JP2016136941A5

JP2016136941A5 -

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Publication number: JP2016136941A5
Application number: JP2016005979A
Authority: JP
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2016-09-15
Anticipated expiration: 2030-08-18

Description

ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入されたＤＮＡの分子特徴決定も、本明細書に記載される。イベントは、プラスミドｐＤＡＳ１７４０のＦｓｐＩ断片を用いるウィスカー形質転換により生成した。サザンブロット解析を用いて、挿入されたＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１遺伝子の挿入断片／コピーの数を決定した。データを作製して、トウモロコシゲノムに挿入されたａａｄ−１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。プロモーターおよびターミネーターのような非コード領域（コード領域を調節するように設計された）、マトリクス付着領域ＲＢ７Ｍａｒｖ３およびＲＢ７Ｍａｒｖ４の組み込みの特徴決定、ならびに世代にわたる導入遺伝子挿入断片の安定性を評価した。挿入されたＤＮＡの安定性は、植物の５つの異なる世代にわたって証明された。さらに、アンピシリン抵抗性遺伝子（Ａｐ^ｒ）領域を含む形質転換プラスミド主鎖配列が存在しないことを、プラスミドｐＤＡＳ１７４０の制限部位（ＦｓｐＩ）に接する主鎖領域のほぼ全体をカバーするプローブにより証明した。挿入の詳細な物理的な地図は、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のこれらのサザンブロット解析に基づいて描いた。

Also described herein is the molecular characterization of the inserted DNA at the AAD-1 corn event DAS-40278-9. Events were generated by whisker transformation using the FspI fragment of plasmid pDAS1740. Southern blot analysis was used to establish the integration pattern of the inserted DNA fragment and to determine the number of inserts / copy of the aad-1 gene at event DAS-40278-9. Data was generated to verify the integration and integrity of the aad-1 transgene inserted into the maize genome. Characterization of integration of non-coding regions such as promoters and terminators (designed to regulate the coding region), matrix attachment regions RB7 Mar v3 and RB7 Mar v4, and stability of transgene inserts across generations did. The stability of the inserted DNA has been demonstrated over five different generations of plants. Furthermore, the absence of a transformed plasmid backbone sequence containing the ampicillin resistance gene (Ap ^r ) region was verified by a probe covering almost the entire backbone region in contact with the restriction site (FspI) of plasmid pDAS1740. A detailed physical map of the insert was drawn based on these Southern blot analyzes of event DAS-40278-9.

全ての主題の開示に鑑みて、主題の発明が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２４４の下で利用可能な種子を含むことが明確である。主題の発明は、受託番号ＰＴＡ−１０２４４の下でＡＴＣＣに寄託された種子から成長した除草剤抵抗性トウモロコシ植物も含む。主題の発明は、葉のような上記の植物の一部分、組織試料、上記の植物により作出される種子、花粉などをさらに含む。

In view of all subject disclosures, it is clear that the subject invention includes seeds that are available under ATCC Deposit Number PTA-10244. The subject invention also includes herbicide- resistant corn plants grown from seed deposited with the ATCC under accession number PTA-10244. The subject invention further includes parts of the above plants such as leaves, tissue samples, seeds produced by the above plants, pollen and the like.

さらに、主題の発明は、寄託された種子から成長した植物の子孫（descendant）および／または子孫（progeny）植物、好ましくは除草剤抵抗性トウモロコシ植物であって、上記の植物が、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムＤＮＡ／挿入断片ＤＮＡ接合部配列を含むゲノムを有する植物を含む。本明細書で用いる場合、用語「トウモロコシ」は、メイズ（ゼア・メイズ（Zea mays））を意味し、トウモロコシと育種できるその全ての品種を含む。

Further, the subject invention is a descendant and / or progeny plant, preferably a herbicide- resistant corn plant, of a plant grown from the deposited seed, wherein said plant is herein Includes plants having a genome comprising a detectable wild type genomic DNA / insert DNA junction sequence as described. As used herein, the term “corn” means maize (Zea mays) and includes all varieties thereof that can be bred with corn.

除草剤耐性トウモロコシ植物は、本明細書で言及する系統のいずれか１つの種子から成長したトウモロコシ植物からなる第１の親のトウモロコシ植物と、第２の親のトウモロコシ植物とをまず有性交雑させ、それにより複数の第１子孫植物を作出し、次いで、除草剤に抵抗性の第１子孫植物（または主題の発明のイベントの少なくとも１つを有するもの）を選択し、第１子孫植物を自家生殖し、それにより複数の第２子孫植物を作出し、次いで、第２子孫植物から、除草剤に抵抗性の植物（または主題の発明のイベントの少なくとも１つを有するもの）を選択することにより育種できる。これらのステップは、第１子孫植物または第２子孫植物を、第２の親のトウモロコシ植物または第３の親のトウモロコシ植物と戻し交雑することをさらに含み得る。主題の発明のトウモロコシ種子を含むトウモロコシ作物またはその子孫を、次いで、植えることができる。

A herbicide-tolerant corn plant first sexually crosses a first parent corn plant consisting of a corn plant grown from the seed of any one of the lines referred to herein with a second parent corn plant. Thereby producing a plurality of first progeny plants, then selecting a first progeny plant that is resistant to the herbicide (or having at least one event of the subject invention) and By regenerating and thereby producing a plurality of second progeny plants, and then selecting, from the second progeny plants, plants that are resistant to the herbicide (or that have at least one event of the subject invention) Can breed. These steps may further include backcrossing the first progeny plant or the second progeny plant with the second parent corn plant or the third parent corn plant. The corn crop or its progeny containing the corn seed of the subject invention can then be planted.

本発明のＤＮＡ分子は、マーカー支援育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして用いることができる。本発明のＤＮＡ分子は、当該技術において知られるように、遺伝子的に連結した農業経済学的に有用な形質を同定する方法において用いることができる（例えばＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲ）。除草剤抵抗性形質は、主題の発明のトウモロコシ植物との交雑の子孫（またはその子孫および任意のその他のトウモロコシ栽培変種または品種）において、ＭＡＢ法を用いて追跡できる。ＤＮＡ分子は、この形質についてのマーカーであり、当該技術において公知のＭＡＢ法を用いて、主題の発明の少なくとも１つのトウモロコシ系統またはその子孫は、親または祖先であったトウモロコシ植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡できる。本発明の方法を用いて、主題のイベントを有する任意のトウモロコシ品種を同定できる。

The DNA molecule of the present invention can be used as a molecular marker in a marker-assisted breeding (MAB) method. The DNA molecules of the present invention can be used in methods for identifying genetically linked agroeconomically useful traits as known in the art (eg, AFLP markers, RFLP markers, RAPD markers, SNPs and SSR). Herbicide resistance traits can be tracked using the MAB method in the offspring (or their offspring and any other corn cultivars or varieties) with the corn plant of the subject invention. A DNA molecule is a marker for this trait, and using MAB methods known in the art, at least one corn line of the subject invention or its progeny is herbicide resistant in a corn plant that was the parent or ancestor . Track trait (s). The method of the present invention can be used to identify any corn varieties having a subject event.

主題の発明の方法は、除草剤耐性トウモロコシ植物を作出する方法であって、主題の発明の植物を育種するステップを含む方法を含む。より具体的には、上記の方法は、主題の発明の２つの植物、または主題の発明の１つの植物と任意のその他の植物とを交雑するステップを含み得る。好ましい方法は、上記の交雑種の子孫を、主題の発明に従って検出可能なイベントについて上記の子孫を解析することにより選択するステップをさらに含む。例えば、主題の発明は、種々の実施例において本明細書で試験されるもののような農業経済学的形質のようなその他の所望の形質を含む植物との育種サイクル中に主題のイベントを追跡するために用いることができる。主題のイベントおよび所望の形質を含む植物は、例えば検出でき、同定でき、選択でき、さらなる回の育種において迅速に用いることができる。主題のイベント／形質は、昆虫抵抗性形質（複数可）および／またはさらなる除草剤耐性形質と育種により組み合わせ、主題の発明に従って追跡できる。後者のある好ましい実施形態は、除草剤ジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせた主題のイベントを含む植物である。

The subject inventive method includes a method of producing a herbicide-tolerant corn plant comprising breeding the subject inventive plant. More specifically, the above method may comprise the step of crossing two plants of the subject invention, or one plant of the subject invention with any other plant. Preferred methods further comprise the step of selecting the progeny of said hybrid by analyzing said progeny for events detectable in accordance with the subject invention. For example, the subject invention tracks the subject event during a breeding cycle with a plant containing other desired traits such as agroeconomic traits such as those tested herein in various embodiments. Can be used for Plants containing the subject event and the desired trait can, for example, be detected, identified, selected and used rapidly in further rounds of breeding. The subject event / trait can be combined by breeding with insect resistance trait (s) and / or additional herbicide tolerance traits and can be tracked according to the subject invention. One preferred embodiment of the latter is a plant comprising the subject event combined with a gene encoding resistance to the herbicide dicamba.

したがって、主題の発明は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば抵抗性植物または細菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルフォシネート抵抗性（例えばＰａｔ、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害除草剤抵抗性（例えばイミダゾリノン［例えばイマゼタピル］、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピルミジニルチオベンゾエート（pyrmidinylthiobenzoates）およびその他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡら］）、ブロモキシニル抵抗性（例えばＢｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害除草剤に対する抵抗性（例えばｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノゲン酸化酵素ＩＸ（ＰＰＯ）阻害除草剤に対する抵抗性（例えばＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤に対する抵抗性（例えばＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えばＵＳ２００３０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを単独または複数の組み合わせで掛け合わせて、雑草のシフトおよび／もしくは上記のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を効果的に制御または妨げる能力を提供できる。

Thus, the subject invention includes, for example, glyphosate resistance (eg, resistant plant or bacterial EPSPS, GOX, GAT), glufosinate resistance (eg, Pat, bar), acetolactate synthase (ALS) inhibitory herbicide resistance ( For example, imidazolinones [eg imazetapyr], sulfonylureas, triazolopyrimidinesulfonanilides, pyrmidinylthiobenzoates and other chemicals [Csr1, SurA et al.], Bromoxynyl resistance (eg Bxn), HPPD (4- hydroxyphenyl - pyruvate - resistance to dioxygenase) inhibitors of the enzyme, resistance to inhibitors of phytoene desaturase (PDS), resistance to photosystem II inhibiting herbicides (e.g. psbA), photosystem I inhibitors herbicides To the agent Resistance to, protoporphyrinogen oxidase IX (PPO) resistance to inhibitors herbicides (e.g. PPO-1), resistance to phenylurea herbicides (e.g. CYP76B1), (see, for example, US20030135879) dicamba degrading enzymes Ability to effectively control or prevent weed shift and / or resistance to any herbicide of the above class, when combined with one or more combinations Can be provided.

さらに、ＡＡＤ−１単独または１もしくは複数の追加のＨＴＣ形質を掛け合わせたものは、１または複数の追加の入力（例えば昆虫抵抗性、真菌抵抗性またはストレス耐性など）または出力（例えば収率の増加、油プロファイルの改善、繊維の質の改善など）形質と掛け合わせることができる。したがって、主題の発明を用いて、任意の数の農業経済学的害虫を柔軟にかつ経済的に効率よく制御する能力を有する、作物の質が改善された完全な農業経済学的パッケージを提供できる。

In addition, AAD-1 alone or multiplied by one or more additional HTC traits can be one or more additional inputs (such as insect resistance , fungal resistance or stress resistance) or output (such as yields). (Increased, improved oil profile, improved fiber quality, etc.). Thus, the subject invention can be used to provide a complete agro-economic package with improved crop quality that has the ability to flexibly and economically efficiently control any number of agro-economic pests .

本明細書で用いる場合、遺伝子、イベントまたは形質を「掛け合わせる」ことは、所望の形質を１つのトランスジェニック系統に組み合わせることである。植物育種家は、トランスジェニック形質を、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑種を作製し、次いでこれらの所望の形質の両方を有する子を同定することにより掛け合わせる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、２以上の遺伝子を、植物の細胞核に、形質転換中に同時に伝達することによる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、トランスジェニック植物を、対象の別の遺伝子で再形質転換することによる。例えば、遺伝子掛け合わせは、例えば２以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数可）および疾患抵抗性形質（複数可）、２以上の除草抵抗性性形質、ならびに／または昆虫抵抗性形質（複数可）および除草剤抵抗性形質（複数可）を含む２以上の異なる形質を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝子に加えて選択マーカーを用いることは、遺伝子掛け合わせと考えることもできる。

As used herein, “multiplying” a gene, event or trait is the combination of the desired trait into a single transgenic line. A plant breeder multiplies the transgenic traits by creating crossbreds of parents each having the desired trait and then identifying offspring that have both of these desired traits. Another way of multiplying genes is by simultaneously transferring two or more genes to the plant cell nucleus during transformation. Another way of crossing genes is by retransforming the transgenic plant with another gene of interest. For example, gene crossing can include, for example, two or more different insect traits, insect resistance trait (s) and disease resistance trait (s), two or more herbicidal resistance traits, and / or insect resistance traits ( Can be used to combine two or more different traits, including her (s) and herbicide resistant trait (s). Using a selectable marker in addition to the gene of interest can also be thought of as gene crossing.

主題のＡＡＤ−１酵素は、ほぼ全ての広葉雑草および禾本雑草（grass weeds）を制御する除草剤の組み合わせに対する耐性をもたらすトランスジェニック発現を可能にする。ＡＡＤ−１は、例えばその他の除草剤耐性作物（ＨＴＣ）形質（例えばグリホサート抵抗性、グルフォシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ブロモキシニル抵抗性など）および昆虫抵抗性形質（Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ３４／４５など）と掛け合わせるための優れたＨＴＣ形質として働くことができる。さらに、ＡＡＤ−１は、第２の遺伝子または遺伝子の群で遺伝子的に工学的に操作された植物の１次形質転換体の選択を助けるための選択マーカーとして働くことができる。

The subject AAD-1 enzyme allows for transgenic expression resulting in resistance to a combination of herbicides that control almost all broadleaf and grass weeds. AAD-1 is, for example, other herbicide tolerant crop (HTC) traits (eg glyphosate resistance , glufosinate resistance , imidazolinone resistance , bromoxynyl resistance, etc.) and insect resistance traits (Cry1F, Cry1Ab, Cry34 / 45, etc.) ) And can serve as an excellent HTC trait. Furthermore, AAD-1 can serve as a selectable marker to assist in the selection of plant primary transformants genetically engineered with a second gene or group of genes.

主題の発明のＨＴＣ形質は、その他のＨＴＣ形質（それに限定されないが、グリホサート耐性を含む）との新規な組み合わせにおいて用いることができる。形質のこれらの組み合わせにより、新しく獲得した抵抗性または除草剤（例えばグリホサート）に対する固有の耐性により、雑草（など）の種を制御する新規な方法が得られる。つまり、ＨＴＣ形質に加えて、除草剤を用いて雑草を制御するための新規な方法（除草剤耐性は、トランスジェニック作物における上記の酵素により確立された）は、本発明の範囲内である。

The HTC trait of the subject invention can be used in novel combinations with other HTC traits, including but not limited to glyphosate resistance. These combinations of traits provide a new way of controlling weed (etc.) species through newly acquired resistance or inherent resistance to herbicides (eg glyphosate). That is, in addition to HTC traits, a novel method for controlling weeds with herbicides (herbicide resistance established by the above-described enzymes in transgenic crops) is within the scope of the present invention.

さらに、グリホサート耐性作物を世界的に成長させることが普及している。その他のグリホサート耐性作物との輪作が多数になると、グリホサート抵抗性の自生植物（volunteers）の制御は、輪作作物において困難になることがある。したがって、掛け合わされたかまたは作物に個別に形質転換された主題のトランスジェニック形質の使用は、その他のＨＴＣ自生作物の制御のためのツールを提供する。

In addition, growing glyphosate-tolerant crops worldwide is widespread. As the number of rotations with other glyphosate-tolerant crops increases, control of glyphosate- resistant volunteers can be difficult in rotation crops. Thus, the use of the subject transgenic traits that have been multiplied or individually transformed into crops provides a tool for the control of other HTC native crops.

「農業経済学的にエリート」は、系統が、収率、成熟度、疾患抵抗性などのような所望の農業経済学的特徴を、主題のイベント（複数可）による昆虫抵抗性に加えて有することを意味する。以下の実施例に示すように、主題の発明のイベントを含む植物において個別または任意の組み合わせで考慮される農業経済学的形質は、主題の発明の範囲内である。これらの農業経済学的特徴およびデータ点のいずれかおよび全てを用いて、このような植物を規定するために用いる特徴の範囲における点として、または一端もしくは両端のいずれかとしてこのような植物を同定できる。

“Agro-economic elite” means that the strain has the desired agro-economic characteristics, such as yield, maturity, disease resistance, etc., in addition to insect resistance due to the subject event (s) Means that. As shown in the examples below, agroeconomic traits that are considered individually or in any combination in a plant containing an event of the subject invention are within the scope of the subject invention. Any and all of these agroeconomic features and data points are used to identify such plants as points in the range of features used to define such plants, or as either one or both ends it can.

さらなる実施形態において、主題の発明は、主題の発明のａａｄ−１イベントを含むトウモロコシ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親のトウモロコシ系統（上記の系統の植物に上記の除草剤抵抗性を与える、本発明の発現カセットを含む）と、第２の親のトウモロコシ系統（この除草剤耐性形質を欠く）とを有性交雑させ、それにより複数の子孫植物を作出するステップと、（ｂ）分子マーカーを用いて子孫植物を選択するステップとを含む方法を含む。このような方法は、子孫植物を第２の親のトウモロコシ系統と戻し交雑して、上記の昆虫耐性形質を含む優良種（true-breeding）トウモロコシ植物を作出するさらなるステップを所望により含み得る。

In a further embodiment, the subject invention is a method of producing a corn plant comprising the aad-1 event of the subject invention, comprising: (a) a first parent corn line (the above-mentioned herbicidal plant in the above lineage) agent confers resistance, and including) an expression cassette of the present invention, the second parental corn line (lacking this herbicide tolerance trait) and were sexually crossed, whereby the steps of producing a plurality of progeny plants (B) selecting a progeny plant using the molecular marker. Such a method may optionally include the further step of backcrossing the progeny plant with a second parental maize line to produce a true-breeding corn plant comprising the insect resistance trait described above.

多数のイベントを生成した。生存し、健常で、ハロキシホップ抵抗性カルス組織を生成したイベントに、推定上の形質転換イベントを表すユニーク識別コードを割り当て、新鮮な選択培地に継続して移した。植物は、各ユニークイベントに由来する組織から再生し、温室に移した。

Generated a large number of events. Events that survived, were healthy, and produced haloxyhop- resistant callus tissue were assigned a unique identification code representing a putative transformation event and were continually transferred to fresh selective media. Plants were regenerated from tissues derived from each unique event and transferred to the greenhouse.

サザンブロットデータは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片挿入が、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのａａｄ−１ＰＴＵの単一のインタクトなコピーの単純な組み込みとして生じたことを示唆した。詳細なサザンブロット解析を、プラスミド領域に含有される遺伝子、プロモーター、ターミネーターおよびその他の調節要素に特異的なプローブと、プラスミド内にある切断部位を有し、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはトウモロコシゲノムＤＮＡとのプラスミドの接合部に及ぶ断片（境界断片）を生成する説明的な制限酵素とを用いて行った。制限酵素とプローブとの組み合わせについてサザンハイブリダイゼーションから示された分子量は、イベントについてユニークであり、その同定パターンを確立した。これらの解析は、プラスミド断片が、ａａｄ−１ＰＴＵの再構成なしにトウモロコシゲノムＤＮＡに挿入されたことも示した。同一のハイブリダイゼーション断片が、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の異なる５つの世代において観察され、このことは、世代にわたるａａｄ−１ＰＴＵ挿入の遺伝形質の安定性を示す。プラスミドｐＤＡＳ１７４０上のＦｓｐＩの制限部位の外側に位置する３つの主鎖プローブの混合物とのハイブリダイゼーションは、いずれの特定のＤＮＡ／遺伝子断片も検出せず、このことは、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるアンピシリン抵抗性遺伝子の不在と、プラスミドｐＤＡＳ１７４０のＦｓｐＩ制限部位に直接隣接するその他のベクター主鎖領域の不在とを示した。ａａｄ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入断片の説明のための地図を、図２〜３に示す。
Southern blot data suggested that the pDAS1740 / FspI fragment insertion in corn event DAS-40278-9 occurred as a simple integration of a single intact copy of aad-1 PTU from plasmid pDAS1740. Detailed Southern blot analysis with probes specific for genes, promoters, terminators and other regulatory elements contained in the plasmid region, and cleavage sites within the plasmid that hybridize within the plasmid or maize This was done with an explanatory restriction enzyme that produces a fragment (boundary fragment) that spans the plasmid junction with genomic DNA. The molecular weights shown from Southern hybridization for the combination of restriction enzyme and probe were unique for the event and established its identification pattern. These analyzes also showed that the plasmid fragment was inserted into maize genomic DNA without reconstitution of aad-1 PTU. The same hybridization fragment was observed in five different generations of transgenic maize event DAS-40278-9, indicating the stability of the inherited trait of aad-1 PTU insertions over generations. Hybridization with a mixture of three backbone probes located outside the restriction site of FspI on plasmid pDAS1740 did not detect any particular DNA / gene fragment, which indicates that the transgenic maize event DAS-40278 The absence of the ampicillin resistance gene in -9 and the absence of other vector backbone regions immediately adjacent to the FspI restriction site of plasmid pDAS1740 are shown. A map for the description of the insert in aad-1 corn event DAS-40278-9 is shown in FIGS.

簡単に述べると、遺伝子発現カセットの側面に位置する特定のＤＮＡ配列を認識し、結合して切断するジンクフィンガーヌクレアーゼのような配列特異的エンドヌクレアーゼを設計する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、トランスジェニックジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットを含有する親の植物を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有する第２の親の植物と交雑させることにより植物細胞に送達される。得られる子孫を成熟まで成長させ、ｐａｔ発現カセットの喪失を、グルフォシネートを含有する除草剤を用いる葉の塗装により解析する。除草剤に抵抗性でない子孫植物を、分子的に確認し、自家繁殖に進む。ｐａｔ発現カセットの切り出しおよび除去は、自家繁殖から得られる子孫において分子的に確認される。本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核酸を、トウモロコシの第２染色体から、実施例４で論じた５’分子マーカーと３’分子マーカーとの間にある標的部位、好ましくは配列番号２９内にあるもの、またはその示された領域にて切り出すことができる。

Briefly, a sequence-specific endonuclease such as a zinc finger nuclease that recognizes, binds and cleaves a specific DNA sequence located on the side of a gene expression cassette is designed. Zinc finger nucleases are delivered to plant cells by crossing a parent plant containing the transgenic zinc finger nuclease expression cassette with a second parent plant containing the corn event DAS-40278-9. The resulting offspring are grown to maturity and the loss of the pat expression cassette is analyzed by painting leaves with a herbicide containing glufosinate. Progeny plants that are not resistant to herbicides are molecularly identified and self-propagated. The excision and removal of the pat expression cassette is confirmed molecularly in the offspring obtained from self-breeding. Using the teaching provided herein, any heterologous nucleic acid can be transferred from corn chromosome 2 to a target site, preferably between the 5 ′ and 3 ′ molecular markers discussed in Example 4, It can be excised at that shown in SEQ ID NO: 29, or at the indicated region.

ブリトルスナップ（brittlesnap）への抵抗性
ブリトルスナップとは、通常、迅速成長期中の成長調節除草剤の散布後に強風によりトウモロコシの茎がくずれることをいう。強風による被害をシミュレートするためにトウモロコシを物理的に押す棒を用いる機械的「プッシュ」試験を、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシおよびイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有しない対照植物について行った。処理は、４つの地理的に異なる場所で完了し、４回反復した（例外として３回だけ反復した１つの試行があった）。プロットは、８列からなった：２列はイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有し、２列はイベントを含有しない、２つのハイブリッドのそれぞれの４列。各列は２０フィートの長さであった。トウモロコシ植物は、Ｖ４発達段階まで成長させ、２，４−Ｄを含有する市販の除草剤（Ｗｅｅｄａｒ６４、ＮｕｆａｒｍＩｎｃ．、ＢｕｒｒＲｉｄｇｅ、ＩＬ）を、１１２０ｇａｅ／ｈａ、２２４０ｇａｅ／ｈａおよび４４８０ｇａｅ／ｈａの割合で用いた。除草剤を用いた７日後に、機械的プッシュ試験を行った。ブリトルスナップについての機械的プッシュ試験は、風被害をシミュレートするために、４フィートの棒で２列のトウモロコシを引き倒すことからなった。棒の高さおよび移動の速さは、未処理の植物を用いて低レベルの茎の破壊（１０％以下）をもたらすように設定して、処理間で相違が証明されるのに十分に試験が厳しいことを確実にした。ブリトルスナップ処理の指向性は、もたれかかったトウモロコシに対して用いた。
Resistance to brittlesnap Brittle snap usually refers to the breakage of corn stalks by strong winds after the application of growth-regulating herbicides during the fast growing season. A mechanical “push” test using a bar that physically pushes the corn to simulate storm damage was performed on hybrid corn containing Event DAS-40278-9 and control plants not containing Event DAS-40278-9. went. The process was completed at four geographically different locations and repeated four times (with one exception that was repeated only three times). The plot consisted of 8 columns: 2 columns contain event DAS-40278-9, 2 columns contain no events, 4 columns each of the two hybrids. Each row was 20 feet long. Corn plants are grown to the V4 developmental stage and commercially available herbicides containing 2,4-D (Weedar 64, Nufarm Inc., Burr Ridge, IL) are loaded with 1120 g ae / ha, 2240 g ae / ha and 4480 g ae. Used at a rate of / ha. A mechanical push test was performed after 7 days with the herbicide. The mechanical push test on Brittle Snap consisted of pulling down two rows of corn with a 4 foot stick to simulate wind damage. Bar height and speed of movement are set to produce low levels of stem destruction (less than 10%) using untreated plants and tested well to demonstrate differences between treatments Ensured that it was tough. The direction of Brittle Snap was used for leaning corn.

Claims

A transgenic corn plant comprising a genome comprising SEQ ID NO: 29.

Corn seeds containing the genome containing event DAS-40278-9 present in seeds deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) under accession number PTA-10244.

Corn seed comprising a genome comprising SEQ ID NO: 29.

A corn plant produced by growing seeds according to claim 2 comprising SEQ ID NO: 29.

The progeny plant of the corn plant of claim 4, comprising the event DAS-40278-9.

The herbicide-tolerant progeny plant of the corn plant of claim 1 comprising SEQ ID NO: 29.

The plant part of claim 4, selected from the group consisting of pollen, ovules, flowers, shoots, roots and leaves, comprising SEQ ID NO: 29.

A method of breeding a corn plant, comprising: crossing a first corn plant comprising SEQ ID NO: 29 with a second corn plant to produce a third corn plant comprising a genome; And assaying for the presence of SEQ ID NO: 29.

A method of controlling weeds, comprising the step of spraying an aryloxyalkanoate herbicide outdoors, wherein the field comprises the plant of claim 1.

The herbicide is a 2, 4-D, The method of claim 9.

The method of claim 9, comprising spraying a second herbicide to the field.

12. The method of claim 11, wherein the second herbicide is selected from the group consisting of glyphosate and dicamba.