JP6093299B2

JP6093299B2 - 植物

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Description

本発明は植物、特にウイルス抵抗性植物、およびそのような植物を作り出す方法に関する。本発明は、真核細胞の翻訳開始因子変異体およびそのアイソフォーム、ならびにそのような変異因子のスプライシングに関わる核酸、およびウイルス感染に抵抗性がある植物を作り出す方法におけるその使用に及ぶ。

ウイルスは、農業で重大な問題を起こす。たとえば、ポチビリダエ科（ｆａｍｉｌｙＰｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）の植物ウイルス類（ポチウイルス類）は、植物ウイルス類のほぼ３０％に相当し、３０を超える様々な科の植物に感染することができ、甚大な作物被害を引き起こし、死に至ることさえある。特に、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）およびマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）の植物は、ポチウイルス類による感染に特に感受性である。現在、多くの細菌感染や真菌感染とは対照的に、植物におけるウイルス感染と闘う方法はほとんどない。植物および種子の国際市場の規模が増大しているため、植物育種家にとって、ウイルス類による感染、たとえばポチビリダエ（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）科によるものに抵抗性がある植物を開発することはより重要になってきている。

植物宿主の感染に際して、植物ウイルスは、宿主の内因性蛋白質の幾つかを使用して、ウイルス自身のライフサイクルを完成させる。たとえば、ターニップ・モザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＴｕＭＶ）等のポチウイルス類は、それらのゲノムを、そのウイルスのコピーをより多く産生するために不可欠なウイルスＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む様々なウイルス蛋白質に翻訳するための必須条件として、植物リボソームをウイルスゲノムＲＮＡに結合するために、植物真核細胞の翻訳開始因子を使用する。したがって、植物真核細胞の翻訳開始因子の欠陥が、植物におけるウイルス抵抗性を与え得る。しかし、真核細胞の翻訳開始因子は、植物の生存に極めて重要であるため、真核細胞の翻訳開始因子の欠陥は植物にとって有害であり、多くの場合、結果的に生育不能な植物をもたらす。

ポチウイルスＶＰｇ（ポチウイルスＲＮＡゲノムによりコード化される蛋白質）はｅＩＦ４Ｅ蛋白質に結合できること、およびｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーのメンバーにおける突然変異は、ポチウイルス類に対する抵抗性を与えることができることが、多くの植物−ポチウイルス相互作用で証明されている。ポチウイルス類による感染に対する劣性抵抗性は、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化している遺伝子のコード領域（すなわち、エクソン）の塩基の変化に起因し、それによってｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体および／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体を結果的にもたらすと考えられている。

たとえば、通常はアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）に感染できる、ターニップ・モザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＴｕＭＶ）は、機能的真核細胞翻訳開始因子アイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）蛋白質が欠如したＡ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物にもはや感染することができない。欠陥トウモロコシトランスポゾン（ｄＳｐｍ）を使用したＡｔ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの挿入突然変異は、正常に成長でき、ＴｕＭＶ感染に抵抗性がある、植物系統を作りだした。さらに、ｌｓｐ１という名の、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を使用したＡ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の化学誘発性点突然変異も、ＴｕＭＶ感染に対する抵抗性を与えた。

ある特定の植物でウイルス抵抗性の様々な機序が発見されているが、これらは大抵、ウイルス株に特異的である。優性の植物Ｒ遺伝子は主として、植物ウイルスに対する株特異的抵抗性を提供し、たとえばＴｕＲＢ０１は、ＴｕＭＶの病原型１単離株に対する抵抗性を提供するが、病原型３、４および１２を含む、他の病原型に属するＴｕＭＶ単離株に克服される。ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅにおける突然変異と関連した劣性抵抗性の殆どの例もやはり株特異的であり、またウイルスのＶＰｇおよび時には他のウイルス蛋白質における突然変異は、そのような抵抗性を克服することができる株を結果的にもたらす。

したがって、何らかの株に特異的ではない植物におけるウイルス抵抗性を誘導し、それによって広域スペクトルウイルス抵抗性を与える必要がある。一部のウイルスについては広域スペクトル抵抗性の例が幾つかあるが、ほとんどの作物タイプにおけるほとんどのウイルスについては、広域スペクトル抵抗性のソースは皆無である。さらに、ウイルスは絶えず変異しており、株特異的抵抗性および広域スペクトル抵抗性に打ち勝つことができる遺伝子型が易感染性植物で生成され、抵抗性植物の栽培によって選択される。ほとんどの植物ウイルスはＲＮＡゲノムを有し、またＲＮＡは、プルーフリーディング機序における背信行為（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）のため、特に高い突然変異率を有することが知られている。その結果として、そのような抵抗性の持続性を改良するために、特に新しい機序に基づいた、広域スペクトル抵抗性の新しいソースが必要である。

以前に報告された、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに基づいたウイルス類（ポチウイルス類等）による感染に対する劣性抵抗性は全て、エクソンにおける塩基の変化によって生じた。そのような塩基変化は、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質の配列における変化、たとえば翻訳された蛋白質におけるアミノ酸残基の変化、または短縮された蛋白質を結果的に生じる未熟な鎖終結を、引き起こす。したがって、ウイルス抵抗性植物種を開発するこれまでの努力は、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのいずれかのエクソンのみに突然変異を抱懐する、植物品種を生み出すことに集中していた。しかし、意外なことに、本発明者は、ポチウイルス類等の、ウイルス類に対する植物の抵抗性は、野生型蛋白質または天然の蛋白質と比較してミススプライシング過程によって産生される植物のｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体によって与え得ることを、今回、初めて確認した。

したがって、本発明の第１態様では、ウイルスにとって非機能的である、単離された植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが提供され、ここで、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化している核酸がミススプライスされている。

ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの前例は全て、その遺伝子のコード領域内に突然変異を含んでいた。本発明者は、今度は、ウイルス抵抗性を誘導するイントロンのＤＮＡ配列における変異の第１例を提供した。イントロンは、翻訳より前に遺伝子からスプライスされ、したがって蛋白質に影響を及ぼさないため、イントロンＤＮＡ配列の殆どの変化は、抵抗性を提供しないであろうと予測される。さらに、遺伝子のミススプライシングは通常、非機能的蛋白質を結果的に生じ、また機能的蛋白質の欠如は致命的であったり、適応度の低下につながったり、あるいは他の悪影響があったりすることがある。

用語「ｅＩＦ４Ｅ」は、真核細胞の翻訳開始因子４Ｅとしても知られる、蛋白質合成の開始における重要な要素である。当業者に知られるように、植物で、ｅＩＦ４Ｅは複雑なｅＩＦ４Ｆ（ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇから成る）を形成する。植物ｅＩＦ４Ｅ蛋白質のウイルス感染における正確な生化学的役割は未だ確認されていない。しかし、いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、植物ｅＩＦ４ＥはウイルスＲＮＡの５’キャップ構造（または模倣物）に結合できることもあり、または植物ｅＩＦ４ＥはウイルスＲＮＡと直接的に相互に作用することもある。あるいは、ｅＩＦ４Ｅは、宿主植物における感染ウイルスの細胞間移動に関与することもある。

用語「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ」はｅＩＦ４Ｅのアイソフォームを指し、またｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅと類似した機能を有する。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来のｅＩＦ４Ｅ蛋白質とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質は、アミノ酸レベルで４４％〜４９％同一である。これは、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）系統Ｒ−ｏ−１８（４７〜５０％同一性）およびブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）系統チイフ（Ｃｈｉｉｆｕ）（４３〜５０％同一性）で見られる値と似ている。

ウイルスのライフサイクルは、ウイルスの核酸を蛋白質に変えるために宿主植物の翻訳機構を使用することに完全に依存している。宿主翻訳機構によって産生されるウイルス蛋白質がなければ、ウイルスのレプリカーゼ蛋白質は何も産生されず、それ故ウイルスも複製されない。多くのウイルスは宿主植物の翻訳複合体に依存していることが示されており、また植物ｅＩＦ４Ｅ蛋白質および／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質とのウイルス相互作用が証明されている（使用されるバージョンは、ウイルス種と植物種との特定の組合せによる）。

ミススプライシングは、第１態様のｅＩＦ４Ｅ変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体（したがって、野生型または天然のｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質と比較して、選択的にスプライスされた変異体であると記述することができる）を産生できることを、熟練者は十分理解するであろう。遺伝子のゲノム配列、たとえばｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化しているもの等は、コード領域（すなわち、エクソン）および非コード領域（すなわちイントロン）を含む。イントロンおよびエクソンは、「一次転写物、ｍＲＮＡの前駆体」（あるいは「ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）」）と呼ばれるＲＮＡに転写される。エクソンよりコード化される天然の蛋白質が産生され得るように、イントロンはｍＲＮＡ前駆体から除去されなければならない。用語「天然の蛋白質」は、自然に存在する蛋白質、野生型蛋白質または機能的蛋白質を意味することができる。

ｍＲＮＡ前駆体からのイントロンの除去および後続するエクソンの相互ライゲーションは、スプライシング過程で実行される。スプライシング過程は通常、スプライシング因子によって仲介される、一連の反応からなり、これは転写後であるが翻訳前にＲＮＡ上で実行される。したがって、「ｍＲＮＡ前駆体」は、エクソンとイントロンの両者を含むＲＮＡ分子であり、「ｍＲＮＡ」は、イントロンは除去されており、エクソンは、リボソームによって蛋白質が翻訳され得るように順次結合された、ＲＮＡである。

イントロンは、スプライシング反応を実行する様々なスプライシング因子を結合する、比較的短い、保存されたＲＮＡセグメントである１組の「スプライス要素」によって明確に規定される。したがって、各イントロンは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、およびその間に位置する枝分かれ部位によって明確に規定される。

本発明者は、第１態様の蛋白質変異体が、天然のＤＮＡおよび／またはｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｍＲＮＡ前駆体のスプライス要素における改変に起因することがあり、これが（野生型と比べて）新しい、異所性の、スプライス要素を作り出すことを発見した。したがって、本発明の一実施態様で、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化しているミススプライスされた遺伝子は、スプライス要素における改変に起因することがあり、それによって異所性のスプライス要素を産生する。異所性のスプライス要素は、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥｍＲＮＡ前駆体のスプライスパターンの変化を引き起こし、変化したｍＲＮＡを生じさせ得る。好ましくは、結果として生じる第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体は、植物がウイルス感染に実質的に抵抗性があるように、植物におけるウイルスにとって機能的ではない。

本発明者は、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化している遺伝子のイントロンの変化は（エクソンの変化よりむしろ）、ミススプライシングの発生を招いて、ｅＩＦ４Ｅ変異体蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体蛋白質（これはウイルスにとって非機能的である）が結果的に産生され、そのため植物に存在するとき、ウイルス抵抗性を与えることを証明した。

一実施態様で、異所性スプライス要素は、イントロンの５’末端または３’末端における天然スプライス部位（すなわち、イントロンの５’天然スプライス部位または３’天然スプライス部位）を変えることがあり、これが新しい、異所性の、スプライス部位を作り出す。ゲノムＤＮＡ配列と成熟メッセージＲＮＡの配列との間の差異がイントロンを明確に規定することは十分理解されるであろう。イントロンの５’末端および３’末端が、遺伝子の天然スプライス部位を明確に規定する。

異所性スプライス部位は、天然スプライス部位の上流であっても下流であってもよい。用語「上流」は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体分子の５’末端に向かうことを意味し、符号「−」で示されることがあることは、当業者により十分理解されるであろう。用語「下流」は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体分子の３’末端に向かうことを意味し、符号「＋」で示されることがあることも、当業者により十分理解されるであろう。したがって、異所性のスプライス部位が、イントロン１の５’天然スプライス部位から１０ヌクレオチド上流であってもよい実施態様で、異所性スプライス部位は「イントロン１の５’スプライス部位に比べて−１０ｂｐ」と呼ばれることもある。

異所性スプライス部位が、イントロンの５’天然スプライス部位の上流である実施態様では、イントロンの上流であるエクソンの一部が、スプライシング過程中に切除され得る。したがって、結果として生じるｍＲＮＡは、切除されたエクソンのヌクレオチドを欠くことがある。異所性スプライス部位がイントロンの５’天然スプライス部位の下流である実施態様では、イントロンの一部がスプライス事象の間保持され得る。したがって、結果として生じるｍＲＮＡは、保持されたイントロンのヌクレオチドを含み得る。

異所性スプライス部位が、イントロンの３’天然スプライス部位の下流である実施態様では、イントロンの下流であるエクソンの一部が、スプライシング過程中に切除され得る。したがって、結果として生じるｍＲＮＡは、切除されたエクソンのヌクレオチドを欠くことがある。異所性スプライス部位が、イントロンの３’天然スプライス部位の上流である実施態様では、イントロンの一部または全部がスプライス事象の間ずっと保持され得る。したがって、結果として生じるｍＲＮＡは、保持されたイントロンヌクレオチドを含み得る。

代替実施態様で、変化したスプライスパターンは、少なくとも１つのイントロンを保持することを含んでもよい。結果として生じるｍＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ変異体）は、したがって保持された１つまたは複数のイントロンに相当するＲＮＡ配列を含むことがあり、天然のｍＲＮＡ分子より大きいことがある。

保持された少なくとも１つのイントロン、またはその一部から翻訳されるアミノ酸配列は、終止コドンを含むことがある。結果として生じる蛋白質（すなわち、蛋白質変異体）は、第１の終止コドンを超えて翻訳されないことがあり、それ故、蛋白質変異体は天然の蛋白質と比べてサイズが小さいことがある。保持されたイントロンによって導入される終止コドンは、ｍＲＮＡの翻訳を早期に停止させる（遺伝子の第１の野生型終止コドンはさらに下流に位置している）ため、未熟終止コドンと呼ばれることがある。したがって、蛋白質変異体は、野生型蛋白質または天然の蛋白質と比べて、機能が欠如していたり変化していたりすることがある。蛋白質変異体は、ウイルスにとって非機能的であり得る。

保持された少なくとも１つのイントロンのコドンリーディングフレーム、またはその一部は、インフレームであることも、隣接したエクソンのコーディングリーディングフレームを含むアウトオブフレームであることもある。結果として生じるｍＲＮＡは、変化したアミノ酸配列をコード化することがあり、したがって蛋白質変異体を産生し得る。蛋白質変異体は、野生型蛋白質または天然の蛋白質と比べて、機能が欠如していたり変化していたりし得る。蛋白質変異体は、ウイルスにとって非機能的であり得る。

保持された少なくとも１つのイントロンのコドンリーディングフレーム、またはその一部が、隣接したエクソンのそれを含むアウトオブフレームである実施態様では、結果として生じる蛋白質（すなわち蛋白質変異体）は、変化したアミノ酸配列を含むことがあり、未熟終止コドンのため短縮されていることがある。結果として生じる蛋白質変異体は、野生型蛋白質または天然の蛋白質と比べて、機能が欠如していたり変化していたりすることがある。蛋白質変異体は、ウイルスにとって非機能的であり得る。

少なくとも１つのエクソン、または、その一部が切除される実施態様では、結果として生じるｍＲＮＡは、変化したアミノ酸配列をコード化することがあり、したがって、蛋白質変異体を産生し得る。変化したアミノ酸配列は、未熟終止コドンを含み得る。蛋白質変異体は、野生型蛋白質または天然の蛋白質と比べて、機能が欠如していたり変化した機能を有していたりし得る。蛋白質変異体は、ウイルスにとって非機能的であり得る。

ｅＩＦ４Ｅ変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体の変化した機能は、その翻訳開始のための活性低下を含み得る。ミススプライシングがイントロン１で生じるとき、これは極度に短縮されたバージョンの蛋白質、あるいは蛋白質の大部分が機能的バージョンと完全に異なるバージョンを結果的に生じ得る。真核細胞の開始複合体の他の要素、特にｅＩＦ４ＧまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇに結合する可能性は極めて低く、またウイルス蛋白質ＶＰｇ、またはメッセンジャーＲＮＡキャップに結合する可能性も低いため、理論に束縛されずに、これには多数の結果があり得る。これは、メッセンジャーＲＮＡおよび／またはウイルスＲＮＡの翻訳を欠く結果となるであろう。

本発明者は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）を植物モデルとして使用して実験を実行し、意外なことに、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）は３つのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子座を含み、したがって、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの３つの蛋白質アイソフォーム（その蛋白質アイソフォームはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃと表示される）を有することを発見した。その結果、本発明者はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａを２つの植物系統で調査した。本明細書で「Ｒ−ｏ−１８」と呼ばれる、第１の植物系統は、ウイルス（すなわち、ターニップ・モザイクウイルス（ＴｕｒｎｉｐＭｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ），ＴｕＭＶ）による感染に感受性であり、本明細書で「ＲＬＲ２２」と呼ばれる、第２の植物系統は、ウイルス感染に抵抗性がある。本発明者は、以下に記す通り、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａアイソフォームの、ゲノム配列、ｍＲＮＡ配列およびポリペプチド配列を決定した。

系統Ｒ−ｏ−１８（ウイルス感染感受性）において、天然または野生型のブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａアイソフォーム、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａをコード化しているゲノムＤＮＡ配列を、以下の通り、配列番号１として本明細書に提供する：

配列番号１は、ボールド体で表示されているイントロンと共に、エクソン１〜５を表す。

系統Ｒ−ｏ−１８（ウイルス感染感受性）における、天然または野生型のＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡ配列を、以下の通り、配列番号２として本明細書に提供する：

図３は、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのエクソンが共にライゲートされて配列番号２のｍＲＮＡを形成することを、概略的に示している。

系統Ｒ−ｏ−１８（ウイルス感染感受性）における、天然または野生型のＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのポリペプチド配列を、以下の通り、配列番号３として本明細書に提供する：

系統ＲＬＲ２２（ウイルス感染抵抗性）における、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａアイソフォーム、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体をコード化しているゲノムＤＮＡ配列を、以下の通り、配列番号４として本明細書に提供する：

配列番号４は、ボールド体で表示されているイントロン、およびイントロン１の５’スプライス部位の＋１位におけるグアニン挿入（上記配列における下線）を表す。この突然変異は本明細書では「挿入／欠失」突然変異または「インデル」と呼ばれる。本発明者は意外なことに、配列番号４として表示されるＤＮＡ配列は、幾つかの実施態様で、幾つかの異なる型のｍＲＮＡ配列を生じさせることができ、それぞれが第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質の変異体を産生することが可能なことを確認した。本発明者は、ウイルス抵抗性系統（ＲＬＲ２２）由来の対立遺伝子（ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ）を「ｒｅｔｒ０１」と名づけた。これは、劣性であると考えられている。

系統ＲＬＲ２２（ウイルス感染抵抗性）におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体のｍＲＮＡ配列の第１実施態様を、以下の通り、配列番号５として本明細書に提供する：

示すように、配列番号４における核酸改変（すなわち、イントロン１の５’スプライス部位の＋１位にグアニン挿入を含む）の影響は、結果として生じた、配列番号５で表されるｍＲＮＡが、完全に保持されているイントロン１に相当するＲＮＡ配列（ボールド体で表示されている）を含むことである。図４は、ｅＩＦ４ＥＤＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の変化したスプライスパターンが、結果的に配列番号５のｍＲＮＡを生じることを概略的に示している。

系統ＲＬＲ２２におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体のｍＲＮＡの第１実施態様（すなわち、配列番号５）に相当するポリペプチド配列を、以下の通り、配列番号６として本明細書に提供する：

配列番号６で、鎖終結は「．」で示されている。示すように、イントロン１全体が保持された、配列番号５で表されるｍＲＮＡの翻訳は、短縮されたｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質が産生されるように、８８位に第１の未熟終止コドンを生じる結果となる。

系統ＲＬＲ２２（ウイルス感染抵抗性）におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体のｍＲＮＡ配列の第２実施態様を、以下の通り、配列番号７として本明細書に提供する：

配列番号７で表されるｍＲＮＡ変異体は、イントロン１の変化した３’スプライス部位に起因する。変化したスプライス部位は、イントロン１の５’末端と比べて＋４８位（すなわち、イントロン１の天然の３’スプライス部位の１５ｂｐ上流）である。保持されたイントロン配列（１５ヌクレオチド）は、ボールド体で表示されている。図５は、このスプライス事象を概略的に示している。

系統ＲＬＲ２２におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体のｍＲＮＡ変異体の第２実施態様（すなわち、配列番号７）に相当するポリペプチド配列を、以下の通り、配列番号８として提供する：

配列番号８で、５つの新しいアミノ酸残基（すなわち、ＩＦＦＣＳ）が核改変の結果として翻訳され、ボールド体で表されている。示すように、イントロンの一部が保持された配列番号７で表されるｍＲＮＡの翻訳は、結果的にフレームシフトを招かないが、伸長した蛋白質はウイルスにとって非機能的となり得る。

系統ＲＬＲ２２（ウイルス感染抵抗性）におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体のｍＲＮＡ配列の第３実施態様を、以下の通り、配列番号９として本明細書に提供する：

配列番号９で表されるｍＲＮＡ変異体は、イントロン１の変化した５’スプライス部位に起因する。変化したスプライス部位は、イントロン１の５’天然スプライス部位と比べて−３位（すなわち、３ｂｐ上流）である。切除されたエクソン配列（３ヌクレオチド）は、符号「Δ」で表示されている。図６は、このスプライス事象を概略的に示している。

系統ＲＬＲ２２におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ変異体のｍＲＮＡの第３実施態様（すなわち配列番号９）に相当するポリペプチド配列を、以下の通り、配列番号１０として本明細書に提供する：

配列番号１０で、新しいアミノ酸残基（すなわち、Ｃ）が核改変の結果として翻訳され、ボールド体で表されている。示すように、イントロンの一部が保持された配列番号９で表されるｍＲＮＡの翻訳は、結果的にフレームシフトを招かなかった。配列番号９を配列番号３と比較すると、アミノ酸：７５〜７７位のフェニルアラニン（Ｆ）−トリプトファン（Ｗ）−グリシン（Ｇ）が、システイン（Ｃ）に置き換えられていた。アミノ酸１つを失い、別のアミノ酸が置換されたことにより、ウイルスにとって非機能的である蛋白質を結果的に生じ得る。

したがって、第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体は、配列番号６、８または１０で実質的に示されるアミノ酸配列、あるいはその変異体またはフラグメントを含み得る。ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質をコード化する核酸は、配列番号４、５、７または９で実質的に示される配列、あるいはその変異体またはフラグメントを含み得る。

上記を考慮すれば、第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体をコード化している核酸のミススプライシングは、前記核酸配列における改変に起因し得ることが十分理解されるであろう。改変は、遺伝子の非コード領域で生じることが好ましい。異所性スプライス要素を作り出すために、改変は、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質をコード化する核酸配列におけるスプライス要素に位置していてもよい。改変は、エクソン−イントロン接合点または天然スプライス部位の上流に存在していてもよく、下流に存在していてもよい。好ましくは、改変は、天然スプライス部位の−１０位〜＋１０位の間に存在する。より好ましくは、改変は、天然スプライス部位の−５位〜＋５位の間に存在する。最も好ましくは、改変は、天然スプライス部位の−１位〜＋１位に存在する。天然スプライス部位は、イントロンの５’−末端または３’−末端にあってもよく、５’−末端または３’−末端の近くにあってもよい。

スプライス要素は、３’スプライス部位、５’スプライス部位および枝分かれ部位（全て、成熟メッセージＲＮＡの産生中に、イントロンを正確に除去するのに必要である）を含むことができる。こうした要素の１つ、または複数における改変は、イントロンの一部、または全部を結果的に除去できなかったり、あるいはエクソン配列を除去する結果となったりし得る。これは、次には、短縮した蛋白質または伸長した蛋白質（機能的である可能性が極めて低いか、天然の蛋白質より低機能性であろう）を生じる結果となる。

改変は、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質をコード化している核酸配列におけるイントロンに位置していてもよい。改変は、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質をコード化している核酸配列のイントロン１、２、３または４にあってもよい。イントロン１は、配列番号１の塩基２０１〜２６３に相当し、イントロン２は、配列番号１の塩基４３９〜５０９に相当し、イントロン３は、配列番号１の塩基６３６〜１１８７に相当し、イントロン４は、配列番号１の塩基１２５４〜１３３９に相当する。

好ましくは、改変は、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質をコード化している核酸配列のイントロン１にある。

改変は、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質をコード化している核酸配列中の、好ましくはイントロン中の、より好ましくはイントロン１中の、何処かに少なくとも１つの核酸塩基の、挿入、欠失、置換またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。挿入は、プリン（アデニンまたはグアニン）であってもよく、ピリミジン（シトシンまたはチミン）であってもよい。好ましくは、改変はグアニン挿入を含む。改変は、天然の蛋白質と比べて、コドンリーディングフレームのフレームシフトを結果的に招き得る。改変は、結果的に未熟終止コドンを形成し得る。改変は、結果的にフレームシフトを招いたり、未熟終止コドンを生じたりすることはないが、アミノ酸の付加または欠失は招き得る。

好ましくは、改変は、配列番号１の２０１位における挿入を含み、その挿入は好ましくはグアニンである。

ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ、またはウイルスのライフサイクルの完成に不可欠な他の蛋白質の、ミススプライシングを結果的にもたらすであろう突然変異を生じさせるために、当該技術分野で知られている人工的な手段によって、植物ゲノムを改変することは可能であろうと、本発明者は考えている。人工的な手段は、組み換えの誘導／促進、多くの手段による部位特異的突然変異誘発、ＴａｒｇｅｔｅｄＩｎｄｕｃｅｄＬｏｃａｌＬｅｓｉｏｎｓｉｎＧｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）、または当該技術分野で知られている他の手段、を含んでもよい。

本発明者は、第１態様のｅＩＦ４Ｅ変異体蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体蛋白質が、ターニップ・モザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＴｕＭＶ）にとって非機能的であることを発見した。しかし、本発明者は、第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質は、（他の状況では植物を感染させることができる）多種多様のウイルス類にとって非機能的であると考えている。このように、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、植物ウイルスのライフサイクルを完成するために、それらに依存しているあらゆる植物ウイルスにとって非機能的であり得る。

しかし、変異体ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ポチビリダエ（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）科のあらゆる植物ウイルスにとって非機能的であることが好ましい。ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが非機能的であり得る好適なポチウイルス類の例としては、ペッパー・ベイナル・モトル・ウイルス（Ｐｅｐｐｅｒｖｅｉｎａｌｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ）（ＰＶＭＰ）、インゲンマメ・モザイクウイルス（Ｂｅａｎｃｏｍｍｏｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＢＣＭＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ）（ＰＶＹ）、またはアズキニン・モザイクウイルス（Ａｚｕｋｉｎｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＡｚＭＶ）、またはｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに依存する他のウイルスなどがある。

本明細書に記載の通り、第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）の様々なウイルスにとって非機能的である。しかし、本発明者は、第１態様のｅＩＦ４Ｅ蛋白質またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質は、広範囲の様々な植物種におけるウイルス類にとって非機能的であると考えている。したがって、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ジャガイモ（全種）、トマト、コショウまたはナス等のナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、メロン、カボチャおよびキュウリ等のウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ）作物、特にアブラ菜等のブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）、白菜等のブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）、およびさらに詳細には、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、チリメンキャベツ、芽キャベツ、赤キャベツ等の、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）エンドウ豆、豆、豆類等、およびまたコメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ等を含む単子葉作物の植物におけるウイルスにとって非機能的であり得る。好ましい一実施態様で、植物は、ブラッシカ種（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｐ）であってもよく、好ましくはＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）および／またはブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ）である。

第２態様では、植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）の、選択的にスプライスされた変異体をコード化している単離された核酸配列であって、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅがウイルスにとって非機能的であるように、ミススプライスされている核酸配列を提供する。

第２態様の単離された核酸配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含んでもよい。

核酸配列は、配列番号４、５、７または９のいずれか１つで実質的に示されるヌクレオチド配列、またはその変異体またはフラグメントを含んでもよい。その核酸配列によってコード化されるｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、配列番号６、８または１０のいずれか１つで実質的に示されるアミノ酸配列、またはその変異体またはフラグメントを含んでもよい。

第３態様では、第２態様の核酸配列を含む組み換えベクターを提供する。

組み換えベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージであってもよい。そのような組み換えベクターは、第２態様の核酸分子で宿主細胞を形質転換するのに極めて有用である。当業者は、発現目的で、本発明の遺伝子構築物を、多くのタイプの骨格ベクターと組合せることが可能なことを十分理解するであろう。骨格ベクターは、バイナリーベクター（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でもアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）でも複製できるもの）であってもよい。たとえば、好適なベクターは、ｐＢＩＮ１９等の、ｐＢＩＮプラスミドであってもよい。

組み換えベクターは、本発明の核酸配列に加えて、プロモーターを含む、種々の他の機能的要素を含んでもよい。たとえば、組み換えベクターを、宿主細胞（植物細胞であってもよい）のサイトゾル内で自律的に複製するように設計することが可能である。この場合、ＤＮＡ複製を誘導または制御する要素が、組み換えベクターで必要なこともある。あるいは、組み換えベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計してもよい。この場合、標的とされた組み込み（たとえば、相同的組み換えによる）に好都合なＤＮＡ配列が予想される。

組み換えベクターはまた、クローニング過程で選択可能マーカーとして使用することが可能な遺伝子、すなわち、形質移入された細胞または形質転換されている細胞の選択を可能にするため、および非相同ＤＮＡを組み込むベクターを抱懐する細胞の選択を可能にするための遺伝子を、コードしているＤＮＡも含んでもよい。あるいは、選択マーカー遺伝子は、関心対象の遺伝子を含んでいるベクターと同時に使用される異なるベクター内にあってもよい。ベクターはまた、コード配列の発現制御と関係があるＤＮＡ、または発現したポリペプチドを宿主細胞のある特定の部分、たとえば、葉緑体に、ターゲットするためのＤＮＡも含んでもよい。したがって、第３態様のベクターは、選択マーカー遺伝子（たとえば抗生物質耐性遺伝子）、ポリペプチド終結信号、および蛋白質ターゲティング配列（たとえば葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加的要素含んでもよい。

好適なマーカー遺伝子の例としては、カナマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）およびハイグロマイシン（ｎｐｔ−ＩＩ、ｈｙｇ−Ｂ）に対する抵抗性を与えるもの等の、抗生物質耐性遺伝子、ホスフィノトリシンおよびスルホンアミド系除草剤に対する抵抗性を与えるもの等の、除草剤抵抗性遺伝子（それぞれ、ｂａｒおよびｓｕＩ、欧州特許出願公開第Ａ−２４２２４６号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０２４９６３７号明細書）、β−グルクロニダーゼ（英国特許第２１９７６５３号明細書）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の、選別マーカーなどがある。

マーカー遺伝子は、細胞における発現を可能にする、第２プロモーター（種子中にあってもよく、なくてもよい）によって制御することができ、それによって植物の発生のいずれかの段階で、そのマーカーを含む細胞または組織の選択を可能にする。好適な第２プロモーターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーターおよび３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）転写物をコード化する遺伝子に由来するプロモーターである。しかし、何か他の好適な第２プロモーターを使用してもよい。

本発明のベクターの様々な実施態様は、好適なクローニング手順を使用して調製してもよく、以下の通りに要約することができる。

第４態様では、第３態様のベクターを含む宿主細胞を提供する。

宿主細胞は植物細胞であってもよい。あるいは、宿主細胞は、細菌またはウイルスであってもよい。当業者に知られている技法を使用して、ベクターを宿主細胞に形質転換することができる。

第３態様のベクターを植物に導入するために必要な分子技術は、当該技術で知られていることは十分理解されるであろう、またＳａｍｂｒｏｏｋらのテキスト等で見ることが可能である。

本発明者は、ウイルスによる感染に対して抵抗性がある植物を検出できることを発見した。

本発明の第５態様では、試験植物で、植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）（ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化している核酸がミススプライスされており、ウイルスにとって非機能的である）の存在を検出する方法であって、
（ｉ）試験植物からＲＮＡを単離するステップと、
（ｉｉ）ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに特異的なプライマーを使用して、ステップ（ｉ）で単離されるＲＮＡからｃＤＮＡを産生するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で産生されるｃＤＮＡの配列を決定するステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で決定されるｃＤＮＡ配列を、野生型ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列と比較するステップと
を含み、
ここで、野生型配列と比較されるステップ（ｉｉｉ）の配列における変異は、試験植物におけるｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化している核酸がミススプライスされており、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異体であることを示す、
方法を提供する。

（ｉ）〜（ｉｖ）の検出ステップが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら等の、当該技術分野で知られている分子技術を含むことは十分理解されるであろう。本方法は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを単離することが可能な、試料を試験植物から得るステップを含んでもよい。ｃＤＮＡは、こうした遺伝子に相補的なプライマーを利用して、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で得ることが可能である。当業者であれば、当該技術分野で知られている技法を使用して、ＲＴ−ＰＣＲプライマーの位置を設計することが十分理解されるであろう。好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲプライマーは、結果として生じる増幅産物が、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の完全なコード領域を含むように設計される。

たとえば、逆転写プライマーは、
ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧ＿（配列番号１３）、
ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＴＡＧＴＴＣＴＴＣ（配列番号１４）、および
ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣ（配列番号１５）、
からなる群から選択することが可能である。

第５態様の方法は、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのミススプライシングを引き起こす植物ゲノムにおける改変を同定するステップをさらに含んでもよく、ここで前記同定ステップは、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子についてホモ接合であるように、試験植物を育種することを含んでもよい。本方法は、前記遺伝子のゲノム配列を決定することを含んでもよい。本方法は、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのミススプライシングを引き起こす改変を同定するために、決定されたゲノム配列を、野生型ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのゲノム配列と比較することを含んでもよい。

試験植物が、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてヘテロ接合である実施態様では、試験植物を自家交配することによってホモ接合性を得ることが可能である。

本発明者は、ウイルス類による感染に抵抗性がある、植物を作り出して選択することが可能なことを発見した。

したがって、第６態様では、ウイルス抵抗性植物を選択する方法であって、
（ｉ）第１態様の、植物真核細胞の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）、および
（ｉｉ）野生型ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの少なくとも１つのコピー（ここで、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの野生型コピーを、植物は使用することができるが、ウイルスは使用することができない）、
の存在を、試験植物で、検出することを含む、方法を提供する。

第７態様では、植物ウイルス抵抗性を誘導するための、第１態様の植物真核細胞の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）あるいは第２態様の核酸の、使用を提供する。

第８態様では、ウイルス抵抗性植物を作り出す方法であって、第１態様の植物真核細胞の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）を発現する親植物を、レシピエント植物と交配することを含み、そのレシピエントは、農学的利点、商業的利点、および／またはある特定の気候または土壌への適合性からなる群から選択される少なくとも１つの形質を含む、方法を提供する。

レシピエント植物は、穀物（たとえばコメ、コムギ等）または野菜（たとえば、トマト等）等の、商業的に有用な植物である。実施例に記述し、また図８に示す通り、ウイルス感染に抵抗性がある親植物は第１態様のｅＩＦ４Ｅ変異体またはｅＩＦ４（ｉｓｏ）４Ｅ変異体を発現するため、これと、レシピエント植物（Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）であってもよい）を、交配してもよい。本方法は、一代雑種の子孫を、レシピエント親（すなわち回帰植物系統）と戻し交配することをさらに含んでもよい。１〜１０周の戻し交配が必要なこともある。第５態様による方法を使用して、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ウイルス抵抗性を与える）の変異型対立遺伝子が、各交配で、非回帰植物に存在することを確実にすることが可能である。最後に、本方法は、戻し交配プログラムによって得られるウイルス抵抗性植物を自家受粉または自殖させるステップを含んでもよい。次いで、改変されたスプライス部位（ウイルス抵抗性を与える）についてホモ接合である次世代の植物を、同定することが可能である。

ウイルス抵抗性を備えたＦ₁雑種植物を育種するために、戻し交配プログラムによって得られ、かつ第１態様のｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてホモ接合である２つの同系交配親植物系統を使用して、Ｆ₁雑種を生み出すことが可能である。次いで、こうした２つの同系交配親系統を共に交配して、第１態様のｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてホモ接合である、ウイルス抵抗性Ｆ₁雑種を生み出すことが可能である。

本方法で作用される親植物は、野生型ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの少なくとも１つのコピーを発現できることが好ましく、ここでｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの野生型コピーを、植物は使用することが可能であるが、ウイルスは使用することができない。

第９態様で、本発明は、第８態様の方法で作り出される、または得られる、ウイルス抵抗性植物を提供する。

第１０態様で、本発明は、第１態様の植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）、あるいは第２態様のｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの選択的にスプライスされた変異体をコード化している核酸を含む、ウイルス抵抗性植物を提供する。

好ましくは、第９態様および第１０態様の植物は、野生型ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの少なくとも１つのコピーを発現するが、ここでｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの野生型コピーを、植物は使用できるが、ウイルスは使用できない。植物は、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコード化している遺伝子の非コード領域に改変または突然変異を含んでもよい。改変は、ｅＩＦ４Ｅ核酸またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ核酸のスプライス要素内であってもよい。

使用、方法または植物は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ、好ましくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａの、使用を含んでもよい。

植物は、ジャガイモ（全種）、トマト、コショウまたはナス等の、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）植物、メロン、カボチャおよびキュウリ等のウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔ）植物、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ）作物、特にアブラ菜等のブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）、白菜等のブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）およびさらに詳細にはブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、チリメンキャベツ、芽キャベツ、赤キャベツ等のブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）エンドウ豆、豆、豆類等、またコメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ等を含むあらゆる単子葉作物であってもよい。好ましい一実施態様で、植物は、ブラッシカ種（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｐ）であってもよく、好ましくはＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）および／またはブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ）である。

第５態様、第６態様または第８態様のいずれか１つの方法、第７態様の使用、または第９態様の植物が、トランスジェニック植物の使用を含んでもよいことは十分理解されるであろう。実際に、本明細書に記載の植物はいずれもトランスジェニックであってもよい、すなわち組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して作り出すことが可能である。

上述のシナリオで、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（これをウイルスが使用して、そのライフサイクルを完成し、感染を引き起こす）の１コピーを有する植物におけるウイルス抵抗性が説明される。したがって、好ましい実施態様で、植物は、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてホモ接合であって、これは植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）の選択的にスプライスされた変異体をコード化しており、ウイルスにとって非機能的である。

しかし、一部の植物が、これらの２つの遺伝子の一方、または両方の、複数のコピー／遺伝子座を有することは十分理解されるであろう。たとえば、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）は、ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方の３コピー（すなわち、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａ、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂおよびＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃ、およびＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂおよびＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ）を有し、またウイルスはこれらの遺伝子のいずれかを使用してそのライフサイクルを完成し、宿主植物でウイルス感染を引き起こし得る。したがって、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの複数のコピー／遺伝子座を有する植物においてウイルス抵抗性を与えるためには、こうした他の遺伝子座の各々におけるｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子も、ウイルスにとって非機能的であることが好ましい。

このことをさらに調査するために、本発明者は、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）ウイルス感染−易感染性系統Ｒ−ｏ−１８とウイルス抵抗性系統ＲＬＲ２２を交配し、Ｆ₁植物を抵抗性植物由来の自殖個体に戻し交配して、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子およびＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合であるが、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ遺伝子座でヘテロ接合であったＢ₁植物を作り出した。次いで、この特定の個体から得られるＢ₁Ｓ₁植物を、表現型検査および遺伝子型検査した。意外なことに、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合の植物は、ターニップ・モザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＴｕＭＶ）に対して完全に抵抗性があり、ヘテロ接合体はウイルス感染に対して僅かに易感染性に過ぎなかったが、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子についてホモ接合であった植物は、ウイルス感染に対して完全に易感染性であった。

したがって、本発明者は、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）におけるウイルスに対する広域スペクトル抵抗性に関係がある第２の遺伝子座を、染色体Ａ８上のＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ．と同定した。この第２の遺伝子座を、本明細書ではＣｏｎＴＲ０１と呼ぶ。本発明者は、広域スペクトルウイルス抵抗性のためには、植物は、第１の遺伝子（すなわちｒｅｔｒ０１、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子）に加えて、第２の遺伝子（すなわち、ＣｏｎＴＲ０１、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子）を必要とすると考えている。これによって、ウイルスがｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの複数のコピー／遺伝子座を利用できる植物においてウイルス抵抗性を与えるためには、２つ以上の遺伝子が重要なことが証明される。ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）系統Ｒ−ｏ−１８および系統ＲＬＲ２２由来のｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ対立遺伝子について決定されたゲノムＤＮＡ配列ならびに予測されるｍＲＮＡ配列およびポリペプチド配列を、ターニップ・モザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）が各対立遺伝子を使用できるかどうかに関する情報と共に、以下に提供する。

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、染色体Ａ１上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードする：

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない染色体Ａ１上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコード化する：

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂ
染色体Ａ３上に位置するＲ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂは、非機能的である。非機能的であるＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜３、ボールド体で表したイントロンおよび下線を施した未熟終止コドンを含む）：

非機能的であるＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

非機能的であるＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードする：

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂ
染色体Ａ３上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂのＲＬＲ２２対立遺伝子について、配列は何も得られなかった。

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、染色体Ａ８上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードする：

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、染色体Ａ８上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードする：

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、染色体Ａ５上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列（ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂと同じ）をコードする：

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、染色体Ａ５上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できない、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列（Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂと同じ）をコードする：

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用でき、植物に易感染性を与える、染色体Ａ８上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用でき、植物に易感染性を与える、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用でき、植物に易感染性を与える、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードする：

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ
ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できず、かつ抵抗性に必要な、染色体Ａ８上に位置するＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のゲノムＤＮＡ配列を有する（エクソン１〜５、ボールド体で表したイントロンを含む）：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できず、かつ抵抗性に必要な、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ＴｕＭＶがＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で使用できず、かつ抵抗性に必要な、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードする：

したがって、第１０態様では、植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）をコード化している単離された核酸配列であって、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅはウイルスにとって非機能的であり、配列番号４、５、７、９、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５８または５９で実質的に示されるヌクレオチド配列、あるいはその変異体またはフラグメントを含む拡散配列を提供する。

第１１態様では、ウイルスにとって非機能的である、単離された植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）変異体、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）を提供する。ここでｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体は、配列番号６、８、１０、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４または６０で実質的に示されるアミノ酸配列、あるいは変異体またはフラグメントを含む。

第３態様のベクター、第４態様の宿主細胞、第５、第６、または第８態様のいずれか１つの方法、第７態様の使用あるいは第９態様の植物は、ウイルスにとって非機能的である本明細書に記載されている配列、すなわち第１０態様で明確に規定されている配列の、いずれを含んでもよいことは十分理解されるであろう。たとえば、一実施態様で、本発明のベクター、細胞、方法、使用または植物は、配列番号４、５、７、９、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５８または５９で実質的に示されるヌクレオチド配列、あるいはその変異体またはフラグメントを含んでもよい。

別の実施態様では、本発明のベクター、細胞、方法、使用または植物は、第１１態様で明確に規定される、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体を含んでもよい。したがって、好ましくは、ベクター、細胞、方法、使用または植物は、配列番号６、８、１０、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４または６０で実質的に示されるアミノ酸配列、あるいはその変異体またはフラグメントを含む、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体を含む。

本発明のベクター、細胞、方法、使用または植物は、配列番号５８または５９で実質的に示されるヌクレオチド配列、またはその変異体またはフラグメントの使用、あるいは配列番号６０で実質的に示されるアミノ酸配列、またはその変異体またはフラグメントを含む、ｅＩＦ４Ｅ蛋白質変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白質変異体の使用を含むことが好ましい。

本発明が、任意の核酸またはペプチド、あるいはその変異体、誘導体または類縁体（（機能的）変異体または（機能的）フラグメントを含む、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸配列または核酸配列を実質的に含む）に及ぶことは、十分理解できるであろう。用語「実質的にアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列」、「（機能的）変異体」および「（機能的）フラグメント」は、本明細書で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列と、少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であり得る。

言及される配列のいずれかと６５％を超える配列同一性、より好ましくは７０％を超える配列同一性、さらに好ましくは７５％を超える配列同一性、いっそう好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も、予想される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと、少なくとも８５％の同一性を有し、より好ましくは本明細書で言及される配列のいずれかと、少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９８％の同一性そして、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。

当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率の計算の仕方を十分理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率を計算するために、２つの配列のアラインメントを最初に作製しなければならず、続いて配列同一性値を計算する。２つの配列に関する同一性率は、（ｉ）配列をアラインさせるために使用される方法、たとえば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実行される）、または３Ｄ比較による構造アラインメント、および（ｉｉ）アラインメント法で使用されるパラメータ（たとえば、ローカルアラインメント対グローバルアラインメント）、使用されるペア−スコア・マトリクス（たとえばＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔ等）、およびギャップ−ペナルティ（たとえば関数形式および定数）によって異なる値をとり得る。

アラインメントを行った後、２つの配列間の同一性率を計算する方法はいくつもある。たとえば、（ｉ）最短配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長、（ｉｖ）非ギャップ位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数で、同一性の数を除してもよい。さらに、同一性率はまた、極めて長さ依存的であることも十分理解されるであろう。したがって、配列対が短いほど、偶然により生じると予期され得る配列同一性は高い。

したがって、蛋白質配列またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントが複雑なプロセスであることは十分理解されるであろう。よく知られている多重アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，１９９７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明による蛋白質またはＤＮＡの多重アラインメントを作成するのに好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに好適なパラメータは以下の通りであろう：ＤＮＡアラインメントについて：ＧａｐＯｐｅｎＰｅｎａｌｔｙ＝１５．０、ＧａｐＥｘｔｅｎｓｉｏｎＰｅｎａｌｔｙ＝６．６６、およびＭａｔｒｉｘ＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。蛋白質アラインメントについて：ＧａｐＯｐｅｎＰｅｎａｌｔｙ＝１０．０、ＧａｐＥｘｔｅｎｓｉｏｎＰｅｎａｌｔｙ＝０．２、およびＭａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびたんぱくアラインメントについて：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、ＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アラインメントのためには、これらのパラメータおよび他のパラメータを変えることが必要なことに気付くであろう。

好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率の計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアラインメントから計算することが可能である（ここで、Ｎは、配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップは含めるがオーバーハングは除外して比較された位置の総数である）。したがって、２つの配列間の同一性率を計算する最も好ましい方法は、（ｉ）たとえば上記のような、好適なパラメータセットを使用し、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して、配列アラインメントを作成すること、および（ｉｉ）Ｎ値およびＴ値を次式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することを含む。

類似した配列を同定する代替法は、当業者に分かるであろう。たとえば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、４、５、７または９で表される配列またはそれらの補体にハイブリダイズする配列によってコード化されるであろう。ストリンジェントな条件によって、ヌクレオチドがほぼ４５℃の３ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルタ結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、ほぼ２０〜６５℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での少なくとも１回の洗浄が後に続くことを意味する。あるいは、実質的に類似したペプチドは、配列番号３、６、８または１０で表される配列と、少なくとも１つ、しかし５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸だけ、異なる。当業者は、単一のヌクレオチド変異または核酸配列における突然変異を同定するための、高感度の技法を熟知しているであろう。

遺伝子コードの縮重が原因で、本明細書の記載のいずれの核酸配列も、それによってコード化される蛋白質の配列に実質的に影響を与えることなく、変異または変化して、その（機能的）変異体を提供することは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、同じアミノ酸をコード化する異なるコドンの置換によって変更された配列を配列内に有するものであり、したがってサイレント変化を生じさせるものである。他の好適な変異体は、相同のヌクレオチド配列を有するが、置換するアミノ酸と類似した生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコード化する異なるコドンの置換によって変更され、保存的変化を生じさせる、配列の全部、または一部を含むものである。たとえば、小さい、非極性の、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンなどがある。大きい、非極性の、疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンなどがある。極性の中性アミノ酸としては、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンなどがある。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどがある。負電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸などがある。したがって、どのアミノ酸を、類似した生物物理学的特性を有するアミノ酸と置換することが可能か十分に理解されるであろうし、また当業者には、これらのアミノ酸をコード化しているヌクレオチド配列が分かるであろう。

本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に記載の全ての特徴、および／またそのように開示されるあらゆる方法またはプロセスのステップは全て、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互排他的である組合せを除き、前述の態様のいずれかと任意の組合せで組み合わせることが可能である。

本発明をより良く理解するために、また本発明の実施形態をいかに実行することが可能かを示すために、今度は、一例として、添付の線図に言及する。

ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥｍＲＮＡとアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＴ産物が分離された電気泳動ゲルを表す。Ｒ−ｏ−１８は、ＴｕＭＶによる感染に易感染性であるＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）系統に相当するが、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）系統ＲＬＲ２２はＴｕＭＶによる感染に抵抗性がある。ウイルス抵抗性系統ＲＬＲ２２由来のｍＲＮＡ（配列番号５）は、易感染性系統Ｒ−ｏ−１８のそれ（配列番号２）より大きい。Ｃｏｌ−０ｅＩＦ４ＥおよびＣｏｌ−０ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは対照であり、それぞれ、野生型アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに相当する。ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ．をコード化している遺伝子の略図である。エクソンは黒色ボックスとして表して番号を付し、イントロンは白色ボックスとして表し、番号は付されていない。ＴｕＭＶで感染させることができる、系統Ｒ−ｏ−１８における、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡの略図である。エクソン１の上方の矢印は、開始コドンに相当し、エクソン５の上方の矢印は終止コドンに相当する。ウイルス感染に抵抗性がある、系統ＲＬＲ２２における、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡの一実施態様（配列番号５）（最も一般的な変異体）の略図である。開始コドンおよび終止コドンは矢印で表示されている。ミススプライシングは、成熟メッセージＲＮＡにおけるイントロン１全体の保持、および左側に赤色矢印で示される未熟終止コドンの導入を招く。ウイルス感染に抵抗性がある、系統ＲＬＲ２２における、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡの別の実施態様（配列番号７）の略図である。開始コドンおよび終止コドンは矢印で表示されている。ミススプライシングは、イントロンの部分的除去を招き、最初の４８ヌクレオチドのみが除去される。ウイルス感染に抵抗性がある、系統ＲＬＲ２２における、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡの別の実施態様（配列番号９）の略図である。開始コドンおよび終止コドンは矢印で表示されている。ミススプライシングは、イントロン１全体に加えて、エクソン１の最後の３ヌクレオチドの切除を招く。ＴｕＭＶ感染に抵抗性がある、系統ＲＬＲ２２におけるブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのイントロン１に改変を有する植物（左）、およびＴｕＭＶに極めて易感染性である、この改変を欠くブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）植物（右）の写真を表す。本発明のｅＩＦ４Ｅ変異体またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体についてホモ接合である植物系統を作り出すための育種プログラムの略図である。プライマーＢＲ２およびＢＲ１４を使用して、植物Ｒ−ｏ−１８およびＲＬＲ２２のＤＮＡから得た、ＰＣＲ産物を示す電気泳動ゲルを表す。

実施例１−ウイルス−抵抗性を与えるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ配列の分析、およびウイルス−抵抗性を与える第１遺伝子座、ｒｅｔｒ０１の単離
ＴｕＭＶに対する植物抵抗性を与えることに関わる遺伝子および機序を同定する目的で、本発明者はＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で調査した。

材料および方法
Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）系統Ｒ−ｏ−１８は、ＴｕＭＶによる感染に易感染性の同系交配系統である。しかし、系統ＲＬＲ２２は、今までに試験した全てのＴｕＭＶ単離株に対して広域スペクトル抵抗性を有する。総ゲノムＤＮＡは、系統Ｒ−ｏ−１８およびＲＬＲ２２系統の若葉から、ＤＮｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、続いてＧｅｎｏｍｉＰｈｉｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して増幅した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および以下のプライマーを使用し、標準ＰＣＲで、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ遺伝子のゲノムコード領域の大部分を増幅した。
ＰＣＲ１（ＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＧ）−（配列番号１１）および
ＰＣＲ２（ＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＴＡＣ）−（配列番号１２）

ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子座ａに相当する、最大の増幅産物を、アガロースゲルおよびＱｉａｑｕｉｃｋｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、ＲｅｄｉＰｒｉｍｅ（商標）ＩＩＤＮＡｌａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、³²ＰｄＣＴＰでＰＣＲ産物を標識し、プローブを形成した。次いで、こうした放射標識したプローブを、ＪＢｒＢＡＣライブラリー（系統Ｒ−ｏ−１８）または系統ＲＬＲ２２のフォスミドライブラリー（ＷａｒｗｉｃｋＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｅＬｉｂｒａｒｉｅｓ，ＵＫ）の３６８６４コロニーをプリントしたフィルターにハイブリダイズさせ、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａを有するプラスミド（それぞれＪＢｒ０４３Ｏ１９およびＲＬＲ０２１Ｇ１３）を含むコロニーを同定した。ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓｙｓｔｅｍおよびＡＢＩＰｒｉｓｍ３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃｓＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、段階的な方法で、これらのプラスミドの部分を配列決定し、２つの対立遺伝子の完全なゲノム配列を決定した。

総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、両植物系統の若葉から抽出した。幾つかの総ＲＮＡ試料を、ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理して、ゲノムＤＮＡのあらゆる残遺物を除去した。ＲＴ−ＦＯＲプライマーおよびＲＴ−ＲＥＶプライマーは、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ遺伝子の完全なコード領域を含む（開始コドンおよび終止コドンをボールド体で示す、クローニング用のアダプターをイタリック体で示す）。

ＲＴ−ＦＯＲ：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧ（配列番号１３）
ＲＴ−ＲＥＶ（Ｒ−ｏ−１８）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＴＡＧＴＴＣＴＴＣ（配列番号１４）
ＲＴ−ＲＥＶ（ＲＬＲ２２）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣ（配列番号１５）

総ＲＮＡ（ＤＮａｓｅＩ処理した、またはＤＮａｓｅＩ処理しないＲＮＡ約１０μｇ）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および好適なＲＴ−ＲＥＶプライマーを使用した標準逆転写反応でｃＤＮＡに変えた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）および好適なＲＴ−ＦＯＲプライマーとＲＴ−ＲＥＶプライマーとの組合せを使用した標準ＰＣＲで、ｃＤＮＡを増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法を使用して分離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲルから抽出した。ＢＰクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、産物をプラスミドｐＤＯＮＲ２２１にクローニングした。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉｒｅａｃｔｉｏｎ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プラスミドを増幅し、次いで配列決定した。

結果
本発明者は、世界各地の様々なＴｕＭＶ単離株に対して抵抗性を有し、かつ異なる遺伝群を表す、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）系統、ＲＬＲ２２を同定した。図８は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合の植物は、ＴｕＭＶ感染に抵抗性がある（左）が、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）Ｒ−ｏ−１８対立遺伝子についてホモ接合、またはヘテロ接合の植物は、ＴｕＭＶ感染に易感染性である（右）ことを説明している。

まず第一に、本発明者は、ウイルス抵抗性表現型がｅＩＦ（ｉｓｏ）Ｅ遺伝子座と関連していることを発見した。易感染性系統（Ｒ−ｏ−１８）と抵抗性系統（ＲＬＲ２２）との間の交配を使用して、本発明者は、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）が３つのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子座を含むことを確認した。

第二に、系統Ｒ−ｏ−１８および系統ＲＬＲ２２におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａの、ゲノムバージョンの配列とｍＲＮＡバージョンの配列を比較した。図１は、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａｍＲＮＡ、および対照としての、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥｍＲＮＡの、ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動ゲルを表す。ゲルで分かる通り、ウイルス抵抗性系統、ＲＬＲ２２由来の、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡは、感染した系統、Ｒ−ｏ−１８から得たＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡより大きい。

系統Ｒ−ｏ−１８におけるＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのゲノム配列を配列番号１として提供し、ＲＬＲ２２のゲノム配列を、配列番号４として提供する。ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのシーケンシングに続いて、本発明者は、２つの対立遺伝子（Ｒ−ｏ−１８およびＲＬＲ２２における）は、エクソン／イントロン接合点における１塩基挿入／欠失（すなわち１「インデル」）だけ異なることを発見した。ウイルス−易感染性系統Ｒ−ｏ−１８では、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ対立遺伝子の、単一のｍＲＮＡ配列が発見され、そのｍＲＮＡ配列を配列番号２として提供する。ｍＲＮＡは、図３に表されている図式によって表される通り、全長蛋白質を産生することができ、またその蛋白質配列を配列番号３として提供する。

しかし、ウイルス抵抗性系統ＲＬＲ２２では、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡのスプライス変異体が幾つか発見された。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのｍＲＮＡは、主として、発現されたＤＮＡに第１イントロンが依然として存在する産物（配列番号５として示される）からなり、より長いｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ蛋白質を形成し、これによって、なぜ図１に示すＲＬＲ２２でフラグメントがより長いのかが説明される。他のさらに希少な、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのスプライス変異体も同定された。すなわち、図５に表示されている通り、配列番号７は、保持された３’末端の１５塩基を除き、第１イントロンの大部分が除去されていた。配列番号９は、図６に表示されている通り、第１イントロンの全てが除去されており、エクソン１の３’末端の３塩基も除去されていた。こうしたスプライシング変異体はどれも、全長の「正確な」ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ蛋白質を産生することができないであろう、すなわち、ウイルス感染に易感染性である系統Ｒ−ｏ−１８のように、スプライシングが正確に行われたかのように全長蛋白質を産生することができないであろう。配列番号５、７および９から翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６、８および１０として表す。本発明者は、改変された蛋白質はどれも、ＴｕＭＶにとって機能的ではないであろうと考えている。

これまで報告されたｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに基づいたポチウイルス類に対する劣性抵抗性は、遺伝子のコード領域（エクソン）のみの塩基の変化によって生じ、変化した蛋白質配列（変化したアミノ酸残基または未熟な鎖終結）をもたらしていた。しかし、ウイルス抵抗性系統ＲＬＲ２２の場合、抵抗性は意外にも遺伝子の非コード領域（イントロン）における変化に関係している。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ対立遺伝子における「インデル」は、系統ＲＬＲ２２における正確なスプライシングを混乱させ、ウイルスゲノム翻訳にとって機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅａ蛋白質を何も生じない（または大幅に減少して生じる）結果となり、最終的にウイルス感染を招かないことを、本発明者は示した。本発明者は、ウイルス抵抗性系統ＲＬＲ２２由来の対立遺伝子、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａを、ｒｅｔｒ０１と命名した。

実施例２−ＴｕＭＶ感染に抵抗性がある植物の育種
ＴｕＭＶに抵抗性があるＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）植物は、以下の育種プログラムから得ることが可能であり、そのプログラムを図８に図示する。

図８を参照すると、所望の農学的形質を有するレシピエントＢ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）植物を、ウイルス抵抗性ＲＬＲ２２植物と交配し、その子孫（Ｆ₁）をレシピエント親（回帰）植物系統と戻し交配する。分子技術（たとえばＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａ対立遺伝子を識別するための、ＰＣＲおよびシークエンシングまたは他の特異的ＰＣＲに基づいた方法）を使用して、ＲＬＲ２２に由来するＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａの対立遺伝子（ウイルス抵抗性を与える）が、各交配で、非回帰植物に存在することを確実にする。最終的に、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子を有する戻し交配プログラムによって得られる植物を自殖させる（すなわち自家受粉させる）。ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合である次世代の植物を、上述の分子技術によって同定する。

ウイルス抵抗性を有するＦ₁雑種植物を育種するためには、別々の戻し交配プログラムによって得られる２つの植物系統が、第１態様のｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてホモ接合でなければならない。次いで、こうした系統を交配して、次には第１態様のｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについてホモ接合であろう、Ｆ₁ハイブリッドを作り出す。

実施例３−ポチウイルス感染に抵抗性がある植物の育種
ある特定のポチウイルスに抵抗性がある植物は、以下の育種プログラムにより得ることが可能である。

レシピエント植物を、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのスプライシングに関して欠陥がある植物と交配し、その子孫をレシピエント親（回帰）植物系統と戻し交配する。分子技術（ＰＣＲおよびシークエンシングまたは他の特異的ＰＣＲに基づいた試験）を使用して、スプライシングに欠陥があり、抵抗性を与える、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子が、各交配で、非回帰植物に存在することを確実にする。スプライシングに欠陥があり、抵抗性を与える、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ対立遺伝子を有する戻し交配プログラムによって得られる植物を、自殖させる。上述の分子技術を使用して、スプライシングに欠陥があるｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子についてホモ接合である次世代の植物を同定する。最終的に、こうした植物を自殖させて、所望のｅＩＦ４Ｅ／ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ対立遺伝子についてホモ接合である系統／ファミリーを提供する。

実施例４−ウイルス−抵抗性を与える第２の遺伝子座、ＣｏｎＴＲ０１の単離
実施例１〜３に記述されているシナリオは、ある特定のウイルスがそのライフサイクルを完成するために利用することができる、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのコピーをたった１つ有する植物におけるウイルス抵抗性を説明するのに十分である。しかし、一部の植物は、こうした２つの遺伝子の一方、または両者の、複数のコピー／遺伝子座を有する。たとえば、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）はｅＩＦ４ＥとｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方の３コピーを有し、ウイルスはこれらの遺伝子のいずれかを使用してそのライフサイクルを完成することが可能である。したがって、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの複数のコピー／遺伝子座を有する植物でウイルス抵抗性を与えるためには、こうした他の遺伝子座の各々におけるｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子が、ウイルスにとって非機能的であることが必要である。

Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）ＴｕＭＶ−易感染性系統Ｒ−ｏ−１８とＴｕＭＶ−抵抗性系統ＲＬＲ２２との間で、上述の交配を使用して、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子とＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合であったが、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ遺伝子座でヘテロ接合であった、Ｂ₁植物を同定した。次いで、この特定の個体に由来するＢ₁Ｓ₁植物を、表現型検査および遺伝子型検査した。ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合の植物は、ＴｕＭＶの全身的な広がりに対して完全に抵抗性があり、ヘテロ接合体はウイルス感染に対して僅かに易感染性に過ぎなかったが、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子についてホモ接合であった植物は、完全に易感染性であった。

Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）で、ＴｕＭＶに対する広域スペクトル抵抗性に関わる第２の遺伝子座が、染色体Ａ８上のＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃとして今や同定され、本明細書ではＣｏｎＴＲ０１と呼ばれる。これによって、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）におけるＴｕＭＶに対する広域スペクトル抵抗性には、ｒｅｔｒ０１（ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａのＲＬＲ２２対立遺伝子）に加えて、第２の遺伝子（ＣｏｎＴＲ０１、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子）が必要なことが確認され、またウイルスがｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの複数のコピー／遺伝子座を利用できる植物で、抵抗性を与えるためには、２つ以上の遺伝子が重要なことが証明される。

材料と方法
総ゲノムＤＮＡは、Ｒ−ｏ−１８系統およびＲＬＲ２２系統の若葉から、ＤＮｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、続いてＧｅｎｏｍｉＰｈｉｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して増幅した。ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａ遺伝子、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂ遺伝子（Ｒ−ｏ−１８のみ）、ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃ遺伝子、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂ遺伝子およびＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ遺伝子のゲノムコード領域を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および下記のプライマーを使用して標準ＰＣＲで増幅した。ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓｙｓｔｅｍおよびＡＢＩＰｒｉｓｍ３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃｓＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、段階的な方法で、これらの産物の部分を配列決定し、対立遺伝子の完全なゲノム配列を決定する。ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂは、非機能的であるため、ＲＬＲ２２から配列決定されなかった。得られた配列の概要を表１に記載する。

ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）系統Ｒ−ｏ−１８およびＲＬＲ２２由来のｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ対立遺伝子を増幅または配列決定するために使用されたプライマー：
Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａ：
順方向（ＢＲ５７）：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧ（配列番号１６）
逆方向（ＢＲ５８）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＣＡ（配列番号１７）

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂ：
順方向（ＢＲ７１）：ＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＴ（配列番号１８）
逆方向（ＢＲ５０）：ＡＧＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＡＣ（配列番号１９）

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃ：
順方向（ＢＲ５９）：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴ（配列番号２０）
逆方向（ＢＲ６０）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号２１）

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂ：
順方向（ＢＲ７３）：ＴＧＡＡＡＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴ（配列番号２２）
逆方向（ＢＲ７４）：ＧＣＡＡＡＣＣＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡ（配列番号２３）

Ｒ−ｏ−１８ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ：
順方向（ＢＲ６３）：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＴ（配列番号２４）
逆方向（ＢＲ６４）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＧＧＧＴＣＡＡＡＡＴ（配列番号２５）

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ａ：
順方向（ＢＲ６８）：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＧ（配列番号２６）
逆方向（ＢＲ５８）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＣＡ（配列番号２７）

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃ：
順方向（５９）：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴ（配列番号２８）
逆方向（６０）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＴＧＡ（配列番号２９）

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂ：
順方向（ＢＲ７３）：ＴＧＡＡＡＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴ（配列番号３０）
逆方向（ＢＲ７４）：ＧＣＡＡＡＣＣＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡ（配列番号３１）

ＲＬＲ２２ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ：
順方向（ＢＲ８０）：ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＣＡＴＡＡＡＧＣ（配列番号３２）
逆方向（ＢＲ８１）：ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＣＣＧＴＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡ（配列番号３３）

実施例５−広域スペクトル抵抗性に関わる第２の遺伝子（ＣｏｎＴＲ０１）の同定
Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）系統Ｒ−ｏ−１８は、ＴｕＭＶに易感染性の同系交配系統である。ＴｕＭＶに抵抗性がある、系統ＲＬＲ２２は、今までに試験した全てのＴｕＭＶ単離株に対して広域スペクトル抵抗性を有する（Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．２００２，ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ１０８，１５−２０）。Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）ＴｕＭＶ−易感染性系統Ｒ−ｏ−１８とＴｕＭＶ−抵抗性系統ＲＬＲ２２との間の交配から（Ｒｕｓｈｏｌｍｅｅｔａｌ．２００７，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ８８，３１７７−３１８６）。Ｂ₁植物１６は、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａおよびＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合であると同定されたが、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ遺伝子座でヘテロ接合であると同定された。ＲＬＲ２２およびＲ−ｏ−１８は、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂ遺伝子座に同じ対立遺伝子を有し、またＢｒａＡ．ｅＩＦ４Ｅ．ｂにおけるＲ−ｏ−１８対立遺伝子は、非常に短縮されたポリペプチドを提供する偽遺伝子であるため、この植物についてこうした対立遺伝子は決定されなかった。

Ｂ₁植物１６に由来するＢ₁Ｓ₁種子を蒔いた。総ゲノムＤＮＡは、発芽させた植物の若葉から、ＤＮｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、続いてＧｅｎｏｍｉＰｈｉｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して増幅した。次いで、プライマーＢＲ２（ＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＴＡＣ−配列番号６１）およびＢＲ１４（ＴＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＧＡＡＡＣＴＧ−配列番号６２）を使用して、植物のＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃ遺伝子座の遺伝子型検査をした。こうしたプライマーは、ＲＬＲ２２について３サイズの産物を産生し（図９参照）、Ｒ−ｏ−１８について３サイズの産物を産生する。最大の産物は、両植物ともにＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａに相当し、中型の産物はＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｂに相当し、最小の産物は両植物ともにＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃに相当する。ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子に関する産物（５６６ｂｐ）は、ＲＬＲ２２対立遺伝子に関する産物（５４６ｂｐ）より大きく、容易に識別できる（図９参照）。ゲルで分かる通り、易感染性植物Ｒ−ｏ−１８由来のＢｒＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅｃに関するＰＣＲ産物は、抵抗性植物ＲＬＲ２２のそれより大きい。

３〜５葉期に、ＴｕＭＶ単離株ＣＤＮ１を植物に機械的に接種し、Ｒｕｓｈｏｌｍｅら（２００７）により記述されている視覚的評価およびＥＬＩＳＡで、感染／抵抗性表現型を決定した。植物に関する遺伝子型、表現型およびＥＬＩＳＡ値を表２に提供する。

ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲＬＲ２２対立遺伝子についてホモ接合の植物はＴｕＭＶに対して完全に抵抗性があり、ヘテロ接合体は検出可能な感染を何も示さないか、または接種した葉から限定された数の未接種葉にウイルスが広がったが、その後それ以上広がらない、僅かに易感染性かのいずれかであった。ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子についてホモ接合であった植物は、完全に易感染性であった。ＴｕＭＶはＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃのＲ−ｏ−１８対立遺伝子を使用することができ、完全な全身性感染を確立するためには、植物はこの対立遺伝子についてホモ接合であることが必要なことが、結果から分かる。この遺伝子座でヘテロ接合であった植物の接種結果から、Ｒ−ｏ−１８対立遺伝子の１コピーは、ＴｕＭＶが最も悪化した全身性感染を確立するのに十分ではないことが分かる。ヘテロ接合体の表現型間の違い（易感染性ではないか、または限定された易感染性）は、恐らく、全身的な広がりが起こるために、ウイルスが接種された葉で十分に高い力価を確立する必要性におそらく関連している。

表３は、ＴｕＭＶが本明細書に記載の６つの対立遺伝子を使用する能力の概要を提供する。ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ａはｒｅｔｒ０１であり、ＢｒａＡ．ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ．ｃはＣｏｎＴＲ０１である。

Claims

ウイルスに対して非機能的である、単離された植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）であって、前記ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコードしている核酸が、前記核酸の非コード領域における改変の結果として、ミススプライスされており、前記ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質が、配列番号４５、５１または５４で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、単離された植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）。
選択的にスプライスされた植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）をコードしている単離された核酸であって、前記ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅがウイルスにとって非機能的であるように、前記核酸がミススプライスされており、前記核酸のヌクレオチド配列が、配列番号４４、５０または５３で示されることを特徴とする、単離された核酸。
前記ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが、請求項１に定義されている、請求項２に記載の単離された核酸。
請求項３に記載の核酸を含む、組み換えベクター。
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
ウイルス抵抗性植物を選択する方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の、植物真核細胞の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）、および
（ｉｉ）野生型ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの少なくとも１つのコピーであって、前記植物は使用することができるが、ウイルスは使用することができない、前記ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの野生型コピー、
の存在を、試験植物で、検出する工程を含むことを特徴とする方法。
植物においてウイルス抵抗性を誘導するための、請求項１に記載の植物真核細胞の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）、または請求項２又は３のいずれかに記載の核酸の使用。
ウイルス抵抗性植物を作り出す方法であって、
請求項１に記載の植物真核細胞の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）を発現する親植物を、レシピエント植物と交配する工程を含み、
前記レシピエントが、農学的利点、商業的利点、および／またはある特定の気候または土壌への適合性からなる群から選択される少なくとも１つの形質を備えることを特徴とする方法。
トランスジェニック植物の使用を含む、請求項６又は８のいずれか１項に記載の方法。
ウイルスにとって非機能的である、前記選択的にスプライスされた植物真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、またはそのアイソフォーム（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ）のをコードしている、ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅについて、前記植物がホモ接合である、請求項６又は８のいずれか１項に記載の方法。
ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの複数のコピー／遺伝子座を有する植物でウイルス抵抗性を与えるために、こうした他の遺伝子座の各々における前記ｅＩＦ４Ｅおよび／またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子もやはり、前記ウイルスにとって非機能的である、請求項６又は８のいずれか１項に記載の方法。
前記植物が、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ）作物、ブラッシカ種（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｐ）、ブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）エンドウ豆、豆、豆類、またはコメ、トウモロコシ、コムギ、もしくはオオムギを含む、単子葉作物、である、請求項６又は８のいずれか１項に記載の方法。