で組み合わせることにより調製し、試験試料と同
じ手順および制限酵素を用いて消化した。従来のトウモロコシ対照(XHH13)からの
DNAを、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化して、陰性対照とした。
(Example 2.2)
DNA digestion and separation For the molecular characterization of DNA, the corn event DAS-40278-9 DN
Nine micrograms (9 μg) of genomic DNA from the A sample and the conventional control were converted to DNA1
The restriction enzyme selected per μg was digested by adding approximately 5-11 units and the corresponding reaction buffer to each DNA sample. Each sample was incubated overnight at approximately 37 ° C. Restriction enzymes EcoRI, NcoI, SacI, FseI and HindIII were used for digestion (New England Biolabs, Ipswich, MA).
. A positive hybridization control sample was obtained from plasmid DNA pDAS1740.
(PDAB3812) was prepared by combining genomic DNA from a conventional control with a ratio approximately equal to one copy of the transgene per corn genome and digested using the same procedure and restriction enzymes as the test sample. DNA from a conventional corn control (XHH13) was digested using the same procedure and restriction enzymes as the test sample to serve as a negative control.
消化したDNA試料を、Quick−Precip(Edge BioSystems
、Gaithersburg、MD)を用いて沈殿させ、1×Blue Juice(I
nvitrogen、Carlsbad、CA)に再懸濁して、ゲルローディングのため
の所望の容量を達成した。DNA試料および分子サイズマーカーを、次いで、0.8%ア
ガロースゲルに1×TBEバッファー(Fisher Scientific、Pitt
sburgh、PA)を55〜65ボルトでおよそ18〜22時間用いて電気泳動して、
断片の分離を達成した。ゲルを、臭化エチジウム(Invitrogen、Carlsb
ad、CA)で染色し、DNAを紫外(UV)光の下で視覚化した。
The digested DNA sample was prepared using Quick-Precip (Edge BioSystems).
, Gaithersburg, MD) and precipitated with 1 × Blue Juice (I
nvitrogen, Carlsbad, CA) to achieve the desired volume for gel loading. DNA samples and molecular size markers were then transferred to a 0.8% agarose gel in 1 × TBE buffer (Fisher Scientific, Pitt
sburgh, PA) at 55-65 volts for approximately 18-22 hours,
Fragment separation was achieved. The gel was treated with ethidium bromide (Invitrogen, Carlsb
ad, CA) and DNA was visualized under ultraviolet (UV) light.
(実施例2.3)
サザントランスファーおよびメンブレン処理
サザンブロット解析を、Memelinkら(1994) Southern, Northern, and Western Blot An
alysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1〜23に記載されるようにして本質的に行った。簡
単に述べると、DNA断片の電気泳動分離および視覚化の後に、ゲルを、0.25N H
Cl(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)をおよそ1
5分間用いて脱プリン化し、次いで、変性溶液(AccuGENE、Sigma、St.
Louis、MO)におよそ30分間、その後中和溶液(AccuGENE、Sigma
、St.Louis、MO)に少なくとも30分間曝露した。サザントランスファーを、
ナイロンメンブレン(Roche Diagnostics、Indianapolis
、IN)上に、灯心(wicking)システムを10×SSC(Sigma、St.Loui
s、MO)とともに用いて一晩行った。トランスファーの後に、メンブレンを2×SSC
溶液中で洗浄し、DNAをメンブレンにUV架橋により結合させた。このプロセスにより
、ハイブリダイゼーションのための準備ができたサザンブロットメンブレンが得られた。
(Example 2.3)
Southern Transfer and Membrane Processing Southern blot analysis was performed by Memelink et al. (1994) Southern, Northern, and Western Blot An
alysis. Plant Mol. Biol. Manual F1: 1-23. Briefly, after electrophoretic separation and visualization of DNA fragments, the gel is 0.25 NH 2
Cl (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) approximately 1
Depurinized using 5 minutes and then denaturing solution (AccumENE, Sigma, St.
Louis, MO) for approximately 30 minutes, then neutralization solution (AccumENE, Sigma)
, St. (Louis, MO) for at least 30 minutes. Southern transfer
Nylon membrane (Roche Diagnostics, Indianapolis)
, IN) on a wicking system 10 × SSC (Sigma, St. Louis)
s, MO) and performed overnight. After transfer, the membrane is 2 x SSC
Washed in solution, the DNA was bound to the membrane by UV crosslinking. This process resulted in a Southern blot membrane that was ready for hybridization.
(実施例2.4)
DNAプローブ標識およびハイブリダイゼーション
ナイロンメンブレンと結合したDNA断片を、標識プローブを用いて検出した。この研
究のために用いたプローブは、ジゴキシゲニン(DIG)標識ヌクレオチドである[DI
G−11]−dUTPのPCRに基づく組み込みにより、プラスミドpDAS1740か
らの遺伝子要素とその他の領域に特異的なプライマーにより作製された断片から作製した
。PCR合成によるDNAプローブの作製は、PCR DIGプローブ合成キット(Ro
che Diagnostics、Indianapolis、IN)を、製造者が推奨
する手順に従って用いて行った。この研究に用いたプローブのリストを、表1に記載する
。
(Example 2.4)
DNA probe labeling and hybridization DNA fragments bound to the nylon membrane were detected using a labeled probe. The probe used for this study is a digoxigenin (DIG) labeled nucleotide [DI
G-11] -dUTP was made from PCR-based integration from the gene element from plasmid pDAS1740 and fragments made with primers specific for other regions. Preparation of a DNA probe by PCR synthesis is performed by PCR DIG probe synthesis kit (Ro
che Diagnostics, Indianapolis, IN) was performed according to the procedure recommended by the manufacturer. A list of probes used in this study is listed in Table 1.
標識プローブを、アガロースゲル電気泳動により解析して、それらの質および量を決定
した。所望の量の標識プローブを、次いで、DIG Easy Hyb溶液(Roche
Diagnostics、Indianapolis、IN)について記載される手順
を用いる特定の断片の検出のために、ナイロンメンブレン上で標的DNAへのハイブリダ
イゼーションのために用いた。簡単に述べると、DNAを固定したナイロンメンブレンブ
ロットを、2×SSC中で短く洗浄し、20〜25mLの予め温めたDIG Easy
Hyb溶液を用いて、ハイブリダイゼーション瓶中でおよそ50℃にて最短で30分間、
ハイブリダイゼーションオーブン中でプレハイブリダイゼーションした。プレハイブリダ
イゼーション溶液を、次いで、デカントし、水中で5分間煮沸することにより予め変性さ
せた所望の量の特異的プローブを含有する20mLの予め温めたDIG Easy Hy
b溶液で置き換えた。ハイブリダイゼーションステップを、次いで、およそ40〜60℃
にて一晩、ハイブリダイゼーションオーブン中で行った。
Labeled probes were analyzed by agarose gel electrophoresis to determine their quality and quantity. The desired amount of labeled probe is then added to the DIG Easy Hyb solution (Roche
Used for hybridization to target DNA on nylon membranes for detection of specific fragments using the procedure described for Diagnostics (Indianapolis, Ind.). Briefly, nylon membrane blots with immobilized DNA were washed briefly in 2 × SSC and 20-25 mL pre-warmed DIG Easy.
Using the Hyb solution in a hybridization bottle at approximately 50 ° C. for a minimum of 30 minutes,
Prehybridization was performed in a hybridization oven. The prehybridization solution is then decanted and 20 mL of pre-warmed DIG Easy Hy containing the desired amount of specific probe previously denatured by boiling in water for 5 minutes.
Replaced with b solution. The hybridization step is then performed at approximately 40-60 ° C
Overnight in a hybridization oven.
(実施例2.5)
検出
プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するDIG Easy H
yb溶液をきれいなチューブにデカントし、−20℃にて貯蔵した。これらのプローブは
、製造者が推奨する手順に従って2〜3回再使用できた。メンブレンブロットを短くすす
ぎ、きれいなプラスチック容器中で、低ストリンジェンシー洗浄バッファー(2×SSC
、0.1%SDS)でおよそ5分間室温にて2回洗浄し、その後、高ストリンジェンシー
洗浄バッファー(0.1×SSC、0.1%SDS)で15分間、それぞれおよそ65℃
にて2回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、別のきれいなプラスチック容器に移
し、DIG洗浄およびブロックバッファーセット(Roche Diagnostics
、Indianapolis、IN)からの1×洗浄バッファーでおよそ2分間短く洗浄
し、1×ブロッキングバッファー中で最短で30分間のブロッキングと、その後の1×ブ
ロッキングバッファー中での抗DIG−AP(アルカリホスファターゼ)抗体(1:5,
000希釈、Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)
との最短で30分間のインキュベーションに進んだ。1×洗浄バッファーで2〜3回洗浄
した後に、特異的DNAプローブは、メンブレンブロットに結合したままであり、DIG
標識DNA標準物質を、CDP−Star化学発光核酸検出システム(Roche Di
agnostics、Indianapolis、IN)を製造者の推奨に従って用いて
視覚化した。ブロットを化学発光フィルム(Roche Diagnostics、In
dianapolis、IN)に、1または複数の時点で露光して、ハイブリダイズして
いる断片を検出して、分子サイズ標準物質を視覚化した。フィルムを、次いで、All−
Pro 100 Plusフィルム現像器(Konica SRX−101)で現像し、
画像を報告のために走査した。検出されたバンドの数およびサイズを、各プローブについ
て文書化した。記載されるようなDIG検出後に視覚化されるDIG標識DNA分子量マ
ーカーII(MWM DIG II)を用いて、サザンブロット上のハイブリダイズして
いる断片のサイズを決定した。
(Example 2.5)
Detection At the end of probe hybridization, DIG Easy H containing the probe
The yb solution was decanted into a clean tube and stored at -20 ° C. These probes could be reused 2-3 times according to the manufacturer's recommended procedure. Rinse the membrane blot briefly and place in a clean plastic container with low stringency wash buffer (2x SSC).
, 0.1% SDS) for approximately 5 minutes at room temperature, followed by high stringency wash buffer (0.1 × SSC, 0.1% SDS) for 15 minutes, each at approximately 65 ° C.
Was washed twice. The membrane blot is then transferred to another clean plastic container and washed with DIG wash and block buffer set (Roche Diagnostics).
Wash briefly with 1 × wash buffer from Indianapolis, IN) for approximately 2 minutes, block for a minimum of 30 minutes in 1 × blocking buffer, followed by anti-DIG-AP (alkaline phosphatase) in 1 × blocking buffer Antibody (1: 5
000 dilution, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)
And proceeded to incubation for 30 minutes at the shortest. After washing 2-3 times with 1 × wash buffer, the specific DNA probe remains bound to the membrane blot and DIG
A labeled DNA standard was added to the CDP-Star chemiluminescent nucleic acid detection system (Roche Di).
visualization, Indianapolis, Ind.) according to the manufacturer's recommendations. Blots were prepared using chemiluminescent film (Roche Diagnostics, In
dianapolis, IN) was exposed at one or more time points to detect hybridized fragments and visualize molecular size standards. The film is then all-
Develop with Pro 100 Plus film developer (Konica SRX-101),
Images were scanned for reporting. The number and size of detected bands were documented for each probe. The size of the hybridizing fragments on the Southern blot was determined using DIG-labeled DNA molecular weight marker II (MWM DIG II) visualized after DIG detection as described.
(実施例2.6)
プローブ除去(stripping)
DNAプローブを、サザンハイブリダイゼーションデータが得られた後にメンブレンブ
ロットから除去させ、メンブレンブロットは、製造者の推奨する手順に従って(DIG Appl
ication Manual for Filter Hybridization、(2003). Roche Diagnostics)、異なるDN
Aプローブとのハイブリダイゼーションのために再使用できた。簡単に述べると、シグナ
ル検出およびフィルム曝露の後に、メンブレンブロットをMilli−Q水で十分にすす
ぎ、除去バッファー(0.2N NaOH、0.1%SDS)中でおよそ15分間、室温
または37℃で2回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、2×SSC中で短く洗浄
し、プレハイブリダイゼーションおよび別のDNAプローブとのハイブリダイゼーション
の準備ができた。メンブレンブロットを、新しい化学発光フィルムに露光して、全てのD
NAプローブを、次のハイブリダイゼーションに進む前に確実に除去させた。再露光した
フィルムを、記録のための研究ファイルに以前のハイブリダイゼーションデータパッケー
ジとともに保存した。
(Example 2.6)
Probe stripping
The DNA probe is removed from the membrane blot after the Southern hybridization data has been obtained, and the membrane blot is prepared according to the manufacturer's recommended procedure (DIG Appl
ication Manual for Filter Hybridization, (2003). Roche Diagnostics), different DN
Could be reused for hybridization with A probe. Briefly, after signal detection and film exposure, membrane blots are rinsed thoroughly with Milli-Q water and approximately 15 minutes in removal buffer (0.2N NaOH, 0.1% SDS) at room temperature or 37 ° C. Washed twice. The membrane blot was then washed briefly in 2 × SSC and ready for prehybridization and hybridization with another DNA probe. Expose the membrane blot to a new chemiluminescent film and remove all D
The NA probe was surely removed before proceeding to the next hybridization. The reexposed film was saved with the previous hybridization data package in a study file for recording.
(実施例2.7)
サザンブロットの結果
pDAS1740/FspI断片の既知の制限酵素部位に基づいて、特定の消化物およ
びプローブで予測される断片サイズおよび観察された断片サイズを、表2に示す。2つの
型の断片をこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定した:既知の酵素部位
がプローブ領域と接し、pDAS1740/FspI断片内に完全に含まれる内部断片と
、既知の酵素部位がプローブ領域の一端にあり、第2の部位がトウモロコシゲノム中に予
測される境界断片。境界断片のサイズはイベントにより変動した。なぜなら、ほとんどの
場合、DNA断片組み込み部位は各イベントについてユニークであるからである。境界断
片は、組み込まれたDNAに対して制限酵素部位の場所を決定し、DNA挿入の数を評価
するための手段を提供する。この研究で完了したサザンブロット解析に基づいて、プラス
ミドpDAS1740/FspIからのインタクトなaad−1 PTUの単一コピーが
、挿入断片地図に詳細に示されるように、イベントDAS−40278−9のトウモロコ
シゲノムに挿入されたと結論付けた(図2〜3)。
(Example 2.7)
Southern Blot Results Based on the known restriction enzyme sites of the pDAS1740 / FspI fragment, the fragment sizes predicted and observed for specific digests and probes are shown in Table 2. Two types of fragments were identified from these digests and hybridizations: an internal fragment where the known enzyme site touches the probe region and is completely contained within the pDAS1740 / FspI fragment, and a known enzyme site is one end of the probe region. A boundary fragment whose second site is predicted in the corn genome. The size of the boundary fragment varied with the event. This is because in most cases the DNA fragment integration site is unique for each event. Border fragments provide a means to determine the location of restriction enzyme sites for the integrated DNA and to assess the number of DNA insertions. Based on the Southern blot analysis completed in this study, a single copy of intact aad-1 PTU from plasmid pDAS1740 / FspI is shown in detail in the insert map, and the corn genome of event DAS-40278-9. (Figs. 2-3).
プラスミドpDAS1740中にユニーク制限部位を有する制限酵素EcoRI、Nc
oI、SacI、FseI/HindIIIを選択して、イベントDAS−40278−
9におけるaad−1遺伝子挿入断片を特徴決定した。>3382bp、>2764bp
、>4389bpの境界断片は、それぞれEcoRI、NcoIおよびSacI消化の後
にaad−1遺伝子プローブとハイブリダイズすると予想された(表2)。約(〜)12
000bp、約4000bpおよび約16000bpの単一のaad−1ハイブリダイゼ
ーションバンドが、それぞれEcoRI、NcoIおよびSacIを用いた場合に観察さ
れ、このことは、イベントDAS−40278−9のトウモロコシゲノムにおけるaad
−1遺伝子挿入の単一の部位を示した。FseIおよびHindIIIを用いる二重消化
を選択して、aad−1植物転写単位(PTU、プロモーター/遺伝子/ターミネーター
)を含有する3361bpの断片を放出した(表2)。予想される3361bpの断片が
、FseI/HindIII消化の後にaad−1遺伝子プローブを用いて観察された。
DAS−40278−9試料の4つ全ての酵素/酵素の組み合わせでの消化とその後のa
ad−1遺伝子プローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドpDAS
1740からのインタクトなaad−1 PTUの単一コピーが、イベントDAS−40
278−9のトウモロコシゲノムに挿入されたことを示した。
Restriction enzymes EcoRI, Nc with unique restriction sites in plasmid pDAS1740
Select oI, SacI, FseI / HindIII and select event DAS-40278-
The aad-1 gene insert in 9 was characterized. > 3382 bp,> 2764 bp
The> 4389 bp border fragment was expected to hybridize with the aad-1 gene probe after EcoRI, NcoI and SacI digestion, respectively (Table 2). About (~) 12
A single aad-1 hybridization band of 000 bp, about 4000 bp and about 16000 bp was observed when using EcoRI, NcoI and SacI, respectively, indicating that the aad in the corn genome of event DAS-40278-9
A single site of -1 gene insertion is shown. Double digestion with FseI and HindIII was selected to release a 3361 bp fragment containing the aad-1 plant transcription unit (PTU, promoter / gene / terminator) (Table 2). An expected 3361 bp fragment was observed using the aad-1 gene probe after FseI / HindIII digestion.
Digestion of DAS-40278-9 sample with all four enzyme / enzyme combinations followed by a
The results obtained with ad-1 gene probe hybridization are the results of plasmid pDAS
A single copy of the intact aad-1 PTU from 1740 is the event DAS-40
It was shown to have been inserted into the 278-9 maize genome.
制限酵素NcoI、SacIおよびFseI/HindIIIを選択して、イベントD
AS−40278−9におけるaad−1についてのプロモーター(ZmUbi1)領域
を特徴決定した。NcoIおよびSacI消化は、ZmUbi1プロモーター領域に特異
的なDNAプローブとハイブリダイズさせた場合に、それぞれ>3472bpおよび>4
389bpの境界領域断片を生じると予測される(表2)。約(〜)6300bpおよび
約3600bpの2つのハイブリダイゼーションバンドが、NcoI消化の後にZmUb
i1プロモータープローブを用いて検出された。しかし、約3600bpのバンドは、従
来の対照を含む全ての試料のレーンにわたって存在し、このことは、この約3600bp
のバンドが、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター(ZmUbi1)プローブがトウ
モロコシ内因性ubi遺伝子と相同結合することによる非特異的シグナルバンドであるこ
とを示唆した。これとは対照的に、約6300bpのシグナルバンドは、試験されたDA
S−40278−9試料で検出されたが従来の対照では検出されず、このことは、この約
6300bpのバンドが、プラスミドpDAS1740からのZmUbi1プロモーター
プローブに特異的であり、よって、これが表2に示す予測されたNcoI/ZmUbi1
バンドであることを示した。同様に、約3800bpおよび約16000bpの2つのハ
イブリダイゼーションバンドが、SacI消化の後にZmUbi1プロモータープローブ
を用いて検出された。約3800bpのバンドは、従来の対照を含む全ての試料のレーン
において出現し、よって、トウモロコシ内因性ubi遺伝子へのZmUbi1プロモータ
ープローブの非特異的ハイブリダイゼーションであると考えられる。DAS−40278
−9試料にのみ存在する約16000bpのハイブリダイゼーションバンドは、予測され
たSacI/ZmUbi1バンドと考えられる。FseI/HindIIIでの二重消化
は、ZmUbi1プロモータープローブとハイブリダイズする3361bpのaad−1
PTU断片を遊離すると予測される(表2)。この3361bpのバンドおよび約64
00bpの非特異的ハイブリダイゼーションバンドが、FseI/HindIII消化の
後にZmUbi1プロモータープローブにより検出された。約6400bpバンドは、ト
ウモロコシ内因性ubi遺伝子とのZmUbi1プロモータープローブの非特異的結合と
考えられる。なぜなら、このバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンに存在するか
らである。さらに、約6400bpに非常に近い別のバンドが、従来の対照、BC3S1
およびいくつかのBC3S2試料で観察された。約6400bpに非常に近いこの追加の
バンドも、非特異的であるとみなされる。なぜなら、これは、従来の対照XHH13試料
レーンに存在し、XHH13の遺伝子背景と関連する可能性が高いからである。
Select restriction enzymes NcoI, SacI and FseI / HindIII to select event D
The promoter (ZmUbi1) region for aad-1 in AS-40278-9 was characterized. NcoI and SacI digestions are> 3472 bp and> 4, respectively, when hybridized with DNA probes specific for the ZmUbi1 promoter region.
It is predicted to produce a 389 bp boundary region fragment (Table 2). Two hybridization bands of about (~) 6300 bp and about 3600 bp are found after ZcoI digestion with ZmUb
It was detected using the i1 promoter probe. However, a band of about 3600 bp exists over the lane of all samples including the conventional control, which means that this about 3600 bp
This band suggested that the maize-derived ubiquitin promoter (ZmUbi1) probe was a non-specific signal band due to homologous binding to the maize endogenous ubi gene. In contrast, a signal band of about 6300 bp is observed for the tested DA
Detected in the S-40278-9 sample but not in the conventional control, this approximately 6300 bp band is specific for the ZmUbi1 promoter probe from plasmid pDAS1740 and is therefore shown in Table 2 Predicted NcoI / ZmUbi1
It showed that it was a band. Similarly, two hybridization bands of about 3800 bp and about 16000 bp were detected using the ZmUbi1 promoter probe after SacI digestion. An approximately 3800 bp band appears in all sample lanes, including the conventional control, and is therefore considered to be non-specific hybridization of the ZmUbi1 promoter probe to the maize endogenous ubi gene. DAS-40278
A hybridization band of approximately 16000 bp present only in the -9 sample is considered the predicted SacI / ZmUbi1 band. Double digestion with FseI / HindIII results in 3361 bp of aad-1 hybridizing with the ZmUbi1 promoter probe
It is expected to release the PTU fragment (Table 2). This 3361 bp band and about 64
A 00 bp non-specific hybridization band was detected with the ZmUbi1 promoter probe after FseI / HindIII digestion. The approximately 6400 bp band is thought to be non-specific binding of the ZmUbi1 promoter probe to the maize endogenous ubi gene. This is because this band is present in all sample lanes including conventional controls. In addition, another band very close to about 6400 bp is the conventional control, BC3S1
And several BC3S2 samples. This additional band very close to about 6400 bp is also considered non-specific. This is because it is present in the conventional control XHH13 sample lane and is likely to be associated with the genetic background of XHH13.
同じ制限酵素/酵素の組み合わせNcoI、SacIおよびFseI/HindIII
を選択して、イベントDAS−40278−9におけるターミネーター(ZmPer5)
領域を特徴決定した。NcoI消化は、ZmPer5ターミネーター領域に特異的なDN
Aプローブとハイブリダイズする場合に、>2764bpの境界領域断片を生じると予測
される(表2)。約(〜)4000bpおよび約3900bpの2つのハイブリダイゼー
ションバンドが、NcoI消化の後にZmPer5ターミネータープローブを用いて検出
された。約3900bpのバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンにわたって存在
し、このことは、この約3900bpのバンドが、おそらく、トウモロコシ由来ペルオキ
シダーゼ遺伝子ターミネーター(ZmPer5)プローブがトウモロコシ内因性per遺
伝子と相同結合することによる非特異的シグナルバンドであることを示唆した。これとは
対照的に、約4000bpのシグナルバンドは、試験されたDAS−40278−9試料
で検出されたが従来の対照では検出されず、このことは、この約4000bpのバンドが
、プラスミドpDAS1740からのZmPer5ターミネータープローブに特異的であ
り、よって、これが表2に示す予測されたNcoI/ZmPer5バンドであることを示
した。>1847bpの境界断片は、SacI消化の後にZmPer5ターミネータープ
ローブとハイブリダイズすると予測される。約1900bpおよび約9000bpの2つ
のハイブリダイゼーションバンドが、SacI消化の後にZmPer5ターミネータープ
ローブを用いて検出された。約9000bpのバンドは、従来の対照を含む全ての試料レ
ーンにわたって存在し、よって、トウモロコシ内因性per遺伝子へのZmPer5ター
ミネータープローブの非特異的ハイブリダイゼーションであると考えられた。DAS−4
0278−9試料にのみ存在した約1900bpのハイブリダイゼーションバンドは、予
測されたSacI/ZmPer5バンドであると考えられる。FseI/HindIII
での二重消化は、ZmPer5ターミネータープローブとハイブリダイズする3361b
pのaad−1 PTU断片を遊離すると予測される(表2)。この3361bpのバン
ドおよび約2100bpの追加の非特異的ハイブリダイゼーションバンドが、FseI/
HindIII消化の後のZmPer5ターミネータープローブにより検出された。追加
の約2100bpのバンドは、トウモロコシ内因性遺伝子へのZmPer5ターミネータ
ープローブの非特異的結合である。なぜなら、このバンドは、陰性対照を含む全ての試料
レーンに存在するからである。DAS−40278−9試料のこれらの消化とその後のZ
mUbi1プロモーターおよびZmPer5ターミネータープローブのハイブリダイゼー
ションで得られた結果により、プラスミドpDAS1740からのインタクトなaad−
1 PTUの単一コピーが、イベントDAS−40278−9のトウモロコシゲノムに挿
入されたことがさらに確認された。
Same restriction enzyme / enzyme combinations NcoI, SacI and FseI / HindIII
Select Terminator at Event DAS-40278-9 (ZmPer5)
The region was characterized. NcoI digestion is a DN specific for the ZmPer5 terminator region.
When hybridized with the A probe, it is expected to produce a border region fragment of> 2764 bp (Table 2). Two hybridization bands of about (˜) 4000 bp and about 3900 bp were detected using a ZmPer5 terminator probe after NcoI digestion. An approximately 3900 bp band is present across all sample lanes, including the conventional control, indicating that the approximately 3900 bp band probably binds the maize-derived peroxidase gene terminator (ZmPer5) probe to homologous to the maize endogenous per gene. It was suggested that this was a non-specific signal band. In contrast, a signal band of about 4000 bp was detected in the tested DAS-40278-9 sample but not in the conventional control, which means that this about 4000 bp band is from plasmid pDAS1740. Specific ZmPer5 terminator probes, thus indicating that this is the predicted NcoI / ZmPer5 band shown in Table 2. A> 1847 bp border fragment is expected to hybridize with the ZmPer5 terminator probe after SacI digestion. Two hybridization bands of about 1900 bp and about 9000 bp were detected using a ZmPer5 terminator probe after SacI digestion. An approximately 9000 bp band was present across all sample lanes, including the conventional control, and was therefore considered to be non-specific hybridization of the ZmPer5 terminator probe to the maize endogenous per gene. DAS-4
The approximately 1900 bp hybridization band that was present only in the 0278-9 sample is believed to be the predicted SacI / ZmPer5 band. FseI / HindIII
Double digestion at 3336b hybridizes with ZmPer5 terminator probe
It is expected to release the p aad-1 PTU fragment (Table 2). This 3361 bp band and an additional non-specific hybridization band of about 2100 bp
Detected with ZmPer5 terminator probe after HindIII digestion. An additional approximately 2100 bp band is non-specific binding of the ZmPer5 terminator probe to the maize endogenous gene. This is because this band is present in all sample lanes including the negative control. These digestions of DAS-40278-9 samples followed by Z
The results obtained from hybridization of the mUbi1 promoter and ZmPer5 terminator probe indicate that the intact aad − from plasmid pDAS1740
It was further confirmed that a single copy of 1 PTU was inserted into the corn genome of event DAS-40278-9.
制限酵素NcoIおよびSacIを選択して、AAD−1トウモロコシイベントDAS
−40278−9におけるpDAS1740/FspI断片からの残りの要素について特
徴決定した(表2)。要素RB7 Mar v3およびRB7 Mar v4のDNA配
列は、99.7%を超える同一性を有し、よって、RB7 Mar v3またはRB7
Mar v4に特異的なDNAプローブは、RB7 Marのいずれかのバージョンを含
有するDNA断片とハイブリダイズすると予測された。>2764bpおよび>3472
bpの2つの境界断片は、NcoI消化の後にRB7 Mar v4およびRB7 Ma
r v3プローブとハイブリダイズすると予測された(表2)。約(〜)4000bpお
よび約6300bpの2つのハイブリダイゼーションバンドが、DAS−40278−9
試料におけるNcoI消化の後にRB7 Mar v4またはRB7 Mar v3プロ
ーブのいずれかを用いて観察された。同様に、>1847bpおよび>4389bpの2
つの境界断片が、SacI消化の後にRB7 Mar v4およびRB7 Mar v3
プローブを用いて予想された(表2)。約1900bpおよび約16000bpのハイブ
リダイゼーションバンドが、DAS−40278−9試料において、SacI消化の後に
RB7 Mar v4またはRB7 Mar v3プローブを用いて検出された。
Select restriction enzymes NcoI and SacI to select AAD-1 corn event DAS
The remaining elements from the pDAS1740 / FspI fragment at -40278-9 were characterized (Table 2). The DNA sequences of elements RB7 Mar v3 and RB7 Mar v4 have greater than 99.7% identity, and thus RB7 Mar v3 or RB7
A DNA probe specific for Mar v4 was predicted to hybridize with DNA fragments containing either version of RB7 Mar. > 2764 bp and> 3472
The two border fragments of bp are RB7 Mar v4 and RB7 Ma after NcoI digestion.
It was predicted to hybridize with the rv3 probe (Table 2). Two hybridization bands of about (˜) 4000 bp and about 6300 bp are found in DAS-40278-9.
Observed with either RB7 Mar v4 or RB7 Mar v3 probe after NcoI digestion in the sample. Similarly,> 1847 bp and> 4389 bp 2
Two border fragments are RB7 Mar v4 and RB7 Mar v3 after SacI digestion
Expected using probes (Table 2). Hybridization bands of about 1900 bp and about 16000 bp were detected with RB7 Mar v4 or RB7 Mar v3 probes after SacI digestion in DAS-40278-9 samples.
まとめると、これらの要素プローブを用いて得られたサザンハイブリダイゼーションの
結果は、トウモロコシイベントDAS−40278−9に挿入されたDNAが、インタク
トなaad−1 PTUを、挿入断片のそれぞれ5’末端および3’末端のマトリクス付
着領域RB7 Mar v3およびRB7 Mar v4とともに含有することを示した
。
In summary, the Southern hybridization results obtained using these elemental probes show that the DNA inserted into corn event DAS-40278-9 contains intact aad-1 PTU, the 5 ′ end of each of the inserts and It was shown to contain with 3'-end matrix attachment region RB7 Mar v3 and RB7 Mar v4.
(実施例2.8)
主鎖配列の不在
プラスミドpDAS1740のほぼ全体のFspI主鎖領域(プラスミドpDAS17
40の4867〜7143bp)をカバーする3つのDNA断片(表1)の等モル比率の
組み合わせを主鎖プローブとして用いて、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40
278−9の特徴決定をした。プラスミドpDAS1740/FspI断片を用いて、イ
ベントDAS−40278−9を作製したので、主鎖プローブの組み合わせを用いて、い
ずれの制限酵素消化の後にも特異的ハイブリダイゼーションシグナルは予測されなかった
(表2)。全てのDAS−40278−9試料において、NcoIまたはSacI消化の
後に主鎖プローブを用いて特異的ハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかったこ
とが確認された。陽性対照レーンは、予測されたハイブリダイズするバンドを含有し、こ
のことは、プローブが、試料中に存在するならばいずれの相同DNA断片ともハイブリダ
イズできたことを証明した。このデータは、トウモロコシイベントDAS−40278−
9の挿入が、プラスミドpDAS1740からのFspI領域の外側のいずれのベクター
主鎖配列も含まなかったことを示唆した。
(Example 2.8)
Absence of main chain sequence FspI main chain region of plasmid pDAS1740 (plasmid pDAS17
AAD-1 corn event DAS-40, using a combination of equimolar proportions of three DNA fragments (Table 1) covering 40 4867-7143 bp) as the backbone probe
278-9 was characterized. Since the plasmid pDAS1740 / FspI fragment was used to generate event DAS-40278-9, no specific hybridization signal was expected after any restriction enzyme digestion using the backbone probe combination (Table 2). ). In all DAS-40278-9 samples, it was confirmed that no specific hybridization signal was detected using a backbone probe after NcoI or SacI digestion. The positive control lane contained the expected hybridizing band, demonstrating that the probe could hybridize to any homologous DNA fragment if present in the sample. This data is from the corn event DAS-40278-
9 insertions did not include any vector backbone sequences outside the FspI region from plasmid pDAS1740.
イベントDAS−40278−9の5つの異なる世代からの葉の試料を用いて、分子特
徴決定のためのサザンブロット解析を行った。組み込みパターンを、選択された制限酵素
消化物およびプローブの組み合わせを用いて調べて、挿入された遺伝子であるaad−1
、ならびに遺伝子発現のプロモーター、ターミネーターを含む非コード領域およびマトリ
クス付着領域の特徴を決定した。
Southern blot analysis for molecular characterization was performed using leaf samples from five different generations of event DAS-40278-9. The integration pattern was examined using a selected restriction enzyme digest and probe combination to insert the inserted gene, aad-1.
And the characteristics of the gene expression promoter, terminator-containing non-coding region and matrix attachment region.
イベントDAS−40278−9に挿入されたDNAのサザンブロット特徴決定は、a
ad−1 PTUの単一のインタクトなコピーが、イベントDAS−40278−9に組
み込まれたことを示す。制限酵素の組み合わせおよびプローブについてのサザンハイブリ
ダイゼーションにより示された分子量はイベントについてユニークであり、その同定パタ
ーンを確立した。ハイブリダイゼーションパターンは、5つ全ての世代にわたって同一で
あり、このことは、挿入断片がトウモロコシゲノム中で安定であることを示す。プラスミ
ドpDAS1740からのpDAS1740/FspI形質転換断片を超える主鎖領域を
カバーするプローブとのハイブリダイゼーションにより、ベクター主鎖配列がイベントD
AS−40278−9に組み込まれていないことが確認される。
Southern blot characterization of DNA inserted into event DAS-40278-9 is
Indicates that a single intact copy of ad-1 PTU has been incorporated into event DAS-40278-9. The molecular weights shown by Southern hybridization for restriction enzyme combinations and probes were unique for the event and established its identification pattern. The hybridization pattern is identical across all five generations, indicating that the insert is stable in the corn genome. Hybridization with a probe covering the backbone region beyond the pDAS1740 / FspI transformed fragment from plasmid pDAS1740 results in the vector backbone sequence being event D
It is confirmed that it is not incorporated into AS-40278-9.
トウモロコシイベントDAS−40278−9の挿入断片およびフランキング境界領域に
おけるDNA配列のクローニングおよび特徴決定
挿入されたDNAを特徴決定し、ゲノム挿入部位を示すために、イベントDAS−40
278−9の挿入断片および境界領域のDNA配列を決定した。合計で、8557bpの
イベントDAS−40278−9ゲノム配列が確認され、これは、1873bpの5’フ
ランキング境界配列、1868bpの3’フランキング境界配列および4816bpのD
NA挿入断片を含んだ。4816bpのDNA挿入断片は、インタクトなaad−1発現
カセット、5’末端に259bpの部分MAR v3および3’末端に1096bpの部
分MAR v4を含有する。配列解析により、5’組み込み接合部での21bpの挿入と
、トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座からの2塩基対の欠失とが明らかになった。1塩基
対の挿入が、トウモロコシゲノムとDAS−40278−9挿入断片との間の3’組み込
み接合部にて見出された。また、単一塩基変化(TからC)が、挿入断片中に、3’UT
Rの非コード領域内の5212位にて見出された。これらの変化はいずれも、aad−1
発現カセットのオープンリーディングフレーム組成に影響しない。
Cloning and characterization of the DNA sequence in the insert and flanking border region of corn event DAS-40278-9 To characterize the inserted DNA and indicate the genomic insertion site, event DAS-40
The 278-9 insert and border region DNA sequences were determined. In total, an 8557 bp event DAS-40278-9 genomic sequence was identified, which was 1873 bp of 5 ′ flanking border sequence, 1868 bp of 3 ′ flanking border sequence and 4816 bp of D.
The NA insert was included. The 4816 bp DNA insert contains an intact aad-1 expression cassette, a 259 bp partial MAR v3 at the 5 ′ end and a 1096 bp partial MAR v4 at the 3 ′ end. Sequence analysis revealed a 21 bp insertion at the 5 ′ integration junction and a two base pair deletion from the corn genome insertion locus. A one base pair insertion was found at the 3 'integration junction between the maize genome and the DAS-40278-9 insert. In addition, a single base change (T to C) can be detected in the 3'UT
Found at position 5212 in the non-coding region of R. Both of these changes are aad-1
Does not affect the open reading frame composition of the expression cassette.
イベントDAS−40278−9挿入断片および境界配列に基づくPCR増幅により、
境界領域がトウモロコシ起源であり、接合部領域を、DAS−40278−9のイベント
特異的同定に用いることができたことが確認された。接合部領域にわたる配列の解析は、
新規なオープンリーディングフレーム(ORF>=200コドン)が、イベントDAS−
40278−9におけるDNA挿入から得られず、ゲノムのオープンリーディングフレー
ムは、天然トウモロコシゲノムへのDAS−40278−9の組み込みにより遮られなか
ったことを示した。全体として、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−
9の挿入断片および境界配列の特徴決定は、aad−1発現カセットの単一のインタクト
なコピーが、天然トウモロコシゲノムに組み込まれたことを示した。
By PCR amplification based on event DAS-40278-9 insert and border sequence,
It was confirmed that the border region was of maize origin and the junction region could be used for event specific identification of DAS-40278-9. Analysis of sequences across the junction region
A new open reading frame (ORF> = 200 codons) is the event DAS-
It was not obtained from DNA insertion at 40278-9, indicating that the genomic open reading frame was not obstructed by the integration of DAS-40278-9 into the native maize genome. Overall, AAD-1 corn event DAS-40278-
Characterization of the 9 inserts and the border sequence showed that a single intact copy of the aad-1 expression cassette was integrated into the native maize genome.
(実施例3.1)
ゲノムDNA抽出および定量
ゲノムDNAを、凍結乾燥したかまたは新しく粉砕した葉の組織から、CTAB変法を
用いて抽出した。DNA試料を、1×TE(10mM Tris pH8.0、1mM
EDTA)(Fluka、Sigma、St.Louis、MO)に溶解し、Pico
Green法を製造者の使用説明(Molecular Probes、Eugene、
OR)に従って用いて定量した。PCR解析のために、DNA試料を分子生物学グレード
の水(5PRIME、Gaithersburg、MD)を用いて希釈して、10〜10
0ng/μLの濃度を得た。
(Example 3.1)
Genomic DNA extraction and quantification Genomic DNA was extracted from lyophilized or freshly ground leaf tissue using a modified CTAB method. A DNA sample was prepared using 1 × TE (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM
EDTA) (Fluka, Sigma, St. Louis, MO)
The Green method is used by the manufacturer (Molecular Probes, Eugene,
OR) and quantified. For PCR analysis, a DNA sample is diluted with molecular biology grade water (5PRIME, Gaithersburg, MD) and 10-10
A concentration of 0 ng / μL was obtained.
(実施例3.2)
PCRプライマー
表3に、イベントDAS−40278−9のDNA挿入断片およびフランキング境界領
域をクローニングするために用いたプライマー配列を、図4に示す位置および記載ととも
に列挙する。表4に、挿入断片および境界配列を確認するために用いたプライマー配列を
列挙する。プライマーの位置は、図4および5にそれぞれ示す。全てのプライマーは、I
ntegrated DNA Technologies,Inc.(Coralvil
le、IA)で合成した。プライマーを水(5PRIME、Gaithersburg、
MD)に、貯蔵溶液のために100μMの濃度まで溶解し、作業溶液のために10μMの
濃度まで水で希釈した。
(Example 3.2)
PCR primers Table 3 lists the primer sequences used to clone the DNA insert and flanking border region of event DAS-40278-9, with the positions and descriptions shown in FIG. Table 4 lists the primer sequences used to confirm the insert and border sequences. Primer positions are shown in FIGS. 4 and 5, respectively. All primers are I
ntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralvir
le, IA). Primer water (5PRIME, Gaithersburg,
MD) was dissolved to a concentration of 100 μM for the stock solution and diluted with water to a concentration of 10 μM for the working solution.
(実施例3.3)
ゲノムウォーキング
GenomeWalker(商標)ユニバーサルキット(Clontech Labo
ratories,Inc.、Mountain View、CA)を用いて、トウモロ
コシイベントDAS−40278−9の5’および3’フランキング境界配列をクローニ
ングした。製造者の使用説明に従って、AAD−1トウモロコシイベントDAS−402
78−9からの約2.5μgのゲノムDNAを、EcoRV、StuI(ともにキットに
より提供される)またはScaI(New England Biolabs、Ipsw
ich、MA)を用いて一晩消化した。消化したDNAを、DNA Clean&Con
centrator(商標)−25(ZYMO Research、Orange、CA
)を用いて精製した後に、GenomeWalker(商標)アダプタにライゲーション
して、GenomeWalker(商標)ライブラリーを構築した。各GenomeWa
lker(商標)ライブラリーを、キットで提供されるアダプタプライマーAP1と、各
構築物特異的プライマー5End3812_Aおよび3End3812_Cとを用いる1
次PCR増幅のためのDNA鋳型として用いた。1マイクロリットルの1:25希釈の1
次PCR反応物を、次いで、ネステッドアダプタプライマーAP2と、各ネステッド構築
物特異的プライマー5End3812_Bと3End3812_Dとを用いる2次PCR
増幅のための鋳型として用いた。TaKaRa LA Taq(商標)HS(Takar
a Bio Inc.、Shiga、Japan)をPCR増幅において用いた。50μ
LのPCR反応中に、1μLのDNA鋳型、8μLの2.5mM dNTPミックス、0
.2μMの各プライマー、2.5単位のTaKaRa LA Taq(商標)HS DN
Aポリメラーゼ、5μlの10×LA PCRバッファーII(Mg2+プラス)、およ
び1.5μLの25mM MgCl2を用いた。具体的なPCR条件を表5に列挙する。
(Example 3.3)
Genome Walking GenomeWalker (TM) Universal Kit (Clontech Labo
ratsies, Inc. , Mountain View, CA) was used to clone the 5 'and 3' flanking border sequences of corn event DAS-40278-9. AAD-1 corn event DAS-402 according to manufacturer's instructions
Approximately 2.5 μg of genomic DNA from 78-9 was added to EcoRV, StuI (both provided by the kit) or ScaI (New England Biolabs, Ipsw
ich, MA) and digested overnight. The digested DNA is converted into DNA Clean & Con
centerr ™ -25 (ZYMO Research, Orange, CA)
) And then ligated to a GenomeWalker ™ adapter to construct a GenomeWalker ™ library. Each GenomeWa
lker ™ library 1 using adapter primer AP1 provided in the kit and each construct specific primer 5End3812_A and 3End3812_C
Used as DNA template for subsequent PCR amplification. 1 of 1 microliter 1:25 dilution
The secondary PCR reaction is then secondary PCR using nested adapter primer AP2 and each nested construct specific primer 5End3812_B and 3End3812_D.
Used as a template for amplification. TaKaRa LA Taq ™ HS (Takar
a Bio Inc. Shiga, Japan) was used in PCR amplification. 50μ
During the L PCR reaction, 1 μL of DNA template, 8 μL of 2.5 mM dNTP mix, 0
. 2 μM of each primer, 2.5 units of TaKaRa LA Taq ™ HS DN
A polymerase, 5 μl of 10 × LA PCR buffer II (Mg2 + plus), and 1.5 μL of 25 mM MgCl 2 were used. Specific PCR conditions are listed in Table 5.
(実施例3.4)
従来のPCR
標準的なPCRを用いて、トウモロコシイベントDAS−40278−9におけるDN
A挿入断片および境界配列をクローニングして確認した。TaKaRa LA Taq(
商標)(Takara Bio Inc.、Shiga、Japan)、HotStar
Taq DNAポリメラーゼ(Qiagen、Valencia、CA)、Expand
High Fidelity PCRシステム(Roche Diagnostics
,Inc.、Indianapolis、IN)またはEasy−A(登録商標)Hig
h−Fidelity PCRクローニング酵素&マスターミックス(Stratage
ne、LaJolla、CA)を、製造者が推奨する手順に従う従来のPCR増幅のため
に用いた。具体的なPCR条件およびアンプリコンの説明を、表6に列挙する。
(Example 3.4)
Conventional PCR
DN at corn event DAS-40278-9 using standard PCR
The A insert and border sequence were cloned and confirmed. TaKaRa LA Taq (
Trademark) (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), HotStar
Taq DNA polymerase (Qiagen, Valencia, CA), Expand
High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics)
, Inc. , Indianapolis, IN) or Easy-A® Hig
h-Fidelity PCR Cloning Enzyme & Master Mix (Strataage
ne, LaJolla, CA) was used for conventional PCR amplification following the manufacturer's recommended procedure. Specific PCR conditions and amplicon descriptions are listed in Table 6.
(実施例3.5)
PCR生成物の検出、精製、PCR生成物のサブクローニングおよび配列決定
PCR生成物を、製品の使用説明に従って、1.2%または2%E−ゲル(Invit
rogen、Carlsbad、CA)を用いる電気泳動により調査した。断片サイズを
、DNAマーカーとの比較により見積もった。必要であれば、PCR断片を、臭化エチジ
ウムで染色した1×TBE中の1%アガロースゲルからQIAquickゲル抽出キット
(Qiagen、Carlsbad、CA)を用いて断片を切り出すことにより精製した
。
(Example 3.5)
PCR product detection, purification, PCR product subcloning and sequencing PCR products were purified according to product instructions according to product instructions 1.2% or 2% E-gel (Invit
rogen, Carlsbad, CA). Fragment size was estimated by comparison with DNA markers. If necessary, PCR fragments were purified by excising the fragments from a 1% agarose gel in 1 × TBE stained with ethidium bromide using a QIAquick gel extraction kit (Qiagen, Carlsbad, Calif.).
PCR断片を、pCR(登録商標)4−TOPO(登録商標)中に、配列決定のための
TOPO TA Cloning(登録商標)キット(Invitrogen、Carl
sbad、CA)を製品の使用説明に従って用いることによりサブクローニングした。具
体的には、2〜5マイクロリットルのTOPO(登録商標)クローニング反応を、One
Shot化学的コンピテントTOP10細胞に、製造者の使用説明に従って形質転換し
た。クローニングされた断片は、プラスミドDNA(QIAprepスピンミニプレップ
キット、Qiagen、Carlsbad、CA)の少量調製と、その後のEcoRIで
の制限消化またはキットで提供されるT3およびT7プライマーを用いる直接のコロニー
PCRにより確認した。プラスミドDNAまたは選択されたコロニーのグリセロールスト
ックを、次いで、配列決定に送った。
PCR fragments were placed in pCR®4-TOPO® in a TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen, Carl for sequencing).
sbad, CA) was subcloned by using according to product instructions. Specifically, 2-5 microliters of TOPO® cloning reaction was performed with One
Shot chemically competent TOP10 cells were transformed according to the manufacturer's instructions. Cloned fragments were prepared by small-scale preparation of plasmid DNA (QIAprep spin miniprep kit, Qiagen, Carlsbad, Calif.) Followed by restriction digestion with EcoRI or direct colony PCR using the T3 and T7 primers provided in the kit. confirmed. Plasmid DNA or glycerol stocks of selected colonies were then sent for sequencing.
サブクローニングの後に、推定標的PCR生成物を、まず配列決定して、予測されるD
NA断片がクローニングされていることを確認した。適当なDNA配列を含有するコロニ
ーを、プライマーウォーキングのために選択して、完全なDNA配列を決定した。配列決
定は、Cogenics(Houston、TX)により行った。
After subcloning, the putative target PCR product is first sequenced to produce the predicted D
It was confirmed that the NA fragment was cloned. Colonies containing the appropriate DNA sequence were selected for primer walking to determine the complete DNA sequence. Sequencing was performed by Cogenics (Houston, TX).
挿入断片および境界配列の最終的な組み立てを、Sequencherソフトウェア(
バージョン4.8 Gene Codes Corporation、Ann Arbo
r、MI)を用いて完了した。トウモロコシイベントDAS−40278−9の挿入断片
および境界配列のアノテーションは、Vector NTI(バージョン10および11
、Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて行った。
The final assembly of the insert and border sequence was performed using the Sequencher software (
Version 4.8 Gene Codes Corporation, Ann Arbo
r, MI). The insert and border sequence annotation of corn event DAS-40278-9 is Vector NTI (versions 10 and 11).
, Invitrogen, Carlsbad, CA).
相同性検索は、BLASTプログラムをGenBankデータベースに対して用いて行
った。Vector NTI(バージョン11、Invitrogen)を用いるオープ
ンリーディングフレーム(ORF)解析を行って、完全な挿入断片およびフランキング境
界配列におけるORF(>=200コドン)を同定した。
Homology searches were performed using the BLAST program against the GenBank database. Open reading frame (ORF) analysis using Vector NTI (version 11, Invitrogen) was performed to identify the complete insert and the ORF (> = 200 codons) in the flanking boundary sequence.
(実施例3.6)
5’末端境界配列
DNA断片を、各トウモロコシイベントDAS−40278−9 GenomeWal
ker(商標)ライブラリーから、導入遺伝子の5’末端についての特異的ネステッドプ
ライマーセットを用いて増幅した。およそ800bpのPCR生成物が、イベントDAS
−40278−9 EcoRVおよびStuI GenomeWalker(商標)ライ
ブラリーの両方から観察された。ScaI GenomeWalker(商標)ライブラ
リーは、約2kbの生成物を生じた。断片をpCR(登録商標)4−TOPO(登録商標
)にクローニングし、各ライブラリーからの6つのコロニーを、末端の配列決定のために
無作為に採取して、挿入断片が予測される配列を含有することを確認した。挿入断片のプ
ライマーウォーキングによる完全な配列決定により、トウモロコシイベントDAS−40
278−9 StuI、EcoRVおよびScaI GenomeWalker(商標)
ライブラリーから増幅される断片が、それぞれ793、822および2132bpであっ
たことが明らかになった。StuIおよびEcoRV GenomeWalker(商標
)ライブラリーから作製したDNA断片は、ScaI GenomeWalker(商標
)ライブラリーから作製したDNA断片と100%一致し、このことは、これらのDNA
断片が、導入遺伝子挿入断片の5’領域から増幅されたことを示唆した。得られた187
3bpのトウモロコシゲノム配列のBLAST検索は、トウモロコシBACクローンの配
列と高い類似性を示した。さらに、挿入接合部の配列解析は、917bpのMAR v3
が、その5’末端領域にて、プラスミドpDAS1740/FspI断片と比較して切断
され、aad−1発現カセットの5’領域にて259bpの部分MAR v3が残ってい
ることを示した。
(Example 3.6)
The 5 ′ end border sequence DNA fragment was transferred to each corn event DAS-40278-9 GenomeWal.
Amplified from the ker ™ library using a specific nested primer set for the 5 ′ end of the transgene. An approximately 800 bp PCR product is generated at the event DAS.
-40278-9 Observed from both EcoRV and StuI GenomeWalker ™ libraries. The ScaI GenomeWalker ™ library yielded a product of approximately 2 kb. Fragments were cloned into pCR®4-TOPO® and 6 colonies from each library were randomly picked for terminal sequencing to determine the sequence from which the insert was predicted. It was confirmed to contain. Complete sequencing by primer walking of the insert resulted in a corn event DAS-40.
278-9 StuI, EcoRV and ScaI GenomeWalker ™
It was revealed that the fragments amplified from the library were 793, 822 and 2132 bp, respectively. The DNA fragments generated from the StuI and EcoRV GenomeWalker ™ libraries are 100% identical to the DNA fragments generated from the ScaI GenomeWalker ™ libraries, indicating that these DNAs
It was suggested that the fragment was amplified from the 5 ′ region of the transgene insert. 187 obtained
A BLAST search of the 3 bp maize genomic sequence showed high similarity to the sequence of the maize BAC clone. In addition, sequence analysis of the insertion junction was performed using a 917 bp MAR v3
Was cleaved at its 5 ′ end region compared to the plasmid pDAS1740 / FspI fragment, indicating that a 259 bp partial MAR v3 remained in the 5 ′ region of the aad-1 expression cassette.
(実施例3.7)
3’末端境界配列
およそ3kbのサイズのDNA断片を、トウモロコシイベントDAS−40278−9
StuI GenomeWalker(商標)ライブラリーから、導入遺伝子の3’末
端についての特異的ネステッドプライマーセットを用いて増幅した。DNA断片を、pC
R(登録商標)4−TOPO(登録商標)にクローニングし、10のコロニーを、末端の
配列決定のために無作為に採取して、予測される配列の挿入を確認した。予測される挿入
断片を有する3つのクローンを完全に配列決定し、2997bpのDNA断片を産出した
。このDNA断片の配列解析により、部分MAR v4要素(その5’領域の70bpを
欠く)および1867bpのトウモロコシゲノム配列が明らかになった。BLAST検索
は、1867bpのゲノムDNA配列が、5’境界配列で同定されたのと同じトウモロコ
シBACクローンにおける配列と100%一致したことを示した。
(Example 3.7)
3 ′ terminal border sequence A DNA fragment of approximately 3 kb in size was ligated to a corn event DAS-40278-9.
Amplified from the StuI GenomeWalker ™ library using a specific nested primer set for the 3 ′ end of the transgene. The DNA fragment is designated as pC
Cloned into R®4-TOPO® and 10 colonies were randomly picked for terminal sequencing to confirm the expected sequence insertion. Three clones with the expected insert were fully sequenced to yield a 2997 bp DNA fragment. Sequence analysis of this DNA fragment revealed a partial MAR v4 element (lacking 70 bp of its 5 ′ region) and a 1867 bp maize genomic sequence. A BLAST search showed that the 1867 bp genomic DNA sequence was 100% identical to the sequence in the same maize BAC clone identified at the 5 'border sequence.
(実施例3.8)
DNA挿入断片および接合部配列
DNA挿入断片および接合部領域を、トウモロコシイベントDAS−40278−9か
ら、以前に記載したようなPCRに基づく方法を用いてクローニングした。5つのプライ
マー対を、5’および3’フランキング境界配列と予測される導入遺伝子配列とに基づい
て設計した。合計で、5つのオーバーラップDNA断片(1767bpのアンプリコン1
、1703bpのアンプリコン2、1700bpのアンプリコン3、1984bpのアン
プリコン4および1484bpのアンプリコン5)をクローニングし、配列決定した(図
4)。全体の挿入断片およびフランキング境界配列を、5つの断片のうちのオーバーラッ
プ配列に基づいて組み立てた。最終的な配列では、pDAS1740/FspIに由来す
る4816bpのDNA挿入断片、1873bpの5’フランキング境界配列および18
68bpの3’フランキング境界配列の存在が確認される。4816bpのDNA挿入断
片は、インタクトなaad−1発現カセット、5’末端に259bpの部分MAR v3
および3’末端に1096bpの部分MAR v4を含有する(配列番号29)。
(Example 3.8)
DNA insert and junction sequence The DNA insert and junction region were cloned from the corn event DAS-40278-9 using a PCR-based method as previously described. Five primer pairs were designed based on the 5 ′ and 3 ′ flanking border sequences and the predicted transgene sequence. In total, five overlapping DNA fragments (1767 bp amplicon 1
1703 bp amplicon 2, 1700 bp amplicon 3, 1984 bp amplicon 4 and 1484 bp amplicon 5) were cloned and sequenced (FIG. 4). The entire insert and flanking boundary sequence was assembled based on the overlapping sequence of the five fragments. In the final sequence, the 4816 bp DNA insert from pDAS1740 / FspI, the 1873 bp 5 'flanking border sequence and 18
The presence of a 68 bp 3 'flanking boundary sequence is confirmed. The 4816 bp DNA insert is an intact aad-1 expression cassette, a 259 bp partial MAR v3 at the 5 ′ end.
And contains a 1096 bp partial MAR v4 at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 29).
各プライマー対について少なくとも2つのクローンを、プライマーウォーキングのため
に用いて、DNA挿入断片およびその境界配列についての完全な配列情報を得た。配列解
析は、5’組み込み接合部にて、トウモロコシゲノムDNAとpDAS1740/Fsp
Iからの組み込まれた部分MAR v3との間に21bpの挿入を示した。BLAST検
索およびVector NTI解析の結果は、21bpの挿入DNAが、いずれの植物種
のDNAまたはpDAS1740プラスミドDNAとも相同性を示さなかったことを示し
た。単一塩基対挿入が、3’組み込み接合部にて、トウモロコシゲノムDNAとpDAS
1740/FspIからの部分MAR v4との間に見出された。DNAの組み込みは、
トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座にて2塩基対の欠失ももたらした(図6)。さらに、
5212bpの位置にて1つのヌクレオチドの相違(TからC)が、DNA挿入断片の非
翻訳3’UTR領域において観察された(配列番号29)。しかし、これらの変化のいず
れも、aad−1発現にとって重要でなく、DAS−40278−9の挿入断片において
接合部にわたっていずれの新しいORF(>=200コドン)も創出しないとみられる。
At least two clones for each primer pair were used for primer walking to obtain complete sequence information about the DNA insert and its border sequences. Sequence analysis was performed at the 5 'integration junction with maize genomic DNA and pDAS1740 / Fsp.
An insertion of 21 bp was shown between the incorporated part MAR v3 from I. The results of BLAST search and Vector NTI analysis showed that the 21 bp insert DNA showed no homology with any plant species DNA or pDAS1740 plasmid DNA. A single base pair insertion is made at the 3 'integration junction with maize genomic DNA and pDAS.
Found between the partial MAR v4 from 1740 / FspI. DNA integration
It also resulted in a 2 base pair deletion at the insertion locus of the maize genome (Figure 6). further,
A single nucleotide difference (T to C) at position 5212 bp was observed in the untranslated 3′UTR region of the DNA insert (SEQ ID NO: 29). However, none of these changes appear to be important for aad-1 expression and do not appear to create any new ORF (> = 200 codons) across the junction in the insert of DAS-40278-9.
(実施例3.9)
トウモロコシゲノム配列の確認
トウモロコシゲノムにおけるイベントDAS−40278−9導入遺伝子の挿入部位を
確認するために、PCR増幅を、異なるプライマー対を用いて行った(図4)。イベント
DAS−40278−9およびその他のトランスジェニックまたは非トランスジェニック
トウモロコシ系統からのゲノムDNAを鋳型として用いた。2つのaad−1特異的プラ
イマーであるAI5End01およびAI5End02と、5’末端境界配列に基づいて
設計した2つのプライマーである1F5End01および1F5End02とを用いて、
aad−1遺伝子が5’末端境界領域に及ぶDNA断片を増幅した。同様に、aad−1
が3’末端境界配列に及ぶDNA断片を増幅するために、3’末端境界配列に由来する1
F3End05プライマーと、aad−1特異的AI3End01プライマーとを用いた
。予測されるサイズのDNA断片は、AAD−1トウモロコシイベントDAS−4027
8−9のゲノムDNAからのみ、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−
9のフランキング境界にある一方のプライマーと、一方のaad−1特異的プライマーと
からなる各プライマー対を用いて増幅された。対照DNA試料は、同じプライマー対を用
いてPCR生成物を生じず、このことは、クローニングされた5’末端および3’末端の
境界配列が、実際に、挿入されたaad−1遺伝子構築物のそれぞれ上流および下流の配
列であることを示した。約8kbのサイズのかすかなバンドが、AAD−1トウモロコシ
イベントDAS−40278−9、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40474
および非トランスジェニックトウモロコシ系統XHH13を含む全てのトウモロコシ試料
から、1F5End01およびAI5End01のプライマー対をPCR増幅に用いた場
合に観察されたことに注意されたい。観察されたかすかなバンド(調製したゲル上で)は
、このプライマー対を用いてのトウモロコシゲノムにおける非特異的増幅の結果であり得
る。
(Example 3.9)
Confirmation of Maize Genomic Sequence To confirm the insertion site of the event DAS-40278-9 transgene in the maize genome, PCR amplification was performed using different primer pairs (FIG. 4). Genomic DNA from event DAS-40278-9 and other transgenic or non-transgenic corn lines was used as a template. Using two aad-1 specific primers AI5End01 and AI5End02 and two primers 1F5End01 and 1F5End02 designed based on the 5 ′ end border sequence,
A DNA fragment in which the aad-1 gene spanned the 5 ′ end border region was amplified. Similarly, aad-1
In order to amplify a DNA fragment spanning the 3 ′ end border sequence 1
F3End05 primer and aad-1 specific AI3End01 primer were used. The DNA fragment of the expected size is the AAD-1 corn event DAS-4027.
AAD-1 corn event DAS-40278 only from 8-9 genomic DNA
Amplification was performed using each primer pair consisting of one primer at the 9 flanking boundaries and one aad-1 specific primer. The control DNA sample does not yield a PCR product using the same primer pair, which means that the cloned 5 'and 3' end border sequences are actually in each of the inserted aad-1 gene constructs. It was shown to be upstream and downstream sequences. A faint band of about 8 kb in size is shown in AAD-1 corn event DAS-40278-9, AAD-1 corn event DAS-40474.
Note that from all corn samples including the non-transgenic corn line XHH13, it was observed when the 1F5End01 and AI5End01 primer pairs were used for PCR amplification. The faint band observed (on the prepared gel) may be the result of non-specific amplification in the corn genome using this primer pair.
トウモロコシゲノムにおけるDNA挿入をさらに確認するために、5’末端境界配列に
ある2つのプライマー1F5End03および1F5End04と、3’末端境界配列に
ある2つのプライマー1F3End03および1F3End04とを用いて、挿入遺伝子
座に及ぶDNA断片を増幅した。プライマー対1F5End03/1F3End03また
はプライマー対1F5End04/1F3End04のいずれかを用いたPCR増幅によ
り、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9のゲノムDNAからおよそ
8kbの予測されるサイズを有する断片が得られた。これとは対照的に、AAD−1トウ
モロコシイベントDAS−40474−7または非トランスジェニックトウモロコシ系統
XHH13のゲノムDNAからは、PCR生成物は得られなかった。AAD−1トウモロ
コシイベントDAS−40278−9およびイベントDAS−40474−7がHiII
の形質転換と、その後の元のトランスジェニックイベントのトウモロコシ系統XHH13
との戻し交雑により作製されたことに鑑みて、これらの2つのイベントのそれぞれにおけ
るゲノムの大部分は、トウモロコシ系統XHH13に理論的に由来する。aad−1導入
遺伝子に近いフランキング境界配列だけが、元のゲノムDNAから持ち越され、AAD−
1イベント遺伝子移入プロセス中に保存されたが、ゲノム配列のその他の領域は、XHH
13のゲノム配列により置き換えられたと考えられる。したがって、AAD−1トウモロ
コシイベントDAS−40474−7およびXHH13のゲノムDNAから、プライマー
対1F5End03/1F3End03またはプライマー対1F5End04/1F3E
nd04のいずれを用いても断片が増幅されなかったことは、驚くことではない。およそ
3.1および3.3kbの断片が、プライマー対1F5End03/1F3End03お
よび1F5End04/1F3End04をそれぞれ用いて、トウモロコシ系統HiII
およびB73のゲノムDNAから増幅されたが、トウモロコシ系統A188では増幅され
なかった。この結果は、境界配列がトウモロコシ系統B73のゲノムを起源とすることを
示す。
To further confirm DNA insertion in the maize genome, the two primers 1F5End03 and 1F5End04 at the 5 ′ end border sequence and two primers 1F3End03 and 1F3End04 at the 3 ′ end border sequence are used to span the insertion locus The DNA fragment was amplified. PCR amplification with either primer pair 1F5End03 / 1F3End03 or primer pair 1F5End04 / 1F3End04 resulted in a fragment with an expected size of approximately 8 kb from genomic DNA of AAD-1 corn event DAS-40278-9. In contrast, no PCR product was obtained from genomic DNA of AAD-1 corn event DAS-40474-7 or non-transgenic corn line XHH13. AAD-1 Corn Event DAS-40278-9 and Event DAS-40474-7 are HiII
And subsequent maize line XHH13 of the original transgenic event
The majority of the genome in each of these two events is theoretically derived from the maize line XHH13. Only the flanking border sequences close to the aad-1 transgene are carried over from the original genomic DNA and AAD-
Although preserved during the one-event gene transfer process, other regions of the genomic sequence are XHH
It is thought that it was replaced by 13 genome sequences. Thus, from genomic DNA of AAD-1 corn event DAS-40474-7 and XHH13, primer pair 1F5End03 / 1F3End03 or primer pair 1F5End04 / 1F3E
It is not surprising that no fragment was amplified using any of nd04. The approximately 3.1 and 3.3 kb fragments were transformed into the maize line HiII using the primer pairs 1F5End03 / 1F3End03 and 1F5End04 / 1F3End04, respectively.
And B73 genomic DNA, but not corn line A188. This result indicates that the border sequence originates from the genome of maize line B73.
B73/HiIIからのトウモロコシゲノムDNAのさらなるクローニングを行って、
フランキング境界配列の正当性を確実にした。PCR増幅断片を配列決定して、B73/
HiIIゲノムDNAの特定の場所に組み込まれた挿入DNA領域を証明した。プライマ
ーは、得られた配列に基づいて設計した。プライマーセットAmp1F/Amp5Rを用
いて、天然B73/HiIIゲノムからの5’から3’の接合部に及ぶ、挿入DNAを有
さない2212bpの断片を増幅した。配列解析により、導入遺伝子挿入遺伝子座におい
て天然B73ゲノムから2塩基対の欠失があったことが明らかになった。クローニングさ
れた天然B73ゲノム断片からのDNA配列の解析は、1つのORF(>=200コドン
)が3’組み込み接合部領域の下流にあることを同定した。さらに、AAD−1トウモロ
コシイベントDAS−40278−9が組み込まれた元の遺伝子座にわたって、その他の
ORFは存在しない。BLAST検索によっても、イベントDAS40278−9からの
5’末端および3’末端の両方の境界配列が、同じトウモロコシBACクローン上で隣同
士にあることが確認された。
Further cloning of maize genomic DNA from B73 / HiII,
The validity of the flanking boundary sequence was ensured. The PCR amplified fragment was sequenced and B73 /
The insert DNA region integrated at a specific location in the HiII genomic DNA was verified. Primers were designed based on the resulting sequences. The primer set Amp1F / Amp5R was used to amplify a 2212 bp fragment without insert DNA spanning the 5 ′ to 3 ′ junction from the native B73 / HiII genome. Sequence analysis revealed that there was a 2 base pair deletion from the native B73 genome at the transgene insertion locus. Analysis of the DNA sequence from the cloned native B73 genomic fragment identified that one ORF (> = 200 codons) was downstream of the 3 ′ integration junction region. Furthermore, there are no other ORFs across the original locus that incorporated the AAD-1 corn event DAS-40278-9. A BLAST search also confirmed that both 5 'and 3' end border sequences from event DAS40278-9 are next to each other on the same maize BAC clone.
AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9の5’組み込み接合部の独自
性に鑑みて、特異的PCRプライマーの2つの対である1F5EndT1F/1F5En
dT1RおよびCorn278−F/Corn278−Rを設計して、この挿入断片から
植物ゲノムへの接合部を増幅した。予想されたように、所望のDNA断片は、AAD−1
トウモロコシイベントDAS−40278−9のゲノムDNAでのみ生じたが、いずれの
その他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックトウモロコシ系統では生じなか
った。したがって、これらの2つのプライマー対は、AAD−1トウモロコシイベントD
AS−40278−9イベント特異的な識別子として用いることができる。
In view of the uniqueness of the 5 ′ integration junction of AAD-1 corn event DAS-40278-9, two pairs of specific PCR primers, 1F5EndT1F / 1F5En
dT1R and Corn278-F / Corn278-R were designed to amplify the junction from this insert to the plant genome. As expected, the desired DNA fragment is AAD-1.
It occurred only with the genomic DNA of corn event DAS-40278-9, but not with any other transgenic or non-transgenic corn line. Therefore, these two primer pairs are AAD-1 corn event D
AS-40278-9 can be used as an event specific identifier.
DAS−40278−9のフランキングSSRマーカーによるゲノムの特徴決定
ゲノム挿入部位を特徴決定して示すために、挿入断片の近傍にあるマーカー配列を決定
した。多形SSRマーカーのパネルを用いて、導入遺伝子の場所を同定して地図にした。
イベントpDAS1740−278は、第2染色体上で、2008DASトウモロコシ連
鎖地図上のおよそ20cMにてSSRマーカーであるUMC1265とMMC0111と
の間のおよそ20cMにある。表6に、導入遺伝子pDAS1740−278の近傍にあ
ると見出されるこれらの2つのマーカーについてのプライマー情報をまとめる。
Genomic characterization with the DAS-40278-9 flanking SSR marker To characterize and show the genomic insertion site, a marker sequence in the vicinity of the insert was determined. A panel of polymorphic SSR markers was used to identify and map the location of the transgene.
Event pDAS 1740-278 is located on chromosome 2 at approximately 20 cM between SMC markers UMC1265 and MMC0111 at approximately 20 cM on the 2008DAS maize linkage map. Table 6 summarizes primer information for these two markers found to be in the vicinity of the transgene pDAS 1740-278.
(実施例4.1)
gDNA単離
gDNAを、葉の押し抜きからDNEasy 96植物テストキット(Qiagen、
Valencia、California)を用いて抽出した。プロトコールを改変して
、自動化のために適応させた。単離されたgDNAを、Molecular Probe
s,Inc.(Eugene、OR)からのPicoGreen(登録商標)色素を用い
て定量した。gDNAの濃度を、全ての試料について5ng/μlに、滅菌脱イオン水を
用いて希釈した。
(Example 4.1)
gDNA Isolation gDNA was extracted from leaf punches with the DNeasy 96 plant test kit (Qiagen,
(Valencia, California). The protocol was modified and adapted for automation. The isolated gDNA was purified from a molecular probe.
s, Inc. Quantified using PicoGreen® dye from (Eugene, OR). The concentration of gDNA was diluted with sterile deionized water to 5 ng / μl for all samples.
(実施例4.2)
マーカーを用いるgDNAのスクリーニング
希釈したgDNAの遺伝子型を、単純配列反復(SSR)マーカーのサブセットを用い
て決定した。SSRマーカーを、Applied Biosystems(Foster
City、California)で、6−FAM、HEX/VICまたはNED(そ
れぞれ青、緑および黄色)の蛍光タグで標識したフォワードプライマーを用いて合成した
。マーカーをそれらの蛍光タグおよびアンプリコンサイズに基づいて群またはパネルに分
けて、PCR後の多重化および分析を容易にした。
(Example 4.2)
Screening gDNA using markers The genotype of diluted gDNA was determined using a subset of simple sequence repeat (SSR) markers. The SSR marker was applied to Applied Biosystems (Foster
Citi, California) was synthesized using forward primers labeled with 6-FAM, HEX / VIC or NED (blue, green and yellow, respectively) fluorescent tags. Markers were divided into groups or panels based on their fluorescent tag and amplicon size to facilitate post-PCR multiplexing and analysis.
PCRを、384ウェルアッセイプレートにおいて、5ngのゲノムDNA、1.25
×PCRバッファー(Qiagen、Valencia、California)、0.
20μMの各フォワードおよびリバースプライマー、1.25mM MgCl2、0.0
15mMの各dNTPならびに0.3単位のHotStart Taq DNAポリメラ
ーゼ(Qiagen、Valencia、California)を含有する各反応で行
った。増幅は、GeneAmp PCRシステム9700において、384−二重ヘッド
モジュール(Applied Biosystems、Foster City、Cal
ifornia)を用いて行った。増幅プログラムは、次のとおりであった:(1)95
℃にて12分間のTaqの最初の活性化、(2)94℃にて30秒、(3)55℃にて3
0秒、(4)72℃にて30秒、(5)ステップ2〜4を40サイクル反復、そして(6
)72℃にて30分間の最終伸長。各SSRマーカーパネルについてのPCR生成物を、
同じ植物からの2μlの各PCR生成物を合計容量60μlの滅菌脱イオン水に加えるこ
とにより一緒に多重化した。多重化したPCR生成物のうち、0.5μlを、1:100
比率のGeneScan500塩基対LIZサイズ標準物質およびABI HiDiホル
ムアミド(Applied Biosystems、Foster City、Cali
fornia)を含む5μlのローディングバッファーを含有する384ウェルローディ
ングプレートにスタンプした(stamped)。試料を、次いで、ABI Prism 37
30xl DNAアナライザ(Applied Biosystems、Foster
City、California)に、製造者の推奨を用いて36分間の全運転時間でキ
ャピラリー電気泳動のために載せた。マーカーのデータは、ABI Prism 373
0xl自動化シーケンサーデータ収集ソフトウェアバージョン4.0により収集し、Ge
neMapper4.0ソフトウェア(Applied Biosystems)により
、対立遺伝子特徴決定および断片サイズ標識について収集した。
PCR was performed in a 384 well assay plate with 5 ng genomic DNA, 1.25
X PCR buffer (Qiagen, Valencia, California), 0.
20 μM each forward and reverse primer, 1.25 mM MgCl 2 , 0.0
It was performed in each reaction containing 15 mM of each dNTP and 0.3 units of HotStart Taq DNA polymerase (Qiagen, Valencia, California). Amplification was performed in a GeneAmp PCR system 9700 using a 384-duplex head module (Applied Biosystems, Foster City, Cal.
ifonia). The amplification program was as follows: (1) 95
Initial activation of Taq for 12 minutes at ° C. (2) 30 seconds at 94 ° C., (3) 3 hours at 55 ° C.
0 seconds, (4) 30 seconds at 72 ° C, (5) repeat steps 2-4 for 40 cycles, and (6
) Final extension for 30 minutes at 72 ° C. The PCR product for each SSR marker panel is
2 μl of each PCR product from the same plant was multiplexed together by adding to a total volume of 60 μl of sterile deionized water. Of the multiplexed PCR product, 0.5 μl was added 1: 100
Ratios of GeneScan 500 base pair LIZ size standards and ABI HiDi formamide (Applied Biosystems, Foster City, Calif.
stamped into a 384 well loading plate containing 5 μl of loading buffer. Samples were then ABI Prism 37
30xl DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster
(City, California) was loaded for capillary electrophoresis with a total run time of 36 minutes using manufacturer's recommendations. Marker data is from ABI Prism 373
Collected by 0xl automated sequencer data collection software version 4.0, Ge
Collected for allelic characterization and fragment size labeling with neMapper 4.0 software (Applied Biosystems).
(実施例4.3)
SSRマーカーの結果
導入遺伝子の近傍で同定されたフランキングマーカーについてのプライマーデータを、
表6に列挙する。2つの緊密に関連するマーカーであるUMC1265およびMMC01
11は、第2染色体上の導入遺伝子挿入断片からおよそ20cM離れて配置される。
(Example 4.3)
SSR marker results Primer data for flanking markers identified in the vicinity of the transgene,
Listed in Table 6. Two closely related markers, UMC1265 and MMC01
11 is located approximately 20 cM away from the transgene insert on chromosome 2.
イベントDAS−40278−9におけるaad−1タンパク質の特徴決定
トランスジェニックメイズイベントDAS−40278−9に由来する組換えaad−
1タンパク質の生化学的特性を、特徴決定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、クーマシーブルーで染色、および糖タンパク質検
出法)、ウェスタンブロット、免疫診断テストストリップアッセイ、マトリクス支援レー
ザ脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)およびタンデムMS
によるタンパク質配列決定解析を用いて、タンパク質の生化学的特性を特徴決定した。
Characterization of aad-1 protein at event DAS-40278-9 Recombinant aad- from transgenic maize event DAS-40278-9
The biochemical properties of one protein were characterized. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, stained with Coomassie blue, and glycoprotein detection method), Western blot, immunodiagnostic test strip assay, matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI- TOF MS) and tandem MS
Protein sequencing analysis was used to characterize the biochemical properties of the protein.
(実施例5.1)
免疫診断ストリップアッセイ
DAS−40278−9の葉の組織におけるaad−1タンパク質の存在を、Amer
ican Bionosticaからの商業的に調製された免疫診断テストストリップを
用いて確認した。ストリップは、葉の粗抽出物を試験することにより、トランスジェニッ
ク植物と非トランスジェニック植物とを区別できた(データは示さず)。非トランスジェ
ニック抽出物(XHH13)は、検出可能な量の免疫反応性タンパク質を含有しなかった
。この結果は、ウェスタンブロット解析によっても確認された。
(Example 5.1)
Immunodiagnostic strip assay The presence of aad-1 protein in leaf tissue of DAS-40278-9
Confirmed using commercially prepared immunodiagnostic test strips from ican Biostica. Strips were able to distinguish between transgenic and non-transgenic plants by testing crude leaf extracts (data not shown). The non-transgenic extract (XHH13) did not contain a detectable amount of immunoreactive protein. This result was also confirmed by Western blot analysis.
aad−1タンパク質の発現を試験するために、免疫診断ストリップ解析を行った。4
つの葉の押し抜きを、XHH13(対照植物)およびイベントDAS−40278−9の
それぞれの植物から、個別の標識された1.5mLのマイクロフュージチューブのスナッ
プキャップの蓋の間に組織を挟むことにより回収した。実験室で受け取る際に、0.5m
Lのaad−1抽出バッファー(American Bionostica、Swede
sboro、NJ)を各チューブに加え、組織を、使い捨て乳棒を用い、その後、試料を
約10秒間振とうすることによりホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後に、テス
トストリップをチューブに入れ、約5分間展開させた。植物抽出物中のaad−1タンパ
ク質の存在または不在は、免疫診断ストリップ上にテストラインが出現する(または出現
しない)ことに基づいて確認された。aad−1タンパク質の発現がトランスジェニック
イベントについて一旦確認されると、メイズの茎の組織を収穫し、凍結乾燥し、使用時ま
でおよそ−80℃で貯蔵した。
To test the expression of aad-1 protein, an immunodiagnostic strip analysis was performed. 4
Punching one leaf from each plant of XHH13 (control plant) and event DAS-40278-9 by sandwiching the tissue between the snap cap lids of individual labeled 1.5 mL microfuge tubes It was collected. When receiving in the laboratory, 0.5m
L aad-1 extraction buffer (American Bioostica, Sweden)
sboro, NJ) was added to each tube, and the tissue was homogenized by using a disposable pestle and then shaking the sample for about 10 seconds. After homogenization, the test strip was placed in a tube and allowed to develop for about 5 minutes. The presence or absence of aad-1 protein in the plant extract was confirmed based on the appearance (or non-occurrence) of a test line on the immunodiagnostic strip. Once the expression of aad-1 protein was confirmed for the transgenic event, maize stem tissue was harvested, lyophilized, and stored at approximately −80 ° C. until use.
(実施例5.2)
トウモロコシからのaad−1タンパク質の精製
免疫精製されたメイズ由来のaad−1タンパク質(分子量:約33kDa)またはト
ウモロコシ茎組織からの水性粗抽出物を調製した。全ての葉および茎の組織を収穫し、実
験室まで次のようにして輸送した。葉を、ハサミで植物から切断し、布の袋に入れ、将来
の使用のためにおよそ−20℃で貯蔵した。別に、茎を土壌の線のすぐ上で切断し、布の
袋に入れ、およそ−80℃にて約6時間、すぐに凍結させた。茎を、次いで、凍結乾燥器
に5日間いれて水分を除去した。組織が一旦完全に乾燥したら、これらを微細な粉末にド
ライアイスを用いて粉砕し、必要になるまでおよそ−80℃にて貯蔵した。
(Example 5.2)
Purification of aad-1 protein from corn Immunoadjusted maize-derived aad-1 protein (molecular weight: about 33 kDa) or an aqueous crude extract from corn stalk tissue was prepared. All leaf and stem tissues were harvested and transported to the laboratory as follows. The leaves were cut from the plants with scissors, placed in a fabric bag and stored at approximately -20 ° C for future use. Separately, the stems were cut just above the soil line, placed in a cloth bag and immediately frozen at approximately -80 ° C for about 6 hours. The stem was then placed in a lyophilizer for 5 days to remove moisture. Once the tissues were completely dry, they were ground into fine powders using dry ice and stored at approximately -80 ° C until needed.
メイズ由来のaad−1タンパク質を、凍結乾燥した茎の組織から、リン酸塩ベースの
バッファー(バッファー成分について表7を参照されたい)中で、約30グラムの凍結乾
燥組織を、冷却した1000mLのガラスブレンダーに秤量し、500mLの抽出バッフ
ァーを加えることにより抽出した。組織を、ハイで60秒間ブレンドし、可溶性タンパク
質を、試料を30,000×gにて20分間遠心分離することにより採集した。ペレット
を記載されるようにして再抽出し、上清を併せ、0.45μフィルタを通して濾過した。
濾過した上清を、およそ+4℃にて、;CNBr活性化セファロース4B(GE Hea
lthcare、Piscataway、NJ)にコンジュゲートされた、Strate
gic Biosolution Inc.(MAb 473F1 85.1;精製プロ
テインA;ロット#:609.03C−2−4;6.5mg/mL(合計約35.2mg
))(Windham、ME)により調製されたモノクローナル抗体とコンジュゲートさ
れた抗aad−1免疫親和性カラムに載せた。未結合タンパク質を回収し、カラムを予め
冷却した20mM重炭酸アンモニウムバッファーpH8.0で十分に洗浄した。結合した
タンパク質は、3.5M NaSCN(Sigma、St.Louis、MO)、50m
M Tris(Sigma、St.Louis、MO)pH8.0バッファーを用いて溶
出された。7つの5mL画分を回収し、画分番号2→7を一晩、およそ+4℃にて10m
M Tris、pH8.0バッファーに対して透析した。画分をSDS−PAGEおよび
ウェスタンブロットにより調べ、残りの試料をおよそ+4℃にて、その後の解析に用いる
まで貯蔵した。
The maize-derived aad-1 protein was lyophilized from lyophilized stem tissue in phosphate-based buffer (see Table 7 for buffer components). Weighed into a glass blender and extracted by adding 500 mL extraction buffer. Tissues were blended high for 60 seconds and soluble protein was collected by centrifuging samples at 30,000 xg for 20 minutes. The pellet was re-extracted as described and the supernatants were combined and filtered through a 0.45μ filter.
The filtered supernatant was at approximately + 4 ° C; CNBr activated Sepharose 4B (GE Hea
lthcare, Piscataway, NJ)
gic Biosolution Inc. (MAb 473F1 85.1; Purified Protein A; Lot #: 609.03C-2-4; 6.5 mg / mL (total approximately 35.2 mg
)) Loaded onto an anti-adad-1 immunoaffinity column conjugated with a monoclonal antibody prepared by (Windham, ME). Unbound protein was recovered and the column was washed thoroughly with pre-cooled 20 mM ammonium bicarbonate buffer pH 8.0. Bound protein was 3.5M NaSCN (Sigma, St. Louis, MO), 50m
Eluted with M Tris (Sigma, St. Louis, MO) pH 8.0 buffer. Seven 5 mL fractions were collected and fraction number 2 → 7 was 10 m overnight at approximately + 4 ° C.
Dialyzed against M Tris, pH 8.0 buffer. Fractions were examined by SDS-PAGE and Western blot and the remaining samples were stored at approximately + 4 ° C. until used for further analysis.
免疫親和性カラムと結合したタンパク質をSDSPAGEにより調べ、結果は、溶出さ
れた画分が、aad−1タンパク質を、33kDaのおおよその分子量で含有したことを
示した。さらに、ウェスタンブロットも行って、これは、aad−1タンパク質について
陽性であった。メイズ由来aad−1タンパク質を、約30gの凍結乾燥茎材料から単離
した。
Proteins bound to the immunoaffinity column were examined by SDS PAGE and the results showed that the eluted fraction contained the aad-1 protein at an approximate molecular weight of 33 kDa. In addition, a Western blot was performed, which was positive for aad-1 protein. The maize-derived aad-1 protein was isolated from approximately 30 g of lyophilized stem material.
(実施例5.3)
SDS−PAGEおよびウェスタンブロット
イベントDAS−40278−9およびXHH13の茎からの凍結乾燥組織(約100
mg)を2mLマイクロフュージチューブに秤量し、10%植物プロテアーゼ阻害剤カク
テル(Sigma、St.Louis、MO)を含有する約1mLのPBST(Sigm
a、St.Louis、MO)で抽出した。抽出は、4つの小さいボールベアリングを加
え、試料を1分間Geno粉砕することにより容易にした。粉砕の後に、試料を20,0
00×gにて5分間遠心分離し、上清を4:1で5×Laemmliサンプルバッファー
(2%SDS、50mM Tris pH6.8、0.2mg/mLブロモフェノールブ
ルー、10%の新しく加えた2−メルカプトエタノールを含有する50%(w/w)グリ
セロール)と混合し、約100℃にて5分間加熱した。短い遠心分離の後に、45μLの
上清を、Criterionセルゲルモジュールに装着されたBioRad Crite
rion SDS−PAGEゲル(Bio−Rad、Hercules、CA)に直接載
せた。微生物由来aad−1の陽性の参照標準物質を、1mg/mLにてPBST pH
7.4に再懸濁し、PBSTでさらに希釈した。試料を、次いで、Bio−Rad La
emmliバッファーと5%2−メルカプトエタノールとともに混合し、前に記載するよ
うにして処理した。電気泳動は、Tris/グリシン/SDSバッファー(Bio−Ra
d、Hercules、CA)を用いて、150〜200Vの電圧で、前方の色素がゲル
の端に到達するまで行った。分離の後に、ゲルを半分に切断し、一方の半分を、Pier
ce GelCode Blueタンパク質染色を用いて染色し、他方の半分を、ニトロ
セルロースメンブレン(Bio−Rad、Hercules、CA)に、Miniトラン
スブロット電気トランスファーセル(Bio−Rad、Hercules、CA)を60
分間、100ボルトの一定電圧の下で用いてエレクトロブロットした。トランスファーバ
ッファーは、20%メタノールおよびBio−RadからのTris/グリシンバッファ
ーを含有していた。免疫検出のために、メンブレンを、aad−1特異的ポリクローナル
ウサギ抗体(Strategic Biosolution Inc.、Newark、
DE、プロテインA精製ウサギポリクローナル抗体ロット#:DAS F1 197−1
5 1、1.6mg/mL)でプローブ付加した。ヤギ抗ウサギIgG(H+L)とアル
カリホスファターゼ(Pierce Chemical、Rockford、IL)との
コンジュゲートを2次抗体として用いた。SigmaFast BCIP/NBT基質を
、免疫反応性タンパク質バンドを現像して視覚化するために用いた。メンブレンを水で十
分に洗浄して反応を停止させ、結果の記録を、デジタルスキャナ(Hewlett Pa
ckard、Palo Alto、CA)を用いて取得した。
(Example 5.3)
SDS-PAGE and Western Blot Lyophilized tissue from stems of events DAS-40278-9 and XHH13 (approximately 100
mg) into a 2 mL microfuge tube and about 1 mL PBST (Sigma) containing 10% plant protease inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO).
a, St. (Louis, MO). Extraction was facilitated by adding 4 small ball bearings and Geno grinding the sample for 1 minute. After grinding, the sample is 20,000
Centrifugation at 00 × g for 5 minutes, and supernatant was added 4 × 5 × Laemmli sample buffer (2% SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 0.2 mg / mL bromophenol blue, 10% freshly added 2 -50% (w / w) glycerol containing mercaptoethanol) and heated at about 100 ° C for 5 minutes. After a short centrifugation, 45 μL of the supernatant was transferred to a BioRad Crite attached to a Criterion cell gel module.
It was loaded directly onto a rion SDS-PAGE gel (Bio-Rad, Hercules, CA). A positive reference standard of microorganism-derived aad-1 was PBST pH at 1 mg / mL.
Resuspended in 7.4 and further diluted with PBST. Samples were then transferred to Bio-Rad La
Mixed with emmli buffer and 5% 2-mercaptoethanol and processed as described previously. Electrophoresis was performed using Tris / Glycine / SDS buffer (Bio-Ra
d, Hercules, CA) at a voltage of 150-200 V until the front dye reached the end of the gel. After separation, the gel is cut in half and one half is
Stained using ce GelCode Blue protein stain, the other half on a nitrocellulose membrane (Bio-Rad, Hercules, Calif.) and a Mini transblot electrotransfer cell (Bio-Rad, Hercules, Calif.) 60
Electroblot using a constant voltage of 100 volts for minutes. The transfer buffer contained 20% methanol and Tris / glycine buffer from Bio-Rad. For immunodetection, the membrane was washed with an aad-1 specific polyclonal rabbit antibody (Strategic Biosolution Inc., Newark,
DE, Protein A purified rabbit polyclonal antibody lot #: DAS F1 197-1
(1, 1.6 mg / mL). A conjugate of goat anti-rabbit IgG (H + L) and alkaline phosphatase (Pierce Chemical, Rockford, IL) was used as the secondary antibody. SigmaFast BCIP / NBT substrate was used to develop and visualize immunoreactive protein bands. Wash the membrane thoroughly with water to stop the reaction and record the results on a digital scanner (Hewlett Packard
(cARD, Palo Alto, CA).
ピー・フルオレセンス(P. fluorescens)により生成されるaad−1において、クー
マシー染色されたSDS−PAGEゲルにおいて視覚化される主なタンパク質バンドは、
およそ33kDaであった。予測されたように、対応するメイズ由来aad−1タンパク
質(イベントDAS−40278−9)は、微生物により発現されるタンパク質と同一の
サイズであった。予想されたように、植物の精製された画分は、aad−1タンパク質に
加えて、マイナーな量の非免疫反応性不純物を含有した。同時精製されたタンパク質は、
カラムマトリクスとの弱い相互作用によりカラムに保持されているか、厳しい溶出条件下
でカラムからモノクローナル抗体を浸出させると考えられた。他の研究者も、臭化シアン
活性化セファロース4B免疫吸着剤上でのペプチドおよびアミノ酸の非特異的吸着につい
て報告している(KennedyおよびBarnes、1983;Holroydeら、1976;PodlaskiおよびStern、
2008)。
In aad-1 produced by P. fluorescens, the main protein band visualized in a Coomassie-stained SDS-PAGE gel is
It was approximately 33 kDa. As expected, the corresponding maize-derived aad-1 protein (event DAS-40278-9) was the same size as the protein expressed by the microorganism. As expected, the purified fraction of plants contained minor amounts of non-immunoreactive impurities in addition to the aad-1 protein. The co-purified protein is
It was thought to be retained in the column due to weak interaction with the column matrix or to leach monoclonal antibodies from the column under severe elution conditions. Other researchers have also reported nonspecific adsorption of peptides and amino acids on cyanogen bromide activated Sepharose 4B immunosorbent (Kennedy and Barnes, 1983; Holroyde et al., 1976; Podlaski and Stern,
2008).
シュードモナス(Pseudomonas)由来aad−1タンパク質は、ポリクローナル抗体ウ
ェスタンブロット解析により、予測されるサイズの陽性シグナルを示した。これは、DA
S−40278−9トランスジェニックメイズ茎抽出物においても観察された。aad−
1ウェスタンブロット解析において、免疫反応性タンパク質は、対照XHH13抽出物に
おいて観察されず、代替のサイズのタンパク質(凝集体または分解生成物)は、トランス
ジェニック試料において観察されなかった。
Pseudomonas-derived aad-1 protein showed a positive signal of the expected size by polyclonal antibody western blot analysis. This is DA
It was also observed in S-40278-9 transgenic maize stem extract. aad-
In 1 Western blot analysis, no immunoreactive protein was observed in the control XHH13 extract and no alternative size protein (aggregate or degradation product) was observed in the transgenic sample.
(実施例5.4)
翻訳後グリコシル化の検出
免疫親和性クロマトグラフィーにより精製されたメイズ由来aad−1タンパク質(画
分#3)を、4:1で5×Laemmliバッファーと混合した。微生物由来aad−1
、ダイズトリプシン阻害剤、ウシ血清アルブミンおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ
を、Milli−Q水で、植物由来aad−1のおおよその濃度まで希釈し、Bio−R
ad Laemmliバッファーと混合した。タンパク質を、次いで、約95℃にて5分
間加熱し、20000×gにて2分間遠心分離して、清澄化された上清を得た。得られた
上清を、Bio−RadCriterionゲルに直接アプライし、XT MES泳動バ
ッファー(Bio−Rad、Hercules、CA)で、電気泳動を170Vにて約6
0分間運転した以外は本質的に上で記載したようにして電気泳動した。電気泳動の後に、
ゲルを半分に切断し、一方の半分を、全タンパク質について、製造者のプロトコールに従
ってGelCode Blue染料で染色した。染色が完了した後に、ゲルを、Mole
cular Dynamics濃度計で走査して、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。ゲ
ルの他方の半分は、GelCode糖タンパク質染色キット(Pierce Chemi
cal、Rockford、IL)を、製造者のプロトコールに従って用いて染色して、
糖タンパク質を視覚化した。糖タンパク質(検出限界はバンドあたり0.625ngほど
低い)を、淡いピンクの背景の上にマゼンタのバンドとして視覚化した。糖タンパク質染
色が完了した後に、ゲルをHewlett Packardデジタルスキャナで走査して
、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。グリコシル化染色の画像を取得した後に、ゲルをG
elCode Blueで染色して、非グリコシル化タンパク質の存在について確認した
。結果は、メイズ由来および微生物由来のaad−1タンパク質がともに、検出可能な共
有結合された炭水化物を有さないことを示した。この結果は、ペプチド質量フィンガープ
リンティングによっても確認された。
(Example 5.4)
Detection of post-translational glycosylation Maize-derived aad-1 protein (fraction # 3) purified by immunoaffinity chromatography was mixed 4 × with 5 × Laemmli buffer. Microbe-derived aad-1
, Soybean trypsin inhibitor, bovine serum albumin and horseradish peroxidase are diluted with Milli-Q water to an approximate concentration of plant-derived aad-1, Bio-R
Mixed with ad Laemmli buffer. The protein was then heated at about 95 ° C. for 5 minutes and centrifuged at 20000 × g for 2 minutes to obtain a clarified supernatant. The obtained supernatant was directly applied to a Bio-Rad Criterion gel and electrophoresed at about 170 V at 170 V with XT MES electrophoresis buffer (Bio-Rad, Hercules, CA).
Electrophoresis was performed essentially as described above except that it was run for 0 minutes. After electrophoresis
The gel was cut in half and one half was stained with GelCode Blue dye for total protein according to the manufacturer's protocol. After staining is complete, the gel is
A permanent dynamics densitometer was scanned to obtain a permanent visual record of the gel. The other half of the gel is a GelCode glycoprotein staining kit (Pierce Chemi).
cal, Rockford, IL) according to the manufacturer's protocol,
Glycoprotein was visualized. Glycoproteins (detection limits as low as 0.625 ng per band) were visualized as magenta bands on a light pink background. After glycoprotein staining was complete, the gel was scanned with a Hewlett Packard digital scanner to obtain a permanent visual record of the gel. After obtaining an image of the glycosylation stain, the gel is
Staining with elCode Blue was confirmed for the presence of non-glycosylated protein. The results showed that both maize-derived and microbial-derived aad-1 proteins had no detectable covalently bound carbohydrate. This result was also confirmed by peptide mass fingerprinting.
(実施例5.5)
メイズ由来およびシュードモナス(Pseudomonas)由来のaad−1の質量分析ペプチド
質量フィンガープリンティングおよび配列決定
シュードモナス(Pseudomonas)由来およびメイズ由来のaad−1の質量分析解析を
行った。トランスジェニックトウモロコシの茎に由来するaad−1タンパク質(イベン
トDAS−40278−9)を、トリプシンによる溶液消化に供し、その後、MALDI
−TOF MSおよびESI−LC/MSに供した。検出されたペプチドの質量を、メイ
ズ由来aad−1タンパク質の配列における可能性のあるプロテアーゼ切断部位に基づい
て推定したものと比較した。理論的切断は、in silicoで、Proteomet
rics LLCからのProtein Analysis Worksheet(PA
WS)フリーウェアを用いて作製した。一旦変性させたaad−1タンパク質は、プロテ
アーゼにより容易に消化され、多数のペプチドピークを生じる。
(Example 5.5)
Mass spectrometry peptide mass fingerprinting and sequencing of aad-1 from maize and Pseudomonas Mass spectrometry analysis of Padudomonas and maize derived aad-1 was performed. The aad-1 protein (event DAS-40278-9) derived from transgenic corn stalk is subjected to solution digestion with trypsin and then MALDI
-Subject to TOF MS and ESI-LC / MS. The mass of the detected peptide was compared to that estimated based on possible protease cleavage sites in the sequence of the maize-derived aad-1 protein. Theoretical cutting is in silico, Proteomet
Protein Analysis Worksheet (PA) from ricks LLC
WS) Freeware. Once denatured, the aad-1 protein is easily digested by proteases, resulting in multiple peptide peaks.
トランスジェニックメイズ由来aad−1タンパク質(イベントDAS−40278−
9)のトリプシン消化において、検出されたペプチド断片は、タンパク質のC末端にて1
つの小さいトリプシン断片であるF248〜R253と、1つの短い(2アミノ酸)ペプ
チド断片とだけを欠いて、ほぼ完全なタンパク質配列をカバーした。この解析により、メ
イズ由来タンパク質アミノ酸配列が、微生物由来aad−1タンパク質のものと一致した
ことが確認された。これらの解析の結果は、メイズ由来aad−1タンパク質のアミノ酸
配列が、ピー・フルオレセンス(P. fluorescens)発現タンパク質と等価であったことを
示す。
Aad-1 protein derived from transgenic maize (event DAS-40278-
In the tryptic digestion of 9), the detected peptide fragment is 1
And F 248 to R 253 is a One small tryptic fragments, lacking only a single short (2 amino acids) peptide fragments, and covered nearly complete protein sequence. This analysis confirmed that the maize-derived protein amino acid sequence matched that of the microorganism-derived aad-1 protein. The results of these analyzes indicate that the amino acid sequence of the maize-derived aad-1 protein was equivalent to the P. fluorescens expressed protein.
(実施例5.5.1)
トリプシンペプチド断片配列決定
ペプチド質量フィンガープリンティングに加えて、メイズ由来aad−1タンパク質(
メイズイベントDAS−40278−9から免疫親和性精製された)のNおよびC末端の
アミノ酸残基を配列決定し、微生物由来タンパク質の配列と比較した。タンパク質配列を
、タンデム質量分析により、微生物由来およびメイズ由来タンパク質の最初の11残基に
ついて得た(表8)。両方のタンパク質についてのアミノ酸配列は、A’HAALSPL
SQR”(配列番号30)であり、N末端のメチオニンは、アミノペプチダーゼにより除
去されていることが示された(表8)。N末端aad−1タンパク質配列は、M’AHA
ALSPLSQR’2(配列番号31)と予測された。これらの結果は、メイズおよびピ
ー・フルオレセンス(P. fluorescens)における翻訳の間またはその後に、N末端メチオ
ニンが、メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)により切断されることを示唆する。M
APは、タンパク質の2番目の残基がGly、Ala、Ser、Cys、Thr、Pro
およびValのように小さい場合、メチオニル残基を迅速に切断する(Walsh、2006)。
メチオニンが除去されていることに加えて、aad−1タンパク質のN末端ペプチドの小
さい部分が、N末端メチオニンが切断された後にアセチル化されたことが示された(表8
)。この結果は、真核生物(植物)発現タンパク質でしばしば遭遇する。なぜなら、およ
そ80〜90%のN末端残基が改変されるからである(PolevodaおよびSherman、2003)
。また、セリンおよびアラニンをN末端に有するタンパク質は、最も頻繁にアセチル化さ
れることが示されている(PolevodaおよびSherman、2002)。2つの同時翻訳プロセス、
N末端メチオニン残基の切断およびN末端アセチル化は、はるかに最も一般的な改変であ
り、大多数の真核生物タンパク質(約85%)で生じる(PolevodaおよびSherman、2002
)。しかし、N末端アセチル化に関連する生物学的重要性を証明する例は希である(Pole
vodaおよびSherman、2000)。
(Example 5.5.1)
Tryptic peptide fragment sequencing In addition to peptide mass fingerprinting, maize-derived aad-1 protein (
N- and C-terminal amino acid residues of immunoaffinity purified from maize event DAS-40278-9) were sequenced and compared to the sequence of the microbial protein. Protein sequences were obtained for the first 11 residues of microbial and maize derived proteins by tandem mass spectrometry (Table 8). The amino acid sequences for both proteins are A'HAALSPL
SQR ″ (SEQ ID NO: 30), indicating that the N-terminal methionine has been removed by aminopeptidase (Table 8). The N-terminal aad-1 protein sequence is M′AHA.
ALSPLSQR '2 (SEQ ID NO: 31) was predicted. These results suggest that the N-terminal methionine is cleaved by methionine aminopeptidase (MAP) during or after translation in maize and P. fluorescens. M
In AP, the second residue of the protein is Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro
And in small cases like Val, methionyl residues are cleaved rapidly (Walsh, 2006).
In addition to the methionine being removed, a small portion of the N-terminal peptide of the aad-1 protein was shown to be acetylated after the N-terminal methionine was cleaved (Table 8).
). This result is often encountered with eukaryotic (plant) expressed proteins. This is because approximately 80-90% of the N-terminal residues are modified (Polevoda and Sherman, 2003).
. Also, proteins with serine and alanine at the N-terminus have been shown to be most frequently acetylated (Polevoda and Sherman, 2002). Two simultaneous translation processes,
Cleavage of the N-terminal methionine residue and N-terminal acetylation are by far the most common modification and occur in the majority of eukaryotic proteins (about 85%) (Polevoda and Sherman, 2002
). However, examples that demonstrate the biological importance associated with N-terminal acetylation are rare (Pole
voda and Sherman, 2000).
N−アセチル化に加えて、メイズ由来aad−1タンパク質の精製中に、わずかなN末
端切断も出現した(表8)。これらの「不揃いの(ragged)末端」は、メイズ由来タンパ
ク質からのアミノ酸A2、H3およびA4(多様な形態および量で)の喪失をもたらした
。この切断は、aad−1タンパク質の精製中に生じたと考えられる。なぜなら、葉の粗
抽出物のウェスタンブロットプローブは、微生物由来aad−1タンパク質と同じMWに
て単一のはっきりしたバンドを含有したからである。ウェスタンブロットした試料につい
ての抽出バッファーは、過剰のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、これは、セリン、
システイン、アスパラギン酸およびメタロプロテアーゼならびにアミノペプチダーゼの阻
害について広い特異性を有するプロテアーゼ阻害剤の混合物を含有する。
In addition to N-acetylation, slight N-terminal truncations also appeared during purification of the maize-derived aad-1 protein (Table 8). These “ragged ends” resulted in the loss of amino acids A 2 , H 3 and A 4 (in various forms and amounts) from the maize-derived protein. This cleavage is believed to have occurred during the purification of the aad-1 protein. This is because the Western blot probe of the crude leaf extract contained a single distinct band at the same MW as the microbial aad-1 protein. The extraction buffer for the Western blotted sample contains excess protease inhibitor cocktail, which contains serine,
Contains a mixture of cysteine, aspartic acid and metalloproteases and protease inhibitors with broad specificity for the inhibition of aminopeptidases.
メイズ由来および微生物由来aad−1タンパク質のC末端配列を上記のようにして決
定し、予測されるアミノ酸配列と比較した(表9)。結果は、測定された配列が、予測さ
れた配列と同一であり、メイズ由来および微生物由来aad−1タンパク質がともに同一
でC末端において変更がないことを示した。
The C-terminal sequences of maize-derived and microbial-derived aad-1 proteins were determined as described above and compared with the predicted amino acid sequences (Table 9). The results showed that the measured sequence was identical to the predicted sequence, both the maize and microbial aad-1 proteins were identical and unchanged at the C-terminus.
イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドメイズ系統の野外での発現、栄
養組成解析および農業経済学的特徴
この研究の目的は、トウモロコシ組織において見出されるAAD−1タンパク質のレベ
ルを決定することであった。さらに、トウモロコシのフォレージおよび穀粒に対して組成
解析を行って、同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコ
シ系統DAS−40278−9との間の等価性を調べた(噴霧なし、2,4−Dを噴霧、
キザロホップを噴霧および2,4−Dとキザロホップとを噴霧)。同質遺伝子非形質転換
トウモロコシ系統の農業経済学的特徴も、DAS−40278−9トウモロコシと比較し
た。野外発現、組成および農業経済学的試行は、米国およびカナダの主要なトウモロコシ
生産地域内にある6つの試験現場で行った。これらの現場は、多様な農業経済学的実施と
環境条件の地域を表す。試行は、Iowa、Illinois(2箇所)、Indian
a、NebraskaおよびOntario、Canadaで行った。
Field expression, nutritional composition analysis and agroeconomic characteristics of a hybrid maize line containing event DAS-40278-9 The purpose of this study was to determine the level of AAD-1 protein found in corn tissue It was. In addition, a compositional analysis was performed on corn forage and grain to examine equivalence between the isogenic non-transformed corn line and the transgenic corn line DAS-40278-9 (no spray, 2, 4 Spray -D,
Spray with quizalofop and spray with 2,4-D and quizalofop). The agroeconomic characteristics of isogenic non-transformed maize lines were also compared to DAS-40278-9 maize. Field development, composition and agro-economic trials were conducted at six test sites within major corn-producing regions in the United States and Canada. These sites represent areas of diverse agricultural economic practices and environmental conditions. Trials are Iowa, Illinois (2 places), Indian
a, Nebraska and Ontario, Canada.
対照、噴霧なしAAD−1、AAD−1+キザロホップ、AAD−1+2,4−Dおよ
びAAD−1+両方の参加項目(entry)試料についての全ての現場の平均値は、トウモ
ロコシについての文献の範囲内であった。噴霧なしAAD−1、AAD−1+キザロホッ
プ、AAD−1+2,4−DまたはAAD−1+両方のトウモロコシと対照との間での限
定数の著しい相違が観察されたが、相違は、生物学的に意味があると考えられなかった。
なぜなら、これらは小さく、結果は、商業的なトウモロコシで見出される範囲内であった
からである。組成の結果のプロットは、噴霧なしAAD−1、AAD−1+キザロホップ
、AAD−1+2,4−DまたはAAD−1+両方のトウモロコシおよび対照トウモロコ
シ系統のうちでのいずれの生物学的に意味がある処置に関連する組成の相違も示さない。
結果として、噴霧なしAAD−1、AAD−1+キザロホップ、AAD−1+2,4−D
およびAAD−1+両方のトウモロコシの組成の結果により、AAD−1(イベントDA
S40278−9)トウモロコシが従来のトウモロコシ系統と等価であることが確認され
る。
All field average values for control, no spray AAD-1, AAD-1 + quizalofop, AAD-1 +2, 4-D and AAD-1 + entry samples are within the literature for corn. there were. Although a limited number of significant differences were observed between corn and controls with no spray AAD-1, AAD-1 + quizalofop, AAD-1 + 2,4-D or both AAD-1 +, the differences were biologically I didn't think it would make sense.
Because they are small, the results were within the range found in commercial corn. The plot of the composition results is a biologically meaningful treatment of both the nebulized AAD-1, AAD-1 + quizalofop, AAD-1 + 2,4-D or both AAD-1 + maize and control maize lines. It does not show any compositional differences related to
As a result, no spray AAD-1, AAD-1 + quizalofop, AAD-1 +2, 4-D
And AAD-1 + corn composition results indicate that AAD-1 (event DA
S40278-9) It is confirmed that the corn is equivalent to the conventional corn line.
(実施例6.1)
試験したトウモロコシ系統
DAS−40278−9イベントを含有するハイブリッド種子および試験物質系統と同
じ遺伝子背景の従来のハイブリッド種子であるがDAS−40278−9イベントを含有
しない対照植物を、表10に列挙する。
(Example 6.1)
Maize lines tested Hybrid seeds containing DAS-40278-9 events and control plants that are conventional hybrid seeds of the same genetic background as the test substance lines but do not contain DAS-40278-9 events are listed in Table 10.
上記のトウモロコシ植物を、米国およびカナダの主要なトウモロコシ成長地域内の場所
で成長させた。6つの野外試験施設、Richland、IA;Carlyle、IL;
Wyoming、IL;Rockville、IN;York、NE;およびBranc
hton、Ontario、Canada(IA、IL1、IL2、IN、NEおよびO
Nという)は、トウモロコシについての多様な農業経済学的実施と環境条件の地域を表す
。
The above corn plants were grown in locations within the major corn growth regions of the United States and Canada. 6 field trial facilities, Richland, IA; Carlyle, IL;
Wyoming, IL; Rockville, IN; York, NE; and Branch
hton, Ontario, Canada (IA, IL1, IL2, IN, NE and O
N) represents a region of diverse agricultural economic practices and environmental conditions for corn.
試験および対照のトウモロコシ種子は、1列あたりおよそ24の種子で、各列内の種子
の間隔がおよそ10インチ(25cm)の播種比率で植えた。各現場において、各処置の
4つの反復プロットを確立し、各プロットは、2〜25ftの列からなった。プロットを
、完全乱塊法(RCB)で配置し、各現場にて独自の無作為化を行った。各トウモロコシ
プロットは、同様の成熟度の非トランスジェニックメイズハイブリッドの2列を境界とし
た。試行現場全体は、同様の相対的成熟度の非トランスジェニックメイズハイブリッドの
最小限で12列(または30ft)で囲まれていた。
Test and control corn seeds were planted at approximately 24 seeds per row, with a seeding rate of approximately 10 inches (25 cm) between the seeds in each row. At each site, four replicate plots for each treatment were established, each plot consisting of 2-25 ft columns. The plots were arranged by the complete randomized block method (RCB) and randomized independently at each site. Each corn plot was bounded by two rows of non-transgenic maize hybrids of similar maturity. The entire trial site was surrounded by a minimum of 12 rows (or 30 ft) of non-transgenic maize hybrids of similar relative maturity.
適当な昆虫、雑草および疾患を管理する実施を用いて、農業経済学的に許容され得る作
物を生産した。月の最高および最低気温と、降水量および潅漑は、現場について平均的で
あった。これらの範囲は、トウモロコシ生産において典型的に遭遇するものである。
Practices that manage suitable insects, weeds and disease were used to produce crops that were agriculturally acceptable. Monthly maximum and minimum temperatures, precipitation and irrigation were average for the site. These ranges are typically encountered in corn production.
(実施例6.2)
除草剤散布
除草剤処理を、エーカーあたりおよそ20ガロン(187L/ha)の噴霧容量で行っ
た。これらの散布は、商業的実施の最大限のラベル割合を反復するように設計した。表1
1に、用いた除草剤を列挙する。
(Example 6.2)
Herbicide application Herbicide treatment was performed at a spray volume of approximately 20 gallons per acre (187 L / ha). These spreads were designed to repeat the maximum label rate of commercial practice. Table 1
1 lists the herbicides used.
2,4−D(Weedar64)を、3回のオーバーザトップ散布(broadcast over-t
he-top applications)として試験参加項目4および5に用いた(季節合計3lb ae
/A)。個別の散布は出芽前であり、およそV4およびV8〜V8.5段階であった。個
別の目標散布割合は、Weedar64について1.0lb ae/A、または1120
g ae/haであった。実際の散布割合は、1096〜1231g ae/Aの範囲で
あった。
2,4-D (Weedar64) 3 times over the top (broadcast over-t)
he-top applications) used in test participation items 4 and 5 (seasonal total 3 lb ae
/ A). Individual sprays were pre-emergence and were approximately V4 and V8-V8.5 stages. Individual target application rates are 1.0 lb ae / A for Weedar 64, or 1120
g ae / ha. The actual spreading rate was in the range of 1096-1231 g ae / A.
キザロホップ(AssureII)は、単一のオーバーザトップ散布として試験参加項
目3および5に用いた。散布時期は、およそV6成長段階であった。目標散布割合は、A
ssureIIについて0.0825lb ai/A、または92g ai/haであっ
た。実際の散布割合は、90.8〜103g ai/haの範囲であった。
Quizalofop (Assure II) was used in Study Participants 3 and 5 as a single over-the-top spray. The spraying time was approximately the V6 growth stage. The target application rate is A
It was 0.0825 lb ai / A, or 92 g ai / ha for sure II. The actual application rate was in the range of 90.8 to 103 g ai / ha.
(実施例6.3)
農業経済学的データ収集および結果
農業経済学的特徴を、各場所でのブロック2、3および4内の全ての試験参加項目につ
いて記録した。表12に、測定された以下の特徴を列挙する。
(Example 6.3)
Agroeconomic data collection and results Agroeconomic features were recorded for all study participants in blocks 2, 3 and 4 at each location. Table 12 lists the following characteristics measured:
対照、aad−1噴霧なし、aad−1+2,4−D、aad−1+キザロホップおよ
びaad−1+両方の参加項目から収集した農業経済学的データの解析を行った。現場間
解析(across-site analysis)について、場所間サマリー解析(across location summar
y analysis)における早期個体群(V1およびV4)、活力、最終個体群、作物損傷、シ
ルキング(silking)時期、花粉落下時期、茎倒伏(lodging)、根倒伏、疾患発生、昆虫
被害、成熟日数、植物高さおよび花粉生存度(形状および色)の値についての統計学的に
有意な相違は観察されなかった(表13)。緑度保持および雌穂(ear)高さについて、
有意な対応のあるt検定が、対照とaad−1+キザロホップ参加項目との間で観察され
たが、有意な全体的な処理効果または偽発見率(False Discovery Rates)(FDR)調
整p値を伴わなかった(表13)。
Analysis of agro-economic data collected from the control, no aad-1 spray, aad-1 + 2,4-D, aad-1 + quizalofop and both aad-1 + entries was performed. About cross-site analysis (across location summar)
y analysis) early population (V1 and V4), vitality, final population, crop damage, silking time, pollen fall time, lodging, root lodging, disease occurrence, insect damage, maturity days, No statistically significant differences were observed in plant height and pollen viability (shape and color) values (Table 13). Regarding greenness retention and ear height,
Significant paired t-tests were observed between controls and aad-1 + quizalofop participants, but with significant overall treatment effect or False Discovery Rates (FDR) adjusted p-value None (Table 13).
(実施例6.4)
試料回収
発現および組成解析のための試料を、表14に列挙するようにして回収した。
(Example 6.4)
Sample Collection Samples for expression and composition analysis were collected as listed in Table 14.
(実施例6.5)
トウモロコシ試料中のaad−1タンパク質の決定
トウモロコシの試料を、aad−1タンパク質の量について解析した。可溶性で抽出可
能なaad−1タンパク質を、Beacon Analytical System,I
nc.(Portland、ME)から購入した酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA
)キットを用いて定量する。
(Example 6.5)
Determination of aad-1 protein in corn samples Corn samples were analyzed for the amount of aad-1 protein. Soluble and extractable aad-1 protein was obtained from Beacon Analytical System, I
nc. (Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) purchased from (Portland, ME)
) Quantify using a kit.
トウモロコシ組織の試料を、試験植物から単離し、粗粉砕、凍結乾燥およびGeno/
粉砕機(Certiprep、Metuchen、New Jersey)を用いる微粉
砕(必要であれば)により発現解析のために調製した。花粉について、追加の調製は必要
でなかった。aad−1タンパク質を、トウモロコシ組織から、0.5%ウシ血清アルブ
ミン(BSA)を含有する、洗浄剤Tween−20を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水
(PBST)を用いて抽出した。花粉について、1mg/mLのアスコルビン酸ナトリウ
ムおよび2%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する0.5%PBST/BSAバッファ
ーを用いてタンパク質を抽出した。植物組織および花粉抽出物を遠心分離した。水性の上
清を回収し、必要であれば適当なバッファーで希釈し、サンドイッチフォーマットのaa
d−1 ELISAキットを用いて解析した。キットは、以下のステップを用いた。希釈
試料の分割量と、ビオチン化抗aad−1モノクローナル抗体とを、固定化抗aad−1
モノクローナル抗体で被覆したマイクロタイタープレートのウェル中でインキュベートす
る。これらの抗体は、ウェル中のaad−1タンパク質と結合して、可溶性抗体と固定化
抗体との間に結合したaad−1タンパク質で「サンドイッチ」を形成する。未結合の試
料およびコンジュゲートは、次いで、PBSTで洗浄することによりプレートから除去す
る。過剰量のストレプトアビジン−酵素(アルカリホスファターゼ)コンジュゲートを、
インキュベーションのためにウェルに加える。インキュベーション期間の最後に、未結合
の試薬を、洗浄によりプレートから除去した。酵素基質をその後加えることにより、着色
生成物が得られた。aad−1は抗体サンドイッチ中に結合しているので、発色のレベル
は、試料中のaad−1の濃度と関連した(すなわち、より低い残存濃度は、より低い発
色をもたらす)。405nmでの吸光度を、Molecular Devices V−
maxまたはSpectra Max 190プレートリーダーを用いて測定した。検量
曲線を作製し、未知試料中のaad−1濃度を、プレートリーダーと適合するSoft−
MAX Pro(商標)ソフトウェアを用いて多項回帰等式から算出した。試料を、報告
した二重ウェルの平均濃度を有する二重ウェル中で解析した。
Samples of corn tissue are isolated from test plants, coarsely ground, lyophilized and Geno /
Prepared for expression analysis by pulverization (if necessary) using a pulverizer (Certreprep, Metuchen, New Jersey). For pollen, no additional preparation was necessary. The aad-1 protein was extracted from corn tissue using phosphate buffered saline (PBST) containing detergent Tween-20 containing 0.5% bovine serum albumin (BSA). For pollen, protein was extracted with 0.5% PBST / BSA buffer containing 1 mg / mL sodium ascorbate and 2% protease inhibitor cocktail. Plant tissue and pollen extract were centrifuged. Collect the aqueous supernatant and dilute with appropriate buffer if necessary to obtain aa in sandwich format.
Analysis was performed using d-1 ELISA kit. The kit used the following steps. The amount of the diluted sample and the biotinylated anti-aad-1 monoclonal antibody are mixed with the immobilized anti-aad-1
Incubate in wells of microtiter plates coated with monoclonal antibodies. These antibodies bind to the aad-1 protein in the well to form a “sandwich” with the aad-1 protein bound between the soluble and immobilized antibodies. Unbound sample and conjugate are then removed from the plate by washing with PBST. Excess streptavidin-enzyme (alkaline phosphatase) conjugate
Add to wells for incubation. At the end of the incubation period, unbound reagent was removed from the plate by washing. A colored product was obtained by subsequent addition of the enzyme substrate. Since aad-1 is bound in the antibody sandwich, the level of color development is related to the concentration of aad-1 in the sample (ie, lower residual concentration results in lower color development). Absorbance at 405 nm was measured using Molecular Devices V-
Measured using a max or Spectra Max 190 plate reader. A calibration curve is generated, and the concentration of aad-1 in the unknown sample is adjusted to Soft-
Calculated from the polynomial regression equation using MAX Pro ™ software. Samples were analyzed in double wells with reported double well average concentrations.
多様なトウモロコシマトリクスにおけるaad−1タンパク質濃度のまとめ(現場間で
平均した)を、表15に示す。aad−1平均タンパク質濃度は、R1段階の根における
2.87ng/mg乾燥重量から、花粉中の127ng/mgの範囲であった。噴霧なし
および噴霧ありのプロットについての発現の結果は、同様であった。aad−1タンパク
質は、Indianaの現場からの1つの対照の根試料を除いて、いずれの対照試料から
も検出されなかった。
A summary of aad-1 protein concentrations in various corn matrices (averaged between sites) is shown in Table 15. The aad-1 average protein concentration ranged from 2.87 ng / mg dry weight in the R1 stage roots to 127 ng / mg in the pollen. The expression results for the non-sprayed and sprayed plots were similar. The aad-1 protein was not detected in any of the control samples except for one control root sample from the Indiana field.
(実施例6.6)
組成解析
トウモロコシのフォレージおよび穀粒の試料を、種々の試験を用いて栄養素含量につい
て解析した。フォレージについて行った解析は、灰分、全脂質、水分、タンパク質、炭水
化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維、中性デタージェント繊維、カルシウムおよびリ
ンを含んだ。穀粒について行った解析は、近成組成(灰分、全脂質、水分、タンパク質、
炭水化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維)、中性デタージェント繊維(NDF)、ミ
ネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、2次代謝産物および抗栄養素を含んだ。トウモロ
コシのフォレージおよび穀粒についての栄養素解析の結果を、文献で報告されている値と
比較した(Watson、1982(4);Watson、1984(5);ILSI Crop Composition Database、2006(6
);OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize、2002(7);お
よびCodex Alimentarius Commission 2001(8)を参照されたい)。
(Example 6.6)
Composition Analysis Corn forage and kernel samples were analyzed for nutrient content using various tests. Analyzes performed on forage included ash, total lipids, moisture, protein, carbohydrates, crude fibers, acidic detergent fibers, neutral detergent fibers, calcium and phosphorus. Analyzes performed on the grain are syngeneic (ash, total lipid, moisture, protein,
Carbohydrate, crude fiber, acidic detergent fiber), neutral detergent fiber (NDF), minerals, amino acids, fatty acids, vitamins, secondary metabolites and anti-nutrients. The results of nutrient analysis for corn forage and kernels were compared with values reported in the literature (Watson, 1982 (4); Watson, 1984 (5); ILSI Crop Composition Database, 2006 (6
); OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize, 2002 (7); and Codex Alimentarius Commission 2001 (8)).
(実施例6.6.1)
フォレージの近成組成、繊維およびミネラルの解析
対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよ
びaad−1+両方の参加項目からのトウモロコシフォレージ試料中のタンパク質、脂質
、灰分、水分、炭水化物、ADF、NDF、カルシウムおよびリンの解析を行った。全て
の場所にわたる結果のまとめを表16に示す。現場間および現場個別の解析について、全
ての近成組成、繊維およびミネラルの平均値は、文献の範囲内であった。対照とトランス
ジェニック参加項目との間に、現場間解析において、水分、ADF、NDF、カルシウム
およびリンについて統計学的な相違は観察されなかった。タンパク質および灰分について
、有意な対応のあるt検定が、噴霧なしAAD−1(タンパク質)、aad−1+キザロ
ホップ(タンパク質)およびaad−1+両方(灰分)について観察されたが、有意な全
体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わなかった。脂質について、有意な対応のある
t検定および調整p値がともに、aad−1+キザロホップについて対照と比較して観察
されたが、有意な全体的な処理効果は観察されなかった。炭水化物について、統計的に有
意な全体的な処理効果、対応のあるt検定およびFDR調整p値が、aad−1+キザロ
ホップと対照との間に観察された。炭水化物についても、有意な対応のあるt検定が噴霧
なしaad−1参加項目について観察されたが、有意なFDR調整p値は観察されなかっ
た。これらの相違は、生物学的に意味がない。なぜなら、これらの分析項目についての全
ての現場間の結果は、トウモロコシについて報告された文献の範囲内であり、対照からの
差は小さかったからである(<23%)。
(Example 6.6.1)
Forage composition, fiber and mineral analysis Control, unsprayed aad-1, aad-1 + quizalofop, protein, lipids in corn forage samples from both aad-1 + 2,4-D and aad-1 + entry , Ash, moisture, carbohydrates, ADF, NDF, calcium and phosphorus were analyzed. A summary of the results across all locations is shown in Table 16. For inter-site and site-specific analyses, the average values of all near-composition, fiber and minerals were within the literature. No statistical differences were observed for water, ADF, NDF, calcium and phosphorus in the inter-site analysis between controls and transgenic participants. Significant paired t-tests for protein and ash were observed for nebulized AAD-1 (protein), aad-1 + quizalofop (protein) and both aad-1 + (ash), but significant overall treatment There was no effect or FDR adjusted p-value. Both significant paired t-tests and adjusted p-values were observed for lipids compared to controls for aad-1 + quizalofop, but no significant overall treatment effect was observed. For carbohydrates, statistically significant overall treatment effects, paired t-tests and FDR adjusted p-values were observed between aad-1 + quizalofop and controls. For carbohydrates, a significant paired t-test was also observed for the no spray aad-1 participants, but no significant FDR adjusted p-value was observed. These differences are not biologically meaningful. This is because all inter-site results for these analytical items were within the literature reported for corn and the difference from the control was small (<23%).
(実施例6.6.2)
穀粒の近成組成(proximate)および繊維の解析
全ての場所にわたるトウモロコシ穀粒における近成組成(タンパク質、脂質、灰分、水
分、コレステロールおよび炭水化物)および繊維(ADF、NDFおよび全食物繊維)に
関する結果のまとめを、表17に示す。近成組成および繊維についての全ての結果は、文
献の範囲内であり、現場間解析において、対照とトランスジェニック参加項目との間に、
脂質、灰分、NDFおよび全食物繊維について有意な相違は観察されなかった。水分につ
いて、有意な全体的な処理効果が観察されたが、有意な対応のあるt検定またはFDR調
整p値を伴わなかった。ADFについて、有意な対応のあるt検定がaad−1+両方に
ついて観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値はみられなかった。
タンパク質および炭水化物の両方について、有意な対応のある検定、調整p値および全体
的な処理効果が、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップおよびaad−1+両
方についてみられた。これらの相違は小さく(<12%)、全ての値は文献の範囲内であ
ったので、相違は生物学的に意味があるとは考えられない。
(Example 6.6.2)
Analysis of grain proximate and fiber Results for syngeneic composition (protein, lipid, ash, moisture, cholesterol and carbohydrate) and fiber (ADF, NDF and total dietary fiber) in corn kernels across all locations Is summarized in Table 17. All results for the syngeneic composition and fiber are within the literature, and in the inter-site analysis, between the control and transgenic participants,
No significant differences were observed for lipid, ash, NDF and total dietary fiber. A significant overall treatment effect was observed for moisture, but without a significant paired t-test or FDR adjusted p-value. For ADF, a significant paired t-test was observed for both aad-1 +, but no significant overall treatment effect or FDR adjusted p-value was seen.
For both proteins and carbohydrates, significant paired tests, adjusted p-values and overall treatment effects were seen for both nebulized aad-1, aad-1 + quizalofop and aad-1 +. These differences are small (<12%) and all values were within the literature, so the differences are not considered biologically meaningful.
(実施例6.6.3)
穀粒のミネラル解析
ミネラルであるカルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄分、マグネシウム、マンガン、モ
リブデン、リン、カリウム、セレン、ナトリウムおよび亜鉛についてのトウモロコシ穀粒
試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを、表18に示す。全ての結果は
、報告される文献の範囲内であった。現場間解析について、カルシウム、銅、鉄分および
カリウムについて有意な相違は観察されなかった。クロム、ヨウ素、セレンおよびナトリ
ウムについての平均の結果は、方法の定量限界未満であった。マグネシウムおよびリンに
ついて、有意な対応のあるt検定が、噴霧なしaad−1およびaad−1+キザロホッ
プ参加項目について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わ
なかった。マンガンおよびモリブデンについて、有意な対応のあるt検定が噴霧なしaa
d−1について観察されたが、有意なFDR調整p値および全体的な処理効果は見られな
かった。aad−1+両方の参加項目について、有意な対応のあるt検定が、亜鉛につい
て観察されたが、有意なFDR調整p値または全体的な処理効果は存在しなかった。さら
に、対照からのこれらの相違は小さく(<13%)、全ての値は、入手可能である場合は
文献の範囲内であった。
(Example 6.6.3)
Kernel mineral analysis Corn grains were analyzed for the minerals calcium, chromium, copper, iodine, iron, magnesium, manganese, molybdenum, phosphorus, potassium, selenium, sodium and zinc. A summary of the results across all locations is shown in Table 18. All results were within the literature reported. For inter-site analysis, no significant differences were observed for calcium, copper, iron and potassium. Average results for chromium, iodine, selenium and sodium were below the limit of quantification of the method. For magnesium and phosphorus, significant paired t-tests were observed for the nebulized aad-1 and aad-1 + quizalofop participants but with no significant overall treatment effect or FDR adjusted p-value. For manganese and molybdenum, a significant paired t-test is no spray aa
Although observed for d-1, no significant FDR adjusted p-values and overall treatment effects were seen. For both aad-1 + entries, a significant paired t-test was observed for zinc, but there was no significant FDR adjusted p-value or overall treatment effect. Furthermore, these differences from controls were small (<13%) and all values were within the literature when available.
(実施例6.6.4)
穀粒のアミノ酸解析
トウモロコシ試料を、アミノ酸含量について、対照、噴霧なしaad−1、aad−1
+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方のトウモロコシについ
て解析し、全ての場所にわたるおよび個別の野外の現場による結果のまとめを、表19に
示す。全てのアミノ酸のレベルは報告された文献の範囲内であり、現場間解析における有
意な相違は、アルギニン、リジンおよびチロシンについて観察されなかった。いくつかの
アミノ酸について、現場間解析において有意な相違が観察された。これらの場合において
、対照のアミノ酸含量は、aad−1トランスジェニック系統よりも低く、これは、aa
d−1系統と比較して、対照穀粒における全体的により低いタンパク質含量と関連すると
考えられる。噴霧なしaad−1参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有
意な対応のあるt検定およびFDR調整p値が、アルギニン、グリシン、リジン、トリプ
トファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。aad−1+キザロホ
ップ参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定および
FDR調整p値が、アルギニン、システイン、グリシン、リジン、トリプトファンおよび
チロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。aad−1+2,4−D参加項目につ
いて、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定(有意なFDR調整p値
とともに)が、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、チロシン
およびバリン以外の全てのアミノ酸についてみられた。aad−1+両方の参加項目につ
いて、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定およびFDR調整p値が
、アルギニン、グリシン、リジン、セリン、トリプトファンおよびチロシン以外の全ての
アミノ酸についてみられた。アミノ酸について観察された多くの相違があったが、相違は
小さく(<15%)、全ての現場にわたって観察されず、全ての平均値は、報告された文
献の範囲内であった。
(Example 6.6.4)
Amino acid analysis of kernels Corn samples were tested for amino acid content, control, no spray aad-1, aad-1
Table 19 shows a summary of the results from corn + quizalofop, both aad-1 + 2, 4-D and aad-1 +, and all field and individual field results. All amino acid levels were within the reported literature, and no significant differences in the field analysis were observed for arginine, lysine and tyrosine. For some amino acids, significant differences were observed in the field analysis. In these cases, the control amino acid content is lower than the aad-1 transgenic line, which
It is believed to be associated with an overall lower protein content in the control kernel compared to the d-1 line. For the nebulized aad-1 entry, significant paired t-tests and FDR adjusted p-values were found for all amino acids except arginine, glycine, lysine, tryptophan, and tyrosine with significant overall treatment effects. For the aad-1 + quizalofop entry, significant paired t-tests and FDR adjusted p-values with significant overall treatment effects were seen for all amino acids except arginine, cysteine, glycine, lysine, tryptophan and tyrosine . For aad-1 + 2,4-D participants, a significant paired t-test (with a significant FDR adjusted p-value) with a significant overall treatment effect was found for arginine, aspartic acid, glycine, histidine, lysine, tyrosine and It was found for all amino acids except valine. For both aad-1 + entries, a significant paired t-test and FDR adjusted p-value with a significant overall treatment effect was seen for all amino acids except arginine, glycine, lysine, serine, tryptophan and tyrosine It was. There were many differences observed for amino acids, but the differences were small (<15%), not observed across all sites, and all average values were within the reported literature.
(実施例6.6.5)
穀粒の脂肪酸解析
脂肪酸についてのトウモロコシ穀粒試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のま
とめを、表20に示す。これらの脂肪酸について解析した対照、噴霧なしaad−1、a
ad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方のトウモロコ
シ穀粒試料についての全ての結果は、発表された文献の範囲内であった。カプリル酸(8
:0)、カプリン酸(10:0)、ラウリン酸(12:0)、ミリスチン酸(14:0)
、ミリストレイン酸(14:1)、ペンタデカン酸(15:0)、ペンタデセン酸(15
:1)、ヘプタデカン酸(17:0)、ヘプタデセン酸(17:1)、ガンマリノレン酸
(18:3)、エイコサジエン酸(20:2)、エイコサトリエン酸(20:3)および
アラキドン酸(20:4)についての結果は、方法の定量限界(LOQ)未満であった。
現場間解析において、16:0パルミチン酸、16:1パルミトレイン酸、18:0ステ
アリン酸、18:2リノール酸、18:3リノレン酸および20:0アラキジン酸につい
て有意な相違は観察されなかった。18:1オレイン酸および20:1エイコセイン酸に
ついて、有意な対応のあるt検定が、噴霧なしaad−1(18:1)およびaad−1
+2,4−D(18:1および20:1)参加項目について観察されたが、有意な全体的
な処理効果またはFDR調整p値は伴わなかった。22:0ベヘン酸について、有意な全
体的な処理効果および有意な対応のあるt検定が、aad−1+2,4−Dおよびaad
−1+両方についてみられたが、有意なFDR調整p値は存在しなかった。
(Example 6.6.5)
Fatty acid analysis of kernels Corn kernel samples were analyzed for fatty acids. A summary of the results across all locations is shown in Table 20. Controls analyzed for these fatty acids, no spray aad-1, a
All results for corn kernel samples of both ad-1 + quizalofop, aad-1 + 2,4-D and aad-1 + were within the published literature. Caprylic acid (8
: 0), capric acid (10: 0), lauric acid (12: 0), myristic acid (14: 0)
, Myristoleic acid (14: 1), pentadecanoic acid (15: 0), pentadecenoic acid (15
1), heptadecanoic acid (17: 0), heptadecenoic acid (17: 1), gamma linolenic acid (18: 3), eicosadienoic acid (20: 2), eicosatrienoic acid (20: 3) and arachidonic acid ( The results for 20: 4) were below the limit of quantification (LOQ) of the method.
In the in-situ analysis, no significant differences were observed for 16: 0 palmitic acid, 16: 1 palmitoleic acid, 18: 0 stearic acid, 18: 2 linoleic acid, 18: 3 linolenic acid and 20: 0 arachidic acid. Significant paired t-tests for 18: 1 oleic acid and 20: 1 eicoseiic acid were nebulized aad-1 (18: 1) and aad-1
+ 2,4-D (18: 1 and 20: 1) participants were observed, but with no significant overall treatment effect or FDR adjusted p-value. For 22: 0 behenic acid, a significant overall treatment effect and a significant paired t-test were found for aad-1 + 2,4-D and aad
Although seen for both -1+, there was no significant FDR adjusted p-value.
(実施例6.6.6)
穀粒のビタミン解析
対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよ
びaad−1+両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料におけるビタミ
ンA、B1、B2、B5、B6、B12、C、D、E、ナイアシンおよび葉酸のレベルを
決定した。全ての場所にわたる結果のまとめを、表21に示す。ビタミンB12、Dおよ
びEは、用いた解析方法によって定量可能でなかった。ビタミンについて報告される全て
の平均の結果は、利用可能である場合は報告された文献の値と同様であった。報告された
文献の範囲がないビタミン(ビタミンB5およびC)の結果は、得られた対照の値と同様
であった(対照から<22%の相違)。現場間解析について、ビタミンB1、Cおよびナ
イアシンを除いて、統計学的相違は観察されなかった。ビタミンB1についての有意な対
応のあるt検定が、対照と噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップおよびaad
−1+両方との間に観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わ
なかった。ビタミンCについて、有意な全体的な処理効果が、有意な対応のあるt検定お
よびFDR調整p値とともに、aad−1+キザロホップおよびaad−1+2,4−D
について観察された。ナイアシンについても同様に、有意な全体的な処理効果が、有意な
対応のあるt検定およびFDR調整p値とともに、aad−1+キザロホップおよびaa
d−1+両方について観察された。aad−1+2,4−Dについての有意な対応のある
t検定も、aad−1+2,4−D参加項目についてナイアシンについて見出されたが、
有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わなかった。相違は現場にわたって観
察されず、値は文献の範囲内であった(入手可能である場合)ので、相違は、生物学的に
意味があるとは考えられない。
(Example 6.6.6)
Vitamin analysis of kernels Vitamin A, B1, B2, B5 in corn kernel samples from control, no spray aad-1, aad-1 + quizalofop, aad-1 + 2,4-D and both aad-1 + corn participants B6, B12, C, D, E, niacin and folic acid levels were determined. A summary of the results across all locations is shown in Table 21. Vitamin B12, D and E were not quantifiable by the analysis method used. All average results reported for vitamins were similar to reported literature values when available. Vitamins with no reported literature (vitamins B5 and C) were similar to the control values obtained (<22% difference from controls). For inter-site analysis, no statistical differences were observed except for vitamins B1, C and niacin. Significant paired t-tests for vitamin B1 were control and no spray aad-1, aad-1 + quizalofop and aad
-1+ was observed between both, but with no significant overall treatment effect or FDR adjusted p-value. For vitamin C, a significant overall treatment effect, with a significant paired t-test and FDR adjusted p-value, is aad-1 + quizalofop and aad-1 + 2,4-D
Was observed. Similarly for niacin, a significant overall processing effect, with a significant paired t-test and FDR adjusted p-value, is aad-1 + quizalofop and aa
Observed for both d-1 +. A significant paired t-test for aad-1 + 2,4-D was also found for niacin for the aad-1 + 2,4-D entry,
There was no significant overall treatment effect or FDR adjusted p-value. Differences were not observed across the field and values were within the literature (if available), so differences are not considered biologically meaningful.
(実施例6.6.7)
穀粒の抗栄養素および2次代謝産物の解析
対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよ
びaad−1+両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料における2次代
謝産物(クマル酸、フェルラ酸、フルフラールおよびイノシトール)および抗栄養素(フ
ィチン酸、ラフィノースおよびトリプシン阻害剤)のレベルを決定した。全ての場所にわ
たる結果のまとめを、表22および23に示す。現場間解析について、全ての値は、文献
の範囲内であった。aad−1参加項目と対照参加項目との間で、イノシトールおよびト
リプシン阻害剤について現場間解析において、有意な相違は観察されなかった。フルフラ
ールおよびラフィノースについての結果は、方法の定量限界未満であった。有意な対応の
あるt検定が、クマル酸(噴霧なしaad−1、aad−1+2,4−Dおよびaad−
1+両方)およびフェルラ酸(aad−1+キザロホップおよびaad−1+両方)につ
いて観察された。これらの相違は、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わ
ず、対照と同様であった(<10%の相違)。有意な全体的な処理効果、対応のあるt検
定およびFDR調整p値は、フィチン酸(噴霧なしaad−1)について見出された。全
ての結果は、文献の範囲内であり、対照と同様であったので(<11%の相違)、これら
の相違は、生物学的に意味があるとは考えられない。
(Example 6.6.7)
Analysis of kernel antinutrients and secondary metabolites Secondary in corn kernel samples from control, unsprayed aad-1, aad-1 + quizalofop, both aad-1 + 2,4-D and aad-1 + corn participants The levels of metabolites (coumaric acid, ferulic acid, furfural and inositol) and anti-nutrients (phytic acid, raffinose and trypsin inhibitors) were determined. A summary of results across all locations is shown in Tables 22 and 23. For inter-site analysis, all values were within the literature. No significant differences were observed in the in-situ analysis for inositol and trypsin inhibitor between aad-1 and control participants. The results for furfural and raffinose were below the limit of quantification of the method. Significant paired t-tests were used for coumaric acid (no spray aad-1, aad-1 + 2,4-D and aad-
1+ both) and ferulic acid (both aad-1 + quizalofop and aad-1 +) were observed. These differences were similar to controls (<10% difference) without significant overall treatment effects or FDR adjusted p-values. Significant overall treatment effects, paired t-tests and FDR adjusted p-values were found for phytic acid (no spray aad-1). All results were within the literature and were similar to the control (<11% difference), so these differences are not considered biologically meaningful.
追加の農業経済学的試行
近同質遺伝子系統(near-isoline)のトウモロコシ系統と比較したトウモロコシ系統4
0278の農業経済学的特徴を、多様な環境にわたって評価した。処理は、合計21の場
所で試験された4つの遺伝子的に異なるハイブリッドとそれらの適当な近同質遺伝子系統
対照ハイブリッドとを含んだ。
Additional agro-economic trials Maize lines 4 compared to near-isoline maize lines 4
The agroeconomic characteristics of 0278 were evaluated across a variety of environments. The treatment included 4 genetically different hybrids tested in a total of 21 locations and their appropriate near-isogenic lineage control hybrids.
4つの試験ハイブリッドは、99〜113日の相対的成熟度の範囲の中〜後期成熟度ハ
イブリッドであった。実験Aは、遺伝子背景近交系C×BC3S1転換におけるイベント
DAS−40278−9を試験した。このハイブリッドは、109日の相対的成熟度を有
し、16の場所において試験された(表24)。実験Bは、113日の相対的成熟度のハ
イブリッドであるハイブリッド背景近交系E×BC3S1転換を試験した。このハイブリ
ッドは14の場所で試験され、実験Aとはわずかに異なる場所のセットを用いた(表24
)。実験CおよびDは、ハイブリッド背景BC2S1転換×近交系DおよびBC2S1転
換×近交系Fをそれぞれ試験した。これらのハイブリッドはともに、99日の相対的成熟
度を有し、同じ10の場所で試験された。
The four test hybrids were mid-late maturity hybrids in the 99-113 day relative maturity range. Experiment A tested the event DAS-40278-9 in a genetic background inbred CxBC3S1 transformation. This hybrid had a relative maturity of 109 days and was tested in 16 locations (Table 24). Experiment B tested a hybrid background inbred ExBC3S1 transformation, which is a 113 day relative maturity hybrid. This hybrid was tested at 14 locations, using a slightly different set of locations from Experiment A (Table 24).
). Experiments C and D tested hybrid background BC2S1 conversion x inbred line D and BC2S1 conversion x inbred line F, respectively. Both of these hybrids had a relative maturity of 99 days and were tested in the same 10 locations.
各試行について、完全乱塊法を、場所あたり2つの反復および2列プロットで用いた。
列の長さは20フィートであり、各列は、列あたり34の種子が播種された。標準的な地
域の農業経済学的実施を用いて、試行を管理した。
For each trial, the complete randomized block method was used with two iterations and two-column plots per location.
The row length was 20 feet and each row was sown with 34 seeds per row. Trials were managed using standard regional agroeconomic practices.
8つの農業経済学的特徴についてデータを収集して、解析した;植物高さ、雌穂高さ、
茎倒伏、根倒伏、最終個体群、穀粒水分、試験重量および収率。植物高さおよび雌穂高さ
のパラメータは、ハイブリッドの外観についての情報を提供する。パーセント茎倒伏およ
び根倒伏の農業経済学的特徴は、ハイブリッドの収穫しやすさ(harvestability)を決定
する。最終個体群のカウントは、収率に影響する種子の質および季節成長条件を測定する
。収穫時のパーセント穀粒水分は、ハイブリッドの成熟度を規定し、収率(湿度について
調整したブッシェル/エーカー)および試験重量(15.5%湿度に調整した1ブッシェ
ル(bushel)のトウモロコシのポンドでの重量)は、ハイブリッドの生殖能を表す。
Data were collected and analyzed for eight agroeconomic characteristics; plant height, ear height,
Stem lodging, root lodging, final population, grain moisture, test weight and yield. The plant height and ear height parameters provide information about the appearance of the hybrid. The agro-economic characteristics of percent stem and root lodging determine the harvestability of the hybrid. Final population counts measure seed quality and seasonal growth conditions that affect yield. Percent grain moisture at harvest dictates the maturity of the hybrid, in yield (bushel / acre adjusted for humidity) and test weight (1 bushel corn pound adjusted to 15.5% humidity) ) Represents the fertility of the hybrid.
分散分析を、線形モデルを用いて野外現場にわたって行った。参加項目および場所を、
固定された影響としてモデルに含めた。場所および無作為な影響としての参加項目による
場所を含む混合モデルを探索したが、参加項目による場所は、分散の小さい部分だけを説
明し、その分散の要素は、しばしば、ゼロから大きくは異ならなかった。茎および根の倒
伏について、対数変換を用いて分散を安定させたが、平均および範囲は元の尺度について
報告する。有意な相違は、95%信頼レベルにて得られた。全体的な処理効果の有意性は
、t検定を用いて見積もった。
Analysis of variance was performed across the field using a linear model. Participating items and locations
Included in the model as a fixed effect. We searched for a mixed model that includes location and location by random participation, but the location by participation only explains a small part of the variance, and its variance component is often not significantly different from zero. It was. For stem and root lodging, logarithmic transformation was used to stabilize the variance, but the mean and range are reported on the original scale. Significant differences were obtained at the 95% confidence level. The significance of the overall treatment effect was estimated using the t test.
これらの農業経済学的特徴決定の試行からの結果を、表2において見出すことができる
。統計的に有意な相違は、雌穂高さ、茎倒伏、根倒伏、穀粒水分、試験重量および収率の
パラメータについて、同質遺伝子系統対照と比較して4つの40278ハイブリッドのい
ずれについても見られなかった(p<0.05にて)。最終個体群カウントおよび植物高
さは、実験AおよびBにおいてそれぞれ統計的に相違したが、試験したその他の4027
8ハイブリッドとの比較において同様の相違は見られなかった。見られたばらつきのいく
らかは、エリート近交系統へのDAS−40278−9イベントの戻し交雑から残ってい
る遺伝的変異性のレベルが低いことによる可能性がある。測定されたパラメータについて
の値の全体的な範囲は、全て伝統的なトウモロコシハイブリッドについて得られた値の範
囲内であり、雑草性の増加という結論は導かれない。まとめると、農業経済学的特徴のデ
ータは、40278トウモロコシが、従来のトウモロコシと生物学的に等価であることを
示す。
The results from these agroeconomic characterization trials can be found in Table 2. No statistically significant differences were found for any of the four 40278 hybrids in terms of ear height, stem lodging, root lodging, grain moisture, test weight and yield parameters compared to isogenic line controls. (At p <0.05). Final population counts and plant heights were statistically different in experiments A and B, respectively, but the other 4027 tested
Similar differences were not seen in comparison with the 8-hybrid. Some of the variability seen may be due to the low level of genetic variability remaining from the backcross of DAS-40278-9 events to elite inbred lines. The overall range of values for the measured parameters are all within the range of values obtained for traditional corn hybrids, and no conclusion can be drawn on increased weediness. In summary, agro-economic data shows that 40278 corn is biologically equivalent to conventional corn.
標的にされた組み込みのためのトウモロコシイベントDAS−40278−9挿入部位の
使用
野外条件下で数世代にわたってトウモロコシイベントDAS−40278−9の導入遺
伝子の農業経済学的性能が安定していることは、トウモロコシイベントDAS−4027
8−9挿入部位の周囲のこれらの同定された領域が、対象のその他のトランスジェニック
遺伝子の標的にされた組み込みについての良好なゲノムの場所を提供することを示唆する
。このような標的にされた組み込みは、いわゆる「位置効果」および導入遺伝子を宿主に
組み込む際にゲノムに変異を創出する危険性の問題を克服する。このような標的にされた
組み込みのさらなる利点は、それらに限定されないが、宿主ゲノムの重要な遺伝子座に導
入遺伝子を偶発的に挿入することに起因する異常をも示すことなく所望のレベルの導入遺
伝子の発現を示すトランスジェニック植物を得る前にスクリーニングして試験されなけれ
ばならない多数の形質転換イベントを減らすことを含む。さらに、このような標的にされ
た組み込みは、両方の遺伝子を有するエリート植物系統の育種をより効率的にする、導入
遺伝子の掛け合わせを可能にする。
Use of Corn Event DAS-40278-9 Insertion Site for Targeted Integration The stable agro-economic performance of the corn event DAS-40278-9 transgene over several generations under field conditions Corn Event DAS-4027
It is suggested that these identified regions around the 8-9 insertion site provide a good genomic location for targeted integration of other transgenic genes of interest. Such targeted integration overcomes the problems of so-called “positional effects” and the risk of creating mutations in the genome when integrating the transgene into the host. Additional benefits of such targeted integration include, but are not limited to, the desired level of introduction without showing any abnormalities due to accidental insertion of the transgene at key loci in the host genome. This includes reducing the number of transformation events that must be screened and tested before obtaining transgenic plants exhibiting gene expression. In addition, such targeted integration allows cross-gene crossing, which makes breeding of elite plant lines carrying both genes more efficient.
開示される教示を用いて、当業者は、対象のポリ核酸を、トウモロコシイベントDAS
−40278−9におけるものと同じ第2染色体上の挿入部位、またはトウモロコシイベ
ントDAS−40278−9における挿入部位に近い部位に標的させることができる。あ
るこのような方法は、国際特許出願第WO2008/021207号(本明細書に参照に
よりその全体が組み込まれている)に開示される。
Using the disclosed teachings, one of ordinary skill in the art can convert a subject polynucleic acid into a corn event DAS.
It can be targeted to the same insertion site on chromosome 2 as that at -40278-9 or close to the insertion site at corn event DAS-40278-9. One such method is disclosed in International Patent Application No. WO 2008/021207, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
簡単に述べると、挿入部位の5’に接する20Kbまでのゲノム配列および挿入部位の
3’に接する20Kbまでのゲノム配列(その部分は、配列番号29を参照して同定され
る)は、相同組換えにより第2染色体上のゲノム位置に挿入しようとする1または複数の
対象の遺伝子に接して用いられる。1または複数の対象の遺伝子は、トウモロコシイベン
トDAS−40278−9挿入部位におけるものと全く同じように配置できるか、または
トウモロコシイベントDAS−40278−9挿入部位の周囲の20Kb領域内のいずれ
かの場所に配置して、植物に有害な影響を与えることなく導入遺伝子発現の一定のレベル
を与えることができる。1または複数の対象の遺伝子およびフランキング配列を含有する
DNAベクターは、それらに限定されないが、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒
介形質転換を含む当業者に知られるいくつかの方法の1つにより植物細胞に送達できる。
ドナーDNAベクターをトウモロコシイベントDAS−40278−9標的部位に挿入す
ることは、それらに限定されないが、組換え増進遺伝子の同時発現もしくは上方制御また
は内因性組換え抑制遺伝子の下方制御を含むいくつかの方法の1つによりさらに増進でき
る。さらに、ゲノム内の特定の配列の2本鎖切断を用いて、相同組換え頻度を増加させる
ことができ、よってトウモロコシイベントDAS−40278−9挿入部位およびそのフ
ランキング領域への挿入を、これらの配列を切断するための天然もしくは設計された配列
特異的エンドヌクレアーゼの発現により増進できることが当該技術において知られている
。つまり、本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核酸を、トウモロコシ第2染
色体上に、実施例4で論じた5’分子マーカーと実施例4で論じた3’分子マーカーとの
間にある標的部位、好ましくは配列番号29内のもの、および/または本明細書の他の所
で論じるその領域にて挿入できる。
Briefly, genomic sequences up to 20 Kb in contact with 5 ′ of the insertion site and up to 20 Kb in contact with 3 ′ of the insertion site (parts of which are identified with reference to SEQ ID NO: 29) It is used in contact with one or a plurality of target genes to be inserted into the genomic position on the second chromosome by replacement. The gene or genes of interest can be placed exactly as in the corn event DAS-40278-9 insertion site, or anywhere in the 20 Kb region around the corn event DAS-40278-9 insertion site To provide a certain level of transgene expression without adversely affecting the plant. A DNA vector containing one or more genes of interest and flanking sequences can be produced by one of several methods known to those skilled in the art including, but not limited to, Agrobacterium-mediated transformation. Can be delivered to.
Inserting a donor DNA vector into the maize event DAS-40278-9 target site includes, but is not limited to, several methods including co-expression or upregulation of recombination enhancing genes or downregulation of endogenous recombination suppressor genes. It can be further enhanced by one of the methods. In addition, double-strand breaks in specific sequences within the genome can be used to increase the frequency of homologous recombination, thus inserting the corn event DAS-40278-9 insertion site and its flanking region into these It is known in the art that it can be enhanced by expression of natural or engineered sequence-specific endonucleases to cleave sequences. That is, using the teachings provided herein, any heterologous nucleic acid can be placed on corn chromosome 2 between the 5 ′ molecular marker discussed in Example 4 and the 3 ′ molecular marker discussed in Example 4. It can be inserted at an intervening target site, preferably within SEQ ID NO: 29, and / or that region discussed elsewhere herein.
トウモロコシイベントDAS−40278−9からのpat遺伝子発現カセットの切り出
し
選択マーカー遺伝子発現カセットの除去は、トウモロコシイベントDAS−40278
−9のゲノム遺伝子座への標的にされた挿入にとって有利である。pat選択マーカーを
トウモロコシイベントDAS−40278−9から除去することにより、ポリ核酸をトウ
モロコシのその後の世代において第4染色体を標的にして組み込むためにpat選択マー
カーを再使用することが可能になる。
Excision of the pat gene expression cassette from corn event DAS-40278-9 The removal of the selectable marker gene expression cassette is performed in corn event DAS-40278.
Advantageous for targeted insertion at the genomic locus of -9. Removal of the pat selectable marker from corn event DAS-40278-9 allows the pat selectable marker to be reused to target polynucleic acids to target chromosome 4 in subsequent generations of corn.
開示された教示を用いて、当業者は、対象のポリ核酸を、トウモロコシイベントDAS
−40278−9から切り出すことができる。あるこのような方法は、米国仮特許出願第
61/297,628号(本明細書に参照によりその全体が組み込まれている)に開示さ
れる。
Using the disclosed teachings, one of ordinary skill in the art can convert a subject polynucleic acid into a corn event DAS.
It can be cut out from -40278-9. One such method is disclosed in US Provisional Patent Application 61 / 297,628, which is incorporated by reference herein in its entirety.
簡単に述べると、遺伝子発現カセットの側面に位置する特定のDNA配列を認識し、結合して切断するジンクフィンガーヌクレアーゼのような配列特異的エンドヌクレアーゼを設計する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、トランスジェニックジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットを含有する親の植物を、トウモロコシイベントDAS−40278−9を含有する第2の親の植物と交雑させることにより植物細胞に送達される。得られる子孫を成熟まで成長させ、pat発現カセットの喪失を、グルフォシネートを含有する除草剤を用いる葉の塗装により解析する。除草剤に抵抗性でない子孫植物を、分子的に確認し、自家繁殖に進む。pat発現カセットの切り出しおよび除去は、自家繁殖から得られる子孫において分子的に確認される。本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核酸を、トウモロコシの第2染色体から、実施例4で論じた5’分子マーカーと3’分子マーカーとの間にある標的部位、好ましくは配列番号29内にあるもの、またはその示された領域にて切り出すことができる。
Briefly, a sequence-specific endonuclease such as a zinc finger nuclease that recognizes, binds and cleaves a specific DNA sequence located on the side of a gene expression cassette is designed. Zinc finger nucleases are delivered to plant cells by crossing a parent plant containing the transgenic zinc finger nuclease expression cassette with a second parent plant containing the corn event DAS-40278-9. The resulting offspring are grown to maturity and the loss of the pat expression cassette is analyzed by painting leaves with a herbicide containing glufosinate. Progeny plants that are not resistant to herbicides are molecularly identified and self-propagated. The excision and removal of the pat expression cassette is confirmed molecularly in the offspring obtained from self-breeding. Using the teaching provided herein, any heterologous nucleic acid can be transferred from corn chromosome 2 to a target site, preferably between the 5 ′ and 3 ′ molecular markers discussed in Example 4, It can be excised at that shown in SEQ ID NO: 29, or at the indicated region.
ブリトルスナップ(brittlesnap)への抵抗性
ブリトルスナップとは、通常、迅速成長期中の成長調節除草剤の散布後に強風によりトウモロコシの茎がくずれることをいう。強風による被害をシミュレートするためにトウモロコシを物理的に押す棒を用いる機械的「プッシュ」試験を、イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシおよびイベントDAS−40278−9を含有しない対照植物について行った。処理は、4つの地理的に異なる場所で完了し、4回反復した(例外として3回だけ反復した1つの試行があった)。プロットは、8列からなった:2列はイベントDAS−40278−9を含有し、2列はイベントを含有しない、2つのハイブリッドのそれぞれの4列。各列は20フィートの長さであった。トウモロコシ植物は、V4発達段階まで成長させ、2,4−Dを含有する市販の除草剤(Weedar 64、Nufarm Inc.、Burr Ridge、IL)を、1120g ae/ha、2240g ae/haおよび4480g ae/haの割合で用いた。除草剤を用いた7日後に、機械的プッシュ試験を行った。ブリトルスナップについての機械的プッシュ試験は、風被害をシミュレートするために、4フィートの棒で2列のトウモロコシを引き倒すことからなった。棒の高さおよび移動の速さは、未処理の植物を用いて低レベルの茎の破壊(10%以下)をもたらすように設定して、処理間で相違が証明されるのに十分に試験が厳しいことを確実にした。ブリトルスナップ処理の指向性は、もたれかかったトウモロコシに対して用いた。
Resistance to brittlesnap Brittle snap usually refers to the breakage of corn stalks by strong winds after the application of growth-regulating herbicides during the fast growing season. A mechanical “push” test using a bar that physically pushes the corn to simulate storm damage was performed on hybrid corn containing Event DAS-40278-9 and control plants not containing Event DAS-40278-9. went. The process was completed at four geographically different locations and repeated four times (with one exception that was repeated only three times). The plot consisted of 8 columns: 2 columns contain event DAS-40278-9, 2 columns contain no events, 4 columns each of the two hybrids. Each row was 20 feet long. Corn plants are grown to the V4 developmental stage and commercially available herbicides containing 2,4-D (Weedar 64, Nufarm Inc., Burr Ridge, IL) are loaded with 1120 g ae / ha, 2240 g ae / ha and 4480 g ae. Used at a rate of / ha. A mechanical push test was performed after 7 days with the herbicide. The mechanical push test on Brittle Snap consisted of pulling down two rows of corn with a 4 foot stick to simulate wind damage. Bar height and speed of movement are set to produce low levels of stem destruction (less than 10%) using untreated plants and tested well to demonstrate differences between treatments Ensured that it was tough. The direction of Brittle Snap was used for leaning corn.
試行場所のうち2つは、強風および雷雨を、2,4−D除草剤を用いた2〜3日後に経
験した。2日連続で、雷雨がHuxley IAで始まった。高速で33m s−1で2
〜17m s−1の風速が、野外プロットの現場で報告された。風の方向は、変動した。
雷雨がLanesboro MNで1日間報告された。高速の風が、この野外プロットの
現場で報告された。さらに、両方の嵐は、雨を伴った。雨と風の組み合わせは、報告され
たブリトルスナップ被害のせいであった。
Two of the trial sites experienced strong winds and thunderstorms after 2-3 days with 2,4-D herbicides. For two consecutive days, a thunderstorm began in Huxley IA. 2 at 33 m s -1 at high speed
A wind speed of ˜17 m s −1 was reported in the field plot. The direction of the wind fluctuated.
A thunderstorm was reported for 1 day at Lanesboro MN. High speed winds were reported at the field plot site. In addition, both storms were accompanied by rain. The combination of rain and wind was attributed to the reported Brittle Snap damage.
機械的プッシュ試験(および悪天候)に起因するブリトルスナップ被害の評価を、損傷
のパーセンテージを視覚的に評価することにより行った。ブリトルスナップの機械的な棒
による処理の前に、植物の立木のカウントを、イベントDAS−40278−9を含有す
るハイブリッドトウモロコシおよび対照について行った。ブリトルスナップの棒での処理
の数日後に、プロット立木カウントを再評価した。プロット内のもたれかかりのパーセン
テージおよび立木のパーセンテージの減少を決定した(表26)。試行からのデータは、
イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシが、2,4−Dを
用いた後に、ヌル植物と比較してブリトルスナップの傾向がより低いことを証明した。
An assessment of Brittle Snap damage due to mechanical push tests (and bad weather) was made by visually assessing the percentage of damage. Prior to treatment with Brittle Snap mechanical bars, plant stand counts were performed for hybrid maize containing the event DAS-40278-9 and controls. The plot standing count was re-evaluated several days after treatment with the Brittle Snap bar. The percentage of leaning and the percentage of standing trees in the plot were determined (Table 26). The data from the trial is
Hybrid corn containing event DAS-40278-9 proved less prone to brittle snaps after using 2,4-D compared to null plants.
穀粒のタンパク質解析
イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシから、イベント
を含有しない対照植物と比較して全タンパク質含量が増加した穀粒を作出した。2つの連
続する多点野外試行を行ったが、これは、噴霧なしおよび除草剤処理を、3つの異なる除
草剤の組み合わせで含んだ。8つの統計学的比較のうち7つにおいて、DAS−4027
8−9イベントは、有意により高い全タンパク質含量を有する穀粒を作出した(表27)
。このデータは、個別のアミノ酸の解析により確証される。
Kernel Protein Analysis Kernels with increased total protein content were produced from hybrid maize containing event DAS-40278-9 compared to control plants containing no event. Two consecutive multi-point field trials were performed, which included no spraying and herbicide treatment in three different herbicide combinations. In 7 of 8 statistical comparisons, DAS-4027
The 8-9 event produced grains with significantly higher total protein content (Table 27)
. This data is confirmed by analysis of individual amino acids.
追加の農業経済学的形質
近同質遺伝子系統(near-isoline)トウモロコシと比較した、イベントDAS−402
78−9を含有するハイブリッドトウモロコシの農業経済学的特徴を、成長季節について
の多様な地理的環境にわたって複数の野外試行から回収した。データを、実施例7に記載
されるような農業経済学的特徴について収集して解析した。ヌル植物と比較した、イベン
トDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシ系統についての結果を、
表28に列挙する。さらに、発達のV3段階にて除草剤キザロホップ(280g ae/
ha)および発達のV6段階にて噴霧された2,4−D(2,240g ae/ha)を
噴霧したイベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシ系統およ
びヌル植物についての農業経済学的特徴を、表29に記載する。
Additional agroeconomic traits Event DAS-402 compared to near-isoline maize
The agroeconomic characteristics of hybrid corn containing 78-9 were recovered from multiple field trials across a variety of geographical environments for the growing season. Data was collected and analyzed for agro-economic features as described in Example 7. Results for a hybrid maize line containing event DAS-40278-9 compared to null plants,
Table 28 lists. Furthermore, at the V3 stage of development, the herbicide quizalofop (280 g ae /
agro-economic characteristics of hybrid maize lines and null plants containing event DAS-40278-9 sprayed with ha) and 2,4-D (2,240 g ae / ha) sprayed at stage V6 of development Are listed in Table 29.
配列番号1〜28は、本明細書に記載されるプライマーである。
配列番号29は、主題のイベントDAS−40278−9についての挿入断片およびフ
ランキング配列を示す。
配列番号30〜33は、実施例4に記載されるフランキングマーカーについてのプライ
マーである。
SEQ ID NOs: 1-28 are primers described herein.
SEQ ID NO: 29 shows the insert and flanking sequence for the subject event DAS-40278-9.
SEQ ID NOs: 30-33 are primers for the flanking markers described in Example 4.
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