JP6082328B2 - Bile acid simultaneous analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、生体由来の試料中に含まれる多種類の胆汁酸を同時に分析する方法に関する。 The present invention relates to a method for simultaneously analyzing multiple types of bile acids contained in a sample derived from a living body.
胆汁の主要構成成分として知られる胆汁酸は、ステロイド核を有する炭素数２４のカルボン酸である。中でも、コール酸、ジヒドロキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸が主要な胆汁酸であるが、水酸基の数や位置、配置の異なる構造類似体が多数存在する。
胆汁酸は、肝臓で生合成された一次胆汁酸が、腸管で微生物による代謝・変換を受け二次胆汁酸となり、胆嚢に輸送され更に胆嚢から十二指腸へ分泌される。
胆汁酸の機能としては、十二指腸において脂質とミセルを形成し、腸管からの脂質の吸収に重要な役割を果たしていることが知られている。一方で、高濃度ではその界面活性作用から生体膜を溶かすなどの毒性を有し、濃度により機能が異なることを示す報告もあるなど、その役割が十分には解明されていない。
Bile acid, known as the main component of bile, is a carboxylic acid having 24 carbon atoms having a steroid nucleus. Among them, cholic acid, dihydroxycholic acid, chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, and ursodeoxycholic acid are the main bile acids, but there are many structural analogs having different numbers, positions, and arrangements of hydroxyl groups.
Bile acids are primary bile acids biosynthesized in the liver, metabolized and converted by microorganisms in the intestine to become secondary bile acids, which are transported to the gallbladder and further secreted from the gallbladder to the duodenum.
As a function of bile acids, it is known that lipids and micelles are formed in the duodenum and play an important role in the absorption of lipids from the intestinal tract. On the other hand, the role is not fully elucidated, for example, there are reports showing that it has toxicity such as dissolving biological membranes due to its surface-active action at high concentrations and the function varies depending on the concentration.
個別の胆汁酸を分析する方法としては、酵素を使用する方法、抗体を使用する方法、などが古くから知られていた。しかし、個別の胆汁酸を分析して得られる情報だけでは十分とは言えず、組織や血中における濃度やその分布を示すプロファイルを明らかにしていくことが求められている。しかし、胆汁酸についての研究は十分に進んでいるとは言い難い。その理由の一つとして、適切な同時分析の方法が存在しないことが挙げられる。 As a method for analyzing individual bile acids, a method using an enzyme, a method using an antibody, and the like have been known for a long time. However, it cannot be said that information obtained by analyzing individual bile acids alone is sufficient, and it is required to clarify a profile indicating the concentration and distribution in tissues and blood. However, research on bile acids is far from advanced. One reason is that there is no appropriate method for simultaneous analysis.
ＨＰＬＣなどの機器分析法の発達により、特定の胆汁酸だけを分析対象とするのではなく、試料中に含まれる胆汁酸を同時に分析すること（特許文献１）、更に、質量分析装置を備えたＬＣ−ＭＳを使用することによって高感度な同時分析をすること（特許文献２、非特許文献１）が報告されているが、これらは同時分析とはいってもその分析可能な胆汁酸の種類に制限があるなど、未だ十分なものではなかった。 Due to the development of instrumental analysis methods such as HPLC, not only specific bile acids are analyzed, but also analyzing bile acids contained in a sample simultaneously (Patent Document 1), and further equipped with a mass spectrometer. It has been reported that high-sensitivity simultaneous analysis is performed by using LC-MS (Patent Document 2, Non-Patent Document 1). There was still a limit and it was not enough.
特許文献１ではＨＰＬＣによる胆汁酸の同時分析方法が開示されているが、分離用と酵素反応用の２種類のカラムを使用しなければならず煩雑であり、前処理から分析まで必要な時間が長いといった問題がある。
特許文献２ではＨＰＬＣと質量分析（ＭＳ）を組み合わせたＬＣ−ＭＳによる胆汁酸の同時分析方法が開示されているが、分析に必要とする検体量が多すぎること、分析可能な胆汁酸成分の種類数が十分でないこと、特許文献１の方法よりは短縮されているものの、それでも分析時間が長いなどの問題がある。
非特許文献１ではＨＰＬＣよりも高感度に分離を行える超高速液体クロマトグラフィー
（ＵＰＬＣ）とＭＳを組み合わせたＵＰＬＣ−ＭＳによる胆汁酸の同時分析方法が開示されている。しかし、分析に必要とする検体量が多いこと、ヒトやマウスに比べて血中胆汁酸濃度の高いラットの血漿中胆汁酸の分析結果であるため、高感度な分析方法とは言い難いといった問題がある。
また、適切な分析方法が存在しない理由として前処理方法が挙げられる。前処理操作により試料中に含有される胆汁酸の損失が起こり、同時分析を妨げる要因と成っている。この損失を回避するためには、抽出工程と濃縮工程を複数回繰り返して行う必要があり、分析を行う際の煩雑さが増す原因となっていた。
従って、本発明は多種類の胆汁酸を、簡便且つ高感度に、同時に分析する方法を提供することを課題とする。
Patent Document 1 discloses a method for simultaneous analysis of bile acids by HPLC. However, two types of columns for separation and enzyme reaction must be used, which is complicated and requires a long time from pretreatment to analysis. There is a problem of being long.
Patent Document 2 discloses a method for simultaneous analysis of bile acids by LC-MS combining HPLC and mass spectrometry (MS). However, the amount of specimen required for analysis is too large, and the bile acid components that can be analyzed Although the number of types is not sufficient and the method is shorter than the method of Patent Document 1, there are still problems such as a long analysis time.
Non-Patent Document 1 discloses a method for simultaneous analysis of bile acids by UPLC-MS in which MS is combined with ultra high performance liquid chromatography (UPLC) capable of separation with higher sensitivity than HPLC. However, there is a problem that it is difficult to say that it is a highly sensitive analysis method because the amount of specimen required for analysis is large and the analysis result of plasma bile acid in rats with high blood bile acid concentration compared to humans and mice There is.
A pretreatment method can be cited as a reason why there is no appropriate analysis method. Loss of bile acids contained in the sample occurs due to the pretreatment operation, which is a factor that hinders simultaneous analysis. In order to avoid this loss, it is necessary to repeat the extraction step and the concentration step a plurality of times, which increases the complexity of the analysis.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for simultaneously analyzing a wide variety of bile acids in a simple and highly sensitive manner.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、UPLCとMSを組み合わせて測定することで２０種類以上の胆汁酸を同時に分析することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を提供する。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that more than 20 types of bile acids can be analyzed simultaneously by measuring in combination with UPLC and complete the present invention. It came to.
That is, the present invention provides the following.
（１）試料中に含まれる、α−ムリコール酸（αＭＣＡ）、β−ムリコール酸（βＭＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ヒオコール酸（ＨＣＡ)、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、１２−ケトリトコー
ル酸（ＫＬＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、グリコ−α−ムリコール酸（ＧαＭＣＡ）、グリコ−β−ムリコール酸（ＧβＭＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコヒオコール酸（ＧＨＣＡ）、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロ−α−ムリコール酸（ＴαＭＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、の中から選ばれた組み合わせである２０種類以上の胆汁酸を同時に分析する方法であって、
（ｉ）ＵＰＬＣにより試料に含まれる胆汁酸を分離する工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で分離された胆汁酸を質量分析計で分析する工程、
を含む方法。
（２）前記２０種類以上の胆汁酸は、１２−ケトリトコール酸、グリコヒオコール酸、タウロ−β−ムリコール酸、タウロヒオコール酸、タウロウルソデオキシコール酸のいずれかを少なくとも１種類以上含む、（１）に記載の方法。
（３）前記胆汁酸が２３種類以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＵＰＬＣによって胆汁酸を分離する前記工程（ｉ）において、ＵＰＬＣの移動相に蟻酸とアセトニトリルを使用する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 前記工程（ｉ）が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を増大させる工程を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記工程（ｉ）が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を第１のアセトニトリル濃度から第２のアセトニトリル濃度まで増大させる工程を含み、アセトニトリル濃度を２０％〜７０％の範囲内で増大させる、（５）に記載の方法。
（７） 前記工程（ｉ）が、移動相中での蟻酸の濃度を減少させる工程を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８） 前記工程（ｉ）が、移動相中での蟻酸濃度を第１の蟻酸濃度から第２の蟻酸濃度まで減少させる工程を含み、蟻酸濃度を０．０８％〜０．０３％の範囲内で減少させる、（７）に記載の方法。
（９）（ｉ）試料に試料の倍量以上のエタノールを添加する工程、
（ｉｉ）４℃で１５，０００回転、３分間遠心分離する工程、
（ｉｉｉ）遠心分離後の試料の上清を得る工程、
を含む試料前処理工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記前処理法の工程（ｉ）において、試料に添加する溶媒に、更に、クロロホルム、およびメタノールを添加する、（９）に記載の方法。
(1) α-mulicholic acid (αMCA), β-mulicholic acid (βMCA), cholic acid (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), hyocholic acid (HCA) contained in the sample, Hyodeoxycholic acid (HDCA), 12-ketritocholic acid (KLCA), lithocholic acid (LCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), glyco-α-muricholic acid (GαMCA), glyco-β-mulicholic acid (GβMCA), Glycocholic acid (GCA), glycochenodeoxycholic acid (GCDCA), glycodeoxycholic acid (GDCA), glycohyocholic acid (GHCA), glycohyodeoxycholic acid (GHDCA), glycolithocholic acid (GLCA), glycoursodeoxycholic Acid (GUDCA), Tauro-α-Muricol Acid (TαMCA), Tauro-β-muricholic acid (TβMCA), Taurocholic acid (TCA), Taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), Taurodeoxycholic acid (TDCA), Taurohyocholic acid (THCA), Taurohyodeoxycholic acid (THDCA) A method for simultaneously analyzing 20 or more types of bile acids, which is a combination selected from taurolithocholic acid (TLCA) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA),
(I) a step of separating bile acids contained in the sample by UPLC;
(Ii) a step of analyzing the bile acid separated in the step (i) with a mass spectrometer,
Including methods.
(2) The 20 or more bile acids include at least one of 12-ketritocholic acid, glycohyocholic acid, tauro-β-muricholic acid, taurohyocholic acid, and taurursodeoxycholic acid, (1) The method described in 1.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the bile acids are 23 or more.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein in the step (i) of separating bile acids by UPLC, formic acid and acetonitrile are used for the mobile phase of UPLC.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the step (i) includes a step of increasing the concentration of acetonitrile in the mobile phase.
(6) The step (i) includes the step of increasing the concentration of acetonitrile in the mobile phase from the first acetonitrile concentration to the second acetonitrile concentration, and increasing the acetonitrile concentration within a range of 20% to 70%. The method according to (5).
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the step (i) includes a step of reducing the concentration of formic acid in the mobile phase.
(8) The step (i) includes a step of reducing the formic acid concentration in the mobile phase from the first formic acid concentration to the second formic acid concentration, and the formic acid concentration is in the range of 0.08% to 0.03%. The method according to (7), wherein
(9) (i) a step of adding ethanol more than double the amount of the sample to the sample;
(Ii) centrifuge at 15,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C.,
(Iii) obtaining a supernatant of the sample after centrifugation;
The method in any one of (1)-(8) including the sample pre-processing process containing.
(10) The method according to (9), wherein in step (i) of the pretreatment method, chloroform and methanol are further added to the solvent added to the sample.
本発明によれば、多種類の胆汁酸を、簡便且つ高感度に、同時に分析し同定、定量することが可能である。例えば、少ない検体量で、かつ、従来よりも大幅に短い時間で高感度に分析することが可能である。また、ラットだけでなく血中胆汁酸濃度が低いヒト、マウスにおいても、試料中に含まれる胆汁酸を分析することが可能である。 According to the present invention, various types of bile acids can be simultaneously analyzed, identified and quantified simply and with high sensitivity. For example, it is possible to perform analysis with high sensitivity in a small amount of sample and in a significantly shorter time than in the past. In addition, not only rats but also humans and mice with low blood bile acid concentrations can analyze bile acids contained in samples.
以下において、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings as appropriate, but the present invention is not limited to these embodiments.
本発明において、α-ムリコール酸（αＭＣＡ）、β−ムリコール酸（βＭＣＡ）、コ
ール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ヒオコール酸（ＨＣＡ）、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、１２−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、グリコ−α−ムリコール酸（ＧαＭＣＡ）、グリコ−β−ムリコール酸（ＧβＭＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコヒオコール酸（ＧＨＣＡ）、グリコヒオデオキシコール酸（GＨ
ＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロ−α−ムリコール酸（ＴαＭＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）など既知の胆汁酸２８種類を分析対象とすることができる。これらの胆汁酸のうち、２０種類以上を適宜必要に応じて組み合わせて、同時分析の対象とすることができる。どの胆汁酸を選択するかは当業者であれば選択することができる。少なくとも２０種以上、好ましくは２２種以上、より好ましくは２３種以上、さらに好ましくは２４種以上の胆汁酸を選択して同時に分析することができる。
また、上記同時分析の対象とする胆汁酸は、１２−ケトリトコール酸、グリコヒオコール酸（ＧＨＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）、タウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（TＵＤＣＡ）のうち少なくとも１種類以上の
胆汁酸を含むことが好ましい。
In the present invention, α-mulicholic acid (αMCA), β-mulicholic acid (βMCA), cholic acid (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), hyocholic acid (HCA), hyodeoxycholic acid ( HDCA), 12-ketritocholic acid (KLCA), lithocholic acid (LCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), glyco-α-muricholic acid (GαMCA), glyco-β-mulicholic acid (GβMCA), glycocholic acid (GCA) ), Glycochenodeoxycholic acid (GCDCA), glycodeoxycholic acid (GDCA), glycohyocholic acid (GHCA), glycohyodeoxycholic acid (GH)
DCA), glycolithocholic acid (GLCA), glycoursodeoxycholic acid (GUDCA), tauro-α-muricholic acid (TαMCA), tauro-β-muricholic acid (TβMCA), taurocholic acid (TCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA) ), Taurodeoxycholic acid (TDCA), taurohyocholic acid (THCA), taurohyodeoxycholic acid (THDCA), taurolithocholic acid (TLCA), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) and other 28 types of bile acids to be analyzed It can be. Of these bile acids, 20 or more types can be appropriately combined as necessary for simultaneous analysis. A person skilled in the art can select which bile acid is selected. At least 20 or more, preferably 22 or more, more preferably 23 or more, and still more preferably 24 or more bile acids can be selected and analyzed simultaneously.
The bile acids to be subjected to the simultaneous analysis are 12-ketritocholic acid, glycohyocholic acid (GHCA), tauro-β-muricholic acid (TβMCA), taurohyocholic acid (THCA), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA). Among these, it is preferable that at least one bile acid is included.
上記胆汁酸に加え、ＵＰＬＣによって分離された未知の胆汁酸についても分析対象とすることができる。該未知の胆汁酸を分析対象とした場合、或いは、未知の胆汁酸であると推定された場合には、本発明の分析方法によって得られた結果に加えて、当業者であれば適宜方法を選択して、構造を推定し胆汁酸であることを同定することができる。 In addition to the above bile acids, unknown bile acids separated by UPLC can also be analyzed. When the unknown bile acid is the target of analysis, or when it is estimated to be an unknown bile acid, in addition to the results obtained by the analysis method of the present invention, those skilled in the art can appropriately use the method. By selection, the structure can be estimated and identified as a bile acid.
新規の胆汁酸であることが同定された場合には、本発明の分析方法において得られた結果を用いて、胆汁酸の同定、定量に使用することができる。 When a novel bile acid is identified, it can be used for identification and quantification of bile acid using the result obtained in the analysis method of the present invention.
本発明において分析対象とする動物種は、ヒト、サルなどの霊長目、マウス、ラットなどの齧歯目、ウサギなどの重歯目、ブタなどの偶蹄目、鳥類を対象として使用することができるが、ヒト、マウス、ラットを分析対象とすることが好ましい。特に、ヒト、マウス等の胆汁酸含有量の低い動物においては特に有用性が高い。 Animal species to be analyzed in the present invention can be used for primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats, heavy teeth such as rabbits, cloven-hoofed animals such as pigs, and birds. However, it is preferable to analyze humans, mice, and rats. In particular, it is particularly useful for animals having a low bile acid content such as humans and mice.
分析に使用することのできる検体の種類は、上記動物生体に由来し胆汁酸を含む生体試料であればよく、例えば、血液、組織、尿、便、胆汁などが好ましい。 The type of specimen that can be used for the analysis may be a biological sample derived from the animal body and containing bile acid, and for example, blood, tissue, urine, stool, bile and the like are preferable.
上記生体試料は、本発明の方法による分析前に、適宜前処理に供されてもよい。前処理としては、例えば、希釈、濃縮、凍結、融解、加熱、乾燥、破砕、懸濁、滅菌、固形分の除去、固相抽出などが挙げられる。本発明において前処理は、分析対象とする胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できるが、熱エタノール抽出法、酸を加える方法などによって前処理することで蛋白質などの分離阻害物質を除去することができる。より簡便に前処理を行うために、抽出に用いられるエタノールの組成や洗浄用および溶出用溶媒の組成を、分析対象の胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択してもよい。また、該前処理は、単独の方法で実施してもよく、適宜複数の方法を組み合わせて行ってもよい。 The biological sample may be appropriately subjected to pretreatment before analysis by the method of the present invention. Examples of the pretreatment include dilution, concentration, freezing, thawing, heating, drying, crushing, suspension, sterilization, solid content removal, solid phase extraction, and the like. In the present invention, the pretreatment can be appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of contaminants, but the protein can be pretreated by a hot ethanol extraction method, a method of adding an acid, or the like. The separation inhibitory substance can be removed. In order to perform pretreatment more simply, the composition of ethanol used for extraction and the composition of the solvent for washing and elution are appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of contaminants. May be. The pretreatment may be performed by a single method or may be performed by appropriately combining a plurality of methods.
本発明においては、エタノール抽出法を改変してより簡便に実施することができる。これは、溶出液をそのまま生体試料として使用できることから、少量の検体で分析可能となる点で好ましい。また、適宜濃縮等して生体試料として分析に供することもできる。 In the present invention, the ethanol extraction method can be modified for easier implementation. This is preferable in that the eluate can be used as a biological sample as it is, and therefore analysis with a small amount of sample is possible. Moreover, it can also be subjected to analysis as a biological sample after appropriate concentration.
具体的には、ポリプロピレン製マイクロチューブに血漿試料２０μｌを採取し、エタノールを８０μｌ及び内部標準溶液（ＩＳ）を２０μｌ添加して攪拌し、４℃で１５，０００回転、３分間遠心分離を行う。遠心分離後に得られた上清は、分析試料として使用することができる。このような前処理操作は、ＵＰＬＣのような高感度の分析装置を使用した場合に特に効果を発揮し、大幅な時間短縮を図れることに加えて、以下に記載する容器への吸着防止の観点からも好ましい。 Specifically, 20 μl of a plasma sample is collected in a polypropylene microtube, 80 μl of ethanol and 20 μl of internal standard solution (IS) are added and stirred, and centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant obtained after centrifugation can be used as an analytical sample. Such a pretreatment operation is particularly effective when a highly sensitive analyzer such as UPLC is used, and in addition to being able to achieve a significant reduction in time, a viewpoint for preventing adsorption to the container described below. Is also preferable.
従来使用されているエタノールを使用した前処理法は、エタノールに加えてクロロホルムやメタノールなどと組み合わせて実施されており、エタノール単独で前処理を行うことは困難であると考えられていたところ（Ｊ．ｌｉｐｉｄ ｒｅｓ．４５；２９５−３００，２００４）、エタノールのみで蛋白質等の夾雑物質を除去することができ、しかもＵＰＬＣ−ＭＳのような高感度な機器分析において使用可能な試料が得られたことは意外な効果であった。 The pretreatment method using ethanol, which has been used in the past, is carried out in combination with chloroform, methanol, etc. in addition to ethanol, and it was considered difficult to perform pretreatment with ethanol alone (J .Lipid res.45; 295-300, 2004), and it was possible to remove contaminants such as proteins with ethanol alone, and a sample that could be used in highly sensitive instrumental analysis such as UPLC-MS was obtained. Was an unexpected effect.
前処理工程によって得られた試料は適宜ＬＣ−ＭＳに適した溶媒に溶解して使用することができる。生体試料を溶媒に溶解させる場合、生体試料に含まれる分析対象とする胆汁酸がポリプロピレン等へ吸着するのを防止できる組成の溶媒を用いるのが好ましい。分析対象とする胆汁酸の標準物質を溶媒に溶解させる場合も同様である。そのような溶媒組成は、分析対象とする胆汁酸の種類等の諸条件に応じて適宜選択できるが、例えば、水と蟻酸を適宜混合した液を希釈液として使用することができる。溶媒中の酸の濃度は、例えば、０．１％〜５％であってよく、例えば、生体試料由来の胆汁酸を分析対象とする場合、溶媒として０．１％蟻酸を使用することができる。 The sample obtained by the pretreatment step can be used by appropriately dissolving in a solvent suitable for LC-MS. When the biological sample is dissolved in the solvent, it is preferable to use a solvent having a composition that can prevent the bile acid to be analyzed contained in the biological sample from adsorbing to polypropylene or the like. The same applies when the bile acid standard substance to be analyzed is dissolved in a solvent. Such a solvent composition can be appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed. For example, a liquid in which water and formic acid are appropriately mixed can be used as a diluent. The concentration of the acid in the solvent may be, for example, 0.1% to 5%. For example, when bile acid derived from a biological sample is an analysis target, 0.1% formic acid can be used as the solvent. .
前記前処理を施された胆汁酸を含む試料の分析は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）装置と
質量分析計（ＭＳ）を利用して実施することができる。液体クロマトグラフ装置と質量分析計は、互いに直列に接続されていてもよいし、それぞれ独立した装置であってもよい。本発明の方法に用いられる装置としては、例えば、液体クロマトグラフ装置と質量分析計を直列につないで構成された、ＬＣ−ＭＳシステムを用いることができる。ＬＣ−ＭＳシステムを用いることにより、液体クロマトグラフィーにより分離された成分を、続けて質量分析することができる。また、液体クロマトグラフィーに質量分析装置を接続したＬＣ−ＭＳ以外にも、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳなどを使用することができる。
The analysis of the sample containing the pretreated bile acid can be performed using a liquid chromatograph (LC) apparatus and a mass spectrometer (MS). The liquid chromatograph device and the mass spectrometer may be connected in series with each other, or may be independent devices. As an apparatus used in the method of the present invention, for example, an LC-MS system configured by connecting a liquid chromatograph apparatus and a mass spectrometer in series can be used. By using the LC-MS system, components separated by liquid chromatography can be subsequently subjected to mass spectrometry. Moreover, LC-MS / MS, LC-MS / MS / MS, etc. can be used besides LC-MS which connected the mass spectrometer to the liquid chromatography.
液体クロマトグラフ装置としては、より迅速に高感度で分離分析が可能なＵＰＬＣ装置を用いる。ＵＰＬＣ、すなわち、超高速液体クロマトグラフィーは１００ＭＰａ程度での高圧送液が可能な液体クロマトグラフィーのことを意味し、超高速液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＵＨＰＬＣ）とも呼ばれ、より高速・高分離能での分析が可能な装置をさす。本発明においては、ＵＰＬＣの他、ＵＨＰＬＣ等と称されるものもＵＰＬＣ装置に含まれる。
ＵＰＬＣ装置は、分離カラム、および分離溶液を分離カラムに送り込むポンプを備える点においてＨＰＬＣ装置と共通し、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器等、を備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や示差屈折率計が挙げられる。
As the liquid chromatograph apparatus, an UPLC apparatus capable of separating and analyzing with higher sensitivity and higher speed is used. UPLC, that is, ultra high performance liquid chromatography means liquid chromatography capable of high pressure liquid transfer at about 100 MPa, and is also called ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). An instrument that can perform analysis with high resolution. In the present invention, in addition to UPLC, what is called UHPLC or the like is also included in the UPLC apparatus.
The UPLC apparatus is common to the HPLC apparatus in that it includes a separation column and a pump for feeding the separation solution to the separation column, and other elements such as an autosampler, a heater, a detector for detecting separated components, etc. You may have. Examples of the detector include a UV detector and a differential refractometer.
ＵＰＬＣは、高圧に耐え得る粒子を充填したカラムを使用しており、ＨＰＬＣ装置に比べてより迅速に高感度で分離分析が可能な点で好ましい。 UPLC uses a column packed with particles capable of withstanding high pressure, and is preferable in that separation analysis can be performed more rapidly and with higher sensitivity than an HPLC apparatus.
ＵＰＬＣによる分離条件はＨＰＬＣの条件設定を行う場合の検討と同様に行うことができ、当業者であれば適宜条件を設定できる。また、既知のＨＰＬＣ分析法の条件をＵＰＬＣに適用する場合には、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎｓ Ｃａｌｃｕｌａｔ
ｏｒなどのソフトウェアを使用して条件検討を行うこともできる。
The separation conditions by UPLC can be carried out in the same manner as in the case of setting the HPLC conditions, and those skilled in the art can appropriately set the conditions. In addition, when applying known HPLC analysis conditions to UPLC, ACQUITY UPLC Columns Calculat
The condition can be examined using software such as “or”.
液体クロマトグラフィーに用いられる分離溶液（移動相）は、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、などが挙げられる。特に本発明においては蟻酸とアセトニトリルを使用して分析を行うことが好ましい。蟻酸およびアセトニトリルを含有する溶液、例えば水溶液、である。蟻酸を利用することにより、適度に、液体クロマトグラフィーによる分離を向上させつつ、質量分析の際の胆汁酸のイオン化を促進できる。また、アセトニトリルを利用することにより、液体クロマトグラフィーにおける溶出時間を調節でき、且つ、質量分析による胆汁酸の検出感度を向上できる。分離溶液は、分析対象の胆汁酸を分析できる限り、他の成分を含有していてもよい。 Examples of the separation solution (mobile phase) used for liquid chromatography include water, acetonitrile, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, and the like. In the present invention, it is particularly preferable to perform analysis using formic acid and acetonitrile. A solution containing formic acid and acetonitrile, for example, an aqueous solution. By using formic acid, ionization of bile acids during mass spectrometry can be promoted while appropriately improving separation by liquid chromatography. Further, by using acetonitrile, the elution time in liquid chromatography can be adjusted, and the detection sensitivity of bile acids by mass spectrometry can be improved. The separation solution may contain other components as long as the bile acid to be analyzed can be analyzed.
更に、上記溶媒に加えて、分離溶液として蟻酸とアセトニトリルを使用する場合には添加剤は使用せずに実施することが可能であるが、分離溶液のｐＨを安定させる目的で、添加剤を加えて使用することもできる。使用可能な添加剤としては、酢酸、水酸化アンモニウム、蟻酸アンモニウム（塩濃度＝１０ｍＭ以下）、酢酸アンモニウム（塩濃度＝１０ｍＭ以下）、不揮発性塩（リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩等）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などが挙げられる。本発明の分析法では、必要に応じて適宜添加剤を使用することができる。 Furthermore, in addition to the above solvent, when formic acid and acetonitrile are used as the separation solution, it is possible to carry out without using additives, but for the purpose of stabilizing the pH of the separation solution, additives are added. Can also be used. Usable additives include acetic acid, ammonium hydroxide, ammonium formate (salt concentration = 10 mM or less), ammonium acetate (salt concentration = 10 mM or less), non-volatile salts (phosphate, borate, citrate, etc.) ), Trifluoroacetic acid (TFA), triethylamine (TEA), tetrahydrofuran (THF) and the like. In the analysis method of the present invention, additives can be appropriately used as necessary.
ＵＰＬＣによる分離工程においては、生体試料中に含有される分析対象の胆汁酸が他の成分と分離され、且つ、分析対象の複数種類の胆汁酸どうしが全て分離されカラムから溶出されるように、分離溶液の組成を適宜変化させることができる。すなわち、分離工程に
おいては、分離溶液中の蟻酸および／またはアセトニトリルなどの分離溶液の濃度を変化させることができる。蟻酸およびアセトニトリルは、分離工程の全期間において分離溶液に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。変化は、連続的な変化（グラジエント）であってもよく、断続的な変化（ステップワイズ）であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。グラジエントやステップワイズの条件は、分析対象の胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。具体的なグラジエントの条件としては、例えば、後述する実施例に記載の条件が挙げられる。同条件は、特に、生体試料中に含まれる胆汁酸を同時分析する際に好適に用いることができる。なお、以下のグラジエントに関する説明は、ステップワイズにも準用できる。
In the separation step by UPLC, the bile acid to be analyzed contained in the biological sample is separated from other components, and the plurality of types of bile acids to be analyzed are all separated and eluted from the column. The composition of the separation solution can be appropriately changed. That is, in the separation step, the concentration of the separation solution such as formic acid and / or acetonitrile in the separation solution can be changed. Formic acid and acetonitrile may or may not be contained in the separation solution during the entire separation step. The change may be a continuous change (gradient), an intermittent change (stepwise), or a combination thereof. Gradient and stepwise conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of impurities. Specific gradient conditions include, for example, conditions described in Examples described later. The same conditions can be suitably used particularly when simultaneously analyzing bile acids contained in a biological sample. Note that the following description regarding the gradient can be applied to stepwise.
具体的には、分離工程は、分離溶液中のアセトニトリル濃度を増大させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、分離溶液中のアセトニトリル濃度（ｖ／ｖ）が第１の濃度（Ｍ１）から第２の濃度（Ｍ２）まで徐々に増大するよう、アセトニトリル濃度にグラジエントをかけることができる。Ｍ１およびＭ２は、分析対象とする胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ｍ１は、例えば、０％以上、１０％以上、または２０％以上であってよい。Ｍ２は、例えば、２０％以上または３０％以上であってよく、７０％以下であってよい。具体的には、例えば、分離溶液中のアセトニトリル濃度（ｖ／ｖ）が２０％から７０％まで徐々に上昇するよう、アセトニトリル濃度にグラジエントをかけてよい。アセトニトリル濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。アセトニトリル濃度は、Ｍ１からＭ２に変化するまでに、増減を繰り返してもよい。アセトニトリル濃度は、Ｍ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、アセトニトリル濃度は、Ｍ２に到達した後、さらに増大してもよく、減少してもよく、増減を繰り返してもよい。例えば、アセトニトリル濃度は、Ｍ２に到達した後、再度Ｍ１に変化するまでに増減を繰り返してもよい。例えば、Ｍ２に到達した後、２０％まで減少してもよい。 Specifically, the separation step may include a step of increasing the acetonitrile concentration in the separation solution. That is, for example, the acetonitrile concentration can be gradient so that the acetonitrile concentration (v / v) in the separation solution gradually increases from the first concentration (M1) to the second concentration (M2). M1 and M2 can be appropriately set according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of impurities. M1 may be, for example, 0% or more, 10% or more, or 20% or more. M2 may be, for example, 20% or more, 30% or more, and 70% or less. Specifically, for example, a gradient may be applied to the acetonitrile concentration so that the acetonitrile concentration (v / v) in the separation solution gradually increases from 20% to 70%. The rate of change of acetonitrile concentration may or may not be constant. The acetonitrile concentration may be repeatedly increased or decreased before it changes from M1 to M2. The acetonitrile concentration may further change after reaching M2. For example, the acetonitrile concentration may further increase, decrease, or repeatedly increase and decrease after reaching M2. For example, the acetonitrile concentration may be repeatedly increased and decreased after reaching M2 and before changing to M1 again. For example, after reaching M2, it may decrease to 20%.
また、具体的には、分離工程は、分離溶液中の蟻酸濃度を減少させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、分離溶液中の酢酸濃度（ｖ／ｖ）がＡ１からＡ２まで徐々に減少するよう、蟻酸濃度にグラジエントをかけることができる。Ａ１およびＡ２は、分析対象の胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ａ１およびＡ２は、例えば、０．０８％〜０．０３％の範囲内で設定することができる。具体的には、例えば、分離溶液中の蟻酸濃度（ｖ／ｖ）が０．０８％から０．０３％まで徐々に減少するよう、蟻酸濃度にグラジエントをかけてよい。蟻酸濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。蟻酸濃度は、増減を繰り返してもよい。蟻酸濃度は、Ａ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、蟻酸濃度は、Ａ２に到達した後、さらに減少してもよく、増大してもよく、増減を繰り返してもよい。例えば、蟻酸濃度は、Ｍ２に到達した後、０．０８％まで増大してもよい。 Specifically, the separation step may include a step of reducing the formic acid concentration in the separation solution. That is, for example, the formic acid concentration can be gradient so that the acetic acid concentration (v / v) in the separation solution gradually decreases from A1 to A2. A1 and A2 can be appropriately set according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of impurities. A1 and A2 can be set within a range of 0.08% to 0.03%, for example. Specifically, for example, the formic acid concentration may be gradient so that the formic acid concentration (v / v) in the separation solution gradually decreases from 0.08% to 0.03%. The rate of change of the formic acid concentration may or may not be constant. The formic acid concentration may be repeatedly increased and decreased. The formic acid concentration may further change after reaching A2. For example, the formic acid concentration may further decrease, increase, or repeatedly increase and decrease after reaching A2. For example, the formic acid concentration may increase to 0.08% after reaching M2.
濃度のグラジエントは、組成の異なる２種またはそれ以上の溶液を、混合比率を変化させながら混合することで、形成することができる。溶液の組み合わせは、所望のグラジエントが形成されるよう、適宜選択することができる。 The concentration gradient can be formed by mixing two or more solutions having different compositions while changing the mixing ratio. The combination of the solutions can be appropriately selected so that a desired gradient is formed.
グラジエントは、蟻酸およびアセトニトリルの濃度にまとめてかけてよい。例えば、蟻酸を含有しアセトニトリルを含有しない第１の溶液と、アセトニトリルを含有し蟻酸を含有しない第２の溶液とを、混合比率を変化させながら混合することで、蟻酸およびアセトニトリルの両濃度にグラジエントをかけることができる。第１の溶液としては、例えば、蟻酸そのものや蟻酸含有水溶液が挙げられる。第２の溶液としては、アセトニトリルそのものやアセトニトリル含有水溶液が挙げられる。 The gradient may be summed to a concentration of formic acid and acetonitrile. For example, by mixing the first solution containing formic acid and not containing acetonitrile with the second solution containing acetonitrile and not containing formic acid while changing the mixing ratio, the concentration of both the formic acid and acetonitrile is increased. Can be applied. Examples of the first solution include formic acid itself and a formic acid-containing aqueous solution. Examples of the second solution include acetonitrile itself and an acetonitrile-containing aqueous solution.
２種またはそれ以上の溶液を混合して分離溶液を調製する場合、当該２種またはそれ以
上の溶液中の蟻酸およびアセトニトリルの濃度は、混合後の分離溶液中の蟻酸およびアセトニトリルの濃度が上記例示した分離溶液中の蟻酸およびアセトニトリルの濃度となるよう、混合比率に応じて適宜設定することができる。例えば、蟻酸含有水溶液とアセトニトリルとを混合して分離溶液として用いる場合、蟻酸含有水溶液中の蟻酸濃度（ｖ／ｖ）は、０．０５％以上または０．１％以上であってよく、０．４％以下または０．２％以下であってよい。同場合の蟻酸含有水溶液中の蟻酸濃度（ｖ／ｖ）は、具体的には、例えば、０．１％〜０．２％であってよい。
When preparing a separation solution by mixing two or more solutions, the concentration of formic acid and acetonitrile in the separation solution after mixing is exemplified in the above examples. The concentration can be appropriately set according to the mixing ratio so as to obtain the concentration of formic acid and acetonitrile in the separated solution. For example, when a formic acid-containing aqueous solution and acetonitrile are mixed and used as a separation solution, the formic acid concentration (v / v) in the formic acid-containing aqueous solution may be 0.05% or more or 0.1% or more. It may be 4% or less or 0.2% or less. Specifically, the formic acid concentration (v / v) in the formic acid-containing aqueous solution in this case may be, for example, 0.1% to 0.2%.
分離溶液のｐＨは、分析対象とする胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。 The pH of the separation solution can be appropriately set according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of impurities.
分離溶液の組成及びｐＨの好ましい範囲は、液体クロマトグラフィーに続いて実施される質量分析において分析対象とする胆汁酸のイオン化効率が高くなるように設定することができる。すなわち、具体的には、分析対象とする胆汁酸がカラムから溶出される時点の分離溶液の組成及びｐＨが、質量分析において分析対象とする胆汁酸のイオン化効率が高くなるように設定されるのが好ましく、例えば、イオン化された割合を示すイオンカウントを使用して分離溶液の組成及びｐＨを設定することもできる。 The preferable range of the composition and pH of the separation solution can be set so that the ionization efficiency of the bile acid to be analyzed becomes high in mass spectrometry performed following liquid chromatography. Specifically, the composition and pH of the separation solution at the time when the bile acid to be analyzed is eluted from the column are set so that the ionization efficiency of the bile acid to be analyzed in mass spectrometry is increased. For example, it is possible to set the composition and pH of the separation solution using an ion count indicating the ratio of ionization.
液体クロマトグラフィーにおける分離溶液の流速は、分離カラムの内径等の諸条件に応じて適宜選択できる。分離溶液の流速は、分離工程を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。分離溶液の流速は、例えば、０．２〜１．０ｍＬ／ｍｉｎであってよく、０．８ｍＬ／ｍｉｎが好ましい。また、液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、分析対象の胆汁酸の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。カラム温度は、例えば、４０〜７０℃であってよく、具体的には５０℃であってよい。 The flow rate of the separation solution in liquid chromatography can be appropriately selected according to various conditions such as the inner diameter of the separation column. The flow rate of the separation solution may or may not be constant throughout the separation process. The flow rate of the separation solution may be, for example, 0.2 to 1.0 mL / min, and preferably 0.8 mL / min. The column temperature in liquid chromatography can be appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed. The column temperature may be, for example, 40 to 70 ° C., specifically 50 ° C.
液体クロマトグラフィーに用いられる分離カラムは、特に制限されず、分析対象の胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。分離カラムとしては、逆相カラムを用いることができる。逆相カラムとしては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ＯＤＳカラム）、Ｃ８カラム、Ｃ２カラム、これらにイオン交換樹脂を配合したカラムが挙げられる。特に、ＵＰＬＣによる分析を行う場合には、粒径が２．０μｍ以下のオクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ＯＤＳカラム）を使用することが好ましく、更に好ましくは粒径が１．７μｍ以下のＯＤＳカラムが好ましい。 The separation column used in the liquid chromatography is not particularly limited, and can be appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of impurities. As the separation column, a reverse phase column can be used. Examples of the reverse phase column include a column (ODS column) packed with an octadecyl silylated silica gel filler, a C8 column, a C2 column, and a column in which an ion exchange resin is blended. In particular, when analyzing by UPLC, it is preferable to use a column (ODS column) filled with an octadecylsilylated silica gel filler having a particle size of 2.0 μm or less, more preferably 1.7 μm or less. ODS columns are preferred.
質量分析計は、公知の質量分析計が使用できるが、特にＬＣ装置に直列に接続することが可能なものは簡便に使用できるので好ましい。用いられる質量分析計は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析計は、直列に接続して用いることができる。すなわち、ＬＣ−ＭＳシステムは、例えば、直列に接続された２つまたはそれ以上の質量分析計を備える、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳであってよい。具体的には、例えば、Ｘｅｖｏ ＴＱ ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）が挙げられる。 As the mass spectrometer, a known mass spectrometer can be used, but a mass spectrometer that can be connected in series to the LC apparatus is particularly preferable because it can be used easily. One mass spectrometer may be used, or two or more mass spectrometers may be used. Two or more mass spectrometers can be used connected in series. That is, the LC-MS system may be, for example, an LC-MS / MS or an LC-MS / MS / MS that includes two or more mass spectrometers connected in series. Specifically, Xevo TQ MS (made by Waters) is mentioned, for example.
質量分析計における検出方式としては、例えば、イオントラップ型、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、セクター型、飛行時間型、および四重極飛行時間ハイブリッド型が挙げられる。質量分析計におけるイオン化法としては、エレクトロスプレー法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、光イオン化法（ＡＰＰＩ）、および音速イオン化法（ＳＳＩ）が挙げられる。検出方式やイオン化法は、分析対象とする胆汁酸の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。 Examples of detection methods in the mass spectrometer include ion trap type, quadrupole type, quadrupole tandem type, ion trap quadrupole hybrid type, sector type, time of flight type, and quadrupole time of flight hybrid type. Can be mentioned. Examples of ionization methods in the mass spectrometer include electrospray method (ESI), atmospheric pressure chemical ionization method (APCI), fast atom bombardment method (FAB), photoionization method (APPI), and sonic ionization method (SSI). . The detection method and ionization method can be appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed.
質量分析により得られるイオンの検出比率（イオン比）は物質固有の値であるため、標準品の分析により得られたイオン比と生体試料の分析により得られたイオン比を比較して、生体試料に含まれる胆汁酸を同定することができる。具体的には、分析対象とする胆汁酸について精製された或いは合成された胆汁酸を標準品として使用し、標準品を分析して得られるクロマトグラムと分析対象とする試料から得られたクロマトグラムとを比較して、試料中に含まれる胆汁酸を同定することができる。 Since the detection ratio (ion ratio) of ions obtained by mass spectrometry is a substance-specific value, the ion ratio obtained by analyzing the standard product and the ion ratio obtained by analyzing the biological sample are compared, and the biological sample Can be identified. Specifically, a chromatogram obtained by analyzing a standard product using a purified or synthesized bile acid as a standard product and a chromatogram obtained from the sample to be analyzed. And bile acids contained in the sample can be identified.
また、標準品が存在しない胆汁酸については、それが未知の胆汁酸である場合には、ＵＰＬＣによって分離された物質が胆汁酸であることを構造推定などによって確認した上で、本発明の同時分析の対象に加えることができる。未知の胆汁酸を確認する方法は当業者であれば適宜選択して実施することが可能であり、例えば、単離精製などをして胆汁酸であることを確認することができる。 For bile acids for which there is no standard product, if it is an unknown bile acid, the substance separated by UPLC is confirmed to be bile acid by structure estimation, etc. It can be added to the subject of analysis. A method for confirming an unknown bile acid can be appropriately selected and carried out by those skilled in the art. For example, it can be confirmed that the bile acid is isolated and purified.
質量分析の結果に基づき、分析対象の胆汁酸を定量することができる。胆汁酸の定量は、常法により行うことができる。具体的には、例えば、検出された分析対象の胆汁酸のピーク面積値を濃度既知の内部標準物質のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、分析対象の胆汁酸を定量することができる。 Based on the result of mass spectrometry, the bile acid to be analyzed can be quantified. The bile acid can be quantified by a conventional method. Specifically, for example, based on a peak area ratio obtained by dividing the detected peak area value of the bile acid to be analyzed by the peak area value of the internal standard substance having a known concentration, the bile acid to be analyzed can be quantified. it can.
ＵＰＬＣ装置、質量分析計、それらに備わる各種要素は、上記例示した分析条件を参照して、分析対象の胆汁酸の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。 The UPLC device, the mass spectrometer, and various elements included in them can be appropriately selected according to various conditions such as the type of bile acid to be analyzed and the type of impurities with reference to the analysis conditions exemplified above.
ヒトを対象に分析を行う場合、疾患が疑われる患者、例えば糖尿病患者を分析対象として試料中の胆汁酸を同時分析により同定、定量してそのプロファイルを健常人と比較することで疾患特有のマーカー探索や治療により変化するマーカー探索などに使用することができる。
また、疾患様の症状を呈するモデル動物を対象に分析を行い、特定の疾患マーカーの探索や、薬剤のスクリーニング等に使用することもできる。
例えば、病態モデル動物としては、糖尿病のモデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）、モデルラット（ＺＤＦ及びＺＤＬ）を使用することができる。正常ラットと糖尿病モデルラット、又は、正常マウスと糖尿病モデルマウスを比較した場合において、特徴的な変化を示す胆汁酸成分、或いは病態のステージ等と関連付けた場合の胆汁酸全体のプロファイル等から、上記マーカー探索や薬剤スクリーニング等を実施することもできる。
糖尿病モデルラットにおいては、正常ラットと比較して、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、α−ムリコール酸（αＭＣＡ）、β−ムリコール酸（βＭＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）及びタウロコール酸（ＴＣＡ）の濃度が著しく変化しており、当該胆汁酸成分を指標としてマーカーとしたり、薬剤スクリーニング等をすることができる。
糖尿病モデルマウスにおいては、正常マウスと比較して、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）及びタウロコール酸（ＴＣＡ）の濃度が著しく変化しており、当該胆汁酸成分を指標としてマーカーとしたり、薬剤スクリーニング等をすることができる。
また、生体肝臓を模倣した肝細胞培養系において、様々な薬物処理条件下や遺伝子型における胆汁酸組成の分析を行うことで、ヒト肝細胞から排泄される代謝物の推定やヒト肝細胞を用いた薬物胆汁うっ滞の評価に使用することができる。
When analyzing human subjects, a disease-specific marker is obtained by identifying and quantifying bile acids in a sample by analyzing the suspected disease, for example, a diabetic patient, by simultaneous analysis. It can be used for marker search that changes with search and treatment.
In addition, it is possible to analyze a model animal exhibiting a disease-like symptom and use it for searching for a specific disease marker, drug screening, or the like.
For example, diabetic model mice (db / db) and model rats (ZDF and ZDL) can be used as pathological model animals. When comparing normal rats and diabetic model rats, or normal mice and diabetic model mice, the bile acid component showing characteristic changes, or the bile acid profile when associated with the stage of the disease state, etc. Marker search, drug screening, and the like can also be performed.
In diabetic model rats, compared with normal rats, hyodeoxycholic acid (HDCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), α-mulicholic acid (αMCA), β-mulicholic acid (βMCA), The concentrations of cholic acid (CA), glycocholic acid (GCA) and taurocholic acid (TCA) are remarkably changed, and the bile acid component can be used as a marker as a marker, drug screening and the like can be performed.
In diabetic model mice, compared with normal mice, ursodeoxycholic acid (UDCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), cholic acid (CA), glycoursodeoxycholic acid (GUDCA), glyco The concentrations of deoxycholic acid (GDCA), glycocholic acid (GCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), tauro-β-muricholic acid (TβMCA) and taurocholic acid (TCA) are significantly changed, and the bile acid component is A marker can be used as an index, and drug screening can be performed.
In addition, by analyzing the bile acid composition under various drug treatment conditions and genotypes in a hepatocyte culture system that mimics the living liver, it is possible to estimate metabolites excreted from human hepatocytes and to use human hepatocytes. It could be used to evaluate drug cholestasis.
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、下記実施例は本発明について
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。
EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the following examples are given only as an aid for obtaining specific recognition about the present invention, and this limits the scope of the present invention. It is not something.
実施例１；試薬の調製
本発明に使用する標準物質として、本発明の検討においては表１に示した胆汁酸をそれぞれ購入して使用したが、これらに限定されることなく、一般に購入可能な胆汁酸の中から適宜選択して使用することができる。
内部標準物質（ＩＳ）には、ナプラタム（和光純薬工業社製）を用いた。また、標準溶液及び内標準溶液は，エタノール（純正化学社製）で調製した。
水は純粋製造装置（メルク社製）で精製したものを用いた。前処理における除蛋白液として、エタノール（純正化学社製）を用いた。希釈液には水とギ酸（和光純薬工業社製）を１０００：１（ｖ／ｖ）の割合で混合したものを使用した。ＵＰＬＣの移動相Ａには、水とギ酸を１０００：１、ｖ／ｖの割合で混合したもの、移動相Bにはアセトニトリル（
純正化学社製）を用いた。ニードル洗浄液にはメタノール（純正化学社製）を用いた。
また、ブランク血漿として、ヒトブランク血漿を「コージンバイオ社」から購入し，使用した。
Example 1; Preparation of Reagents As a standard substance used in the present invention, the bile acids shown in Table 1 were purchased and used in the study of the present invention, but the present invention is not limited to these and can be generally purchased. It can be appropriately selected from bile acids.
Naplatam (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the internal standard substance (IS). The standard solution and the internal standard solution were prepared with ethanol (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.).
Water purified by a pure production apparatus (Merck) was used. Ethanol (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.) was used as a protein removal solution in the pretreatment. As the diluent, a mixture of water and formic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a ratio of 1000: 1 (v / v) was used. The mobile phase A of UPLC is a mixture of water and formic acid in a ratio of 1000: 1, v / v, and the mobile phase B is acetonitrile (
Pure Chemical Co., Ltd.) was used. Methanol (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.) was used as the needle cleaning liquid.
As blank plasma, human blank plasma was purchased from “Kojin Bio Inc.” and used.
実施例２；試料の前処理
ポリプロピレン製マイクロチューブに血漿試料（検量線の場合は水）２０μLを採取し
た。エタノール（検量線試料の場合は混合標準溶液）８０μＬ及び内部標準溶液（ＩＳ）を２０μＬ添加後撹拌し、４°Cで１５，０００回転、３分間遠心分離を行った。得られ
た上清８０μＬを採取し、希釈液を８０μＬ添加後攪拌したものを、分析試料とした。
Example 2 Sample Pretreatment 20 μL of a plasma sample (water in the case of a calibration curve) was collected in a polypropylene microtube. 80 μL of ethanol (mixed standard solution in the case of a calibration curve sample) and 20 μL of internal standard solution (IS) were added and stirred, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C. 80 μL of the obtained supernatant was collected, and 80 μL of the diluted solution was added and stirred to prepare an analysis sample.
実施例３；胆汁酸の分析
実施例１において調製した胆汁酸溶液を用いて、表３に示すＵＰＬＣによる分離条件及び表３に示すＭＳによる胆汁酸の同定、定量条件によって、胆汁酸の同時分析を試みた。分析装置としては、ＵＰＬＣ装置（ＡＣＱＵＩＴＹ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ、Ｗａｔｅｒｓ社製）、質量分析装置（Ｘｅｖｏ ＴＱ ＭＳ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。
その結果、図１のようなクロマトグラムが得られ、胆汁酸２４成分が全て分離され、一度に同定、定量を行うことが可能であった。
Example 3; Analysis of bile acids Simultaneous analysis of bile acids using the bile acid solution prepared in Example 1 according to the separation conditions by UPLC shown in Table 3 and the identification and quantification conditions of bile acids by MS shown in Table 3. Tried. As the analysis apparatus, a UPLC apparatus (ACQUITY Ultra Performance LC, manufactured by Waters) and a mass spectrometer (Xevo TQ MS, manufactured by Waters) were used.
As a result, a chromatogram as shown in FIG. 1 was obtained, and all 24 bile acid components were separated, and identification and quantification could be performed at a time.
実施例４；マウス、ヒト、ラットの結果
ラット、マウスの血漿を用いて血漿中の胆汁酸同時分析を試みた。前処理方法及び分析方法は実施例２及び３に記載の方法と同様の方法で行った。
その結果、ヒト以外のマウス及びラットを使用した場合においても血漿中の胆汁酸を同時分析し同定、定量することが可能であった。ヒト、マウス、ラットの結果を比較した結果を表４に示す。
Example 4: Results of mouse, human and rat Simultaneous analysis of bile acids in plasma was attempted using rat and mouse plasma. The pretreatment method and analysis method were the same as those described in Examples 2 and 3.
As a result, even when non-human mice and rats were used, it was possible to simultaneously analyze, identify and quantify bile acids in plasma. Table 4 shows the result of comparing the results of human, mouse and rat.
比較例１；生化学的手法を用いた総胆汁酸濃度の分析
血漿中の総胆汁酸濃度を、生化学的試薬を使用して分析し、本発明の方法との比較を行った。分析試薬としては酵素サイクリング法（３α−ＨＳＤ）法による総胆汁酸測定用試薬（アクアオート カイノス ＴＢＡ試薬、カイノス社製）を、分析装置には自動生化学分析装置（ＴＢＡ−２００ＦＲ、東芝製）を使用し、分析方法は分析試薬の能書に記載の方法に従って実施した。
Comparative Example 1: Analysis of total bile acid concentration using biochemical technique Total bile acid concentration in plasma was analyzed using a biochemical reagent and compared with the method of the present invention. As an analytical reagent, a reagent for measuring total bile acids by the enzyme cycling method (3α-HSD) (Aqua Auto Kainos TBA Reagent, manufactured by Kainos Co., Ltd.) is used. The analytical method was carried out according to the method described in the analytical reagent specifications.
生化学的試薬によって分析された総胆汁酸濃度と、本発明により定量された各胆汁酸成分分析値の合計を比較したところ、ほぼ一致する結果となり、本発明の分析方法が血漿中の胆汁酸分析に有用であることが確認された（表５）。マウスの総胆汁酸濃度については、検出下限未満となり、濃度を決定することができなかったが、ヒトだけでなくラットを使用して分析した結果についても同様に血漿中の総胆汁酸濃度とほぼ一致する値となった。 When the total bile acid concentration analyzed by the biochemical reagent and the total analysis value of each bile acid component quantified by the present invention were compared, the results almost coincided with each other, and the analysis method of the present invention performed the bile acid in plasma. It was confirmed to be useful for analysis (Table 5). The total bile acid concentration in mice was below the lower limit of detection, and the concentration could not be determined, but the results of analysis using rats as well as humans were similar to the total bile acid concentration in plasma. Matched values.
実施例５；病態モデル動物を使用した胆汁酸の同時分析
本発明の胆汁酸同時分析法を用いて、疾患特異的なマーカーとして使用可能な胆汁酸が存在するか、その探索を試みた。
Example 5: Simultaneous analysis of bile acids using disease model animals Using the bile acid simultaneous analysis method of the present invention, an attempt was made to search for the presence of bile acids that can be used as disease-specific markers.
糖尿病の病態モデルとされる実験動物を使用して、血漿中の胆汁酸の分析を行った。病態モデル動物として、マウス（db/db）、ラット（ZDF及びZDL）を対象としそれぞれの血
漿中に含まれる胆汁酸の同時分析を、実施例２及び３に記載の方法で行った。
Bile acid in plasma was analyzed using an experimental animal that is considered to be a pathological model of diabetes. As a disease state model animal, mice (db / db) and rats (ZDF and ZDL) were subjected to simultaneous analysis of bile acids contained in each plasma by the methods described in Examples 2 and 3.
分析結果を表６に示す。それぞれの成分について得られた定量値をグラフで示した（図２，３）。
正常ラットと比較して、糖尿病モデルラットにおいては、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、α−ムリコール酸（αＭＣＡ）、β−ムリコール酸（βＭＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、グリココール
酸（ＧＣＡ）及びタウロコール酸（ＴＣＡ）の濃度が著しく変化していることが見出された。
The analysis results are shown in Table 6. The quantitative values obtained for each component are shown in graphs (FIGS. 2 and 3).
In diabetic model rats, compared with normal rats, hyodeoxycholic acid (HDCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), α-mulicholic acid (αMCA), β-mulicholic acid (βMCA), It has been found that the concentrations of cholic acid (CA), glycocholic acid (GCA) and taurocholic acid (TCA) vary significantly.
また、正常マウスと比較して、糖尿病モデルマウスにおいては、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）及びタウロコール酸（ＴＣＡ）の濃度が著しく変化していることが見出された。 In addition, compared with normal mice, ursodeoxycholic acid (UDCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), cholic acid (CA), glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) in diabetic model mice. , Glycodeoxycholic acid (GDCA), glycocholic acid (GCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), tauro-β-muricholic acid (TβMCA) and taurocholic acid (TCA) are found to be significantly changed. It was done.
以上のように、胆汁酸を同時に分析することによって、マウスとラットとでは変化の見られる胆汁酸の種類に違いがあり、そのプロファイルが異なることが見出されたことから、新たなマーカーの探索やモデル動物を使用した薬剤のスクリーニングに有用である可能性が示唆された。 As described above, by analyzing bile acids at the same time, it was found that there are differences in the types of bile acids seen in mice and rats, and their profiles were different. These results suggest that it may be useful for screening drugs using model animals.
本発明によれば、多種類の胆汁酸を同時に分析し同定、定量することが可能である。しかも、少ない検体量で、かつ、従来よりも大幅に短い時間で高感度に分析することが可能である。また、ヒトだけでなく、ラット、マウスに由来する試料を使用して試料中に含まれる胆汁酸を分析することが可能である。ヒトや疾患様の症状を呈するモデル動物を対象にして、疾患特有のマーカー探索薬剤のスクリーニング等に使用することもできる。 According to the present invention, it is possible to simultaneously analyze, identify and quantify many types of bile acids. In addition, it is possible to perform analysis with high sensitivity in a small amount of specimen and in a significantly shorter time than in the past. In addition, it is possible to analyze bile acids contained in samples using samples derived from not only humans but also rats and mice. It can also be used for screening for marker-specific drug searching agents for humans and model animals exhibiting disease-like symptoms.
Claims (8)
（ｉ）超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により試料に含まれる胆汁酸を分離する工程において、ＵＰＬＣの移動相に蟻酸を使用し、移動相中での蟻酸の濃度を減少させることを含む工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で分離された胆汁酸を質量分析計で分析する工程、
を含む方法。 Α-mulicholic acid (αMCA), β-mulicholic acid (βMCA), cholic acid (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), hyocholic acid (HCA), hyodeoxycole contained in the sample Acid (HDCA), 12-ketritocholic acid (KLCA), lithocholic acid (LCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), glyco-α-muricholic acid (GαMCA), glyco-β-mulicholic acid (GβMCA), glycocholic acid (GCA), glycochenodeoxycholic acid (GCDCA), glycodeoxycholic acid (GDCA), glycohyocholic acid (GHCA), glycohyodeoxycholic acid (GHDCA), glycolithocholic acid (GLCA), glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) ), Tauro-α-muricholic acid ( αMCA), tauro-β-muricholic acid (TβMCA), taurocholic acid (TCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurohyocholic acid (THCA), taurohyodeoxycholic acid (THDCA), tauro A method for simultaneously analyzing 20 or more bile acids, which is a combination selected from lithocholic acid (TLCA) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA),
(I) in the step of separating bile acids contained in a sample by ultra high performance liquid chromatography (UPLC) , using formic acid as the mobile phase of UPLC, and reducing the concentration of formic acid in the mobile phase ;
(Ii) a step of analyzing the bile acid separated in the step (i) with a mass spectrometer,
Including methods.
ロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、の中から選ばれた組み合わせである２０種類以上の胆汁酸を同時に分析する方法であって、20 types of combinations selected from Rhodeoxycholic acid (TDCA), Taurohyocholic acid (THCA), Taurohyodeoxycholic acid (THDCA), Taurolithocholic acid (TLCA), Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) A method for simultaneously analyzing the above bile acids,
（ｉ）超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により試料に含まれる胆汁酸を分離する工程において、ＵＰＬＣの移動相に蟻酸とアセトニトリルを使用し、移動相中での蟻酸の濃度を減少させる工程、(I) In the step of separating bile acids contained in a sample by ultra high performance liquid chromatography (UPLC), formic acid and acetonitrile are used as the mobile phase of UPLC, and the concentration of formic acid in the mobile phase is reduced,
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で分離された胆汁酸を質量分析計で分析する工程、(Ii) a step of analyzing the bile acid separated in the step (i) with a mass spectrometer,
を含む方法。Including methods.
（ｉｉ）４℃で１５，０００回転、３分間遠心分離する工程、
（ｉｉｉ）遠心分離後の試料の上清を得る工程、
を含む試料前処理工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 (I) a step of adding ethanol more than double the amount of the sample to the sample;
(Ii) centrifuge at 15,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C.,
(Iii) obtaining a supernatant of the sample after centrifugation;
Including sample pretreatment steps including A method according to any one of claims 1-7.
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