JP6073857B2 - Synthetic antimicrobial effect - Google Patents
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Description
本発明は、生物防除の分野に関し、特に、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株及び/又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株を含有する、抗微生物組成物に関する。更に、本発明は、そのような抗微生物組成物の、そのような抗微生物組成物を含有する食料、飼料及び医薬製品を製造するための使用、そのような食料、飼料及び医薬製品を製造する方法、並びにそのような食料、飼料及び医薬製品の望まれない微生物の含有量を減少させる方法に関する。 The present invention relates to the field of biocontrol, and in particular, to an antimicrobial composition comprising a Lactobacillus rhamnosus strain and / or a Lactobacillus paracasei strain. Furthermore, the present invention uses such antimicrobial compositions to produce foods, feeds and pharmaceutical products containing such antimicrobial compositions, to produce such foods, feeds and pharmaceutical products. Methods and methods for reducing the content of unwanted microorganisms in such food, feed and pharmaceutical products.
生物防御培養株(Bioprotective culture)は、化学的保存料の代替品として、様々な食品用途に使用されている。乳製品において、酵母やカビによるコンタミネーションは、当該乳製品の棚寿命(shelf life)を限定し得る。酵母及びカビのコンタミネーションの顕著な問題を経験する製品分野として、フレッシュチーズが挙げられる。 Bioprotective cultures are used in various food applications as an alternative to chemical preservatives. In dairy products, contamination with yeast and mold can limit the shelf life of the dairy product. A product area that experiences significant problems of yeast and mold contamination includes fresh cheese.
これらの問題を解決するための生物防御溶液は、乳業分野で開発されてきた。市場において最も有名で恐らく最も一般に使用される抗真菌生物防御溶液は、Danisco製のHOLDBAC(商標)YM−b及びHOLDBAC(商標)YM−Cであり、これらのいずれも、プロピオニバクテリア(Propionibacteria)及びラクトバチルス(Lactobacillus)の亜種の組み合わせを含有する。 Bioprotective solutions to solve these problems have been developed in the dairy industry. The most famous and perhaps the most commonly used antifungal bioprotection solutions on the market are HOLDBAC ™ YM-b and HOLDBAC ™ YM-C from Danisco, both of which are Propionibacterium And a combination of Lactobacillus subspecies.
プロピオン酸細菌を乳酸細菌と一緒に微生物の阻害のために使用することは、特許出願US 2005/0095318及びWO 2004/041305に開示されている。 The use of propionic acid bacteria together with lactic acid bacteria for the inhibition of microorganisms is disclosed in patent applications US 2005/0095318 and WO 2004/041305.
プロピオニバクテリア亜種(Propionibacteria ssp.)は、主にプロピオン酸の生産に加えて酢酸及び他の代謝物の生産を通じて、抗真菌活性に寄与すると考えられている。 Propionibacterium subsp. Is believed to contribute to antifungal activity primarily through the production of acetic acid and other metabolites in addition to the production of propionic acid.
しかしながら、これらの種は、産業スケールでの生産にかなりの費用かかり、また、プロピオン酸の生産は、最終的な乳製品に臨まれない変質を生じさせる可能性がある。 However, these species are quite expensive to produce on an industrial scale, and the production of propionic acid can cause alterations that are unacceptable to the final dairy product.
乳製品用の市販の他の抗真菌生物防御溶液として、Sacco製のLyofast LPRA及びBIOPROX製のAroma−Prox(登録商標)RP80が挙げられる。これらの製品のいずれも、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)の組み合わせを含有する。Tharmaraj and Shah (2009)は、チーズベースのディップにおける生物防御乳酸菌の候補のスクリーニングを記載している。単一の株として試験されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及びラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)は、酵母及びカビに対して最大の阻害効果を示した。しかしながら、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及びラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の組み合わせについては、試験されなかった。 Other commercially available antifungal biodefense solutions for dairy products include Lyofast LPRA from Sacco and Aroma-Prox® RP80 from BIOPROX. Both of these products contain a combination of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus. Tharmaraj and Shah (2009) describe the screening of bioprotective lactic acid bacteria candidates in cheese-based dip. Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei tested as single strains showed the greatest inhibitory effect on yeast and mold. However, the combination of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei was not tested.
従って、抗真菌効果を損なわずにプロピオニバクテリア亜種(Propionibacteria ssp.)の使用を控えられる、改善された生物防御溶液を開発することには、産業上の受容が存在する。 Therefore, there is industrial acceptance in developing improved biodefense solutions that can refrain from using Propionibacterium spp. Without compromising antifungal effects.
本発明は乳及び乳製品中のコンタミナントとして知られる細菌及び真菌微生物の増殖の阻害に顕著に効果的な乳酸菌の新規株を同定した。更に、本発明は、特定の乳酸菌が、他種の乳酸菌と組み合わされたとき、顕著な相乗的抗微生物効果を発揮することを見出した。組み合わせられた2種類の細菌の抗微生物効果は、驚くべきことに、当該2種類の細菌を単独で用いた場合の効果の合計を上回る。 The present invention has identified a new strain of lactic acid bacteria that is markedly effective in inhibiting the growth of bacterial and fungal microorganisms known as contaminants in milk and dairy products. Furthermore, the present invention has found that certain lactic acid bacteria exhibit a significant synergistic antimicrobial effect when combined with other types of lactic acid bacteria. The antimicrobial effect of the two types of bacteria combined is surprisingly greater than the combined effect of using the two types of bacteria alone.
従って、本発明の第一の側面は、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株を含有する、抗微生物組成物に関する。好ましい態様において、当該抗微生物組成物は、(a)ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226並びにそれらの突然変異株からなる群から選択される1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株、並びに(b)ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777及びその突然変異株からなる群から選択される1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株を含有する。他の好ましい側面において、本発明は、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777及びそれらの突然変異株から選択される1つ以上の株を含有する抗微生物組成物を提供し、ここで当該突然変異株は、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。 Accordingly, a first aspect of the present invention relates to an antimicrobial composition comprising one or more Lactobacillus rhamnosus strains and one or more Lactobacillus paracasei strains. In a preferred embodiment, the antimicrobial composition comprises one or more selected from the group consisting of (a) Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 and Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 and mutants thereof. One or more Lactobacillus paracasei strains selected from the group consisting of Lactobacillus rhamnosus strains, and (b) Lactobacillus paracasei CHCC12777 and mutants thereof. To do. In another preferred aspect, the present invention relates to a Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, a Lactobacillus paraCC27 mutant strain CC1 An antimicrobial composition containing one or more strains is provided, wherein the mutant strain is obtained using the strain deposited as starting material.
本発明の組成物は、ヒト及び動物用の食料、飼料及び医薬製品等における、真菌、細菌及びそれらの混合物から選択される望まれない微生物の繁殖を阻害出来るという利点を提供する。真菌、例えば酵母及びカビの増殖の予防及び/又は阻害が、特に想定される。従って、好ましい態様において、「抗微生物」という用語は、「抗真菌」として理解されるべきである。従って、本発明の第二の側面は、食料、飼料及び医薬製品の調製における、第一の側面の抗微生物組成物の使用に関する。 The composition of the present invention provides the advantage that it can inhibit the growth of unwanted microorganisms selected from fungi, bacteria and mixtures thereof in human and animal food, feed and pharmaceutical products and the like. The prevention and / or inhibition of the growth of fungi such as yeasts and molds is particularly envisaged. Thus, in a preferred embodiment, the term “antimicrobial” should be understood as “antifungal”. Accordingly, a second aspect of the invention relates to the use of the antimicrobial composition of the first aspect in the preparation of food, feed and pharmaceutical products.
第三の側面は、真菌、細菌及びその混合物からなる群から選択される望まれない微生物の増殖を阻害するための第一の側面の抗微生物組成物の使用に関する。特に、本発明の組成物は、乳業のプロセス、例えば乳の発酵プロセスにおける既知のコンタミナントである真菌及び細菌の増殖を阻害及び/又は予防するのに使用され得る。 The third aspect relates to the use of the antimicrobial composition of the first aspect for inhibiting the growth of unwanted microorganisms selected from the group consisting of fungi, bacteria and mixtures thereof. In particular, the compositions of the present invention can be used to inhibit and / or prevent the growth of fungi and bacteria, which are known contaminants in dairy processes, such as the milk fermentation process.
第四の側面は、医薬製品としての第一の側面の抗微生物組成物の使用に関する。当該医薬製品は、好ましくは、細菌又は真菌、好ましくはカビが感染した患者を治療するのに使用される。 The fourth aspect relates to the use of the antimicrobial composition of the first aspect as a pharmaceutical product. The pharmaceutical product is preferably used to treat patients infected with bacteria or fungi, preferably mold.
第五の側面は、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を含有する食料、飼料又は医薬製品に関する。 The fifth aspect relates to a food, feed or pharmaceutical product containing the antimicrobial composition of the first aspect of the present invention.
本発明の第六の側面は、本発明の第五の側面の食料、飼料又は医薬製品を製造する方法に関し、当該方法は、当該食料、飼料又は医薬製品の製造の過程で、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を添加する工程を含む。ここで、当該方法は、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株とラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株を組み合わせて含有する抗微生物組成物の添加を含み、当該組成物は、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株が、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、それぞれ1x106cfu/g以上、好ましくは5x106cfu/g以上、又はそれぞれ1x106cfu/ml以上、好ましくは5x106cfu/ml以上、あるいは当該食料、飼料又は医薬製品の表面に、1x105cfu/cm2、好ましくは1x107cfu/cm2の濃度となるように添加される。そして、当該製造の過程で、製造パラメーターは、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株の濃度が増大し、又は一定となるように制御される。 A sixth aspect of the present invention relates to a method for producing a food, feed or pharmaceutical product according to the fifth aspect of the present invention, and the method comprises the steps of the present invention in the course of producing the food, feed or pharmaceutical product. Adding an antimicrobial composition of one aspect. Wherein the method comprises the addition of an antimicrobial composition comprising a combination of a Lactobacillus rhamnosus strain and a Lactobacillus paracasei strain, the composition comprising one or more lactobacillus strains. Bacillus rhamnosus (Lactobacillus rhamnosus) strains and one or more Lactobacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) strain, the food for feed or pharmaceutical product, each 1x10 6 cfu / g, preferably at least 5x10 6 cfu / g above, or respectively 1x10 6 cfu / ml or more, preferably to 5x10 6 cfu / ml or more, or the food, feed or pharmaceutical product surface, 1x10 5 fu / cm 2, is preferably added at a concentration of 1x10 7 cfu / cm 2. In the course of the production, the production parameters are such that the concentration of one or more Lactobacillus rhamnosus strains and one or more Lactobacillus paracasei strains increases or becomes constant. To be controlled.
第七の側面において、本発明は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24616で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697、又はその突然変異株に関し、当該突然変異株は、出発材料として供託された当該株を使用して取得される。 In a seventh aspect, the present invention relates to Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, or a mutant thereof, deposited at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under accession number DSM24616. , Obtained using the stock deposited as starting material.
第八の側面において、本発明は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24652で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226、又はその突然変異株に関し、当該突然変異株は、出発材料として供託された当該株を使用して取得される。
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24651で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777;
In an eighth aspect, the present invention relates to Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, or a mutant strain thereof, deposited under the accession number DSM24652 to German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). , Obtained using the stock deposited as starting material.
Lactobacillus paracasei CHCC12777 deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under the accession number DSM24651;
第九の側面において、本発明は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24651で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777、又はその突然変異株に関し、当該突然変異株は、出発材料として供託された当該株を使用して取得される。 In a ninth aspect, the present invention relates to a Lactobacillus paracasei CHCC12777 deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under the accession number DSM24651, or a mutant strain thereof. , Obtained using the stock deposited as starting material.
定義
本明細書中で使用されたとき、「乳酸菌」は、糖の発酵において主に生産される酸として乳酸を含む酸を生産する、グラム陽性微小好気性又は嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種(Lactococcus spp.)、ストレプトコッカス亜種(Streptococcus spp. )、ラクトバチルス亜種(Lactobacillus spp. )、ロイコノストック亜種(Leuconostoc spp. )、シュードロイコノストック亜種(Pseudoleuconostoc spp. )、ペディオコッカス亜種(Pediococcus spp. )、ブレビバクテリウム亜種(Brevibacterium spp. )、エンテロコッカス亜種(Enterococcus spp.)を含む「ラクトバチラレス(Lactobacillales)」目に属する。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、食品用培養株としてしばしば使用される。
Definitions As used herein, “lactic acid bacteria” refers to gram-positive microaerobic or anaerobic bacteria that produce acids containing lactic acid as the primary acid produced in sugar fermentation. The most useful lactic acid bacteria in the industry include Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. “Lactobacilli spp.”, “Lactobacilli spp.”, “Lactobacilli spp.”, “Lactobacilli spp.”, “Lactobacillus sp.” Belongs. These are often used as food cultures alone or in combination with other lactic acid bacteria.
ラクトバチルスsp(Lactobacillus sp.)及びストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)の種の細菌を含む乳酸菌は、通常、乳業において、バルク出発育苗物(bulk starter propagation)のための凍結又は凍結乾燥培養株として、又は、発酵器しくはチーズ等の乳製品の生産のために発酵ベセルやバットに直接播種することを意図したいわゆるDirect Vat Set(DVS)培養株として供給される。そのような乳酸菌培養株は、一般に、「出発培養株(starter culture)」又は「出発株(starter)」と称される。 Lactic acid bacteria, including bacteria of the species Lactobacillus sp. And Streptococcus thermophilus, are commonly used in the dairy industry as frozen or lyophilized cultures for bulk starter seedlings. Alternatively, it is supplied as a so-called Direct Vat Set (DVS) culture intended to be seeded directly on fermenting vessels or bats for the production of fermenters or dairy products such as cheese. Such lactic acid bacteria cultures are commonly referred to as “starter cultures” or “starter strains”.
本明細書中、「中温性(mesophile)」という用語は、中等度の温度(15℃〜40℃)で最も繁殖する微生物を指す。産業上最も有用な中温性細菌は、ラクトコッカス亜種(Lactococcus spp.)及びロイコノストック亜種(Leuconostoc spp.)を含む。本明細書中、「中温発酵」という用語は、約22℃〜約35℃の間の温度での発酵を指す。「中温発酵乳製品」という用語は、中温性出発培養株の中温発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、バターミルク、サワーミルク、カルチャードミルク、スメタナ、サワークリーム及びフレッシュチーズ、例えばクアーク、トバログ及びクリームチーズが挙げられる。 As used herein, the term “mesophile” refers to the most proliferating microorganisms at moderate temperatures (15 ° C. to 40 ° C.). The most useful mesophilic bacteria in the industry include Lactococcus spp. And Leuconostoc spp. As used herein, the term “medium temperature fermentation” refers to fermentation at a temperature between about 22 ° C. and about 35 ° C. The term “mesophilic dairy product” refers to a fermented dairy product prepared by mesophilic fermentation of a mesophilic starting culture, such as buttermilk, sour milk, cultured milk, smetana, sour cream and Fresh cheeses such as Quark, Tobalog and cream cheese can be mentioned.
本明細書中、「好熱性」という用語は、43℃超の温度で最も繁殖する微生物を指す。産業上最も有用な好熱性細菌として、ストレプトコッカス亜種(Streptococcus spp.)及びラクトバチルス亜種(Lactobacillus spp.)が挙げられる。本明細書中、「好熱発酵」という用語は、約35℃を上回る温度、例えば約35℃〜約45℃での発酵を指す。「好熱発酵乳製品」という用語は、好熱性出発培養株の好熱発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、セットヨーグルト、スタードヨーグルト及び飲用ヨーグルトが挙げられる。 As used herein, the term “thermophilic” refers to the most proliferating microorganisms at temperatures above 43 ° C. The most useful thermophilic bacteria in the industry include Streptococcus spp. And Lactobacillus spp. As used herein, the term “thermophilic fermentation” refers to fermentation at temperatures above about 35 ° C., such as at about 35 ° C. to about 45 ° C. The term “thermophilic dairy product” refers to a fermented dairy product prepared by thermophilic fermentation of a thermophilic starting culture, such fermented dairy products include set yogurt, starred yogurt and drinking yogurt.
「乳」という用語は、任意の哺乳類、例えばウシ、羊、ヤギ、バッファロー又はラクダ等を搾乳して得た乳分泌物として理解されるべきである。好ましい態様において、乳は、牛乳である。また、乳は、植物材料から生産したタンパク質/脂肪溶液、例えば投入をも含む。 The term “milk” should be understood as a milk secretion obtained by milking any mammal, such as cows, sheep, goats, buffalo or camels. In a preferred embodiment, the milk is milk. Milk also includes protein / fat solutions produced from plant material, such as inputs.
「乳基質」という用語は、本発明の方法に係る発酵に供され得る任意の生乳/調製乳材料を指す。従って、有用な乳基質は、限定されないが、タンパク質を含有する任意の乳又は乳様製品の溶液/懸濁物、例えば全乳又は低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、再構築乳粉、練乳、乾燥乳、ホエイ、ホエイ透過物、ラクトース、ラクトースの結晶化からの母液、ホエイタンパク質濃縮物、又はクリームを含む。明らかに、乳基質は任意の哺乳類由来であってもよく、例えば実質的に純粋な哺乳類の乳、又は再構築乳粉である。発酵の前に、当該技術分野で公知の方法に従い乳基質は均質化又は殺菌されてもよい。 The term “dairy substrate” refers to any raw / dairy material that can be subjected to fermentation according to the method of the present invention. Thus, useful dairy substrates include, but are not limited to, any milk or milk-like product solution / suspension including protein, such as whole or low fat milk, skim milk, butter milk, reconstituted milk powder, condensed milk, Contains dry milk, whey, whey permeate, lactose, mother liquor from lactose crystallization, whey protein concentrate, or cream. Obviously, the dairy substrate may be from any mammal, such as substantially pure mammalian milk, or reconstituted milk powder. Prior to fermentation, the dairy substrate may be homogenized or sterilized according to methods known in the art.
本明細書中、「均質化」という用語は、可溶性懸濁物又は乳液を取得するための激しい混合を意味する。均質化が発酵の前に実施される場合、それは、乳脂肪が乳から分離しない程度に小さなサイズに分散するように実施されるべきである。これは、乳を小さなオリフィスで高圧をかけることにより達成され得る。 As used herein, the term “homogenization” means vigorous mixing to obtain a soluble suspension or emulsion. If homogenization is performed prior to fermentation, it should be performed so that the milk fat is dispersed to such a small size that it does not separate from the milk. This can be accomplished by applying high pressure to the milk with a small orifice.
本明細書中、「殺菌」とは、生きた生物、例えば微生物を減少又は死滅させるために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、殺菌は、一定時間特定の温度で乳基質を維持することにより達成される。当該特定の温度は、通常加熱により達成される。殺菌温度及び時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅又は不活性化するように選択され得る。急速冷却工程が続いてもよい。 As used herein, “sterilizing” means treating a dairy substrate to reduce or kill live organisms, such as microorganisms. Preferably, sterilization is achieved by maintaining the milk substrate at a specific temperature for a period of time. The specific temperature is usually achieved by heating. The sterilization temperature and time can be selected to kill or inactivate specific bacteria, such as harmful bacteria. A rapid cooling process may follow.
本発明における「発酵」は、微生物の作用により炭水化物がアルコール又は酸に変換されることを意味する。好ましくは、本発明の方法は、ラクトースを乳酸に変換することを含む。 “Fermentation” in the present invention means that carbohydrates are converted into alcohols or acids by the action of microorganisms. Preferably, the method of the present invention comprises converting lactose to lactic acid.
乳製品の生産に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素量、微生物の量及び特性、並びに処理時間等の適切な処理条件をどのように選択するかを心得ている。自明であるが、発酵条件は、本発明の達成を支持するように、即ち固体(チーズ等)又は液状(例えば発酵乳製品)の乳製品を取得するように選択される。 Fermentation processes used to produce dairy products are well known and the skilled person knows how to select appropriate processing conditions such as temperature, oxygen content, microbial content and characteristics, and processing time. . Obviously, the fermentation conditions are selected to support the achievement of the present invention, ie to obtain a dairy product that is solid (such as cheese) or liquid (such as a fermented dairy product).
本明細書中、「望まれない微生物」は、病原性の、及び/又は食料、飼料若しくは医薬製品を劣化させる、細菌及び真菌、例えば酵母等の微生物を意味する。 As used herein, “unwanted microorganism” refers to microorganisms such as bacteria and fungi, such as yeast, that are pathogenic and / or degrade food, feed or pharmaceutical products.
望まれない微生物に関して「阻害する」及び「阻害すべき」という用語は、例えば、抗微生物組成物を添加した、食料製品中、及び/又は食料製品表面上の望まれない微生物の数又は密度又は増殖率が、そのような抗微生物組成物を添加していない食料製品中、及び/又は食料製品表面上よりも少ないことを意味する。 The terms “inhibit” and “to inhibit” with respect to unwanted microorganisms refer to, for example, the number or density of unwanted microorganisms in a food product and / or on the surface of a food product, or with the addition of an antimicrobial composition. It means that the growth rate is less in the food product without such antimicrobial composition and / or on the food product surface.
本明細書において、「突然変異」という用語は、遺伝子操作、放射線照射及び/又は化学処理等の手段により作製された、本発明の株に由来する株として理解されるべきである。突然変異は、機能的に同等の突然変異、例えば親株と比較して実質的に同一、又は改善された特徴を有する(例えばジアセチル生産、粘性、ゲル強度、口腔被膜(mouth coating)、風味、ポスト酸性化(post acidification)、酸性化速度及び/又はファージロバスト性(phage robustness))突然変異である。そのような突然変異は、本発明の一部である。特に、「突然変異」という用語は、エタンメタンスルホン酸(EMS)又はN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトログアニジン(NTG)等の化学変異原やUV光等による処理を含む通常使用される任意の突然変異形成処理に本発明の株を供することにより取得された株、又は自然発生した突然変異を指す。突然変異は、複数の突然変異形成処理(1つの処理は、スクリーニング/選択工程が続く突然変異形成処理として理解されるべきである)に供されたものでもよいが、好ましくは、20以下、又は10以下又は5以下の処理(又はスクリーニング/選択工程)が実施されるのが望ましい。好ましい突然変異において、親株と比較して、細菌ゲノム中のヌクレオチドの5%未満、又は1%未満、又は0.1%未満が、別のヌクレオチドに変化し、又は欠失している。 In the present specification, the term “mutation” is to be understood as a strain derived from the strain of the present invention, produced by means such as genetic manipulation, radiation and / or chemical treatment. Mutations are functionally equivalent mutations, such as having substantially the same or improved characteristics compared to the parent strain (eg, diacetyl production, viscosity, gel strength, mouth coating, flavor, post Acidification, rate of acidification and / or phage robustness mutations. Such mutations are part of the present invention. In particular, the term “mutation” is commonly used, including treatment with chemical mutagens such as ethanemethanesulfonic acid (EMS) or N-methyl-N′-nitro-N-nitroguanidine (NTG), UV light and the like. Strains obtained by subjecting the strains of the present invention to any mutagenesis treatment, or spontaneously occurring mutations. Mutations may have been subjected to multiple mutagenesis processes (one process should be understood as a mutagenesis process followed by a screening / selection step), but preferably no more than 20, or Desirably, no more than 10 or 5 treatments (or screening / selection steps) are performed. In preferred mutations, less than 5%, or less than 1%, or less than 0.1% of the nucleotides in the bacterial genome are changed to another nucleotide or deleted compared to the parent strain.
本願の記載における「当該」、「前記」、「1つの」という用語、及びこれらの類似語(特に特許請求の範囲)は、他の言及が無い限り、又は明確に否定していない限り、単数及び複数の両方を包含すると想定される。「含む」、「有する」、「含有する」、及び「包含する」という用語は、他に言及が無い限り、非限定的用語(即ち「含むがそれに限定されない」を意味する)として理解されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は、他に言及が無い限り、単に当該範囲内の各個別の数値を個別に参照する簡単な方法と見なされることが意図され、各個別の数値は、それらが個別に本明細書中に記載されているかのように本明細書中に包含される。本明細書中に記載される全ての方法は、本記載中に他の言及が無い限り、又は明確に否定されていない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書中の任意の及び全ての例実施例、又は例示的用語(「例えば」等)は、本発明をより良く明示することのみを意図しており、他の言及が無い限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの用語も、本発明の実施に必須の明示されていない要素であることを示唆するものとして解釈されるべきではない。 In the description of the present application, the terms “subject”, “above”, “one”, and similar terms thereof (particularly the claims) are singular unless otherwise stated or explicitly denied. And a plurality are envisioned. The terms “including”, “having”, “containing”, and “including” are understood as non-limiting terms (ie, including but not limited to) unless otherwise stated. Should. The recitation of numerical ranges herein is intended to be considered merely a simple way to individually reference each individual numerical value within that range, unless otherwise stated. Are hereby incorporated by reference as if individually described herein. All methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted. Any and all example embodiments or exemplary terms (such as “for example”) in this specification are intended only to better illustrate the present invention and, unless stated otherwise, It does not limit the range. No language in the specification should be construed as indicating any non-specified element essential to the practice of the invention.
発明の実施及び側面
発明者らは、カビ及び酵母等の望まれない微生物に対して有効な2つの異なる乳酸菌株の1つ又はそれらの混合物を含有する抗微生物組成物を提供するために、鋭意スクリーニングと研究を行った。
Implementation and Aspects of the Invention The inventors have eagerly provided an antimicrobial composition containing one or a mixture of two different lactic acid strains effective against unwanted microorganisms such as mold and yeast. Screening and research were conducted.
本発明は、酵母及びカビ等の広範囲の微生物に対して最も効果的な単一又は組み合わせの株を見つけるために、200株のラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)の候補をスクリーニングした。スクリーニングは、可能な限り中温性発酵乳製品を模倣した乳ベースの培地を用いたモデルアッセイにおいて行われ、当該培地に、出発培養株を、生物防御株の候補と共に、又は単独で添加し、そしてそれを、中温性発酵乳製品において採用される条件下で発酵させた。標的の微生物は、中温性発酵乳製品から単離された。Danisco A/S, Denmarkから提供されたHOLDBAC(商標)培養株、並びに乳酸菌及びプロピオン酸細菌のいずれも含有する完全HOLDBAC(商標)YM−B及びHOLDBAC(商標)YM−Cから単離した乳酸菌を、ベンチマークとして使用した。 The present invention provides 200 strains of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei to find the most effective single or combination strains against a wide range of microorganisms such as yeast and mold. And candidates for Lactobacillus rhamnosus were screened. Screening is performed in a model assay using a milk-based medium that mimics the mesophilic fermented dairy product as much as possible, to which the starting culture is added, along with a bioprotectant candidate or alone, and It was fermented under the conditions employed in mesophilic fermented dairy products. Target microorganisms were isolated from mesophilic fermented dairy products. Lactic acid bacteria isolated from HOLDBAC ™ culture strain provided by Danisco A / S, Denmark, and complete HOLDBAC ™ YM-B and HOLDBAC ™ YM-C containing both lactic acid bacteria and propionic acid bacteria Used as a benchmark.
ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)の中から17個の候補が、25℃で試験したとき、ベンチマークの乳酸菌と同等に、又はより顕著に、12個の指標のカビを阻害した。従って、第一の側面において、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)又はラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)の1つ以上の株を含有する抗微生物組成物に関する。 When 17 candidates out of Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus were tested at 25 ° C., the equivalent of, or more prominently, the 12 indicators Inhibited mold. Accordingly, in a first aspect, the present invention relates to an antimicrobial composition comprising one or more strains of Lactobacillus paracasei or Lactobacillus rhamnosus.
同定した9個の候補株も、低温条件下で試験したときベンチマークの乳酸菌と同程度の活性を示し、特に、受入番号DSM24651のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777、受入番号DSM24616のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697 、及び受入番号DSM24652のラクトバチルス・ラモノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226の3つの株は、非常に有効であることが示された。これらの3つの株は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に供託された。 The nine identified candidate strains also showed similar activity as the benchmark lactic acid bacteria when tested under low temperature conditions, in particular, Lactobacillus paracasei CHCC12777 with accession number DSM 24651, Lactobacillus with accession number DSM24616. Three strains of Lactobacillus rhamnosus CHCC12597 and accession number DSM24652 Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 have been shown to be very effective. These three strains were deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ).
これらの株は、いわゆるボトルアッセイで試験したとき、HOLDBAC(商標)培養株と比較して、単一で、様々な酵母に対して、顕著な、あるいは有意な効果を発揮した。従って、これらの単一の株は、抗微生物剤としての使用に非常に適している。好ましい態様において、本発明は、以下の群:
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24616で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697、
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24652で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226、
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24651で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777;
及びそれらの突然変異株から選択される1つ以上の株を含有し、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される、抗微生物組成物を提供する。
These strains, when tested in a so-called bottle assay, exhibited a significant or significant effect on a single, different yeast compared to the HOLDBAC ™ culture. These single strains are therefore very suitable for use as antimicrobial agents. In preferred embodiments, the present invention provides the following groups:
Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, deposited with German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) with accession number DSM24616,
Lactobacillus paracasei CHCC12777 deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under the accession number DSM24651;
And one or more strains selected from those mutant strains, wherein the mutant strains are obtained using said strains deposited as starting material .
特に好ましい態様において、本発明の抗微生物組成物は、抗微生物活性を有する一つの剤として、上記株又はそれらの突然変異の1つを含有する。 In a particularly preferred embodiment, the antimicrobial composition of the present invention contains the above strain or one of their mutations as one agent having antimicrobial activity.
上記3つの株とは別に、本発明は、これらの株由来の突然変異、即ち出発材料として供託されたCHCC12777、CHCC12697又はCHCC14226株の一つを使用して取得される突然変異株をも想定する。突然変異株は、例えば遺伝子操作、放射線照射、UV照射、化学処理、及び/又はゲノムに変化を誘導する任意の方法を使用して、上記出発材料から作製されてもよい。本発明の突然変異は、特定の細菌又は真菌、好ましくはカビの増殖を阻害又は予防し得る。当該突然変異は、例えばコンタミナントとして酵母K. marxianus、P. fermentas、Y. lipolytica又はC. sakeの一つを使用する実施例2に記載のアッセイ等で判定したとき、その親株と比較して、80%以上、90%以上、95%以上、又は100%以上の抗微生物、例えば抗真菌活性を有する。 Apart from the above three strains, the present invention also contemplates mutations derived from these strains, ie mutant strains obtained using one of the CHCC12777, CHCC12697 or CHCC14226 strains deposited as starting material. . Mutant strains may be made from the starting materials using, for example, genetic engineering, irradiation, UV irradiation, chemical treatment, and / or any method that induces changes in the genome. The mutations of the present invention may inhibit or prevent the growth of certain bacteria or fungi, preferably molds. The mutation is, for example, yeast K. as a contaminant. marxianus, P.M. fermentas, Y.M. lipolytica or C.I. 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% or more of an antimicrobial, such as antifungal, as determined by the assay described in Example 2 using one of the sake Has activity.
これらの株の望まれない微生物に対する阻害効果は、下記実施例に記載されるように、適切な保存期間中、適切な温度で、ボトルを保存することにより判定され得る。 The inhibitory effect of these strains on unwanted microorganisms can be determined by storing the bottles at an appropriate temperature for an appropriate storage period, as described in the examples below.
一般に、この方法が実施されるべき適切な温度は、具体的な食料、飼料又は医薬製品が通常保存及び/又は製造される温度に依存する。製品が通常保存される温度は、5℃〜26℃、好ましくは約8℃である。 In general, the appropriate temperature at which this method is to be performed depends on the temperature at which the particular food, feed or pharmaceutical product is usually stored and / or manufactured. The temperature at which the product is normally stored is 5 ° C to 26 ° C, preferably about 8 ° C.
当該温度での保存時間は、当該食料、飼料又は医薬製品が通常保存される期間(棚寿命)に依存する。通常の保存期間は、7〜28日、好ましくは約21日である。 The storage time at the temperature depends on the period (shelf life) in which the food, feed or pharmaceutical product is normally stored. The normal storage period is 7 to 28 days, preferably about 21 days.
2つの株の組み合わせを試験すると、最も有効な単一の株の組み合わせは、添加された細胞の合計の濃度が単一での試験の場合と2つの株の組み合わせでの試験の場合とで同じであっても、それらの株を単独で使用した場合よりも良好であった。ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777とラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697の組み合わせ、又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226の組み合わせは、ベンチマークの培養株であるDanisco, DenmarkのHOLDBAC(商標)YM−B及びHOLDBAC(商標)YM−Cよりも効果的であった。 When testing a combination of two strains, the most effective single strain combination is the same when the total concentration of added cells is tested in a single test and in a combination of two strains. Even so, it was better than using those strains alone. Lactobacillus paracasei CHCC12777 and Lactobacillus rhamnosus CCC12697 or Lactobacillus paracasei Lactobacillus Lactobacillus Was more effective than HOLDBAC ™ YM-B and HOLDBAC ™ YM-C from Danisco, Denmark.
従って、好ましい態様において、本発明は、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)を含有する抗微生物組成物に関し、当該1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)は、受入番号DSM24616のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697、受入番号DSM24652のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226、及びそれらの突然変異株から選択され、ここで、当該突然変異株は、出発材料として供託された上記株を使用して取得される。 Accordingly, in a preferred embodiment, the present invention relates to an antimicrobial composition comprising one or more Lactobacillus rhamnosus and one or more Lactobacillus paracasei. Lactobacillus rhamnosus is Lactobacillus rhamnosus with accession number DSM24616 (Lactobacillus rhamnosus), Lactobacillus rmunosus with accession number DSM24652, Lactobacillus rhamnosus The mutant strain is deposited as a starting material. Acquired using the above stock.
他の好ましい態様において、1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)は、受入番号DSM24651のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777及びその突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。 In another preferred embodiment, the one or more Lactobacillus paracasei is selected from the group consisting of Lactobacillus paracasei with accession number DSM 24651 CHCC12777 and mutants thereof, wherein the mutation A strain is obtained using said strain deposited as starting material.
更なる態様において、本発明は、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)を含有する抗微生物組成物、より好ましくは抗真菌組成物に関し、ここで、
当該1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)は、受入番号DSM24616のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697、受入番号DSM24652のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226、及びそれらの突然変異株から選択され、ここで、当該突然変異株は、出発材料として供託された上記株を使用して取得され、かつ
当該1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)は、受入番号DSM24651のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777及びその突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。
In a further aspect, the present invention relates to an antimicrobial composition, more preferably an antifungal composition, comprising one or more Lactobacillus rhamnosus and one or more Lactobacillus paracasei. ,here,
The one or more Lactobacillus rhamnosus is Lactobacillus rhamnosus with accession number DSM 24616 CHCC12697, Lactobacillus rmusnosil with the accession number DSM24652 Wherein the mutant strain is obtained using the above strain deposited as starting material, and the one or more Lactobacillus paracasei is a Lactobacillus acc. Lactobacillus paracasei CHCC12777 and It is selected from the group consisting of mutant, wherein said mutant strain is obtained using the strains deposited as a starting material.
1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) CHCC12697及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) CHCC12777を含有する抗微生物組成物が、特に好ましい。同様に、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) CHCC14226及び1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) CHCC12777を含有する抗微生物組成物も、本発明において特に好ましい。 Particularly preferred is an antimicrobial composition containing one or more Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 and one or more Lactobacillus paracasei CHCC12777. Similarly, antimicrobial compositions containing one or more Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 and one or more Lactobacillus paracasei CHCC12777 are also particularly preferred in the present invention.
典型的には、前記抗微生物組成物は、凍結、乾燥、又は凍結乾燥濃縮物等の濃縮形態の細菌を含有し、典型的には、生細胞の濃度は、組成物1gあたり104〜1012cfu(コロニー形成単位)であり、例えば104cfu/g以上、例えば105cfu/g以上、例えば106cfu/g以上、例えば107cfu/g以上、例えば108cfu/g以上、例えば109cfu/g以上、例えば1010cfu/g以上、例えば1011cfu/g以上である。従って、本発明の抗微生物組成物は、好ましくは、凍結、乾燥又は凍結乾燥の形態で、例えばDirect Vat Set(DVS)培養株として存在する。しかしながら、本明細書中で使用されるとき、抗微生物組成物は、当該凍結、乾燥又は凍結乾燥細胞濃縮物を、水又はPBS等の液体媒体中に懸濁することにより取得される液体であってもよい。本発明の抗微生物組成物が懸濁物である場合、生細胞の濃度は、組成物1mlあたり104〜1012cfu(コロニー形成単位)であり、例えば104cfu/ml以上、例えば105cfu/ml以上、例えば106cfu/ml以上、例えば107cfu/ml以上、例えば108cfu/ml以上、例えば109cfu/ml以上、例えば1010cfu/ml以上、例えば1011cfu/ml以上である。 Typically, the antimicrobial composition contains bacteria in a concentrated form, such as a frozen, dried, or lyophilized concentrate, and typically the concentration of viable cells is between 10 4 and 10 per gram of composition. 12 cfu (colony forming unit), for example, 10 4 cfu / g or more, such as 10 5 cfu / g or more, such as 10 6 cfu / g or more, such as 10 7 cfu / g or more, such as 10 8 cfu / g or more, For example, it is 10 9 cfu / g or more, for example, 10 10 cfu / g or more, for example, 10 11 cfu / g or more. Accordingly, the antimicrobial composition of the present invention is preferably present in frozen, dried or lyophilized form, for example as a Direct Vat Set (DVS) culture. However, as used herein, an antimicrobial composition is a liquid obtained by suspending the frozen, dried or lyophilized cell concentrate in a liquid medium such as water or PBS. May be. When the antimicrobial composition of the present invention is a suspension, the concentration of viable cells is 10 4 to 10 12 cfu (colony forming unit) per ml of the composition, for example, 10 4 cfu / ml or more, for example 10 5. cfu / ml or more, such as 10 6 cfu / ml or more, such as 10 7 cfu / ml or more, such as 10 8 cfu / ml or more, such as 10 9 cfu / ml or more, such as 10 10 cfu / ml or more, such as 10 11 cfu / ml. More than ml.
前記組成物は、更なる成分として、凍結保護剤及び/又は公知の添加物、例えば酵母抽出物、糖類及びビタミン、例えばビタミンA, C, D, K又はビタミンB類のビタミン等の栄養素を追加で含有してもよい。本発明の組成物に追加され得る適切な凍結保護剤は、マンニトール、ソルビトール、トリポリリン酸ナトリウム、キシリトール、グリセロール、ラフィノース、マルトデキストリン、エリスリトール、スレイトール、トレハロース、グルコース及びフルクトース等の、微生物の凍結耐性を改善する成分である。他の添加物として、炭水化物、香料、鉱物、酵素(例えばレンネット、ラクターゼ及び/又はホスホリパーゼ)が挙げられる。 The composition further comprises, as further components, cryoprotectants and / or known additives such as yeast extract, sugars and vitamins such as vitamins A, C, D, K or vitamin B vitamins You may contain. Suitable cryoprotectants that can be added to the compositions of the present invention are refractory to microorganisms such as mannitol, sorbitol, sodium tripolyphosphate, xylitol, glycerol, raffinose, maltodextrin, erythritol, threitol, trehalose, glucose and fructose. It is an ingredient that improves. Other additives include carbohydrates, perfumes, minerals, enzymes (eg rennet, lactase and / or phospholipase).
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) 株及びラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株を含有する本発明の抗微生物組成物において、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) 株とラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株の比率、例えばラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) 株とラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株の濃度又は個数の比率は、好ましくは1:100〜100:1、好ましくは1:10〜10:1である。 In an antimicrobial composition of the present invention comprising a Lactobacillus rhamnosus strain and a Lactobacillus paracasei strain, the Lactobacillus strain Lactobacillus rhamnoslus Lactobacillus strain The ratio of, for example, the concentration or number of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei strains is preferably 1: 100 to 100: 1, preferably 1:10 to 10: 1. It is.
本発明の抗微生物組成物は、微生物分解及び/又は酵母及びカビによるコンタミネーションを受けやすい任意の食料、飼料及び医薬製品に使用され得る。これらは、限定されないが、乾燥品を含む果物及び野菜、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物が含まれる。特に好ましい態様において、前記組成物は、乳製品及び/又は獣肉及び鶏肉に使用される。好ましい態様において、本発明の組成物は、ヨーグルト、トバログ、サワークリーム、クリームチーズ等の乳製品に調製において添加物として使用される。 The antimicrobial compositions of the present invention can be used in any food, feed and pharmaceutical product that is susceptible to microbial degradation and / or contamination with yeast and mold. These include, but are not limited to, fruits and vegetables including dried products, cereal and cereal derived products, dairy products, animal meat, poultry and marine products. In a particularly preferred embodiment, the composition is used for dairy products and / or animal and poultry. In a preferred embodiment, the composition of the invention is used as an additive in the preparation of dairy products such as yogurt, tobalog, sour cream, cream cheese and the like.
本発明の抗細菌組成物は、真菌及び細菌並びにそれらの混合物からなる群から選択される望まれない微生物の阻害にも使用され得る。本発明の組成物は、乳発酵プロセス等の乳業のプロセスにおけるありふれたコンタミナントである、真菌及び細菌の増殖を阻害及び/又は防止するのに、特に有用である。 The antibacterial compositions of the present invention can also be used to inhibit unwanted microorganisms selected from the group consisting of fungi and bacteria and mixtures thereof. The compositions of the present invention are particularly useful for inhibiting and / or preventing the growth of fungi and bacteria, which are common contaminants in dairy processes such as the milk fermentation process.
特に好ましい態様において、本発明の抗微生物組成物は、酵母及びカビ等の真菌に対して使用される。これは、当該組成物が、乳業のプロセス、特に乳発酵プロセスにおいてコンタミネーションを引き起こす、真菌の増殖を阻害及び/又は防止するのに使用されることを意味する。本発明の抗微生物組成物は、酵母、例えば、クリヴェロマイケス(Klyveromyces)(例えばK. マルキシアヌス(marxianus)、K. ラクティス(lactis))、ピキア(Pichia)(例えばP. (フェルメンタンス(fermentans))、ヤロウィア(Yarrowia)(例えばY. リポリティカ(lipolytica))、カンジダ(Candida)(例えばC. サケ(sake))等の属の酵母;又はカビ、例えば、ペニシリウム(Penicillium)(例えばP. ナルギオヴェンス(nalgiovense)、P. コムネ(commune)、P. クルストサム(crustosum)、P. ブレビコンパクツム(brevicompactum)、P. グラブラム(glabrum))、ムコール亜種(Mucor sop.)、クラジオスポリウム亜種(Cladiosporium ssp.)、アスペルギルス(Aspergillus)(例えばA. ヴェルシコロール(versicolor))、デバロマイケス(Debaromyces)(例えばD. ハンセニイ(hansenii))等の属のカビの増殖を阻害及び/又は防止するのに使用され得る。クリヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、ペニシリウム・ナルギオヴェンス(Penicillium nalgiovense)、クラディオsポリウム亜種(Cladiosporium ssp.)、ペニシリウム・コムネ(Penicillium commune)、ムコール亜種(Mucor ssp.)、ペニシリウム・ブレヴィコンパクツム(Penicillium brevicompactum)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(Aspergillus versicolor)、ペニシリウム・クルストスム(Penicillium crustosum)、クルイヴェロマイケス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、及び/又はデバロマイケス・ハンセニイ(Debaromyces hansenii)の増殖の阻害及び/又は防止に、本発明の抗微生物組成物を使用するのが特に好ましい。 In a particularly preferred embodiment, the antimicrobial composition of the present invention is used against fungi such as yeast and mold. This means that the composition is used to inhibit and / or prevent fungal growth which causes contamination in dairy processes, in particular milk fermentation processes. The antimicrobial compositions of the present invention may be used in yeasts such as Klyveromyces (eg K. marxianus, K. lactis), Pichia (eg P. (fermentans)). fermentans), Yarrowia (eg, Y. lipolytica), Candida (eg, C. sake), and other yeasts; or molds, eg, Penicillium (eg, P. pylori). Nalgiovense, P. commune, P. crustosum, P. brevicompactum, P. glabra (Glabrum), Mucor sop., Cladiosporium ssp., Aspergillus (eg A. versicolor), Debaromikes (eg. Debaromyces. It can be used to inhibit and / or prevent the growth of molds of the genus such as Hansenii, Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium p. ), Cladosporium ssp., Peni Penicillium commune, Mucor ssp., Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium cus It is particularly preferred to use the antimicrobial composition of the invention for the inhibition and / or prevention of the growth of Lactis (Kluyveromyces lactis) and / or Debaromyces hansenii.
本発明の第一の側面の抗微生物組成物は、病原性真菌、好ましくは病原性酵母の感染を治療するための医薬組成物として使用されてもよい。 The antimicrobial composition of the first aspect of the invention may be used as a pharmaceutical composition for treating infections of pathogenic fungi, preferably pathogenic yeasts.
上記のように、本発明の一つの側面は、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を含有する、食料、飼料又は医薬製品に関する。 As mentioned above, one aspect of the present invention relates to a food, feed or pharmaceutical product containing the antimicrobial composition of the first aspect of the present invention.
好ましい態様において、そのような食料製品は、果物及び果物由来の製品、野菜及び野菜由来の製品、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物並びにそれらの混合物からなる群から選択される。 In preferred embodiments, such food products are selected from the group consisting of fruits and fruit-derived products, vegetables and vegetable-derived products, cereals and cereal-derived products, dairy products, animal meat, poultry and marine products and mixtures thereof. The
より好ましい態様において、前記食料製品は乳製品であり、好ましくは、中温又は好熱発酵乳製品、例えばフレッシュチーズ、ヨーグルト、サワークリーム又はトバログである。 In a more preferred embodiment, the food product is a dairy product, preferably a medium temperature or thermophilic fermented dairy product, such as fresh cheese, yogurt, sour cream or tobalog.
他の好ましい態様において、前記食料製品は、獣肉又は鶏肉である。好ましい態様において、前記医薬製品は、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を、病原性微生物を阻害し、当該病原性微生物に関連する症状を緩和するために、ヒト又は動物に投与するのに有用な製品である。そのような症状の例として、酵母感染に関連する症状が挙げられる。そのような態様において、前記医薬製品は、抗微生物組成物を含有する単位投与剤形であってもよい。好ましくは、当該単位投与剤形は、カプセル又は錠剤であってもよい。しかしながら、当該単位投与剤形は、粘膜又は皮膚への適用に適するものでもよく、その場合、ペースト、クリーム、軟膏等の形態である。 In another preferred embodiment, the food product is animal meat or chicken. In a preferred embodiment, said pharmaceutical product administers the antimicrobial composition of the first aspect of the invention to a human or animal to inhibit pathogenic microorganisms and alleviate symptoms associated with said pathogenic microorganisms. It is a useful product. Examples of such symptoms include symptoms associated with yeast infection. In such embodiments, the pharmaceutical product may be in unit dosage form containing an antimicrobial composition. Preferably, the unit dosage form may be a capsule or a tablet. However, the unit dosage form may be suitable for application to mucous membranes or skin, in which case it is in the form of a paste, cream, ointment or the like.
本発明の他の側面は、本発明の第五の側面の食料、飼料又は医薬製品を製造する方法に関し、当該方法は、当該食料、飼料又は医薬製品を製造する過程で、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を添加する工程を含む。 Another aspect of the present invention relates to a method for producing a food, feed or pharmaceutical product according to the fifth aspect of the present invention. Adding an antimicrobial composition of this aspect.
好ましい態様において、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の濃度は、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、1x106cfu/g以上、好ましくは5x106cfu/g以上、最も好ましくは1x108cfu/g以上であり、又は1x106cfu/ml以上、好ましくは5x106cfu/ml以上、最も好ましくは1x108cfu/ml以上でありあるいは、当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、1x105cfu/cm2以上、好ましくは5x105cfu/cm2以上、最も好ましくは1x107cfu/cm2以上である。 In a preferred embodiment, the concentration of one or more Lactobacillus rhamnosus strains or Lactobacillus paracasei is greater than or equal to 1 × 10 6 cfu / g, preferably for said food, feed or pharmaceutical product, 5x10 6 cfu / g or more, most preferably 1x10 8 cfu / g or more, or 1x10 6 cfu / ml or more, preferably 5x10 6 cfu / ml or more, most preferably 1x10 8 cfu / ml or more, or food for feed or pharmaceutical product surface, 1x10 5 cfu / cm 2 or more, preferably 5x10 5 cfu / cm 2 or more, and most preferably 1x10 7 cfu / cm 2 or more.
前記食料、飼料又は医薬製品が、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株及びラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)を含有する組成物を添加することにより製造される場合、当該1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の濃度は、それぞれ、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、1x106cfu/g以上若しくは1x106cfu/ml以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、1x105cfu/cm2以上である。好ましくは、当該1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の濃度は、それぞれ、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、5x106cfu/g以上若しくは5x106cfu/ml以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、5x105cfu/cm2以上である。更なる態様において、当該1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の濃度は、それぞれ、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、1x108cfu/g以上若しくは1x108cfu/ml以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、1x107cfu/cm2以上である。 Where the food, feed or pharmaceutical product is produced by adding a composition containing one or more Lactobacillus rhamnosus strains and Lactobacillus paracasei, the one or more The concentration of Lactobacillus rhamnosus strain or Lactobacillus paracasei is 1 × 10 6 cfu / g or more or 1 × 10 6 cfu / ml or more with respect to the food, feed or pharmaceutical product, respectively. Or it is 1x10 < 5 > cfu / cm < 2 > or more with respect to the surface of the said foodstuff, feed, or a pharmaceutical product. Preferably, the concentration of the one or more Lactobacillus rhamnosus strains or Lactobacillus paracasei is 5 × 10 6 cfu / g or more, respectively, for the food, feed or pharmaceutical product, or 5 × 10 6 cfu / ml or more, or 5 × 10 5 cfu / cm 2 or more with respect to the surface of the food, feed or pharmaceutical product. In a further aspect, the concentration of the one or more Lactobacillus rhamnosus strains or Lactobacillus paracasei is 1 × 10 8 cfu / g for the food, feed or pharmaceutical product, respectively. Or 1 × 10 8 cfu / ml or more, or 1 × 10 7 cfu / cm 2 or more with respect to the surface of the food, feed or pharmaceutical product.
好ましい態様において、前記製造パラメーターは、当該製造の過程で、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の濃度が増大し、又は一定となるようにコントロールされる。 In a preferred embodiment, the production parameters are controlled so that the concentration of one or more Lactobacillus rhamnosus strains or Lactobacillus paracasei increases or remains constant during the production. Is done.
本発明の抗微生物組成物は、混合可能な食料、飼料又は医薬組成物と混合され、及び/又はそれらに適用されることにより最も簡便に使用されるが、固体の食料製品の表面、又はそのような製品の内部を、注射により処理するのも有効である。更に他の態様において、前記組成物は、マリネ、パン粉、シーズニングラブ(seasoning rub)、蜜、着色料混合物等として適用されてもよく、重要な基準は、前記抗微生物が、細菌による分解並びに酵母及びカビでコンタミネーションする表面上で利用可能となっていることである。尚も他の態様において、前記組成物は、食料の容器に当該組成物を適用し、そして当該容器を食料表面に適用して、食料表面と接触させてもよい。使用される適切な量は、処理される具体的な食料製品、及び食料表面への組成物の適用に使用される方法に依存し得るが、単純な実験により決定することが出来る。 The antimicrobial composition of the present invention is most conveniently used by being mixed with and / or applied to a mixable food, feed or pharmaceutical composition, but on the surface of a solid food product or its It is also effective to treat the interior of such products by injection. In still other embodiments, the composition may be applied as marinade, bread crumbs, seasoning rubs, nectar, colorant mixtures, etc., with important criteria being that the anti-microbial is degraded by bacteria as well as yeast. And available on mold-contaminated surfaces. In still other embodiments, the composition may be in contact with the food surface by applying the composition to a food container and applying the container to the food surface. The appropriate amount used may depend on the particular food product being treated and the method used to apply the composition to the food surface, but can be determined by simple experimentation.
大変好ましい態様において、前記方法は、1つ以上の発酵工程を含んでもよく、そして前記抗微生物組成物は、そのような1つ以上の発酵工程の前に、間に、又は後に、前記食料、飼料又は医薬製品に添加されてもよい。 In a highly preferred embodiment, the method may comprise one or more fermentation steps, and the antimicrobial composition is the food, before, during or after such one or more fermentation steps. It may be added to feed or pharmaceutical products.
尚もより好ましい態様において、前記方法は、ラクトバチルスLactobacillus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ラクトコッカス(Lactococcus)及びロイコノストック(Leuconostoc)から選択される属の1つ以上の株、例えばラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)の1つ以上の株、及びストレプトコッカス・テルモフィルス(Streptococcus thermophilus)の1つ以上の株、又は例えばラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス(Lactococcus lactis subsp. Lactis)の1つ以上の株、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス(Leuconostoc mesenteroides subsp. Cremoris)の1つ以上の株、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ジアセチラクティス(Lactococcus lactis subsp. diacetylactis) の1つ以上の株を含有する出発培養株を用いて乳基質を発酵させることを含む。 In an even more preferred embodiment, the method comprises one or more strains of a genus selected from Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus and Leuconostoc, such as Lactobacillus bulgari. One or more strains of Lactobacillus bulgaricus and one or more strains of Streptococcus thermophilus, or one or more strains of Lactococcus lactis subsp. Lactis. , Leuconostoc mesenteroides subspecies cremolith ferment a milk substrate with a starting culture containing one or more strains of C. mesenteroides subsp. Cremoris and one or more strains of Lactococcus lactis subsp. diacetylactis Including that.
本発明の最後の側面は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24616で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697又はその突然変異株、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24652で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226又はその突然変異株、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24651で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777又はその突然変異株;に関し、ここで当該突然変異株は、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。 The final aspect of the present invention is the Lactobacillus rhamnosus CHL C12697 or its mutant strain, Germanol of the Cultivation of Germulzrum Candum, which was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) under the accession number DSM24616. Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 or its mutant strain, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM) deposited under the accession number DSM24652 Z) Lactobacillus paracasei CHCC12777 deposited under accession number DSM 24651 or a mutant thereof, wherein said mutant is obtained using said strain deposited as starting material .
出発材料として供託された前記株を使用することにより、当業者が、公知の突然変異形成技術又は再単離技術を用いて、本明細書中に記載の関連する特徴及び長所を保持する更なる突然変異を容易に取得出来ることは、当業者にとって明白である。従って、第一の側面における「その突然変異」という用語は、出発材料として供託された前記株を使用することにより取得される突然変異株に関する。 By using the strains deposited as starting material, those skilled in the art can use the known mutagenesis or reisolation techniques to retain the relevant features and advantages described herein. It will be apparent to those skilled in the art that mutations can be easily obtained. Thus, the term “its mutation” in the first aspect relates to a mutant strain obtained by using said strain deposited as starting material.
本発明の態様は、非限定的な例示を用いて、以下に記載される。 Aspects of the invention are described below using non-limiting examples.
実施例1:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697の単独及び組み合わせ使用の、様々な酵母及びカビによるコンタミネーションの阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 1: Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of various yeasts and fungi on the use of Lb. rhamnosus CHCC12697 alone and in combination Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC12697 alone and in combination, an agar assay was used, which mimics the fresh cheese manufacturing process and product.
全脂肪(3.5%w/w)均質化乳を79±1℃で20分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS CHN−19)を0.1μ/lで播種し、当該播種された乳を220mlボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及び/又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697を、合計で5x106CFU/mlの濃度で播種し、そして1つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、pH表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが5%添加された。全てのボトルを29±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が40℃に達するまで加熱し、一度溶解させて60℃に冷却した5%滅菌寒天溶液を40ml添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをLAFベンチで30分間乾燥させた。 Full fat (3.5% w / w) homogenized milk was heat treated at 79 ± 1 ° C. for 20 minutes and quenched. A commercially available starting culture strain (Chr. Hansen A / S, F-DVS CHN-19 from Denmark) was seeded at 0.1 μl and the seeded milk was dispensed into 220 ml bottles. Lb. Paracasei CHCC12777 and / or Lb. Rb. Rhamnosus CHCC12697 was seeded at a total concentration of 5 × 10 6 CFU / ml and one bottle served as a reference seeded with only the starting culture. In addition, 5% of the pH indicators bromcresol purple and bromcresol green were added to provide an indicator of the rate of acidification and to obtain a blue-green medium that can more easily detect the target yeast and mold. All bottles were incubated in a 29 ± 1 ° C. water bath and fermented under these conditions until the pH reached 4.60 ± 0.1. After fermentation, these bottles were quenched on ice and shaken vigorously to break up the coagulum. Then, the fermented milk was heated until the temperature reached 40 ° C., and 40 ml of 5% sterilized agar solution dissolved once and cooled to 60 ° C. was added. The fermented milk and agar solution was poured into a sterile petri dish and the plates were dried on a LAF bench for 30 minutes.
選択された酵母及びカビを、クライヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)、ピキア・フェルメンタンス(Pichia fermentans)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)及びカンジダ・サケ(Candida sake)について、それぞれ104、103、及び102CFU/スポットで滴下した。十分に出芽した胞子の懸濁物を、1000、100、10倍に希釈し、ペニシリウム・ナルギオヴェンス(Penicillium nalgiovense)ムコール亜種(Mucor ssp.)、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)及びクラジオスポリウム亜種(Cladiosporium ssp.)については希釈されなかった。当該プレートを7±1℃でインキュベートし、これらが、酵母及びカビの増殖の為に主に試験された。 Selected yeasts and molds, Cry Vero My Kes-marxianus (Klyveromyces marxianus), Pichia Fell Men chest (Pichia fermentans), the Yarrowia lipolytica (Yarrowia lipolytica) and Candida sake (Candida sake), respectively 10 4, Added dropwise at 10 3 and 10 2 CFU / spot. Sufficiently germinated spore suspensions are diluted 1000, 100, 10 fold, Penicillium nargiovense Mucor ssp., Penicillium commune, and Cradiosporia sub The species (Cladiosporium ssp.) Was not diluted. The plates were incubated at 7 ± 1 ° C. and these were mainly tested for yeast and mold growth.
寒天アッセイの結果を図1に示す。出発培養株のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート(参照)上では、全ての試験された酵母及び株は、活発な増殖を示した。しかしながら、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697が乳発酵の過程で存在したとき、得られたプレートにおいて、全ての濃度のK.マルキシアヌス(K. marxianus)及びY.リポリティカ(Y. lipolytica)の増殖が阻害された。更に、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697が乳発酵の過程で存在していたとき、それらのプレート上に滴下した全てのカビにおいて、顕著な阻害が観察された。Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697のいずれも、単独の株として添加した場合、P.フェルメンタンス(P. fermentans)又はC.サケ(C. sake)株に対して阻害効果を引き起こさなかった。しかしながら、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697の両方の存在下で乳を発酵させた場合、103、及び102CFU/スポットの低目の濃度で滴下されたP.フェルメンタンス(P. fermentans)の増殖の阻害が観察され、そしてクラディオスポリウム亜種(Cladiosporium ssp.)及びムコール亜種(Mucor ssp.)は、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697が単独で添加された場合よりも強力に増殖を阻害した。これらの結果は、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697の2つの株が、一定の相乗的抗真菌効果を有することを示している。 The results of the agar assay are shown in FIG. On agar plates (reference) made from milk fermented only with the starting culture, all tested yeasts and strains showed active growth. However, Lb. Paracasei CHCC12777 or Lb. When Lb. rhamnosus CHCC12697 was present in the course of milk fermentation, all concentrations of K. K. marxianus and Y.M. Lipolytica (Y. lipolytica) growth was inhibited. Furthermore, Lb. Paracasei CHCC12777 or Lb. When Rb. Rhamnosus CHCC12697 was present during the milk fermentation, significant inhibition was observed in all molds dripped onto the plates. Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. When any of the Rb. Rhamnosus CHCC12697 was added as a single strain, Fermentans or C. fermentans It did not cause an inhibitory effect on the salmon (C. sake) strain. However, Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. When milk was fermented in the presence of both Lb. rhamnosus CHCC12697, P. plutonium was dripped at a lower concentration of 10 3 and 10 2 CFU / spot. Inhibition of growth of P. fermentans was observed, and Clariosporium ssp. And Mucor ssp. Paracasei CHCC12777 or Lb. Rb. Rhamnosus CHCC12697 inhibited growth more potently than when added alone. These results are shown in Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Two strains of Lb. rhamnosus CHCC12697 have been shown to have a certain synergistic antifungal effect.
実施例2:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697の単独及び組み合わせ使用の、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)に対する阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 2: Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC12697 alone and in combination on Yarrowia lipolytica Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC12697 alone and in combination, an agar assay was used, which mimics the fresh cheese manufacturing process and product.
全脂肪(3.5%w/w)均質化乳を79±1℃で20分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS CHN−19)を0.1μ/lで播種し、当該播種された乳を1lボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及び/又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697を、合計で5x106CFU/mlの濃度で播種し、そして1つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、2つのボトルには、CHN−19出発培養株と共に、HOLDBAC(商標) YM−B (50DCU/100L; Danisco A/S, Denmark)又はHOLDBAC(商標) YM−C (20 DCU/100L; Danisco A/S, Denmark)を播種した。全てのボトルを29±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。 Full fat (3.5% w / w) homogenized milk was heat treated at 79 ± 1 ° C. for 20 minutes and quenched. A commercially available starting culture strain (Chr. Hansen A / S, F-DVS CHN-19 manufactured by Denmark) was seeded at 0.1 μl, and the seeded milk was dispensed into 1 l bottles. Lb. Paracasei CHCC12777 and / or Lb. Rb. Rhamnosus CHCC12697 was seeded at a total concentration of 5 × 10 6 CFU / ml and one bottle served as a reference seeded with only the starting culture. In addition, the two bottles include HOLDBAC ™ YM-B (50 DCU / 100 L; Danisco A / S, Denmark) or HOLDBAC ™ YM-C (20 DCU / 100 L; Danisco) with CHN-19 starting culture. A / S, Denmark). All bottles were incubated in a 29 ± 1 ° C. water bath and fermented under these conditions until the pH reached 4.60 ± 0.1. After fermentation, these bottles were quenched on ice and shaken vigorously to break up the coagulum.
各ボトルの内容物をより小さいプラスチックカップに分注し、フレッシュチーズ製品のコンタミナントとして単離されたヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を播種した。2つの別個のカップに、1% (v/w)の体積で、最終的なY.リポリティカ(Y. lipolytica)の発酵乳製品中のコンタミネーションレベルが1x102CFU/gとなるように播種された。前記プラスチックカップを目張りし、8±1℃で保管した。当該発酵乳製品を、酵母グルコースクロラムフェニコール(YGC)寒天上に生理食塩水ペプトンで10倍に希釈してプレーティングし、有酸素インキュベーションで5日間25℃で培養することにより、Y.リポリティカ(Y. lipolytica)のコンタミネーションレベルを判定した。更に、発酵乳資料のpHは、保管の期間を通して測定された。 The contents of each bottle were dispensed into smaller plastic cups and seeded with Yarrowia lipolytica isolated as a contaminant of fresh cheese products. In two separate cups with a volume of 1% (v / w), the final Y.V. It was seeded so that the contamination level in the fermented dairy product of Lipolytica was 1 × 10 2 CFU / g. The plastic cup was covered and stored at 8 ± 1 ° C. The fermented dairy product was plated on yeast glucose chloramphenicol (YGC) agar diluted 10-fold with physiological saline peptone and cultured at 25 ° C. for 5 days with aerobic incubation. The contamination level of Y. lipolytica was determined. Furthermore, the pH of the fermented milk material was measured throughout the storage period.
図2に記載されたように、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697のいずれも、発酵前に出発培養株CHN−19と共に単独の株として使用されたとき、Y.リポリティカ(Y. lipolytica)の増殖は阻害された。いずれの株も、HOLDBAC(商標) YM−B及びHOLDBAC(商標) YM−Cよりも顕著な阻害を引き起こした。更に、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697が組み合わせて使用されたとき、各株が単独で使用された場合と比較して、相乗的な阻害効果が認められた。Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC12697は、組み合わせて使用されるとき、前記発酵乳中のY.リポリティカ(Y. lipolytica)の誘導期及び定常期のいずれにおいても細胞カウントに影響を及ぼし、この相乗効果は、これらの種類の製品の棚寿命の延長に貢献し得る。 As described in FIG. Paracasei CHCC12777 and Lb. When any of the Rb. Rhamnosus CHCC12697 was used as a single strain with the starting culture CHN-19 prior to fermentation, The growth of lipolytica (Y. lipolytica) was inhibited. Both strains caused more significant inhibition than HOLDBAC ™ YM-B and HOLDBAC ™ YM-C. Furthermore, Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. When Rb. Rhamnosus CHCC12697 was used in combination, a synergistic inhibitory effect was observed compared to when each strain was used alone. Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Rb. Rhamnosus CHCC12697, when used in combination, is Y. in the fermented milk. It affects cell counts during both the induction and stationary phase of lipolytica, and this synergistic effect can contribute to extending shelf life of these types of products.
実施例3:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせ使用の、様々な酵母及びカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 3: Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC14226 alone and in combination on various yeast and mold contaminants Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effect of Lb.
全脂肪(3.5%w/w)均質化乳を79±1℃で20分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(F−DVS CHN−19)を0.1μ/lで播種し、当該播種された乳を220mlボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及び/又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226を、合計で5x106CFU/mlの濃度で播種し、そして1つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、pH表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが5%添加された。全てのボトルを29±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が40℃に達するまで加熱し、一度溶解させて60℃に冷却した5%滅菌寒天溶液を40ml添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをLAFベンチで30分間乾燥させた。 Full fat (3.5% w / w) homogenized milk was heat treated at 79 ± 1 ° C. for 20 minutes and quenched. A commercially available starting culture (F-DVS CHN-19) was seeded at 0.1 μl and the seeded milk was dispensed into 220 ml bottles. Lb. Paracasei CHCC12777 and / or Lb. Rb.rhamnosus CHCC14226 was seeded at a total concentration of 5 × 10 6 CFU / ml and one bottle served as a reference seeded with only the starting culture. In addition, 5% of the pH indicators bromcresol purple and bromcresol green were added to provide an indicator of the rate of acidification and to obtain a blue-green medium that can more easily detect the target yeast and mold. All bottles were incubated in a 29 ± 1 ° C. water bath and fermented under these conditions until the pH reached 4.60 ± 0.1. After fermentation, these bottles were quenched on ice and shaken vigorously to break up the coagulum. Then, the fermented milk was heated until the temperature reached 40 ° C., and 40 ml of 5% sterilized agar solution dissolved once and cooled to 60 ° C. was added. The fermented milk and agar solution was poured into a sterile petri dish and the plates were dried on a LAF bench for 30 minutes.
選択された酵母及びカビを、クライヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)、ピキア・フェルメンタンス(Pichia fermentans)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)及びカンジダ・サケ(Candida sake)について、それぞれ104、103、及び102CFU/スポットで滴下した。十分に出芽した胞子の懸濁物を、1000、100、10倍に希釈し、ペニシリウム・ナルギオヴェンス(Penicillium nalgiovense)ムコール亜種(Mucor ssp.)、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)及びクラジオスポリウム亜種(Cladiosporium ssp.)については希釈されなかった。当該プレートを7±1℃でインキュベートし、これらが、酵母及びカビの増殖の為に主に試験された。 Selected yeasts and molds, Cry Vero My Kes-marxianus (Klyveromyces marxianus), Pichia Fell Men chest (Pichia fermentans), the Yarrowia lipolytica (Yarrowia lipolytica) and Candida sake (Candida sake), respectively 10 4, Added dropwise at 10 3 and 10 2 CFU / spot. Sufficiently germinated spore suspensions are diluted 1000, 100, 10 fold, Penicillium nargiovense Mucor ssp., Penicillium commune, and Cradiosporia sub The species (Cladiosporium ssp.) Was not diluted. The plates were incubated at 7 ± 1 ° C. and these were mainly tested for yeast and mold growth.
寒天アッセイの結果を図3に示す。出発培養株のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート(参照)上では、全ての試験された酵母及び株は、活発な増殖を示した。しかしながら、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777が乳発酵の過程で存在したとき、得られたプレートにおいて、全ての濃度のK.マルキシアヌス(K. marxianus)及びY.リポリティカ(Y. lipolytica)の増殖が阻害された。Lb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226においても、得られたプレートにおいて、全ての濃度のK.マルキシアヌス(K. marxianus)及び最低濃度から2番目までのY.リポリティカ(Y. lipolytica)の増殖が阻害された。Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が単一の株として添加された場合であっても、それらは低濃度のP.フェルメンタンス(P. fermentans)に対して僅かな阻害効果を示した。しかしながら、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が乳発酵の過程で両方とも存在している場合、102CFU/spotの最低の濃度で添加されたP.フェルメンタンス(P. fermentans)の増殖が阻害された。カビにおいて、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が乳発酵の過程で存在する場合、顕著な阻害が認められた。Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の組み合わせが使用された場合、クラディオスポリウム亜種(Cladiosporium ssp.)の増殖は、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が単独で添加された場合と比較して、より強力に阻害された。これらの結果は、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の2つの株が一定の相乗的抗真菌効果を有することを示す。
The results of the agar assay are shown in FIG. On agar plates (reference) made from milk fermented only with the starting culture, all tested yeasts and strains showed active growth. However, Lb. When Lb. paracasei CHCC12777 was present during the milk fermentation, all concentrations of K. K. marxianus and Y.M. Lipolytica (Y. lipolytica) growth was inhibited. Lb. Rb.
実施例4:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせ使用の、クリヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)に対する阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 4: Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC14226, alone and in combination, on Klyveromyces marxianus Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effect of Lb.
全脂肪(3.5%w/w)均質化乳を79±1℃で20分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(F−DVS CHN−19)を0.1μ/lで播種し、当該播種された乳を1lボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及び/又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226を、合計で5x106CFU/mlの濃度で播種し、そして1つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、2つのボトルには、CHN−19出発培養株と共に、HOLDBAC(商標) YM−B (50DCU/100L)又はHOLDBAC(商標) YM−C (20 DCU/100L)を播種した。全てのボトルを29±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。 Full fat (3.5% w / w) homogenized milk was heat treated at 79 ± 1 ° C. for 20 minutes and quenched. A commercially available starting culture strain (F-DVS CHN-19) was seeded at 0.1 μl and the seeded milk was dispensed into 1 l bottles. Lb. Paracasei CHCC12777 and / or Lb. Rb.rhamnosus CHCC14226 was seeded at a total concentration of 5 × 10 6 CFU / ml and one bottle served as a reference seeded with only the starting culture. In addition, two bottles were seeded with HOLDBAC ™ YM-B (50 DCU / 100 L) or HOLDBAC ™ YM-C (20 DCU / 100 L) along with the CHN-19 starting culture. All bottles were incubated in a 29 ± 1 ° C. water bath and fermented under these conditions until the pH reached 4.60 ± 0.1. After fermentation, these bottles were quenched on ice and shaken vigorously to break up the coagulum.
各ボトルの内容物をより小さいプラスチックカップに分注し、フレッシュチーズ製品のコンタミナントとして単離されたクリヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)を播種した。2つの別個のカップに、1% (v/w)の体積で、最終的なクリヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)の発酵乳製品中のコンタミネーションレベルが1x102CFU/gとなるように播種された。前記プラスチックカップを目張りし、8±1℃で保管した。当該発酵乳製品を、酵母グルコースクロラムフェニコール(YGC)寒天上に生理食塩水ペプトンで10倍に希釈してプレーティングし、有酸素インキュベーションで3〜5日間25℃で培養することにより、クリヴェロマイケス・マルキシアヌス(Klyveromyces marxianus)のコンタミネーションレベルを判定した。更に、発酵乳資料のpHは、保管の期間を通して測定された。 The contents of each bottle were dispensed into smaller plastic cups and seeded with Klyveromyces marxianus isolated as a contaminant of fresh cheese products. In two separate cups, with a volume of 1% (v / w), the contamination level in the final fermented dairy product of Klyveromyces marxianus is 1 × 10 2 CFU / g Seeded. The plastic cup was covered and stored at 8 ± 1 ° C. The fermented dairy product is plated on yeast glucose chloramphenicol (YGC) agar diluted 10-fold with physiological saline peptone and cultured at 25 ° C. for 3-5 days with aerobic incubation. The contamination level of Velomyces marxianus was determined. Furthermore, the pH of the fermented milk material was measured throughout the storage period.
図4に示すように、K. マルキシアヌス(K.marxianus)の増殖は、発効前にCHN−19出発培養株と共にLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の両方が単一の株として使用されて存在するとき、阻害された。実施例2に見られるように、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777は、HOLDBAC(商標) YM−B及びHOLDBAC(商標) YM−Cよりも顕著に強力なK. マルキシアヌス(K.marxianus)の阻害を引き起こしたが、Lb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226により引き起こされる阻害は、HOLDBAC(商標)培養株と同等であった。Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が組み合わせて使用されるとき、各株が単独で使用された場合の阻害効果と比較して、協調的な阻害効果が認められた。組み合わせて使用されるとき、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226は、発酵乳中でのK. マルキシアヌス(K.marxianus)の増殖を遅延させ、この種類の製品の棚寿命の延長に貢献し得る。
As shown in FIG. The growth of K. marxianus was confirmed with Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Rb. Rhamnosus CHCC14226 was inhibited when both were present and used as a single strain. As seen in Example 2, Lb. Parabasei CHCC12777 is significantly more potent than HOLDBAC ™ YM-B and HOLDBAC ™ YM-C. It caused inhibition of K. marxianus, but Lb. The inhibition caused by Lb. rhamnosus CHCC14226 was comparable to the HOLDBAC ™ culture. Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. When Rb. Rhamnosus CHCC14226 was used in combination, a coordinated inhibitory effect was observed compared to the inhibitory effect when each strain was used alone. When used in combination, Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Rb.
実施例5:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC5366の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC5366の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 5: Lb. Paracasei CHCC 14676 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC5366 alone and in combination on various mold contaminants Lb. Paracasei CHCC 14676 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effects of Lb. rhamnosus CHCC5366 alone and in combination, an agar assay was used, which mimics the manufacturing process and product of yogurt.
均質化乳(1.5%w/w)を95℃で5分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark 製F−DVS YC−350)を0.02%で播種し、当該播種された乳を220mlボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676、Lb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC5366、及びそれらの2つの組み合わせを、合計で1x107CFU/mlの濃度で播種した。前記出発培養物のみ播種された1つのボトルを、参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、pH表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに5%添加された。全てのボトルを43±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が40℃に達するまで加熱し、一度溶解させて60℃に冷却した5%滅菌寒天溶液を40ml添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをLAFベンチで30分間乾燥させた。 Homogenized milk (1.5% w / w) was heat treated at 95 ° C. for 5 minutes and quenched. A commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS YC-350) was seeded at 0.02%, and the seeded milk was dispensed into 220 ml bottles. Lb. Paracasei CHCC 14676, Lb. Rb. Rhamnosus CHCC5366, and combinations of the two, were seeded at a total concentration of 1 × 10 7 CFU / ml. One bottle seeded with only the starting culture served as a reference. Furthermore, the pH indicators bromcresol purple and bromcresol green are 5% in all bottles to serve as an indicator of the rate of acidification and to obtain a blue-green medium that can more easily detect the target yeast and mold. Added. All bottles were incubated in a 43 ± 1 ° C. water bath and fermented under these conditions until the pH reached 4.60 ± 0.1. After fermentation, these bottles were quenched on ice and shaken vigorously to break up the coagulum. Then, the fermented milk was heated until the temperature reached 40 ° C., and 40 ml of 5% sterilized agar solution dissolved once and cooled to 60 ° C. was added. The fermented milk and agar solution was poured into a sterile petri dish and the plates were dried on a LAF bench for 30 minutes.
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオヴェセ(Penicillium nalgiovese)(1Ox)、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)(1OOx)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(Aspergillus versicolor)(1OOx)及びペニシリウム・クルストスム(Penicillium crustosum)(1OOx)の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを7℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。 Selected molds Penicillium nargiovese (1Ox), Penicillium commune (1Ox), Aspergillus versumol (1Ox) Of the completely germinated spore suspension was dropped onto the plate. These plates were incubated at 7 ° C. and tested for mold growth after an appropriate normal interval.
寒天アッセイの結果を、図5に示す。試験された全てのカビは、出発培養株(参照)のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC5366が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を抑制した。更に、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC5366が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(Aspergillus versicolor)及びペニシリウム・クルストスム(Penicillium crustosum)の増殖は、顕著な阻害が認められた。 The results of the agar assay are shown in FIG. All molds tested grew very well on agar plates made from milk fermented only with the starting culture (reference). However, Lb. Paracasei CHCC 14676 or Lb. Plates in which Rb. Rhamnosus CHCC5366 was present inhibited all mold growth. Furthermore, Lb. Paracasei CHCC 14676 and Lb. Penicillium commune, Aspergillus versicolor and Penicillium crustilus crustilus crusilis (Lb. rhhamnosus) CHCC5366 was dropped onto a plate that had been combined in the course of milk fermentation. ) Proliferation was markedly inhibited.
実施例6:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 6: Lb. Paracasei CHCC 14676 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC14226 alone and in combination on various fungal contaminants Lb. Paracasei CHCC 14676 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC14226 alone and in combination, an agar assay was used, which mimics the yogurt manufacturing process and product.
均質化乳(1.5%w/w)を95℃で5分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark 製F−DVS YoflexR Mild)を0.02%で播種し、当該播種された乳を220mlボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676、Lb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226、及びそれらの2つの組み合わせを、合計で1x107CFU/mlの濃度で播種した。前記出発培養物のみ播種された1つのボトルを、参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、pH表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに5%添加された。全てのボトルを43±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が40℃に達するまで加熱し、一度溶解させて60℃に冷却した5%滅菌寒天溶液を40ml添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをLAFベンチで30分間乾燥させた。
Homogenized milk (1.5% w / w) was heat treated at 95 ° C. for 5 minutes and quenched. A commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS Yoflex® Mild) was seeded at 0.02%, and the seeded milk was dispensed into 220 ml bottles. Lb. Paracasei CHCC 14676, Lb.
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオヴェセ(Penicillium nalgiovese)(1Ox)、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)(1OOx)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(Aspergillus versicolor)(1OOx)及びペニシリウム・クルストスム(Penicillium crustosum)(1OOx)の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを7℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。 Selected molds Penicillium nargiovese (1Ox), Penicillium commune (1Ox), Aspergillus versumol (1Ox) Of the completely germinated spore suspension was dropped onto the plate. These plates were incubated at 7 ° C. and tested for mold growth after an appropriate normal interval.
寒天アッセイの結果を、図6に示す。試験された全てのカビは、出発培養株(参照)のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を抑制した。更に、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC14676及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(Aspergillus versicolor)及びペニシリウム・クルストスム(Penicillium crustosum)の増殖は、顕著な阻害が認められた。 The results of the agar assay are shown in FIG. All molds tested grew very well on agar plates made from milk fermented only with the starting culture (reference). However, Lb. Paracasei CHCC 14676 or Lb. Plates in which Rb. Rhamnosus CHCC14226 was present inhibited the growth of all molds. Furthermore, Lb. Paracasei CHCC 14676 and Lb. Penicillium commune, Aspergillus versicolor and Penicillium crustilus crustilus crusilis (Lb. rhamnosus) CHCC14226 was dropped onto a plate that had been combined in the course of milk fermentation. ) Proliferation was markedly inhibited.
実施例7:Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Example 7: Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. Semi-quantitative determination of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC14226 alone and in combination on various fungal contaminants Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. For semi-quantitative testing of the inhibitory effect of Lb. rhamnosus CHCC14226 alone and in combination, an agar assay was used, which mimics the yogurt manufacturing process and product.
均質化乳(1.5%w/w)を95℃で5分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark 製F−DVS YoflexR Mild)を0.02%で播種し、当該播種された乳を220mlボトルに分注した。これらのボトルにLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777、Lb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226、及びそれらの2つの組み合わせを、合計で1x107CFU/mlの濃度で播種した。前記出発培養物のみ播種された1つのボトルを、参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、pH表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに5%添加された。全てのボトルを43±1℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、pHが4.60±0.1に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が40℃に達するまで加熱し、一度溶解させて60℃に冷却した5%滅菌寒天溶液を40ml添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをLAFベンチで30分間乾燥させた。
Homogenized milk (1.5% w / w) was heat treated at 95 ° C. for 5 minutes and quenched. A commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS Yoflex® Mild) was seeded at 0.02%, and the seeded milk was dispensed into 220 ml bottles. Lb. Paracasei CHCC12777, Lb.
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオヴェセ(Penicillium nalgiovese)(1Ox)、ペニシリウム・コミューン(Penicillium commune)(1OOx)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(Aspergillus versicolor)(1OOx)及びペニシリウム・クルストスム(Penicillium crustosum)(1OOx)の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを7℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。 Selected molds Penicillium nargiovese (1Ox), Penicillium commune (1Ox), Aspergillus versumol (1Ox) Of the completely germinated spore suspension was dropped onto the plate. These plates were incubated at 7 ° C. and tested for mold growth after an appropriate normal interval.
寒天アッセイの結果を、図7に示す。試験された全てのカビは、出発培養株(参照)のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でLb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777又はLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を抑制した。更に、Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777及びLb.ラムノサス(Lb. rhamnosus)CHCC14226が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、全てのカビの増殖は、顕著な阻害が認められた。 The results of the agar assay are shown in FIG. All molds tested grew very well on agar plates made from milk fermented only with the starting culture (reference). However, Lb. Paracasei CHCC12777 or Lb. Plates in which Rb. Rhamnosus CHCC14226 was present inhibited the growth of all molds. Furthermore, Lb. Paracasei CHCC12777 and Lb. A significant inhibition was observed in the growth of all molds that were dripped onto the plates where Rb. Rhamnosus CHCC14226 was present in combination during the milk fermentation.
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777を用いて作製したサワークリームでのチャレンジ試験
Lb.パラカゼイ(Lb. paracasei)CHCC12777を単一株として用いた場合の、P・コミューン(P. commune)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(A. versicolor)、P・ブレヴィコンパクツム(P. brevicompactum)、P・クルストスム(P. crustosum)及びペニシリウム・グラブルム(P. glabrum)に対する阻害作用を視覚的に試験するために、サワークリームを調製した。
Lb. Challenge test with sour cream made with Lb. paracasei CHCC12777 Lb. P. commune, A. versicolor, P. brevicompactum, P. when using Lb. paracasei CHCC12777 as a single strain Sour cream was prepared to visually test the inhibitory effect on P. crustosum and P. glabrum.
滅菌した高脂肪乳に、市販の異発酵(heterofermentative)出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS DSG−2000)を0.01%で播種した。当該乳に、更にOLDBAC(商標) YM−B ( 10DCU/100L)又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777 (5x106 CFU/g)を播種した。1つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。 Sterilized high fat milk was seeded at 0.01% with a commercially available heterofermentative starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS DSG-2000). The milk was further seeded with OLDBAC ™ YM-B (10 DCU / 100 L) or Lactobacillus paracasei CHCC12777 (5 × 10 6 CFU / g). One batch was seeded with only the starting culture as a reference.
当該乳を、pHが4.60±0.05に達するまで28±1℃で発酵させ、サワークリームが後処理された。当該サワークリームを撹拌して20±1℃まで冷まし、7℃±1℃で保管した。 The milk was fermented at 28 ± 1 ° C. until the pH reached 4.60 ± 0.05 and the sour cream was post-treated. The sour cream was stirred and cooled to 20 ± 1 ° C. and stored at 7 ° C. ± 1 ° C.
サワークリームを調製した翌日、サワークリームの表面コンタミナントとして様々なカビがサワークリームの表面上にスポットあたり胞子100個となるように播種された。カビの増殖は、45日間7℃±1℃での保管後に視覚的に評価された。 The day after the sour cream was prepared, various molds were sown on the surface of the sour cream so that there were 100 spores per spot on the surface of the sour cream. Mold growth was assessed visually after storage at 7 ° C. ± 1 ° C. for 45 days.
サワークリームの試験の結果を、図8に示す。P・コミューン(P. commune)(M6)、A・ヴェルシコロール(A. versicolor)(M7)、P・ブレヴィコンパクツム(P. brevicompactum)(M1)、P・クルストスム(P. crustosum)(M10)及びペニシリウム・グラブルム(P. glabrum)(M8)は、出発細胞株のみ(上段)、又は出発培養株及びHOLDBAC(商標) YM−B培養株(中段)で発酵させた乳から作製したサワークリーム上で、活発に増殖した。対照的に、乳発酵の過程でラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777が存在していた場合、試験されたカビの全てにおいて、増殖が阻害された。 The results of the sour cream test are shown in FIG. P. commune (M6), A. versicocolor (M7), P. brevicompactum (M1), P. crustosum ( M10) and P. glabrum (M8) are sour creams made from milk fermented with only the starting cell line (top), or the starting culture and the HOLDBAC ™ YM-B culture (middle) Above, it proliferated actively. In contrast, when Lactobacillus paracasei CHCC12777 was present during the milk fermentation, growth was inhibited in all of the molds tested.
実施例9:ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697を用いて作製したトバログでのチャレンジ試験
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697を単一株として用いた場合の、ムコール亜種(mucor ssp.)に対する阻害作用を視覚的に試験するために、トバログを調製した。
Example 9: Challenge test on Tobalog made with Lactobacillus rhhamnosus CHCC12697 Mucor subspecies (mucor subspecies with Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 as single strain Tovalogs were prepared to visually test their inhibitory effect on.
滅菌した低脂肪乳に、市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS CHN−19)を0.01%で播種した。当該乳に、更にOLDBAC(商標) YM−B (5DCU/100L)又はラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697 (5x106 CFU/g)を播種した。1つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。 Sterilized low fat milk was seeded with 0.01% of a commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS CHN-19). The milk was further seeded with OLDBAC ™ YM-B (5DCU / 100 L) or Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (5 × 10 6 CFU / g). One batch was seeded with only the starting culture as a reference.
当該乳を、pHが4.60±0.05に達するまで28±1℃で発酵させた。湯浸温度(scalding temperature)は、38〜40℃とした。吸引後、カードを1barで30分間与圧した。 The milk was fermented at 28 ± 1 ° C. until the pH reached 4.60 ± 0.05. The bathing temperature was 38-40 ° C. After aspiration, the card was pressurized with 1 bar for 30 minutes.
トバログを調製した翌日、トバログ(100g)の表面上に、表面コンタミナントとしてムコール亜種(mucor ssp.)が、ピペットで2回、スポットあたり胞子100個となるように播種された。カビの増殖は、18日間7℃±1℃での保管後に視覚的に評価された。 The day after tobalog was prepared, mucor ssp. As a surface contaminant was seeded twice on the surface of tobalog (100 g) twice with a pipette so that there were 100 spores per spot. Mold growth was assessed visually after storage at 7 ° C. ± 1 ° C. for 18 days.
トバログ試験の結果を、図9に示す。出発培養株CHN−19のみを用いて発酵させた乳から作製されたトバログ上では、ムコール亜種(mucor ssp.)は活発に増殖したことを示す。当該カビは、出発培養株とHOLDBAC(商標) YM−B培養株を用いて培養した乳から作製したトバログでも活発に増殖し、それには及ばないが出発培養株とHOLDBAC(商標) YM−C培養株を用いて培養した乳から作製したトバログでも増殖した。しかしながら、乳の発酵の過程でラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697が存在していた場合、ムコール亜種(mucor ssp.)増殖の顕著な阻害が確認された。 The results of the tovalog test are shown in FIG. On tobalogs made from milk fermented using only the starting culture CHN-19, mucor ssp. Shows active growth. The fungus proliferates actively on tobalog made from milk cultured with the starting culture and the HOLDBAC ™ YM-B culture, although not as much as the starting culture and the HOLDBAC ™ YM-C culture. It also grew on tobalog made from milk cultured with the strain. However, when Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 was present during the fermentation of milk, significant inhibition of mucor ssp. Growth was observed.
実施例10:ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226を用いて作製したヨーグルトでのチャレンジ試験
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226を単一株として用いた場合の、P・ブレヴィコンパクツム(P. brevicompactum)、P・コミューン(P. commune)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(A. versicolor)及びP・クルストスム(P. crustosum)に対する阻害作用を視覚的に試験するために、脂肪分1.5%のヨーグルトを調製した。
Example 10: Challenge test with yogurt made using Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 P. brevicompactum using Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 as a single strain 1.5% fat to visually test the inhibitory effect on P. communicum, P. commune, A. versicolor and P. crustosum. Of yogurt was prepared.
均質化した乳(脂肪分1.5%)を、ウォーターバス中の1Lボトル中で、95±1℃で5分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS YF−L901)が0.02%で播種された。当該乳に、更にHOLDBAC(商標) YM−B (20DCU/100L)又はラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226(1x107 CFU/g)を播種した。1つのボトルは、参照として出発培養株のみ播種した。 Homogenized milk (fat 1.5%) was heat treated at 95 ± 1 ° C. for 5 minutes in a 1 L bottle in a water bath and cooled rapidly. A commercial starting culture (Chr. Hansen A / S, F-DVS YF-L901 from Denmark) was seeded at 0.02%. The milk was further seeded with HOLDBAC ™ YM-B (20 DCU / 100 L) or Lactobacillus rhamnosus CHCC 14226 (1 × 10 7 CFU / g). One bottle was seeded with only the starting culture as a reference.
当該乳を、pHが4.60±0.05に達するまで43±1℃で発酵させた。形成されたヨーグルトをカップに注ぎ(100g)、7±1℃で保存した。 The milk was fermented at 43 ± 1 ° C. until the pH reached 4.60 ± 0.05. The formed yogurt was poured into a cup (100 g) and stored at 7 ± 1 ° C.
ヨーグルトを調製した翌日、2つのヨーグルトのカップ中の表面コンタミナントとして様々なカビがヨーグルトの表面上にスポットあたり胞子100個となるように播種された。カビの増殖は、45日間7℃±1℃での保管後に視覚的に評価された。 The day after the yogurt was prepared, various molds were sown on the surface of the yogurt as surface contaminants in two yogurt cups so that there were 100 spores per spot. Mold growth was assessed visually after storage at 7 ° C. ± 1 ° C. for 45 days.
ヨーグルト試験の結果を、図10に示す。P・ブレヴィコンパクツム(P. brevicompactum)(M1)、P・コミューン(P. commune)(M6)、アスペルギルス・ヴェルシコロール(A. versicolor)(M7)P・クルストスム(P. crustosum)(M10)は、
出発培養株YF−L901のみ(上段)、又は出発培養株及びHOLDBAC(商標) YM−B培養株(中段)を用いて発酵させた乳から作製されたヨーグルト上で、活発に増殖したことを示す。対照的に、乳の発酵の過程でラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226が存在していた場合、試験された全てのカビにおいて、増殖の阻害が確認された。
The result of the yogurt test is shown in FIG. P. brevicompactum (M1), P. commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) P. crussum (M10) )
Shows active growth on yogurt made from milk fermented with only starting culture YF-L901 (upper) or starting culture and HOLDBAC ™ YM-B culture (middle) . In contrast, growth inhibition was observed in all molds tested when Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 was present during the milk fermentation.
実施例11:トバログ中のK.ラクティス(K. lactis)に対するラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777を単一株として用いた場合の、K.ラクティス(K. lactis)に対する阻害効果を定量的に試験するため、トバログが調製された。
Example 11: K. in Tobalog Quantitative determination of the inhibitory effect of Lactobacillus paracasei CHCC12777 against K. lactis K. lactis using Lactobacillus paracasei CHCC12777 as a single strain. Tovalogs were prepared to quantitatively test the inhibitory effect on K. lactis.
滅菌した低脂肪乳に、市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS CHN−19)を0.01%で播種した。当該乳に、更にOLDBAC(商標) YM−B (20DCU/100L)又はラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777 (5x106 CFU/g)を播種した。1つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。 Sterilized low fat milk was seeded with 0.01% of a commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS CHN-19). The milk was further sown with OLDBAC ™ YM-B (20 DCU / 100 L) or Lactobacillus paracasei CHCC12777 (5 × 10 6 CFU / g). One batch was seeded with only the starting culture as a reference.
当該乳を、pHが4.60±0.05に達するまで28±1℃で発酵させた。湯浸温度(scalding temperature)は、38〜40℃とした。吸引後、カードを1barで30分間与圧した。 The milk was fermented at 28 ± 1 ° C. until the pH reached 4.60 ± 0.05. The bathing temperature was 38-40 ° C. After aspiration, the card was pressurized with 1 bar for 30 minutes.
トバログを調製した翌日、約10gのトバログの試料ブロックを切り出し、それらをストマッカーバッグ(stomacher bag)中に納めた。当該ブロックに、細い針を用いて内部に酵母を10.000 CFU/mlで2回接種した。当該バッグは当該トバログを覆い、テープで密封された。 The next day after the tovalog was prepared, approximately 10 g of tobalog sample blocks were cut out and placed in a stomacher bag. The block was inoculated twice with 10.000 CFU / ml of yeast inside using a thin needle. The bag covered the tobalog and was sealed with tape.
当該試料を7±1℃で保存し、適切な間隔で、K.ラクティス(K. lactis)のコンタミネーションのレベルが解析された。解析は、1gのトバログ、更にサリンペプトンの適切な1倍希釈液を、Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC)寒天上にプレーティングし、それを25℃で5日間好気的にインキュベーションすることにより行われた。 The samples are stored at 7 ± 1 ° C. The level of K. lactis contamination was analyzed. Analysis was performed by plating 1 g of Tovalog and an appropriate 1-fold dilution of sarinpeptone on Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) agar and incubating it aerobically at 25 ° C. for 5 days. .
図11に示すように、発酵前に出発培養株CHN−19と共にラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777が存在していたトバログにおいて、K.ラクティス(K. lactis)のの増殖は阻害された。ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777は、市販の培養株HOLDBAC(商標) YM−Bよりも顕著に高い阻害を引き起こした。 As shown in FIG. 11, in Tovalog where Lactobacillus paracasei CHCC12777 was present together with the starting culture CHN-19 before fermentation, The growth of Lactis was inhibited. Lactobacillus paracasei CHCC12777 caused a significantly higher inhibition than the commercial culture HOLDBAC ™ YM-B.
実施例12:トバログ中のK.ラクティス(K. lactis)に対するラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697を単一株として用いた場合の、K.ラクティス(K. lactis)に対する阻害効果を定量的に試験するため、トバログが調製された。
Example 12: K. in Tobalog Quantitative determination of the inhibitory effect of Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 on Lactis (K. lactis) When K. lactis is used as a single strain, L. bacillus rhamnosus. Tovalogs were prepared to quantitatively test the inhibitory effect on K. lactis.
滅菌した低脂肪乳に、市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark製F−DVS CHN−19)を0.01%で播種した。当該乳に、更にOLDBAC(商標) YM−B (5DCU/100L)又はラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697 (5x106 CFU/g)を播種した。1つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。 Sterilized low fat milk was seeded with 0.01% of a commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS CHN-19). The milk was further seeded with OLDBAC ™ YM-B (5DCU / 100 L) or Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (5 × 10 6 CFU / g). One batch was seeded with only the starting culture as a reference.
当該乳を、pHが4.60±0.05に達するまで28±1℃で発酵させた。湯浸温度(scalding temperature)は、38〜40℃とした。吸引後、カードを1barで30分間与圧した。 The milk was fermented at 28 ± 1 ° C. until the pH reached 4.60 ± 0.05. The bathing temperature was 38-40 ° C. After aspiration, the card was pressurized with 1 bar for 30 minutes.
トバログを調製した翌日、約10gのトバログの試料ブロックを切り出し、それらをストマッカーバッグ(stomacher bag)中に納めた。当該ブロックに、細い針を用いて内部に酵母を10.000 CFU/mlで2回接種した。当該バッグは当該トバログを覆い、テープで密封された。 The next day after the tovalog was prepared, approximately 10 g of tobalog sample blocks were cut out and placed in a stomacher bag. The block was inoculated twice with 10.000 CFU / ml of yeast inside using a thin needle. The bag covered the tobalog and was sealed with tape.
当該試料を7±1℃で保存し、適切な間隔で、K.ラクティス(K. lactis)のコンタミネーションのレベルが解析された。解析は、1gのトバログ、更にサリンペプトン中の適切な1倍希釈物を、Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC)寒天上にプレーティングし、それを25℃で5日間好気的にインキュベーションすることにより行われた。 The samples are stored at 7 ± 1 ° C. The level of K. lactis contamination was analyzed. Analysis is performed by plating 1 g of Tovalog and an appropriate 1-fold dilution in sarin peptone on Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) agar and incubating it aerobically at 25 ° C. for 5 days. It was.
図11に示すように、発酵前に出発培養株CHN−19と共にラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697が存在していたトバログにおいて、K.ラクティス(K. lactis)のの増殖は阻害された。ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697は、市販の培養株HOLDBAC(商標) YM−Bよりも顕著に高い阻害を引き起こした。 As shown in FIG. 11, in Tobalog where Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 was present with the starting culture CHN-19 prior to fermentation, The growth of Lactis was inhibited. Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 caused a significantly higher inhibition than the commercial culture HOLDBAC ™ YM-B.
実施例13:ヨーグルト中のデバロマイケス・ハンセニイ(Debaromyces hansenii)に対するラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226を単一株として用いた場合の、デバロマイケス・ハンセニイ(Debaromyces hansenii)に対する阻害効果を定量的に試験するため、ヨーグルトが調製された。
Example 13: Quantitative determination of the inhibitory effect of Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 against Debaromyces hansenii in yogurt using Lactobacillus 26 as a single strain Lactobacillus 26 as Lactobacillus 26 Yogurt was prepared to quantitatively test its inhibitory effect on Debaromyces hansenii.
均質化乳(1.5%w/w)を1Lボトル中のウォーターバスで95℃で5分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株(Chr. Hansen A/S, Denmark 製F−DVS YF−L901)を0.02%で播種した。当該乳に、更に、HOLDBAC(商標) YM−B (20DCU/100L)又はラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226(1x107CFU/ml)を播種した。前記出発培養物のみ播種された1つのボトルを、参照物とした。 Homogenized milk (1.5% w / w) was heat treated at 95 ° C. for 5 minutes in a water bath in a 1 L bottle and quenched. A commercially available starting culture (Chr. Hansen A / S, Denmark F-DVS YF-L901) was seeded at 0.02%. The milk was further seeded with HOLDBAC ™ YM-B (20 DCU / 100 L) or Lactobacillus rhamnosus CHCC 14226 (1 × 10 7 CFU / ml). One bottle seeded with only the starting culture served as a reference.
当該乳を、pHが4.60±0.1に達するまで、43℃±1℃で発酵させた。作製されたヨーグルトをカップ(100g)に注ぎ、7℃±1℃で保存した。 The milk was fermented at 43 ° C. ± 1 ° C. until the pH reached 4.60 ± 0.1. The prepared yogurt was poured into a cup (100 g) and stored at 7 ° C. ± 1 ° C.
ヨーグルトを調製した翌日、2つのヨーグルトのカップ中に、20CFU/gとなるように、カップあたり1mlの酵母を播種した。当該酵母は、ヨーグルト中に均一に分散させられた。当該カップに蓋をして、7℃で保存し、適切な間隔でD.ハンセニイ(D. hansenii)のコンタミネーションが解析された。解析は、1gのヨーグルト、更にサリンペプトンの適切な1倍希釈液を、Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC)寒天上にプレーティングし、それを25℃で5日間好気的にインキュベーションすることにより行われた。 The day after the yogurt was prepared, 1 ml of yeast was inoculated per cup so as to be 20 CFU / g in two yogurt cups. The yeast was uniformly dispersed in yogurt. The cup is capped, stored at 7 ° C., and D.I. Contamination of D. hansenii was analyzed. The analysis was performed by plating 1 g yogurt and an appropriate 1-fold dilution of sarinpeptone on Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) agar and incubating it aerobically at 25 ° C. for 5 days. .
図12に示すように、D.ハンセニイ(D. hansenii)の増殖は、発酵前に出発培養株YF−L901と共にラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226が存在していた場合、阻害された。当該株は、市販の培養株HOLDBAC(商標) YM−Bよりも顕著に高度な阻害を引き起こした。 As shown in FIG. Growth of D. hansenii was inhibited when Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 was present with the starting culture YF-L901 prior to fermentation. The strain caused a significantly higher inhibition than the commercial culture HOLDBAC ™ YM-B.
供託及び当業者の解決法
出願人は、下記の供託された微生物の試料が、当該特許が登録査定を受けるまでに、必ず当業者に利用可能となっているべきことを要求する。
Deposits and solutions of those skilled in the art Applicants require that the following deposited samples of microorganisms must be available to those skilled in the art before the patent is subject to registration assessment.
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697は、2011年3月1日に、Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D−38124 Braunschweigに、受入番号DSM24616で、供託された。 Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 was published on March 1, 2011, in Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikhlogenismanund Zellkultur. 7B, deposited with D-38124 Braunschweig, with accession number DSM24616.
ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226は、2011年3月15日に、Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D−38124 Braunschweigに、受入番号DSM24652で、供託された。
ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777は、2011年3月15日に、Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D−38124 Braunschweigに、受入番号DSM24651で、供託された。 Lactobacillus paracasei CHCC12777 was published on March 15, 2011, in Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikhlogensund und Zellkultur. 7B, D-38124 Braunschweig, deposited with accession number DSM 24651.
以上の供託は、特許手続を目的とする微生物の供託の国際的承認についてのブダペスト条約に従い行われた。 These deposits were made in accordance with the Budapest Treaty on the International Approval of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedures.
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Claims (13)
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24616で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC12697、
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24652で供託されたラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)CHCC14226、及び
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)に受入番号DSM24651で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)CHCC12777;
から選択される1つ以上の株を含有する、抗微生物組成物。 The following groups:
Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, deposited with German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) with accession number DSM24616,
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), deposited with the accession number DSM24652, Lactobacillus rhamnosus Cul 14 with the Cact. Lactobacillus paracasei CHCC12777;
Containing one or more strains selected from the antimicrobial composition.
(a)前記食料、飼料又は医薬製品の製造の過程で、請求項1又は2のいずれかに記載の抗微生物組成物を、1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又は1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株が、当該食料、飼料又は医薬製品に対して1x106cfu/g以上又は1x106cfu/ml以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に1x105cfu/cm2の濃度となるように添加する工程、並びに
(b)1つ以上のラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)株又は1つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)株の濃度が増大し、又は一定となるように、当該製造の過程で製造パラメーターを制御する工程
を含む、当該製造方法。 It is a manufacturing method of Claim 8 , Comprising:
(A) in the process of producing the food, feed or pharmaceutical product, the antimicrobial composition according to any of claims 1 or 2 is applied to one or more Lactobacillus rhamnosus strains or one or more Lactobacillus paracasei strain of 1 × 10 6 cfu / g or more or 1 × 10 6 cfu / ml or more to the food, feed or pharmaceutical product, or 1 × 10 5 cfu on the surface of the food, feed or pharmaceutical product It added to a concentration of / cm 2 steps, and (b) one or more Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus rhamnosus) strain or concentration of one or more of Lactobacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) strain Large and, or so that a constant, comprising the step of controlling the manufacturing parameters during the course of the production, the production method.
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